CN107865963A - 藻蓝蛋白在制备抗胰腺癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及藻蓝蛋白在胰腺癌治疗中的用途。通过体内外实验证实，藻蓝蛋白能显著抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵入，表明能够应用在胰腺癌的治疗以及制备抗胰腺癌的药物中。

Description

藻蓝蛋白在制备抗胰腺癌药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及藻蓝蛋白在制备抗胰腺癌药物中的应用。

背景技术

胰腺癌(pancreatic cancer，PC)是常见的消化系统恶性肿瘤之一，来源于胰腺组织中的转化细胞，具有发病隐匿、恶性程度高、病程进展快、高致死等特点。该病总体患者的1年相对生存率小于25％，而5年相对生存率小于6％，其中原位癌的5年生存率约为20％，局部晚期和转移性癌的中位生存期分别约是10个月和6个月。有些患者在确诊时就已经病入膏肓，只有数天或数周生存时间。在癌症导致的相关死亡人数中，胰腺癌在美国名列第四，全球第八，并且在主要临床癌症中其死亡率是最高的。目前，胰腺癌的治疗以手术为主，根治性手术切除是现阶段唯一可以治愈胰腺癌的方法。然而由于大多数患者就诊时已属中晚期，失去了手术切除的机会，故非手术治疗(如化疗)在胰腺癌的综合治疗中有着十分重要的地位。化疗是目前胰腺癌的主要辅助治疗手段，吉西他滨是治疗局部进展期及转移性胰腺癌的一线药物。但是吉西他滨存在临床应答率低、固有或获得性耐药等问题，导致吉西他滨单药化疗疗效并不理想。因此，提高胰腺癌的早期诊断率，抑制肿瘤的生长和远处转移，提高药物的治疗效果，成为改善胰腺癌患者预后的关键因素。藻蓝蛋白(phycocyanin，PC)主要存在于蓝藻(Cyanophyta)、红藻(Rhodophyta)、隐藻(Cryptophyta)和少数甲藻(Pyrrophyta)中，是这些藻类进行光合作用的捕光色素之一。分离纯化的藻蓝蛋白在溶液中呈亮蓝色，并发出紫色荧光，在波长620nm具有特异吸收峰，可以A₆₂₀/A₂₈₀表示其纯度。藻蓝蛋白既可以作为天然色素广泛应用于食品、化妆品、染料等工业，同时也具有强烈荧光可制成荧光试剂、荧光探针、荧光示踪物质等，用于临床医学诊断、免疫化学及生物工程等研究领域中。藻蓝蛋白的药理活性非常广泛，但目前尚未见有藻蓝蛋白在治疗胰腺癌方面的研究报道及临床应用。

发明内容

本发明公开了藻蓝蛋白的一种新用途，即在抗胰腺癌药物中的应用。

本发明通过体内外实验证实，藻蓝蛋白能显著抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵入，表明能够应用在胰腺癌的治疗以及制备抗胰腺癌的药物中。

本发明的藻蓝蛋白可以来源于蓝藻(Cyanophyta)、红藻(Rhodophyta)或隐藻(Cryptophyta)，优选蓝藻(如螺旋藻等)的新鲜藻体或干藻粉。

藻蓝蛋白制备方法如下：藻体悬浮于50mmol/L磷酸盐缓冲中，反复冻融，4℃离心(10000g×10min)，上清加入固体硫酸铵至50％饱和度，4℃静置过夜，离心(10000g×10min)，收集沉淀，溶解于少量磷酸盐缓冲液(10mmol/L，pH7.0)中，并在此缓冲液中充分透析，透析液过滤，上样于上述磷酸盐缓冲液平衡的DEAE-Sepharose FF柱，用含0-1mol/LNaCl梯度的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，收集蓝色洗脱液，收集的洗脱液透析后，上样于上述同样缓冲液平衡的羟基磷灰石柱，10-300mmol/L梯度的磷酸盐缓冲液(pH7.0)梯度洗脱，收集A₆₂₀/A₂₈₀大于4的蓝色洗脱液，透析后浓缩或冻干即为藻蓝蛋白。

上述抗癌药物可以是由有效应用量的藻蓝蛋白和药学上的载体组成的药物组合物。

上述抗癌药物可以是由有效应用量藻蓝蛋白和药学上的赋形剂组成的药物组合物。

通常可以将本发明所述藻蓝蛋白配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为4-8，pH值也可随被配制物质的性质以及待治疗的病症有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括但不限于：肌内，腹膜内，皮下、皮内或局部给药。

可以将藻蓝蛋白与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的药物和药学上可接受的载体或赋型剂。这类载体包括但不限于盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的藻蓝蛋白可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。

附图说明

图1藻蓝蛋白对胰腺癌细胞增殖的抑制作用

图2藻蓝蛋白对胰腺癌细胞迁移的抑制作用

图3藻蓝蛋白对胰腺癌细胞运动的抑制作用

图4藻蓝蛋白对人胰腺癌PANC-1细胞裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用

图5藻蓝蛋白对胰腺癌细胞PANC-1在裸鼠中转移的抑制作用

具体实施方式

以下将通过具体的实施例对本发明进行描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

实施例1

藻蓝蛋白对胰腺癌细胞增殖的抑制作用

胰酶消化对数生长期生长状态良好的胰腺癌细胞PANC-1和Capan-1，分别以10000个/孔的密度接种于96孔板，继续培养24h，然后采用倍比稀释法给予0.15625、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40(μM)9个浓度梯度的藻蓝蛋白以及不加藻蓝蛋白的对照组处理，继续培养72h后，每孔加入等体积celltiter-gloTM试剂，缓慢振荡平板15min后，以多功能酶标仪读取各孔化学发光信号(CL)；细胞抑制率％(inhibition)＝(1-药物处理组平均CL值/细胞对照孔平均CL值)×100％；采用graphpad prism5.0以细胞抑制率对藻蓝蛋白的浓度对数作四参数非线性回归拟合曲线，计算得到细胞的半数抑制浓度(half inhibitionconcentration，IC50)。从图1可以看出，在作用72h条件下，随着浓度的升高，藻蓝蛋白对细胞生长的抑制率也逐渐升高，对PANC-1细胞以及Capan-1细胞的IC₅₀分别为13.3μM和9.3μM。

实施例2

藻蓝蛋白对胰腺癌细胞迁移的抑制作用

采用细胞划痕实验。取处于对数生长期生长状态良好的胰腺癌细胞PANC-1，以5×10⁵个细胞/孔，接种于6孔板中，培养过夜；第二天划痕，用PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，分别给予5、10、20、40μM藻蓝蛋白(0.2％低血清培养基配制)以及对照组(仅含0.2％无血清培养基)处理，放入37度5％CO₂培养箱，培养。按0，24，48，72小时时间点选取细胞孔，拍照记录。从图2可以看出，各个时间点横向比较，随着藻蓝蛋白浓度的提高，细胞迁移的距离越来越小；纵向比较，对照组相随着时间延长，细胞迁移非常明显，72h细胞已达融合，而给予藻蓝蛋白的各组，细胞迁移变化很小，特别是40μM藻蓝蛋白组。由此可见，藻蓝蛋白对胰腺癌细胞迁移具有明显的抑制作用。

实施例3

藻蓝蛋白对胰腺癌细胞运动的抑制作用

将处于对数生长期生长状态良好的PANC-1细胞以2000个/孔接种于黑壁亮底的96孔板上；培养24h后，去掉上清，每孔加入100μL以1640培养液配制的浓度为1μg/mL的CellTracker^TMGreen BODIPY，放入37℃，5％CO₂培养箱中负载30min；去除培养液，按照设置的组别每孔加入含浓度为5、10、20μM藻蓝蛋白的1640完全培养液，放入高内涵筛选系统的活细胞培养室，每隔30min对固定视野中的细胞位置进行扫描一次，扫描持续时间为24h，以仪器自带软件记录细胞运动轨迹，并以细胞离开初始0点位置的位移对扫描时间做图，分析细胞运动能力的改变。从图3可以看出，对照组(未给药组)细胞运动轨迹呈现多数的长线型，细胞整体位移图振幅变化很大；而给予不同浓度的藻蓝蛋白后，细胞运动整体轨迹线明显变短，细胞整体位移图的振幅趋于平缓，到20μM高浓度藻蓝蛋白组大多细胞基本仅呈现为一个细胞点，细胞位移图振幅更加平坦。(图中左列不同的颜色代表不同细胞的运动轨迹，右列不同颜色代表不同细胞的运动位移)

实施例4

藻蓝蛋白对人胰腺癌PANC-1细胞裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用

以胰酶消化对数生长期的人胰腺癌PANC-1细胞株，在无菌条件下用生理盐水制备成5×10⁷个/mL细胞悬液，以0.1ml接种于裸鼠右侧腋窝皮下；用游标卡尺测量裸鼠移植瘤直径，待肿瘤生长至80-110mm³后，将裸鼠随机分成五组，每组6只，开始给药，藻蓝蛋白给药方式为腹腔注射；于每次给药前称量裸鼠体重并以游标卡尺测定肿瘤直径，每两天给药一次，给药周期21天；最后一次给药后两天对裸鼠称重，测定肿瘤体积并处死裸鼠，取出肿瘤进行称重、拍照；设置组别为阴性对照组给予等量0.9％生理盐水，藻蓝蛋白处理浓度分别为12.5mg/kg、25mg/kg以及50mg/kg。肿瘤体积计算公式：TV＝0.5×a×b²，其中a、b分别表示长宽，根据测量结果计算出相对肿瘤体积，并以体积为纵坐标，时间为横坐标绘制肿瘤在裸鼠体内的生长曲线。从图4(A)及图4(B)可知，在给药终点，与对照组相比，给予藻蓝蛋白的组裸鼠肿瘤体积变小，肿瘤重量也显著变轻，并且呈现明显的剂量依赖性；从图4(C)可知，藻蓝蛋白能够显著抑制PANC-1细胞在裸鼠体内的生长；从图4(D)可知，所给予的藻蓝蛋白的剂量条件对裸鼠本身的体重影响很小。

实施例5

藻蓝蛋白对胰腺癌细胞PANC-1在裸鼠中转移的抑制作用

实验开始前对约6周龄的SPF级裸鼠以40mg/kg的量腹腔注射免疫抑制剂，每天注射1次，连续注射2天；以胰酶消化对数生长期的荧光标记的人胰腺癌PANC-1-luciferase稳定转染细胞株，计数，在无菌条件下以生理盐水制备成5×10⁷个/ml细胞悬液；以200μL的量尾静脉注射注入裸鼠体内；第二天开始对各组动物分别以腹腔给药的方式给予不同浓度的藻蓝蛋白，阴性对照组给予等量0.9％生理盐水，藻蓝蛋白处理浓度分别为10mg/kg、20mg/kg以及40mg/kg；每两天给药一次，给药持续3周；最后一次给药后间隔一天，然后对每只老鼠以腹腔注射0.15mg/10μL/g体重的量给予D-luciferin，10-15min后采用小动物活体成像仪记录各组肿瘤细胞在裸鼠体内转移的情况。从图5的结果可以看出，对照组(Control)裸鼠体内PANC-1细胞大部分已扩散至全身组织，呈现大面积的化学发光，随着给予不同浓度的藻蓝蛋白，PANC-1细胞的扩散分布越来越小，高剂量有一只裸鼠基本没有扩散，因此藻蓝蛋白能显著抑制PANC-1细胞在裸鼠体内的转移。

Claims (2)

1.藻蓝蛋白在制备用于治疗胰腺癌药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述的藻蓝蛋白用于抑制胰腺癌细胞的增殖、侵袭和转移。