CN105687216A

CN105687216A - 治疗下肢缺血性疾病的药物

Info

Publication number: CN105687216A
Application number: CN201610039248.8A
Authority: CN
Inventors: 吴寿荣; 江崎慧; 张静
Original assignee: Chongqing University
Current assignee: Chongqing University
Priority date: 2016-01-21
Filing date: 2016-01-21
Publication date: 2016-06-22
Anticipated expiration: 2036-01-21
Also published as: CN105687216B

Abstract

本发明提供一种治疗下肢缺血性疾病的药物，该药物含有红景天苷作为活性成分。此外，提供一种PHD3的特异性抑制剂，该抑制剂为红景天苷。

Description

治疗下肢缺血性疾病的药物

技术领域

本发明涉及一种治疗下肢缺血性疾病的药物，该药物含有红景天苷作为活性成分。本发明还涉及PHD3的特异性抑制剂、血管新生因子促进剂、血管平滑肌细胞迁移促进剂、骨骼肌细胞迁移促进剂以及成熟血管形成的促进剂。

背景技术

外周动脉疾病(PeripheralArteryDisease)是指由于动脉粥样硬化等导致动脉阻塞，从而限制心脏以外的组织的血流供应。下肢缺血性疾病(LimbIschemia)是一种最常见的外周动脉疾病，由于血管堵塞、血栓、高血糖等原因导致远端(下肢)供血不足。由于氧气是由血液中的红血球运输到各个组织器官，供血不足的结果是引起下肢组织缺氧、缺营养，严重时会导致组织坏疽，组织缺失(tissueloss)甚至个体的死亡。

目前，下肢缺血性疾病尚未有有效的治疗和控制方法，严重时需要对患者进行截肢，给患者带来巨大的痛苦和损失。目前被认为有望起到良好效果的治疗方法是通过促进血管新生，改善远端供血的情况，从而阻止组织继续坏死并起到改善下肢功能的作用。

作为下肢缺血性疾病的药物，目前有第一代治疗药物和第二代治疗药物。其中，第一代治疗药物利用的是单个血管新生因子(血管内皮生长因子(Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)等)，但临床试验结果不理想，新生血管不成熟，出现漏的情况，缺乏功能性(参见：Therapeuticangiogenesisforcriticallimbischaemia.NatureReviewsCardiology,2013,10(7):387-96)。治疗结果不理想的原因被认为是由于血管重构是个多因子参与的复杂的过程。第二代治疗药物则利用了多种血管新生因子的组合(成纤维细胞生长因子2(Fibroblastgrowthfactor2，FGF2)和血小板衍生因子(Platelet-derivedgrowthfactor，PDGF)；VEGF和血管生成素-1(Angiopoietin-1，ANG1))，虽然有一定的效果，然而血管新生因子种类繁多，它们在血管重构的不同的阶段起到不同的作用。因此，存在着血管新生因子种类的选择、组合时的比率、何时给药等难题。另外，目前对下肢缺血性疾病的治疗手段还面临外来血管新生因子的局部化，因此不足以在广泛的缺血缺氧区域内诱导足够的新生成熟血管的难题。

发明内容

发明所要解决的问题

基于上述现状，作为解决上述问题的最佳方法，目前迫切需要一种能在广泛的缺血缺氧区域内起作用，并同时调控多种血管新生因子和参与成熟血管重构的多种体内通路的药物。

解决问题的手段

本发明的发明人等对此进行了深入研究，结果发现，红景天苷(结构式如式1所示)对治疗下肢缺血性疾病有良好的治疗效果。进而，还发现红景天苷具有在骨骼肌内特异性抑制PHD3并促进骨骼肌细胞迁移能力的效果。进而，还发现红景天苷能促进骨骼肌内血管新生因子(VEGF-A、ANG1、FGF2、PDGF-BB、血红素加氧酶-1(Hemeoxygenase-1，HO-1)、肝细胞生长因子(Hepatocytegrowthfactor，HGF)、核因子-kappaB(Nuclearfactor-kappaB，NF-κB))、特别是促进对血管成熟起关键作用的因子(FGF2、HGF、PDGF-BB、NF-κB和ANG1)的表达以及分泌的作用。进而还发现，红景天苷具有促进骨骼肌细胞迁移的作用。进而还发现，红景天苷具有在缺血以及/或缺氧条件下促进成熟血管形成的作用。由此，完成了本发明。

本发明涉及如下方案。

1.一种治疗下肢缺血性疾病的药物，所述药物含有红景天苷作为活性成分。本发明的发明人发现，红景天苷对于治疗下肢缺血性疾病起到良好的治疗效果。

2.根据方案1的治疗下肢缺血性疾病的药物，所述药物为注射剂。

3.根据方案1或2的治疗下肢缺血性疾病的药物，所述药物为骨骼肌注射剂。

4.根据方案1～3中任一项的治疗下肢缺血性疾病的药物，所述药物进一步包含辅料。

5.一种PHD3的特异性抑制剂，所述抑制剂为红景天苷。本发明的发明人发现，红景天苷能特异性抑制PHD3的表达，同时对PHD家族的其他因子的表达没有影响。

6.一种血管新生因子的表达和分泌的促进剂，所述促进剂为红景天苷。

7.根据方案6的促进剂，所述促进剂促进骨骼肌细胞的血管新生因子的表达和分泌。本发明的发明人发现，红景天苷能促进血管新生因子在骨骼肌细胞内的表达以及从骨骼肌细胞里的分泌。

8.根据方案6或7的促进剂，所述血管新生因子为HIF-1α依赖性和HIF-1α非依赖性的血管新生因子。本发明的发明人发现，红景天苷能促进HIF-1α依赖性和HIF-1α非依赖性的血管新生因子，起到同时调控多种血管新生因子的作用，从而达到促进成熟血管形成的结果。

9.根据方案6～8中任一项的促进剂，所述血管新生因子能在缺血以及/或缺氧条件下促进成熟血管形成。本发明的发明人发现，红景天苷能在缺血缺氧条件下促进缺血缺氧区域内血管内皮细胞以及血管平滑肌细胞的数量，进一步能促进由血管平滑肌细胞包围血管内皮细胞的管腔结构(即成熟血管)的形成。

10.一种治疗下肢缺血性疾病的药物，所述药物为方案5的PHD3的特异性抑制剂或方案6～9中任一项的促进剂。本发明的发明人发现，PHD3的降低能起到同时调控多种血管新生因子的作用，从而达到促进成熟血管形成的效果。

11.一种骨骼肌细胞迁移的促进剂，所述促进剂为红景天苷。本发明的发明人发现，红景天苷在促进骨骼肌细胞分泌各种血管新生因子的同时，能促进骨骼肌细胞的迁移，从而达到在更广泛的范围内促进成熟血管形成的效果。

12.一种血管平滑肌细胞迁移的促进剂，所述促进剂含有利用红景天苷刺激骨骼肌细胞而产生的分泌性蛋白。

13.根据方案11的骨骼肌细胞迁移的促进剂或方案12的血管平滑肌细胞迁移的促进剂，所述促进剂通过骨骼肌细胞与血管平滑肌细胞之间的细胞通讯促进血管平滑肌细胞的迁移。本发明的发明人发现，红景天苷能通过促进骨骼肌细胞与血管平滑肌细胞之间的细胞通讯，促进血管平滑肌细胞的迁移，从而促进成熟血管的形成。

14.根据方案11的骨骼肌细胞迁移的促进剂或根据方案12的血管平滑肌细胞迁移的促进剂，所述促进剂通过促进FGF2介导的骨骼肌细胞与血管平滑肌细胞间的细胞通讯促进血管平滑肌细胞的迁移。

15.根据方案11的骨骼肌细胞迁移的促进剂或根据方案12的血管平滑肌细胞迁移的促进剂，所述促进剂通过PDGF-BB介导的骨骼肌细胞与血管平滑肌细胞间的细胞通讯促进血管平滑肌细胞的迁移。

16.红景天苷在制备治疗下肢缺血性疾病的药物中的用途。

17.根据方案16所述的用途，所述治疗下肢缺血性疾病的药物为注射剂。

18.根据方案17所述的用途，所述治疗下肢缺血性疾病的药物为骨骼肌注射剂。

19.红景天苷在制备PHD3的特异性抑制剂中的用途。

20.根据方案19所述的用途，所述PHD3的特异性抑制剂为治疗下肢缺血性疾病的药物。

21.红景天苷在制备血管新生因子的表达和分泌的促进剂中的用途。

22.根据方案21所述的用途，所述血管新生因子的表达和分泌的促进剂为治疗下肢缺血性疾病的药物。

23.根据方案21所述的用途，所述血管新生因子的表达和分泌的促进剂促进骨骼肌细胞的血管新生因子的表达和分泌。

24.根据方案21～23中任一项的促进剂，所述血管新生因子为VEGF-A、ANG1、FGF2、PDGF-BB、HO-1、HGF、NF-κB中的一种或多种。

25.红景天苷在制备成熟血管形成促进剂中的用途。

26.根据方案25的促进剂，其促进下肢缺血性疾病的组织中的血管新生以及新生血管的成熟。

另外，上述方案中的下肢缺血性疾病没有限制，包括血栓闭塞性脉管炎、闭塞性动脉硬化症、间歇性跛行(IntermittentClaudication，IC)、糖尿病足(DiabeticFoot)等糖尿病相关血管病变以及恶性下肢缺血性疾病(CriticalLimbIschemia,CLI)，优选为间歇性跛行、糖尿病足和下肢缺血性疾病，最优选为糖尿病足和下肢缺血性疾病。

根据本发明，能够提供一种治疗下肢缺血性疾病的药物，所述药物含有红景天苷作为活性成分。所述药物通过抑制PHD3的表达，从而促进血管新生因子(VEGF-A、ANG1、FGF2、PDGF-BB、HO-1、HGF、NF-κB)、特别是促进对血管成熟起关键作用的因子(FGF2、HGF、PDGF-BB、NF-κB和ANG1)的表达，进而通过促进骨骼肌细胞迁移以及间接促进血管平滑肌细胞迁移以及改善低氧适应性，从而促进病变部位的成熟血管的形成，实现促进下肢血流的恢复的治疗效果。

附图说明

图1A表示红景天苷促进下肢缺血模型小鼠的血流恢复作用的图。

图1B表示红景天苷促进下肢缺血模型小鼠的血流恢复作用的定量结果图。

图1C表示红景天苷促进下肢缺血模型小鼠的血流恢复作用的图。

图2A表示红景天苷促进血管内皮细胞、血管平滑肌细胞的增多以及由血管平滑肌细胞包围血管内皮细胞的管腔结构(即成熟血管)的形成的免疫组织染色结果的照片。

图2B表示红景天苷促进血管内皮细胞以及血管平滑肌细胞增多的免疫组织染色结果的定量图。

图3A表示红景天苷对PHD3的特异性抑制作用的结果。

图3B表示红景天苷对血管新生因子的表达的促进作用。

图3C表示PHD3基因沉默对血管新生因子的影响。

图4：红景天苷对骨骼肌细胞迁移的促进作用。

图5：条件培养基对于血管平滑肌细胞迁移的促进作用。

图6：促进血管平滑肌细胞迁移的、红景天苷刺激下骨骼肌细胞产生的分泌蛋白的种类的鉴定结果。

图7：低氧条件下红景天苷对骨骼肌细胞凋亡的影响。

具体实施方式

本发明中的下肢缺血性疾病可以为任何一种下肢缺血性疾病，例如血栓闭塞性脉管炎、闭塞性动脉硬化症、间歇性跛行(Intermittentclaudication)、糖尿病足(DiabeticFoot)等糖尿病相关血管病变以及恶性下肢缺血性疾病(CriticalLimbIschemia)。

本发明中的下肢缺血性疾病的治疗药物包含红景天苷作为活性成份。本发明中的红景天苷为结构式如式1的化合物。红景天苷的来源可以是从高山红景天、大花红景天、蔷薇红景天、西藏红景天等景天科植物中提取，也可以是通过化学合成。红景天苷的纯度没有限制，优选为80％以上，更优选为90％以上，进而优选为95％以上，再优选为98％以上，最优选为99.8％以上。关于纯度的影响，申请人说明如下：后述的本发明实施例中记载了使用上海同田生物技术有限公司(纯度≥98.0％)生产的红景天苷，申请人另外也使用了中国食品药品检定研究院的红景天苷产品(纯度≥99.8％)，且使用这两种浓度的红景天苷效果相同，由此可以理解，后述的本发明效果是由红景天苷所产生的，而不是由杂质成分产生。

另外，关于使用红景天苷治疗下肢缺血性疾病时的浓度，可以设定为每次注射10-500mg/kg体重。该剂量可以单次或者分成多次使用。给药次数可以单次或多次，可以连续性每天给药或间隔性给药。

本发明中的下肢缺血性疾病的程度没有任何限制，可为前期病变、轻度、中度或严重的下肢缺血性疾病，也可为慢性或急性下肢缺血性疾病。本发明中的“低氧”或“缺氧”没有任何限制，可以是下肢缺血性疾病疾病所导致的组织细胞低氧、缺氧。对于低氧、缺氧状态下的氧浓度没有任何限定。由于组织里的氧浓度会根据部位(包括同一个组织里的部位)而有所不同，并且考虑到组织里的氧气浓度低于动脉氧气浓度、且动脉氧气分压一般认为为100mmHg(低于40mmHg就会使生物体至死)，因此本发明中低氧是指氧气分压优选为高于0mmHg且为100mmHg以下的范围，更优选为10～100mmHg、进一步优选为20～100mmHg、再优选30～100mmHg、最优选40～100mmHg的范围。本领域技术人员应可以理解，本发明实施例中的下肢缺血性小鼠模型是采用完全切断大腿大动脉构建的(即严重下肢缺血缺氧模型)，且采用的小鼠为血管重构和血流恢复能力非常差的Balb/c品种；而细胞实验采用的也是对细胞影响非常严重的严重低氧(氧气浓度低于0.1％)的条件。由此可以理解，后述的本发明的效果除了对严重下肢缺血性疾病具有良好的治疗效果之外，在血管重构和下肢功能恢复能力更强的前期病变、轻度或中度的下肢缺血性疾病能起到更好的治疗效果。

本发明中的下肢缺血性疾病的治疗药物也可以包含一种或多种辅料。辅料没有限定，例如溶剂、等张剂、赋形剂、pH调整剂、抗氧化剂、崩解剂、调味剂、香料、保存剂等本领域常用的辅料。

作为溶剂可以列举：注射用蒸馏水、生理盐水、植物油，丙二醇、聚乙二醇、乙醇、甘油之类的醇类等。

作为等张剂可以列举：山梨醇、氯化钠、葡萄糖等本领域常用的等张剂。

作为赋形剂可以列举：乳糖、甘露醇、葡萄糖、微晶纤维素、淀粉等。

作为pH调整剂可以列举：盐酸、枸橼酸、氢氧化钠、强氧化钾、碳酸氢钠、磷酸氢二钠等。

作为抗氧化剂可以列举：亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、抗坏血酸等。

作为崩解剂可以列举：马铃薯淀粉等。

作为调味剂可以列举：蔗糖、单糖浆等甜味剂等。

作为香料可以列举：薄荷油、橙皮油等。

作为保存剂可以列举：尼泊金类、山梨酸及其盐等本领域常用的保存剂。

本发明中的下肢缺血性疾病的治疗药物可以为任何一种剂型，例如口服液、贴剂、片剂、胶囊、注射剂等，优选为注射剂，最优选为骨骼肌注射剂。

本发明中的抑制剂为抑制基因的表达水平的药剂，可包含抑制转录、翻译、蛋白质合成以及蛋白质稳定性的药剂。促进剂为促进基因的表达或分泌水平的药剂，可包含促进转录、翻译、蛋白质合成、蛋白质稳定性以及分泌的药剂。

本发明中的血管新生因子为对成熟血管的形成起到作用的因子，其中包括对管腔形成起作用的因子(VEGF-A、FGF2、HGF等)、对细胞成熟起作用的因子(FGF2、HGF、PDGF-BB、NF-κB和ANG1等)、起到提高低氧耐受性和细胞保护作用的因子(HO-1等)等。血管新生因子包含HIF-1α依赖性和HIF-1α非依赖性的血管新生因子。HIF-1α依赖性的血管新生因子例如VEGF、PDGF-BB和HO-1，而HIF-1α非依赖性的血管新生因子例如FGF2、HGF、NF-κB和ANG1。

本发明中的细胞通讯为任意一种细胞间交流的方式，例如内分泌(endocrine)、旁分泌(paracrine)、自分泌(autocrine)、化学突触(chemicalsynapse)、接触性依赖的通讯、间隙连接等，介导细胞通讯的可以为配体/受体、小分子化合物、囊泡等。

本领域技术人员应可以理解，本发明所涉及的血管新生因子、它们的调控机制以及它们的作用效果在小鼠和包括人类在内的哺乳动物中是共通的，因此，基于本说明书对红景天苷在小鼠模型中的作用效果以及作用机制的描述，本领域技术人员应可以理解：红景天苷在包括人类在内的哺乳动物体内也能达到治疗下肢缺血性疾病、特异抑制PHD3、促进血管新生因子的表达分泌、促进骨骼肌细胞以及血管平滑肌细胞迁移、促进成熟血管的形成等本说明书所描述的效果。

另外，本领域技术人员应可以理解，本说明书中“促进血管重构”和“促进成熟血管的形成”为促进血管的新生以及/或促进新生血管的成熟。

1.红景天苷对下肢缺血模型小鼠的血流恢复作用的测定

1-1下肢缺血模型小鼠的建立

使用Balb/c小鼠(8周，雄性)，在麻醉条件下对左侧大腿大动脉进行切除手术，并利用LaserDopplerPerfusionImagingSystem(MOORINSTRUMENTSLtd,MOORLDLS2-IR)检测血流的情况(参照文献ShourongWuetal.,Prolylhydroxylasedomain-2silencinginducedbyhydrodynamiclimbveininjectionenhancesvascularregenerationincriticallimbischemiamicethroughactivationofmultiplegenes(2015)CurrGeneTher.,15(3):313-25.中的方法)。需要说明的是，关于本申请说明书中“左侧”、“右侧”的表述，进行了手术的是左侧大腿，此时小鼠处于俯卧状态，后述的血流图的照片中小鼠处于仰卧状态，所以该血流图照片中手术的大腿在图中右侧。

1-2红景天苷的注射

将红景天苷(上海同田生物技术有限公司，纯度≥98.0％)用PBS溶解，配成40mg/ml的储存液，用0.22μm滤膜过滤后，于-20℃保存备用。

注射前将红景天苷储存液稀释至20mg/ml。小鼠注射剂量是100mg/kg，术后第1天开始每三天注射一次，每次注射将注射液分3次，连续往左侧腓肠肌里分三个位点分别注射。

使用生理盐水作为对照，同样地过滤、保存和注射。

1-3观察结果

利用LaserDopplerPerfusionImagingSystem检测术前、刚手术后、术后第3、7、14、21天的血流情况。

本实验获得了令人惊奇的优异效果。参照图1A，灰色部分反应血流状况。术前，生理盐水对照组小鼠和红景天苷处理组小鼠具有同等的血流状况(需要说明的是，LaserDopplerPerfusionImagingSystem原初成像为彩图，转化为灰度图片后，与原初所成的像看起来有些许差异。在原彩图中，红色表示血流丰富，蓝色表示没有血流。在灰度图像下无法较清晰地区分血流恢复的地方(即原彩图中红色部位)和没有血流(即原彩图中蓝色部位)的地方)。针对该问题，本申请发明人依据彩图结果对灰度图进行了图像处理，并将处理后的图片作为图1A。在图1A中，网点状图案表示血流恢复的地方，即原彩图中的红色部分。刚手术后，对照组小鼠和红景天苷处理组小鼠左侧下肢均显示出黑色(在原彩图中均为蓝色部分，在处理后的图中为没有网点状图案的黑色部分)，即二者左侧下肢均没有血流，可知手术成功地制造出下肢缺血小鼠模型。在术后第3天，红景天苷处理组小鼠左侧下肢开始出现灰色和黑色部分(即原彩图中的红色部分、处理后的图中的网点部分)，可知出现了明显的血流恢复状况；与之相对，生理盐水对照组小鼠左侧下肢仍为黑色(即原彩图中的蓝色部分，在处理后的图中为没有网点状图案的黑色部分)，可知没有出现血流恢复的迹象。术后第21天时，红景天苷处理组小鼠左侧下肢达到了与未处理的左侧下肢几乎同等的血流状况，即左侧下肢的血流得到了较为充分的恢复；与之相对，图中生理盐水对照组小鼠左侧下肢影像缺失，推测是由于没有血流恢复而导致了下肢萎缩和组织坏死。另外从图中也可以看出，随着治疗时间的延长，红景天苷处理组左侧下肢的灰色和黑色部分(即原彩图中的红色部分、处理后的图中的网点部分)越来越达到下肢的远端(即靠近脚趾)部位，可知血流逐渐恢复到距离动脉切除较远的部位。

另外，发明人对LaserDopplerPerfusionImagingSystem的结果进行了定量，结果示于图1B。具体定量方法为：将缺血下肢(左侧下肢)的定量值(即血流面积的像素)除以同一只小鼠的非缺血下肢(右侧下肢)的定量值，然后将每一个时间点的该比值平均化并除以各组术前的比值的平均值。参照基于统计结果的图1B可知，刚手术后，对照组小鼠和红景天苷处理组小鼠的血流比值均降为低于0.2的数值。在术后第3天，红景天苷处理组小鼠的血流比值达到高于0.5；与之相对，生理盐水对照组小鼠的血流比值明显低于0.2。术后第21天时，红景天苷处理组小鼠的血流比值达到了0.8以上；与之相对，对照组小鼠的血流比值仍为大约0.4的低值。

另外，申请人将血流状况检测结果的灰度图(即将血流状况检测结果的彩色图灰度化后的图)示于图1C中。

2.红景天苷治疗下肢缺血疾病的机理的研究

对于这一优异效果，申请人进行了机理方面的研究。

2-1.免疫组织染色

采用冰冻切片进行，术后21天，取得小鼠的左侧腓肠肌组织后保存在-80℃。待组织冷冻后进行切片。

切片流程如下，包埋剂包埋组织后在切片机(Leica生产)上进行切片，切片厚度是10μm。切片结束后将切片置于37℃烘箱中烘干30min，2.5％牛血清白蛋白(BSA)中封闭30～60min。将组织周围的BSA除去后，用抗PECAM-1(别名：CD31)抗体室温孵育1h(PECAM-1：PurifiedRatAnti-MouseCD31(CloneMEC13.3,BDPharmingen^TMCat550274)，抗体稀释比例1:50)，然后用含有0.1％吐温的生理盐水(PBS-T)清洗三次，每次5min。进一步将该切片用带有荧光标记的抗α-SmoothMuscleActin(α-SMA)的抗体Mousemonoclonal(Clone1A4,Sigma-AldrichCatC6198)(即α-SmoothMuscle-Cy3，抗体稀释比例1:100)、和荧光标记的针对抗PECAM-1抗体的二抗(Goatanti-RatIgG(H+L)SecondaryAntibody,Alexa488conjugate(ThermoScientificCatA11006，抗体稀释比例1:100))的混合液室温孵育30min。然后PBS-T清洗三次，每次5min。免疫荧光染色结束并用丙三醇封片后，在荧光显微镜(LeicaMicrosystems，DMI6000B)上面检测。对注射了红景天苷和生理盐水的小鼠确认血管生成及血管成熟情况。结果如图2A所示。另外，对所获得的图片中的被染色部分的面积利用LeicaApplicationSuiteVersion4.6软件进行定量，得出PECAM-1阳性和α-SMA阳性的面积。结果如图2B所示。

结果确认，注射红景天苷的小鼠的组织内发现了血管内皮细胞(即PECAM-1阳性)和血管平滑肌细胞(即α-SMA阳性)的细胞增多。通过重叠图片(Mergeimage)发现PECAM-1和α-SMA双阳性的结构增多，并形成由血管平滑肌细胞包围血管内皮细胞的管腔结构，意味着形成了丰富的成熟血管，而注射生理盐水的小鼠仅有非常微弱的阳性信号，且不形成官腔结构。另外，定量结果也显示了红景天苷能在缺血缺氧条件下显著地诱导更多的血管内皮细胞和血管平滑肌细胞。

该结果表明，注射红景天苷能够治疗小鼠下肢缺血、即促进缺血下肢血流的恢复，其原因很可能是由于红景天苷促进了小鼠的血管新生和成熟血管的形成。

2-2.红景天苷对PHD3的特异性抑制和对血管新生因子的诱导

RNA提取：根据上述1.建立下肢缺血性疾病小鼠模型并注射红景天苷。在手术第三天对小鼠进行安乐死，并取左侧腓肠肌组织置于RNAlaterSolution。将组织分成两块在液氮中研磨，待磨成粉末状之后加入TRIZOL(Invitrogen)后收集到1.5mL的无酶EP管中，并根据Trizol的说明书提取RNA。RNA提取之后用Nanodrop-2000(GeneCompany,Ltd)检测所提取的RNA的质量和浓度后进行反转录。

mRNA水平的测定：

RT-PCR

TAKARA-PrimeScript^TMRTreagentKitwithgDNAEraser(CodeNo.RR047A)

(1)

去除基因组DNA反应

试剂	使用量
		5*gDNA Eraser Buffer	2.0μL
gDNA Eraser	1.0μL
		Total RNA	1.0μg
RNase Free DH₂O	Up to 10.0μL

体系完成之后置于Bio-RadT100Thermalcycler中，反应条件如下：

42℃2min

4℃。

⑵

反转录反应

试剂	使用量
		PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ	1.0μL
RT Prime Mix^*4	1.0μL
		5*PrimeScript Buffer2	4.0μL
RNase Free DH₂O	4.0μL
		步骤1的反应液	10.0μL
Total	20.0μL

体系完成之后置于Bio-RadT100Thermalcycler中，反应条件如下：

37℃15min

85℃5sec

4℃

⑶得到cDNA后稀释10倍。稀释后的样品用来做定量PCR实验(定量PCR仪：CFX96OpticalReactionModule#1845097，Bio-Rad)，测定PHD1、PHD2、PHD3、FGF2、HGF、ANG1、VEGF-A、HO-1、NF-κB以及PDGF-BB的基因的表达水平，并用β-Actin的表达量归一化。反应体系如下

试剂	用量
		SYBR	5.0μL8 -->
PCR Forward Primer(10Μm)	0.4μL
		PCR Reverse Primer(10Μm)	0.4μL
RT反应液	2.5μL
		DH₂O	1.7μL
Total	10μL

定量PCR反应程序

1.50.0℃for2min

2.95.0℃for10min

3.95.0℃for15sec

4.60.0℃for35sec

5.GOTO3.40moretimes

6.95.0℃for15sec

7.60.0℃for1min

8.MeltCurve65.0to95.0,increment0.5℃.

定量PCR相关引物序列

测定结果示于图3A～C。

目前已知的是，PHD家族(PHD1、PHD2、PHD3)对血管新生起到至关重要的调控作用。根据本申请人的实验结果(参见图3A)，确认红景天苷在骨骼肌中对PHD3有特异性的抑制作用，对于PHD1和PHD2则没有抑制作用。

由图3B可知，红景天苷促进了血管新生因子(VEGF-A、ANG1、FGF2、PDGF-BB、HO-1、HGF、NF-κB)的表达。其中，已知FGF2、HGF、PDGF-BB、NF-κB和ANG1为与血管成熟相关的因子，因此本领域技术人员可以理解，红景天苷通过促进VEGF等多种血管新生因子表达量的上调能够促进管腔形成，通过促进FGF2、HGF、PDGF-BB、NF-κB和ANG1表达量的上调而能够促进新生血管的成熟。

申请人进而通过PHD3基因沉默实验研究了PHD3的抑制与血管新生因子表达量上调间的关系。

PHD3基因沉默(RNA干扰)试验：

构建2个以PHD3为靶标，表达能诱导RNA干扰的短发夹型RNA(shorthairpinRNA,shRNA)表达质粒，即shPHD3-1和shPHD3-2。质粒的制作可参见下述文献：YinYang1inducestranscriptionalactivityofp73throughcooperationwithE2F1,ShourongWuet.al.,BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications365(2008)75–81；以及SynergisticcooperationofMDM2andE2F1contributestoTAp73transcriptionalactivity,ViviKasimetal.,BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications449(2014)319–326)。种小鼠骨骼肌细胞C2C12于6孔板中，每孔30万细胞，18小时后，细胞换成不含抗生素的培养基(DMEMbasic+10％胎牛血清(FBS))。同时按照Lipofectamine2000(Invitrogen)试剂的指导说明进行转染。2μg质粒(shPHD3-1、shPHD3-2shRNA表达质粒)分别与200μL的Opti-MEM培养基混合均匀，另外取4μLLipofectamine2000与200μL的Opti-MEM培养基混合均匀。室温静置5min。将两个混合体系混合在一起，静置20min后加入六孔板中。6h后换DMEM+10％胎牛血清培养基培养(DMEM+10％胎牛血清(FBS)+penicillin-streptomycinsolution)，20h后更换培养基并在低氧环境下培养12h，之后收集样品进行总RNA提取。

RNA干扰试验中使用的干扰用序列如下所示：

低氧环境下的细胞培养：低氧处理是将细胞培养板和AnaeroPack.Anaero(MitshubishiGasChemical,Japan)放入专用密封容器(标准四角形密封容器，MitsubishiGasChemical)内，放入培养箱。所述密封容器内的氧气浓度低于0.1％。

实验结果示于图3C。

由图3C可知，使PHD3基因沉默后，VEGF-A、ANG1、FGF2、PDGF-BB、HO-1、HGF、NF-κB的表达量均显著上调。

2-3成熟血管形成的深入研究

申请人在上述实验的基础上，继续进行了深入研究。为了确认所形成的成熟血管中的细胞的来源，申请人进行了细胞实验。

2-3-1细胞实验中所用的红景天苷的制备

将红景天苷(上海同田生物技术有限公司，纯度≥98.0％)用PBS溶解，配成2mg/ml的储存液，用0.22μm滤膜过滤后，于-20℃保存。

2-3-1细胞迁移实验

使用骨骼肌细胞的细胞迁移实验

将骨骼肌细胞C2C12种在transwell小室内，每个小室内种4000细胞，5小时后将盛放transwell小室的24孔板内分别换成对照培养基(含有10％胎牛血清和Penicillin、Streptomycin的双抗DMEM培养基)或含有红景天苷的(在上述对照培养基的基础上添加红景天苷，红景天苷含量是100μg/ml)，置于低氧条件下培养。18小时后取出transwell小室，去除transwell小室内部未迁移的细胞后，用DAPI染色透过滤膜而到达小室另一侧的细胞并在荧光显微镜下拍照(每组6张以上)，并通过数6张照片中的细胞数(即迁移的细胞)得出每张照片中细胞数的平均。

使用血管平滑肌细胞的细胞迁移实验

除了将细胞由小鼠骨骼肌细胞C2C12变更为小鼠血管平滑肌细胞MOVAS外，与上述“使用骨骼肌细胞的细胞迁移实验”同样进行。

将实验结果示于图4。

由图4可知，红景天苷显著促进了骨骼肌细胞的迁移，但对血管平滑肌细胞则没有促进迁移的作用。

2-3-3条件培养基对于血管平滑肌迁移的作用

条件培养基处理组

首先将小鼠骨骼肌细胞C2C12播种到100mm*20mm培养皿内，每个板子60万细胞，培养18小时后用PBS清洗，并更换为含有红景天苷的培养基(DMEM+10％FBS+Penicillin+Streptomycin+100μg/ml红景天苷)，来刺激骨骼肌细胞。处理24小时后，去除含红景天苷的培养基，用PBS清洗细胞，换上DMEM+10％FBS+Penicillin+Streptomycin培养基后放入低氧盒内培养24h,收集培养基，3000rpm/min离心5min，收集上清液，用0.22μm膜滤器进行过滤。将所收集的不含红景天苷的培养基作为条件培养基。用条件培养基(该条件培养基里包含了由骨骼肌细胞受到红景天苷的刺激而分泌的多种分泌性蛋白)按照2-3-2里所述的方法对小鼠血管平滑肌细胞MOVAS进行Transwell小室实验。

对照组

与条件培养基的制作方法相同，但不添加红景天苷，而是添加与红景天苷同等体积的PBS。用所获得的对照培养基(该对照培养基里包含了由骨骼肌细胞在未受到的刺激的情况下分泌的分泌性蛋白)按照2-3-2里所述的方法对小鼠血管平滑肌细胞MOVAS进行Transwell小室实验。

将条件培养基处理和对照组的实验结果示于图5。

图5表明，经红景天苷刺激的骨骼肌细胞所分泌的分泌性蛋白质能够促进血管平滑肌细胞的迁移。结合上述含红景天苷的培养基对于血管平滑肌细胞的迁移没有促进作用的结果，我们认为，本实验中，血管平滑肌细胞的迁移之所以受到促进，是由于骨骼肌细胞受到红景天苷刺激后将分泌性蛋白分泌到培养基中，该分泌性蛋白起到了骨骼肌细胞-血管平滑肌细胞间的细胞通讯的作用，从而实现的。另外已知的是，血管平滑肌细胞的迁移对形成功能性的成熟血管非常重要。

2-3-4分泌性蛋白的确认

利用上述的条件培养基培养血管平滑肌细胞MOVAS，并在MOVAS的培养基里添加各个血管新生因子受体的抑制剂，对小鼠血管平滑肌细胞MOVAS的迁移情况进行确认。

结果示于图6。

由图6可知，红景天苷通过促进骨骼肌细胞与血管平滑肌细胞的由FGF2和PDGF-BB介导的细胞通讯促进血管平滑肌细胞的迁移，从而促进成熟血管的形成。

2-3-5红景天苷对于低氧下的骨骼肌细胞的凋亡的影响

凯基细胞凋亡PI染色试剂盒。货号：KGA214

将小鼠骨骼肌细胞C2C12种于6cm板中，每板种细胞10万，18小时后用PBS清洗，并更换为含有红景天苷的培养基(DMEM+10％FBS+Penicillin+Streptomycin+100μg/ml红景天苷)。继续培养24小时后去除培养基并用PBS清洗，换成不含红景天苷的培养基后在低氧条件下培养48小时。收集细胞后用细胞凋亡PI染色试剂盒(凯基，货号：KGA214)和流式细胞仪(FACS)检测细胞凋亡。具体步骤如下：

(1)用1xBufferA洗涤细胞一次(离心2000rpm,5min),收集细胞并将细胞浓度稀释到1x10⁶细胞/ml。

(2)细胞加9倍体积的70％乙醇，在-20℃固定12-14小时。

(3)离心收集细胞后用1xBufferA洗涤细胞除去乙醇，细胞重悬于500μLBufferA中。

(4)加入RNaseA,使其终浓度为0.25mg/ml，37℃反应30min。

(5)加入5μLPI，室温避光染色30min，然后利用流式细胞仪检测PI阳性细胞(凋亡细胞)。

发明人通过流式细胞仪检测PI阳性细胞数确认，低氧条件并未明显诱导骨骼肌细胞的凋亡，低氧条件下使用红景天苷的凋亡率与常氧条件下和低氧对照的凋亡率无显著差异。

结果示于图7。

2-3-6红景天苷调控血管新生的机理的推测。

通过上述各个实验，可以合理推测，红景天苷通过特异性抑制骨骼肌细胞中的PHD3的表达，从而促进了骨骼肌细胞在低氧条件下的多种血管新生因子的表达，还提高了骨骼肌细胞自身的迁移能力，这些因素使得骨骼肌细胞分泌出的血管新生因子增多，受其影响的范围增广；并且这些骨骼肌细胞分泌出的血管新生因子中的PDGF-BB和FGF2通过作用于血管平滑肌细胞上的各自的受体(本发明中也称为骨骼肌细胞-血管平滑肌细胞间的细胞通讯)而促进了对成熟血管形成起至关重要的作用的血管平滑肌细胞的迁移，最终实现了成熟血管的形成，从而获得了良好的下肢缺血性疾病的治疗效果。

Claims

1.一种PHD3的特异性抑制剂，所述抑制剂为红景天苷。

2.一种血管新生因子的表达和分泌的促进剂，所述促进剂为红景天苷。

3.一种治疗下肢缺血性疾病的药物，所述药物含有权利要求1的PHD3的特异性抑制剂或权利要求2的促进剂。

4.一种治疗下肢缺血性疾病的药物，所述药物含有红景天苷作为活性成分。

5.根据权利要求3或4的治疗下肢缺血性疾病的药物，所述药物进一步含有药用辅料。

6.一种血管平滑肌细胞迁移的促进剂，所述促进剂含有利用红景天苷刺激骨骼肌细胞而产生的分泌性蛋白。

7.一种骨骼肌细胞迁移的促进剂，所述促进剂为红景天苷。

8.红景天苷在制备治疗下肢缺血性疾病的药物中的用途。

9.红景天苷在制备PHD3的特异性抑制剂中的用途。

10.红景天苷在制备血管新生因子的表达和分泌的促进剂中的用途。