TW201615202A - 甲病毒在製備抗腫瘤藥物方面的應用 - Google Patents

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Abstract

本發明屬於生物醫藥領域，涉及甲病毒用於製備抗腫瘤之醫藥組合物的用途，其中所述的甲病毒為M1病毒或蓋塔病毒。本發明進一步地確定了對上述甲病毒治療敏感的特定腫瘤類型，從而為抗腫瘤用藥方案提供了更為安全有效的解決方案。

Description

甲病毒在製備抗腫瘤藥物方面的應用
本發明屬於生物醫藥領域，涉及一種甲病毒在製備抗腫瘤藥物方面的應用。
腫瘤源於正常細胞中基因和表觀遺傳學的積累變化，這種改變驅使正常細胞轉變為惡性腫瘤。這個複雜病理變化過程決定了不同腫瘤在發生、維持以及轉移中機制的多樣性。目前，手術切除、化療和放療是臨床治療腫瘤常用的方法。然而手術切除腫瘤易復發，且放、化療毒副作用大。
約15~20%人類的癌症與病毒感染有關，如B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)與肝癌、人類乳突病毒(HPV)與子宮頸癌等。
甲病毒屬病毒屬於披膜病毒科，是一類有包膜結構的單正鏈RNA病毒，主要透過節肢動物作為傳播媒介。29種甲病毒中有13種可引起人、畜疾病(David M.Knipe,Peter M.Howley,Chapter 23,Alphaviruses,Fields Virology 6th edition：651-685,2013)。
甲病毒委內瑞拉馬腦炎病毒可作為載體轉導樹突細胞治療腫瘤(Moran TP,Burgents JE,Long B,et al：‘Alphaviral vector-transduced dendritic cells are successful therapeutic vaccines against neu-overexpressing tumors in wild-type mice.’Vaccine 25：6604-6612,2007)。然而，這種病毒曾引起人類發熱、抽搐、流產甚至死亡，因此選擇性與安全性問題嚴重影響病毒在抗腫瘤治療中的應用。
本發明的目的在於提供一種安全有效的病毒抗腫瘤藥物。
本發明的進一步目的在於提供一種針對特定腫瘤類型的安全有效的病毒抗腫瘤藥物。
本發明的進一步目的在於針對特定的個體/腫瘤提供一種安全有效的病毒抗腫瘤藥物。
本發明的進一步目的在於提供一種有效的抗腫瘤用藥系統及用藥方法。
本發明的進一步目的在於提供一種更為有效的抗腫瘤藥物和腫瘤治療方法。
本發明透過以下技術方案實現上述目的。
本發明提供一甲病毒(Alphavirus)用於製備抗腫瘤之醫藥組合物的用途其中該甲病毒為一M1病毒或蓋塔病毒(Getah Virus)。
M1病毒(Alphavirus M1)屬於甲病毒屬，於1964年從中國海南島庫蚊屬(Culex)蚊蟲中分離得到(Li XD,et al,‘Isolation of Getah virus from mosquitos collected on Hainan Island,China,and results of a serosurvey’.Southeast Asian J Trop Med Public Health 23：730-734,1992.)。2008年M1病毒的全基因組序列被測定(Zhai YG,et al,‘Complete sequence characterization of isolates of Getah virus(genus Alphavirus,family Togaviridae)from China’.J Gen Virol 89：1446-1456,2008.)。M1病毒的獲取方式可選但不限於透過上述文獻方法獲得，或者透過以下生物寄存資訊獲得：寄存編號：CCTCC V201423；寄存時間：2014年7月17日；分類命名：Alphavirus M1；寄存單位：中國典型培養物保藏中心。
本發明研究者此前對M1病毒的研究結果顯示M1病毒對一些腫瘤細胞具有殺傷作用，例如對大鼠惡性膠質瘤細胞C6，人類惡性膠質瘤細胞U251和U-87；然而，對另外一些腫瘤細胞則不具備殺傷作用，例如人類惡性膠質瘤細胞T98G。這些研究並不能確定M1病毒是否具備有效抗腫瘤效果。
本發明進一步提供了該病毒所適用的腫瘤類型，以提高M1病毒作為抗腫瘤藥物時的治療有效性。
較佳地，本發明以M1病毒作為製備抗腫瘤藥物所適用的腫瘤類型包括一種或多種之肝癌、結直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、子宮頸癌、前列腺癌、膠質瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌、胃癌。
M1病毒對各種腫瘤細胞引起不同程度的細胞死亡。M1病毒處理腫瘤細胞48小時(病毒感染劑量(Multiplicity of infection，MOI)=10)，胰腺癌、鼻咽癌、前列腺癌和黑色素瘤細胞死亡率超過50%；結直腸癌(LoVo、HCT-8、SW620和SW480)、肝癌(Hep3B、Huh-7和Huh-6)、膀胱癌和乳腺癌細胞死亡率超過40%；膠質瘤、子宮頸癌、肺癌細胞死亡率超過30%；胃癌細胞死亡率超過20%。上述結果提示M1病毒作為抗腫瘤藥物效果最顯著的針對以下癌症類型：胰腺癌、鼻咽癌、前列腺癌和黑色素瘤； 其次為：結直腸癌、肝癌、膀胱癌和乳腺癌；再其次為：膠質瘤、宮頸癌、肺癌；而再進一步其次的為胃癌。
鑒於M1病毒屬於蓋塔相似病毒，其與蓋塔病毒同源性高達97.8%，本領域技術人員有理由認可，基於M1病毒的抗腫瘤效果，蓋塔病毒也可類似地與M1病毒起到相似的作用和效果。
進一步地，本發明提供了一種可以針對特定個體/腫瘤更為準確有效地給予治療方案和治療藥物的方法，以及針對特定個體/腫瘤相關的藥物。
所述的病毒適合用於治療ZAP低表現腫瘤或ZAP陰性腫瘤，較佳地可用於治療ZAP低表現的實體瘤或ZAP陰性的實體瘤。
M1病毒治療腫瘤的有效性與腫瘤ZAP表達調控密切相關。M1病毒的複製受到ZAP的抑制，並且ZAP在多種腫瘤中低表現或陰性，M1病毒可選擇性地治療ZAP低表現或ZAP陰性的腫瘤/個體。
ZAP是鋅指CCCH型抗病毒蛋白1縮寫，其英文名是Zinc finger CCCH-type antiviral protein 1，它由zc3hav1基因編碼。文獻報導細胞內ZAP透過誘導RNA降解和轉譯抑制的機制來抑制某些病毒的複製，比如伊波拉病毒和馬堡病毒，但ZAP對其他病毒複製無抑制作用，例如水皰疹性口炎病毒、脊髓灰質炎病毒和黃熱病病毒等。
M1病毒能夠顯著在ZAP低表現/ZAP陰性的細胞株中引起細胞死亡，M1病毒在荷瘤動物體內富集於ZAP低表現/ZAP陰性的腫瘤組織，並抑制腫瘤生長，同時M1病毒抑制ZAP低表現/ZAP陰性的人離體活腫瘤組織的存活。
發明人首次發現在多個不同種類腫瘤中，ZAP的表現量在腫瘤組織中低於癌旁非瘤組織。臨床多種腫瘤病理標本的免疫組織化學分析表明，在69%的肝癌、52%的結直腸癌和61%的膀胱癌組織中ZAP表現水準顯著低於相對應的癌旁非瘤組織。M1病毒可用於選擇性治療ZAP低表現/ZAP陰性的腫瘤。
發明人的實驗結果首次證明M1病毒的複製受到ZAP抑制，ZAP表現水準是M1病毒選擇性引起腫瘤細胞死亡和抑制腫瘤生長的決定因素。發明人的研究顯示M1病毒抗腫瘤效果與ZAP的表現水準直接相關。發明人發現，減弱(knockdown)ZAP後的腫瘤細胞感染M1病毒，腫瘤細胞存活率較未敲低ZAP的細胞顯著降低。因此，作為一種可選的優選治療方案，可以在給予癌症患者M1病毒治療時，同時或預先給予ZAP抑制劑，以提高腫瘤對M1病毒的敏感性。
因此，為了進一步提高M1病毒作為抗腫瘤藥物治療的有效率，在治療方案的選擇中，可以首先判斷患者腫瘤的ZAP表現情況，再針對性地給予M1病毒的治療方案，以此來提高治療方案的有效性，避免無效給藥所造成的時間拖延和藥物濫用。例如，在給藥前先測定患者腫瘤ZAP表現情況，如果是ZAP低表現或ZAP陰性的腫瘤，可直接給以M1病毒治療；如果是ZAP正常表現/ZAP高表達腫瘤，則可在M1病毒給藥前或同時給予ZAP抑制劑(例如ZAP表現或功能抑制劑、ZAP干擾片段、或者ZAP抗體等)，以提高腫瘤對M1病毒的敏感性，提高治療有效性。腫瘤的ZAP表現量之高低直接影響到M1治療的有效性。ZAP表現量越低的腫瘤越有利於M1的治療效果。判斷某個體/腫瘤是否適於利用M1進行治療，可先檢測腫瘤ZAP的表 現量。判斷ZAP表現量高低的方法可以優選但不限於以下方式：ZAP低或高表達是指比較兩組(個)樣本之間ZAP mRNA或者蛋白質數量之後得出的結論；如果一組(個)樣本比另外一組(個)ZAP mRNA或者蛋白質數量少或多，則稱為該樣本ZAP低或高表現。ZAP陰性是指一樣本完全不表達ZAP mRNA或蛋白。用於比較ZAP mRNA和蛋白質數量的樣本可以是腫瘤細胞和正常細胞、腫瘤組織與癌旁非瘤組織，或者M1治療有效與無效的腫瘤。
作為一種可選的方式，腫瘤的ZAP高、低或陰性表達均指腫瘤組織與相應癌旁非瘤組織比較，ZAP mRNA和蛋白質的數量多、少或者無表達。若前者的ZAP mRNA或蛋白質均一化表現量比後者少(即腫瘤組織較癌旁非瘤組織的ZAP均一化表現量比值<1)，則屬於ZAP低表達，適用於M1進行治療。更為有效的治療對象之條件為腫瘤組織較癌旁非瘤組織的ZAP均一化表現量比值<0.8的腫瘤，較佳的<0.6，較佳的<0.4，較佳的<0.3，較佳的<0.2，較佳的<0.1，最佳的是ZAP陰性腫瘤組織。這些腫瘤組織與相應癌旁非瘤組織包括但不限於病理穿刺手術或外科切除手術來源組織樣本。臨床調查發現，在有些腫瘤組織中ZAP表達量甚至高於癌旁非瘤組織，這些腫瘤或腫瘤患者將不適宜直接利用M1進行治療。
ZAP mRNA或蛋白檢測方法包括但不限於QRT-PCR、Northern Blot、Western Blot、免疫組織化學、ELISA等。為準確判定不同樣本之間ZAP mRNA或蛋白數量的差異，首先計算出每一個樣本ZAP mRNA或蛋白的均一化表現量。均一化表現量是指每個樣本的ZAP mRNA或蛋白質表現值和樣本內參mRNA或蛋白質表現值相除，進行均一化處理得 出該樣本ZAP均一化表現量。在不同檢測方法中內參可以不同，其共同特徵是在不同細胞或組織樣本中內參表現量一致，這樣經過均一化處理的不同樣本的ZAP表現量才具備可比性，用於判斷樣本之間ZAP mRNA或蛋白的數量差異。
在本發明的一個示範性實施例中(圖4)，M1病毒對人離體培養的活肝癌組織和結直腸癌組織具有不同的抑制生長效果(表2和表3)，腫瘤生長抑制率超過10%的樣本合計達到32例，而腫瘤生長抑制率小於等於10%的有19例。進一步透過QRT-PCR方法分析這兩組每個腫瘤組織中ZAP和內參mRNA的表現水準(各自2-Ct值)，用每個樣本的2-Ct-ZAP除以2-Ct-內參獲得各自ZAP均一化表現量。對上述兩組樣本的ZAP均一化表達量統計分析發現，抑制率超過10%樣品組的ZAP均一化表達量為0.117±0.890，低於抑制率小於等於10%組(0.791±0.108)，二者均數比值為0.148。
作為另一種可選的方式，腫瘤的ZAP高、低或陰性表現係指腫瘤細胞(例如來源於腫瘤患者的培養腫瘤細胞)與正常細胞比較，ZAP mRNA和蛋白質的數量多、少或者無表現。若前者的ZAP的mRNA或蛋白質均一化表現量比後者少(即腫瘤細胞較正常細胞的ZAP均一化表現量比值<1)，則屬於ZAP低表現，適於利用M1進行治療。更為有效的治療物件為腫瘤細胞較正常細胞的ZAP均一化表現量比值<0.8的腫瘤，較佳的<0.6，較佳的<0.4，較佳的<0.3，較佳的<0.2，較佳的<0.1，最佳的是ZAP陰性腫瘤細胞。
在本發明的一個示範性實施例中(圖3c)，運用Western Blot方法測定HepG2肝癌細胞株和L-02正常肝細胞株的ZAP蛋白表現水準之差 異，同時測定β-actin作為不同樣本之間表現量一致的標準參照。Western blot檢測條帶的灰度代表被檢測分子的數量，ZAP均一化蛋白表現量=ZAP條帶灰度平均值/β-actin條帶灰度平均值。HepG2的ZAP均一化蛋白表現量與L-02的比值為0.8，其係代表ZAP在Hep G2為低表現。在感染M1病毒後，Hep G2細胞存活率只有70.4%±3.5%，而同樣處理的L-02存活率達100.3±10.0%，二者存活率差異具統計意義。
在另一個示範性實施例中(圖3a和圖3b)，在透過QRT-PCR和Western blot檢測T24、SCaBER、LoVo和Hep3B腫瘤細胞株後，無論是ZAP mRNA(圖3a)還是ZAP蛋白質(圖3b)，分別與各自內參比較後的均一化表現量為未檢出或接近於0(<0.1)，即ZAP表現為陰性或接近陰性(<0.1)；M1感染這些腫瘤細胞後引起細胞死亡，細胞存活率分別顯著下降到21.1%(T24)、11.5%(SCaBER)、6.9%(LoVo)和3.8%(Hep3B)(表1)。而圖3a和圖3b中的正常細胞L-02和HEB，無論是ZAP mRNA(圖3a)還是ZAP蛋白質(圖3b)的均一化表現量與上述腫瘤細胞的比值大於1，屬於ZAP高度表現，在M1感染後沒有明顯引起這些正常細胞存活率下降，L-02的細胞存活率為100.3%，HEB的細胞存活率為98.8%(表1)。
由此，本發明同時提供了一種抗腫瘤用藥系統，其特徵在於包括ZAP表現量水準檢測試劑，以及甲病毒；所述的甲病毒為M1病毒或蓋塔病毒。該系統透過先檢測患者腫瘤的ZAP表現水準，再針對性地採取合適的給藥方案。
同時，本發明還提供了一種抗腫瘤之醫藥組合物，其包括甲病毒和ZAP抑制劑；所述甲病毒為M1病毒或蓋塔病毒。所述的ZAP抑制劑 為ZAP表現或功能抑制劑、ZAP干擾片段或者ZAP抗體等。
為了避免M1病毒同時對正常細胞的殺傷作用，較佳地，所給予的ZAP抑制劑針對性地給予或靶向於腫瘤組織，為腫瘤標靶性ZAP抑制劑。
作為可選的實施方案，本發明所提供的抗腫瘤之醫藥組合物之劑型可以是注射劑、片劑、膠囊、貼劑等。作為優選的實施方案，本發明的抗腫瘤藥物之劑型為注射劑；較佳的，可採用靜脈注射。
作為可選的給藥方式，本發明M1病毒可以透過靜脈或瘤內注射方式給藥。瘤內注射方式為每天給予2×105PFU/kg至2×109PFU/kg；以靜脈注射的方式為每天給予2×106PFU/kg至2×1010PFU/kg。與溶劑對照組相比，M1病毒組顯著抑制了腫瘤的生長。
與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：本發明所提供的抗腫瘤藥物，可用於治療多種腫瘤，包括肝癌、結直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、子宮頸癌、前列腺癌、膠質瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌、胃癌。細胞學實驗證明M1病毒可引起多種腫瘤細胞的死亡；動物實驗證明M1病毒在體內顯著抑制肝癌、結直腸癌的生長；在人離體活腫瘤組織培養實驗證明M1病毒顯著抑制肝癌、結直腸癌組織存活。
本發明所提供的抗腫瘤藥物，可優先的治療ZAP低表現/ZAP陰性腫瘤，包括但不限於肝癌、結直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、子宮頸癌、前列腺癌、膠質瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌、胃癌。
本發明所提供的抗腫瘤之醫藥組合物，具有選擇性抗腫瘤作用，安全性良好。M1病毒能選擇性引起腫瘤細胞死亡，而對正常細胞的存 活無影響，表示M1病毒具有腫瘤細胞選擇性。在荷瘤裸鼠體內，經尾靜脈注射的M1病毒能高度富集於腫瘤組織，而在正常組織內病毒量較低，二者病毒量相差約102~106倍，因此進一步闡明了M1病毒的腫瘤選擇性。同時給予M1病毒並不影響裸鼠體重和精神狀態，表示M1病毒的安全性良好。
本發明首次針對特定的個體/腫瘤提供安全有效的病毒抗腫瘤藥物。本發明藥物選擇性地治療ZAP低表現/ZAP陰性的腫瘤，由此提高了用藥效率，防止無效給藥和藥物濫用。
本發明提供了更為有效的用藥方法和用藥系統，透過先檢測患者腫瘤的ZAP表現水準，再針對性地給予藥物治療，或者輔以其他手段給予治療，可以提高M1病毒的治療針對性和有效性。
本發明提供了更為有效的抗腫瘤藥物和腫瘤治療方法，在給藥前或給藥同時，輔以ZAP抑制劑，從而可以提高了腫瘤對藥物的敏感性。
圖1為M1病毒顯著引起腫瘤細胞病變效應；a)M1病毒感染引起腫瘤細胞形態學病變；b)M1病毒感染對正常細胞株形態學沒有影響；Control表示OptiPROTMSFM培養基對照組，M1表示M1病毒感染實驗組。
圖2為M1病毒有效抑制荷瘤鼠的腫瘤生長；a)M1病毒瘤內注射後對Hep3B荷瘤鼠腫瘤體積與動物體重的影響，M1表示M1病毒處理組，溶劑表示OptiPROTMSFM培養基溶劑對照組，n=9；b)M1病毒瘤內注射後對LoVo荷瘤鼠腫瘤體積與動物體重的影響，n=11；c)M1病毒靜脈注射後對Hep3B荷瘤鼠腫瘤體積與動物體重的影響，n=9；d)QRT-PCR檢測 靜脈注射M1病毒後在Hep3B荷瘤鼠的組織分佈，n=6；腫瘤體積與體重資料以平均值±標準差表示，ANOVA法統計；箭頭或方形表示M1病毒處理組，圓圈表示OptiPROTMSFM培養基對照組，ns表示無統計學差異；i.t表示瘤內注射，i.v表示靜脈注射；*表示未檢測到M1病毒的mRNA表現。
圖3為M1病毒選擇性引起ZAP低表現/ZAP陰性腫瘤細胞的死亡；a)ZAP mRNA表現量在不同細胞中的差異表現；ND表示未檢測到ZAP的mRNA表現；b)ZAP的蛋白表現量在不同細胞中的差異表現；β-actin是內參；c)細胞ZAP蛋白水準與M1病毒感染引起的細胞存活率改變。β-actin是內參，students’t檢驗統計分析，**P<0.01；d)M1病毒顯著引起減弱ZAP水準後的正常細胞L-02、腫瘤細胞PLC和HCT116死亡。空心圓/空心三角/空心倒三角表示干擾減弱ZAP，實心圓/實心三角/實心倒三角表示亂碼干擾陰性對照，採用students’t檢驗統計分析，*/#/&表示P<0.05，& &表示P<0.01，ns表示無統計學差異；e)在減弱ZAP的正常細胞L-02、腫瘤細胞PLC和HCT116中M1病毒相對滴度增加，採用students’t檢驗統計分析，*表示P<0.05；f)在減弱ZAP的正常細胞L-02、腫瘤細胞PLC和HCT116中M1病毒RNA表現增加，採用students’t檢驗統計分析，*表示P<0.05，**表示P<0.01；g)在減弱ZAP的正常細胞L-02、腫瘤細胞PLC和HCT116中M1病毒蛋白NS3，E1表現增加，GAPDH作為內參；h)過度表現ZAP部分阻斷由M1病毒引起的腫瘤細胞死亡，採用students’t檢驗統計分析，#表示P<0.05，ns表示無統計學差異；i)過度表現ZAP的腫瘤細胞中病毒M1病毒相對滴度減少，採用students’t檢驗統計分析，**表示P<0.01；j)過度表現ZAP的腫瘤細胞中病毒M1病毒的RNA減少，採用students’t檢驗統計分析，**表 示P<0.01；k)過表現ZAP的腫瘤細胞中，M1病毒的蛋白NS3，E1表現量增加，β-actin作為內參。
圖4為M1病毒對人離體活腫瘤組織抑制率與ZAP mRNA表現水準負相關；QRT-PCR檢測ZAP的mRNA表現，比較M1病毒無效組(抑制率10%)與M1病毒有效組(抑制率>10%)之ZAP相對表現量的差別，M1病毒處理抑制率小於等於10%的腫瘤組織ZAP均一化表現量中位數是0.414，大於10%的腫瘤組織ZAP表現量中位數為0.075。採用秩和檢驗統計分析，P<0.05。
圖5為ZAP在多種腫瘤臨床病理組織中低表現；a)免疫組織化學染色檢測臨床腫瘤病理組織中ZAP的表現情況，N：癌旁非瘤組，T：腫瘤組；b)在多種腫瘤臨床病理組織中，腫瘤組ZAP表現顯著低於癌旁非瘤組，N：癌旁非瘤組，T：腫瘤組；N與T秩和檢驗進行統計分析，*** P<0.001；c)在多種腫瘤臨床病理組織中，腫瘤組織ZAP表現量低於癌旁非瘤組織的病例比率。
以下實施方式是對本發明作進一步說明，但本發明的實施方式不侷限於以下的實施例介紹，凡依照本發明的原理或理念所作的等同的變化或變通都應視為本發明保護的範疇。在沒有特別指明的情況下，本發明採用的材料及實驗方法為常規材料及方法。
實施例1 M1病毒選擇性引起腫瘤細胞死亡
M1病毒顯著引起腫瘤細胞形態學病變
材料：肝癌細胞株Hep3B、人膀胱移行細胞癌T24、人結直腸癌細胞株LoVo、人不死化正常肝細胞株L-02、M1病毒、高糖DMEM培養基、F-12培養基、倒置相差顯微鏡。
方法：a)細胞的培養：將人肝細胞癌細胞株Hep3B，人膀胱移行上皮細胞癌細胞株T24、人不死化正常肝細胞株L-02，培養生長在含10%FBS、100U/ml青黴素及0.1mg/ml鏈黴素的DMEM完全培養基中；人結直腸癌細胞株LoVo培養生長在含10% FBS、100U/ml青黴素及0.1mg/ml鏈黴素的F-12完全培養基中。所有細胞株均置於5% CO2、37℃恆溫密閉式孵箱(相對濕度95%)內培養傳代，利用倒置顯微鏡觀察生長情況。大約2~3天傳代一次，取處於對數生長期的細胞用於正式實驗。
b)細胞顯微鏡下觀察：選擇對數生長期細胞，DMEM或F-12完全培養液(含10%胎牛血清、1%雙抗)製成細胞懸液，細胞以2.5×104/孔的密度接種在24孔培養板內。用M1病毒(MOI=1)感染48小時後，在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態學的變化。
結果：在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態，Hep3B細胞、T24細胞和LoVo細胞均是單層貼壁生長，並且細胞緊密排列，表型一致。而M1病毒(MOI=1)處理48h後，細胞的形態發生了明顯改變，較對照組細胞，感染病毒組的細胞數目明顯減少，胞體收縮成球狀，折光率明顯增強，呈死亡病變樣，如圖1a。如圖1b顯示了M1病毒的感染對正常細胞的影響，採用同樣滴度的M1病毒感染L-02細胞，沒有發現細胞數目及形態有明顯的變化。結果表明M1病毒對腫瘤細胞有選擇性引起細胞死亡，而對正常細胞存活沒有影響。
M1病毒選擇性地降低腫瘤細胞株存活
材料：34株腫瘤細胞株(見表1)、3株人不死化正常細胞株(見表1)、M1病毒、高糖DMEM培養基、F-12培養基、MTT(四甲基偶氮唑藍)。
方法：a)接種細胞、給藥處理：選擇對數生長期細胞，DMEM(或F-12)完全培養液(含10%胎牛血清、1%雙抗)製成細胞懸液，以每孔4×103/孔的密度接種在96孔培養板內。12小時後見細胞完全貼壁，實驗分實驗組和對照組，實驗組：M1病毒(MOI=10)感染細胞；對照組：高糖DMEM溶劑對照組，兩組均設5個複孔。
b)MTT與細胞內的琥珀酸脫氫酶反應：培養至48h時，每孔加入MTT 15μl(5mg/ml)，繼續孵育4小時，此時鏡檢可觀察到活細胞內形成的顆粒狀藍紫色甲臢(formazan)結晶。
c)溶解甲臢顆粒：小心吸去上清，加DMSO 100μl/孔溶解形成的結晶，在微型振盪器上震盪5分鐘，然後在酵素結合免疫吸附分析儀(ELISA)上用波長570nm檢測各孔的光密度(OD值)。每組實驗重複3次。細胞存活率=藥物處理組OD值/對照組OD值×100%。
結果：如表1所示，M1病毒(MOI=10)處理腫瘤細胞48小時後，胰腺癌、鼻咽癌、前列腺癌和黑色素瘤細胞死亡率超過50%；結直腸癌(LoVo、HCT-8、SW620和SW480)、肝癌(Hep3B、Huh-7和Huh-6)、膀胱癌和乳腺癌細胞死亡率超過40%；膠質瘤、子宮頸癌、肺癌細胞死亡率超過30%；胃癌細胞死亡率超過20%。而3株正常細胞(L-02、HEB和SV-HUC-1)以及PLC和HCT116細胞存活率沒有統計學顯著變化。結果表 明M1病毒的感染可選擇性地引起大部分腫瘤細胞死亡。
(附：**p<0.01,*p<0.05,ns：差異不具有統計學意義；統計方法：students’t檢驗，-：未統計。)
實施例2 M1病毒選擇性有效抑制腫瘤生長
在荷瘤鼠體內M1病毒有效抑制腫瘤生長
材料：M1病毒、人肝癌細胞株Hep3B、人結直腸癌細胞株LoVo、58隻4周齡雌性BALB/c裸鼠。
方法：a)荷瘤鼠模型建立：將5×106 Hep3B或者LoVo細胞注入到4周齡BALB/c裸鼠背側皮下。
B)瘤內給藥：當Hep3B腫瘤體積達到約50mm3或LoVo腫瘤體積達到約70mm3時，開始瘤內注射給藥，12天內共注射6次(2×106PFU/次)M1病毒，OptiPROTMSFM培養基注射為溶劑對照組。每兩天測量腫瘤的長寬和裸鼠體重，腫瘤體積計算公式：長×寬2/2。
C)靜脈給藥：當Hep3B細胞腫瘤體積達到約50mm3時，靜脈注射M1病毒(3×107PFU/次)，隔三天後，接受第二次靜脈注射。OptiPROTMSFM培養基注射為溶劑對照組。每三天測量體重和腫瘤的長寬，腫瘤體積計算公式：長×寬2/2。
結果：在BALB/c裸鼠上建立了皮下荷瘤Hep3B(圖2a和2c)和LoVo(圖2b)裸鼠模型後，連續多次瘤內(圖2a和圖2b)或靜脈注射(圖2c)給予M1病毒，觀察裸鼠腫瘤體積與動物體重變化狀況。如圖2a，在Hep3B裸鼠模型中，採用瘤內注射給藥方式，第20天終止實驗，溶劑對照組腫瘤體積平均值為0.368±0.051cm3，M1病毒組腫瘤體積平均值為0.172±0.058cm3，統計表明M1病毒顯著抑制Hep3B荷瘤鼠腫瘤生長，並且M1病毒組裸鼠平均體重(16.4±1.54g)與對照組裸鼠平均體重(17.0±1.16g)比較無顯著差異，且精神狀態良好，表明M1病毒安全性良好。如圖2b，在LoVo裸鼠 模型中，採用瘤內給藥方式，第24天終止實驗，對照組腫瘤體積平均值為0.546±0.087cm3，M1病毒組腫瘤體積平均值為0.389±0.049cm3，統計表明M1病毒顯著抑制LoVo荷瘤鼠腫瘤生長，並且M1病毒組裸鼠平均體重(18.9±1.40g)與對照組裸鼠平均體重(19.4±1.86g)相比，無顯著差異，且精神狀態良好，表明M1病毒安全性良好。如圖2c，在Hep3B裸鼠模型中，採用靜脈注射給藥方式，第21天終止實驗，對照組腫瘤平均體積為0.247±0.067cm3，M1病毒組腫瘤平均體積為0.134±0.057cm3，統計表明M1病毒顯著抑制Hep3B荷瘤鼠腫瘤生長，並且M1病毒組裸鼠平均體重(17.2±2.50g)與對照組平均裸鼠體重(17.5±2.16g)相比，無顯著差異，且精神狀態良好，表明M1病毒安全性良好。
M1病毒選擇性地富集於腫瘤組織
材料：24隻4周齡雌性BALB/c裸鼠、肝癌細胞株Hep3B、Trizol試劑、組織均質機、即時螢光定量PCR儀。β-actin引子：有義鏈(SEQ ID No.1：GATCATTGCTCCTCCTGAGC)；反義鏈(SEQ ID No.2：ACTCCTGCTTGCTGATCCAC)。M1病毒非結構蛋白NS1(Non-Structure 1)引子：有義鏈(SEQ ID No.3：GTTCCAACAGGCGTCACCATC)；反義鏈(SEQ ID No.4：ACACATTCTTGTCTAGCACAGTCC)。
方法：向4周齡的裸鼠背側皮下注入5×106 Hep3B細胞。4天後，每隻小鼠尾靜脈注入M1病毒(3×107PFU)。給藥後分別於第1、2、3以及4天犧牲裸鼠，收集組織樣品(包括腫瘤、心、肝、脾、肺、腎、腦、肌肉)，並抽取組織RNA。然後用QRT-PCR的方法檢測M1病毒的量，以檢測M1病毒非結構蛋白NS1代表M1病毒量，同時檢測β-actin內參，相對M1 病毒RNA量按照公式計算：，其中、來自Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System儀器讀數。
結果：如圖2d所示，在裸鼠皮下Hep3B腫瘤模型體中，在4個不同時間點上M1病毒在腫瘤組織內的數量超過其他器官組織102~106倍以上，說明M1病毒選擇性地富集於腫瘤組織。
實施例3 M1病毒選擇性引起ZAP低表現/ZAP陰性腫瘤細胞死亡
M1病毒選擇性引起ZAP低表現的腫瘤細胞死亡，而對正常細胞無影響，故ZAP的表現水準是M1病毒選擇性的決定性因素。在正常細胞和ZAP正常表現/高表現的腫瘤細胞中透過干擾RNA來減弱ZAP的表現量後，M1病毒能夠顯著地引起細胞死亡。同時，在ZAP低表現的腫瘤細胞中透過表現ZAP能部分阻斷由M1病毒引起的腫瘤細胞死亡。
M1病毒不引起ZAP表現量高的正常細胞和腫瘤細胞死亡
材料：M1病毒、人肝細胞L-02、人膠質細胞HEB、人膀胱癌細胞SCaBER及T24、人肝癌細胞株Hep3B和PLC、人肝癌細胞株Hep G2、人結直腸癌細胞株LoVo和HCT116；
Western blot：細胞總蛋白抽取液(M-PER® Mammalian Protein Extraction Reagent，Thermo)、ZAP抗體(Thermo，USA)、β-actin抗體(Neomarker，USA)；抽取RNA、PCR：RNA抽取試劑Trizol、即時定量PCR儀(Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System(Life，USA))、ZAP引子：ZAP有義鏈(SEQ ID No.5：TCACGAACTCTCTGGACTGAA)；ZAP反義鏈(SEQ ID No.6：ACTTTTGCATATCTCGGGCATAA)、β-actin引子同實施例2。
方法：選擇對數生長期細胞，DMEM或F-12完全培養液(含10%的胎牛血清、1%的雙抗)製成細胞懸液，細胞以2×105/皿的密度接種在35mm皿內。提取RNA，PCR檢測細胞中ZAP mRNA表現量，本實驗內參為β-actin。ZAP mRNA均一化表現量計算按照公式進行：ZAP均一化mRNA表現量=，其中、來自Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System儀器讀數，表示PCR擴增過程中，螢光信號開始由本底進入指數增長階段的閾值所對應的迴圈次數。
抽取細胞總蛋白、定量，進行Western Blot實驗(電泳、轉膜、封閉、孵育一抗和二抗、顯影)。通過成像儀軟體Image Lab對ZAP和內參β-actin條帶灰度掃描，檢測條帶灰度，計算ZAP均一化蛋白表現量按照以下公式進行：ZAP均一化蛋白表現量=ZAP條帶灰度/內參條帶灰度。試驗重複3次，取平均值計算ZAP均一化蛋白表現量。
結果：如圖3a和3b所示，ZAP在腫瘤細胞SCaBER、T24、Hep3B和LoVo中mRNA(圖3a)和蛋白(圖3b)均一化表現量幾乎檢測不到，顯著低於正常細胞(L-02和HEB)以及腫瘤細胞(PLC、HCT116)。
M1病毒引起ZAP低表現/陰性的腫瘤細胞死亡，但不導致ZAP高表現的細胞死亡。正常細胞(L-02和HEB)和部分腫瘤細胞(PLC、HCT116)在感染M1病毒後存活率沒有統計學意義的改變，L-02細胞存活率為100.3%，HEB細胞存活率為98.8%(表1)。而腫瘤細胞SCaBER、T24、Hep3B和LoVo在感染M1病毒後，細胞存活率顯著下降到21.1%(T24)、11.5%(SCaBER)、6.9%(LoVo)和3.8%(Hep3B)(表1)。
如圖3c和表1所示，Hep G2肝癌細胞ZAP蛋白均一化表 現量低於L-02正常細胞，比值為0.8。L-02細胞感染M1病毒後存活率並無明顯改變，而Hep G2細胞在感染M1病毒後存活率降低到70.4%，二者具有統計學差異。這進一步說明M1病毒選擇性導致ZAP低表現的腫瘤細胞死亡。
M1病毒顯著引起減弱ZAP水準後的正常細胞和腫瘤細胞死亡
材料：M1病毒、人肝細胞L-02、人肝癌細胞PLC、人結直腸癌細胞HCT116、ZAP RNA干擾片段、MTT(甲基偶氮唑藍)、轉染試劑(LipofectamineTM)、RNAiMAX(invertrogen，USA)
Western blot：細胞總蛋白抽取液(M-PER® Mammalian Protein Extraction Reagent，Thermo)、ZAP抗體(Thermo，USA)、M1病毒NS3抗體(Beijing Protein Innovation)、M1病毒E1抗體(Beijing Protein Innovation)、GAPDH抗體(CST，USA)；抽取RNA、PCR：Trizol、即時定量PCR儀(Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System)、β-actin及M1病毒非結構蛋白NS1的引子同實施例2；ZAP干擾片段(Si RNA)設計針對靶序列(SEQ ID No.7：5’CCAAGAGTAGCACTTGTTA3’)、Si RNA有義鏈(SEQ ID No.8：5’CCAAGAGUAGCACUUGUUA dTdT 3’)、Si RNA反義鏈(SEQ ID No.9：3’dTdT GGUUCUCAUCGUGAACAAU 5’)；ZAP亂碼干擾片段對照(siNC)：有義鏈和反義鏈的核苷酸比例與Si RNA片段一樣但是排列順序完全隨機。
方法：選擇對數生長期細胞，DMEM完全培養液(10%胎牛血清、1%雙抗)製成細胞懸液，細胞以1×105/孔的密度接種在6孔板內。24小時後，加入RNAiMAX包裹的Si RNA片段。48小時後，感染M1病毒。感染48小時後，處理樣本。
每孔加入MTT 20μl(5mg/ml)，4小時後檢測吸光度值，計算細胞存活率，siZAP實驗組以ZAP RNA干擾片段處理，siNC對照組以ZAP亂碼干擾片段處理。
a)收集細胞上清液，用TCID50的方法檢測病毒滴度。
b)抽取RNA樣本，PCR，透過檢查M1病毒非結構蛋白NS1量來檢測M1病毒量，β-actin為內參。
c)抽取蛋白質樣本，Western blot檢測ZAP蛋白表現量和M1病毒蛋白NS3和E1，內參是GAPDH，ZAP均一化表現量計算除內參GAPDH代替β-actin外，其他同【0072】。
d)試驗重複3次，資料以平均值±標準差表示；與各自對照組比較進行students’t檢驗統計，*/#/&表示P<0.05，**/& &表示P<0.01，ns表示無統計學差異。
結果：如圖3d-3g所示，以ZAP RNA干擾片段處理人正常肝細胞L-02、人肝癌細胞PLC和人結直腸癌細胞HCT116後，ZAP蛋白表現量顯著下降至檢測不到(圖3g)，而M1病毒蛋白NS3和E1蛋白明顯增加；在感染M1病毒(MOI=100)後，顯著引起減弱ZAP水準後的L-02細胞(siZAP組)，存活率降低為69.7%±3.45%，PLC細胞存活率降低為63.9%±11.5%，HCT116細胞存活率降低為49.6%±1.21%(圖3d)；如圖3e 所示，在感染M1病毒48小時後減弱ZAP(siZAP組)的L-02細胞中相對M1病毒滴度為相應siNC組的4.10±1.38倍，HCT116細胞(siZAP組)為相應siNC組的3.39±1.27倍，PLC細胞(siZAP組)為相應siNC組的32.6±2.34倍。同時如圖3f所示，在感染M1病毒48小時後減弱ZAP(siZAP組)的L-02細胞中M1病毒RNA表現量是相應siNC組的16.3±8.20倍，HCT116細胞中是相應siNC組的8.82±4.02倍，PLC細胞中是相應siNC組的30.5±12.23倍。以上結果表明M1病毒顯著引起減弱ZAP水準後的正常細胞和腫瘤細胞的死亡。
過表現ZAP拮抗M1病毒引起的腫瘤細胞死亡
材料：M1病毒、人肝癌細胞Hep3B、表現GFP的pReceiver-M02-GFP質粒(空白對照質粒，廣州複能基因)、表現ZAP的pReceiver-M02-ZAP質粒(過表現ZAP質粒)、FuGENE HD轉染試劑、MTT(甲基偶氮唑藍)
抽取RNA、PCR：Trizol、即時定量PCR儀(Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System)、β-actin及M1病毒非結構蛋白NS1引子同實施例2。
Western bolt：細胞總蛋白抽取液(M-PER® Mammalian Protein Extraction Reagent，Thermo)、ZAP抗體(Thermo，USA)、M1病毒NS3抗體(Beijing Protein Innovation)、M1病毒E1抗體(Beijing Protein Innovation)、GAPDH抗體(CST，USA)。
方法：選擇對數生長期細胞，DMEM完全培養液(10%的胎牛血清、1%的雙抗)調製成細胞懸液，細胞以1×105/孔的密度接種在6 孔板內。24小時後，分別轉染過表現GFP對照質粒和過表現ZAP質粒，獲得表現綠色螢光蛋白的細胞和ZAP過表現的細胞。48小時後，感染M1病毒。感染48小時後，處理樣本並檢測：a)MTT法檢測細胞存活率，每孔加入MTT 20μl(5mg/ml)，4小時後570nm波長檢測吸光度值，其他處理同實施例1。
b)收集細胞上清液，用TCID50的方法檢測病毒滴度。
c)抽取樣品總RNA樣本，QRT-PCR法檢測M1病毒RNA表現量，其計算按照實施例2方法進行。
d)收集蛋白質樣本，Western blot檢測ZAP蛋白表現量和M1病毒蛋白NS3、E1蛋白表現量，處理方法同實施例3之1)。
e)每次試驗均重複3次，資料以平均值±標準差表示。與各自對照組比較，採用students’t檢驗進行統計，#表示P<0.05，**表示P<0.01，ns表示差異不具有統計學意義。
結果：如圖3k所示，人肝癌細胞Hep3B轉染了ZAP過表現質粒後，透過Image Lab軟體對不同樣本的ZAP和內參β-actin條帶進行灰度掃描後計算各自ZAP均一化蛋白表現量。ZAP均一化蛋白表現量ZAP過表現組是1.61±0.05，過表現GFP對照組是0.03±0.01，均數前者是後者的53.7倍；M1病毒蛋白NS3和E1蛋白明顯增加。
如圖3h所示，過表現ZAP部分阻斷M1病毒感染引起的Hep3B細胞死亡。使用不同M1病毒滴度感染後48小時，當MOI=0.1時，過表現ZAP組細胞存活率均數為74.7%±8.94%，顯著高於過表現GFP對照組細胞存活率(59.0%±6.27%)；當MOI=1時，過表現ZAP組細胞存活率 均數為69.4%±6.95%，顯著高於過表現GFP對照組存活率(51.4%±5.31%)；當MOI=10時，過表現ZAP組細胞存活率均數為63.7%±6.04%，顯著高於過表現GFP對照組存活率(40.5%±3.19%)；如圖3i所示，感染M1病毒後過表現ZAP的Hep3B細胞中M1相對病毒滴度是相應過表現GFP對照組的31.5±11.6%。同時，感染M1病毒後過表現ZAP的Hep3B細胞中M1病毒RNA表現量是相應過表現GFP對照組的9.5±4.7%。
實施例4 M1病毒抑制ZAP低表現人離體活腫瘤組織(ex vivo)生長
材料：DMEM高糖培養基、TECIA(Tissue Culture-MTT Endpoint Computer Image Analysis Chemo-sensitivity Test)、β-actin和ZAP引子同【0072】。
方法：a)人離體活肝癌組織和結直腸癌組織培養
離體活組織由中山大學腫瘤防治中心手術切除獲得，保存於4℃，4小時內送實驗室進行藥物敏感性試驗，所有病例均經病理組織學檢查確診。在無菌條件下取出瘤組織，切成直徑0.5~1mm組織塊，放置於24孔培養板上，每孔4~6塊，每孔加入1ml DMEM培養基。培養1小時後，用藥敏試驗專用圖像分析儀攝取腫瘤組織塊的投射照明圖像，測定比較每孔瘤塊面積(area，A)，分析M1病毒對人離體活腫瘤組織的抑制作用。
b)藥物處理及組織活性測定
腫瘤組織在CO2細胞培養箱培養12小時，狀態穩定後，加入107PFU的M1病毒和陽性對照藥物5-氟尿嘧啶(5-Fu，10mg/L)，感染 96小時後，加入50μl的MTT(5mg/ml)/孔，培養3小時，再用藥敏試驗用藥敏試驗專用圖像分析儀攝取腫瘤組織塊的漫射光照明圖像，測定每孔瘤塊被甲臢藍染的面積和顯色程度(blue area，BA)，按下式計算組織存活率(survival fraction，SF)：
腫瘤組織抑制率(Cell inhibition，CI)：CI=(1-SF)×100%，BA藥物處理表示M1病毒/5-Fu處理組的藍染面積，A藥物處理表示M1病毒/5-Fu處理組的瘤塊面積，BA對照表示溶劑對照處理組的藍染面積，A對照表示溶劑對照處理組的瘤塊面積。
c)ZAP mRNA均一化表現量檢測
按照M1病毒對腫瘤抑制率10%為標準，將全部上述病例組織分為兩組，分別抽取樣本RNA，利用QRT-PCR法檢測ZAP mRNA、β-actin(內參)水準，比較兩者ZAP均一化表現量的差別，採用秩和檢驗統計分析；計算ZAP均一化表現量方法同【0072】。
結果：a)如表2所示，在肝癌組織中，抑制率超過10%的病例比例在M1病毒組為59.5%，高於5-Fu組的53.8%，證明M1病毒在有效率上高於目前臨床治療肝癌的藥物5-Fu。
b)如表3所示，在結直腸癌組織中，抑制率超過10%的病例比例在M1病毒組為71.4%，高於5-Fu組的61.5%，證明M1病毒在有效率上高於目前臨床治療結直腸癌的藥物5-Fu。
c)將上述M1病毒處理後的人離體活腫瘤組織按照抑制率10%為標準分為兩組，進一步分析這些組織中ZAP mRNA表現水準與抑制率的相關性。M1病毒處理抑制率超過10%的樣品組ZAP均一化表現量為0.117±0.890，低於抑制率小於等於10%組(0.791±0.108)，二者均數比值為0.148。如圖4所示，M1病毒處理抑制率小於等於10%的腫瘤組織ZAP均一化表現量中位數是0.414，大於10%的腫瘤組織ZAP表現量中位數為0.075。採用秩和檢驗的方法統計表明差異具有統計學意義，P<0.05，說明M1病毒能夠選擇性的引起ZAP低表現/ZAP陰性的腫瘤組織死亡。
實施例5 ZAP在多種腫瘤臨床病理組織中低表現
材料：來自506位元患者8張組織晶片(包括肝癌、結直腸癌、膀胱癌以及配對癌旁組織)、ZAP抗體(Thermo，USA)、APERIO全自動數位病理切片掃描器
結果：發明人應用組織免疫化學方法檢測了ZAP在人類多種腫瘤病理樣本表現情況，圖5a顯示了人肝癌、結直腸癌、膀胱癌病理組織樣本中ZAP的免疫組織化學染色代表性圖譜，ZAP染色在腫瘤組織中相對癌旁組織較淺。
如圖5b所示，對肝癌、結直腸癌、膀胱癌和各自相應癌旁非瘤組織ZAP蛋白均一化表現量的平均值進行統計分析，結果顯示在上述每種腫瘤組織中平均的ZAP蛋白均一化表現量顯著低於各自癌旁非瘤組織，ZAP在腫瘤組織中低表現。全部肝癌腫瘤組織的平均ZAP均一化表現量為5.83±8.49，顯著低於相應癌旁非瘤組織(11.8±11.5)，二者均值比值為0.494；全部結直腸癌腫瘤組織的平均ZAP均一化表現量為2.41±3.60，顯著低於相應癌旁非瘤組織(8.30±8.94)，二者均值比值為0.290；全部膀胱癌癌腫瘤組織的平均ZAP均一化表現量為2.93±4.63，低於癌旁非瘤組織(10.3±8.36)，二者均值比值為0.284；如圖5c顯示，在所分析全部肝癌病例中，ZAP低表現的病例數占69%；在所分析全部結直腸癌病例中，ZAP低表現的病例占52%；在所分析全部膀胱癌病例中，ZAP低表現的病例占61%。因此ZAP成為M1病毒抗腫瘤治療肝癌、結直腸癌以及膀胱癌的選擇性分子標記。
實施例6 M1病毒製備方法
材料：非洲綠猴腎細胞Vero、高糖DMEM培養基、OptiPROTMSFM培養基(1×)、M1病毒、100mm細胞培養皿、離心機。
方法：選擇對數生長期細胞，DMEM完全培養基(含10%胎牛血清、1%雙抗)製成細胞懸液，細胞接種在100mm細胞培養皿內。待細胞的融合度達到80%~90%時，換成OptiPROTMSFM培養基，再加入50μl(MOI=0.01)M1病毒感染。當細胞出現大面積病變(約36小時)，收集細胞上清。2000~3000RPM離心5min，小心吸出上清，混勻分裝，於-80℃冰箱保存。
上述實施例為本發明的示例性實施方式及效果說明，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均未脫離本發明的內容，都包含在本發明的保護範圍內。
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<170> PatentIn version 3.5
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Claims (11)

  1. 一種甲病毒(Alphavirus)用於製備抗腫瘤之醫藥組合物的用途，其中該甲病毒為一M1病毒或蓋塔病毒(Getah Virus)。
  2. 如請求項1之用途，其中該腫瘤為肝癌、結直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、子宮頸癌、前列腺癌、膠質瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌或胃癌。
  3. 如請求項1之用途，其中該腫瘤為ZAP(Zinc finger CCCH-type antiviral protein 1)低現量腫瘤或ZAP陰性腫瘤。
  4. 如請求項1之用途，其中該腫瘤為ZAP低表現量之實體瘤或ZAP陰性之實體瘤。
  5. 如請求項1之用途，其中該腫瘤為ZAP低現量或ZAP陰性的肝癌、結直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、子宮頸癌、前列腺癌、膠質瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌或胃癌。
  6. 如請求項1之用途，其中該醫藥組合物之劑型為注射劑、片劑、膠囊或貼劑。
  7. 如請求項6所述之用途，其中該劑型為注射劑。
  8. 一種抗腫瘤用藥系統，其包括一ZAP表現水準檢測試劑、及一甲病毒，其中該甲病毒為M1病毒或蓋塔病毒。
  9. 一種抗腫瘤之醫藥組合物，其包括一甲病毒和一ZAP抑制劑其中該甲病毒為M1病毒或蓋塔病毒。
  10. 如請求項9之醫藥組合物，其中該ZAP抑制劑為腫瘤標靶ZAP抑制劑。
  11. 一種ZAP抑制劑用於製備甲病毒抗腫瘤增敏劑/耐藥逆轉劑之用途，其中 該甲病毒為M1病毒或蓋塔病毒。
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