CN104258377A - Pik3c2a蛋白在治疗肝癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种PIK3C2A蛋白在治疗肝癌药物中的应用。本发明首先通过Real-time PCR和蛋白质免疫印迹法测定肝癌组织和肝癌细胞株中PIK3C2A mRNA和蛋白的表达量，然后运用免疫组化法比较肝癌组织和临近非瘤肝组织(adjacent nontumorous liver tissue，ANLT)中PIK3C2A染色程度的差别，并结合临床随访资料，采用Kaplan-meier生存分析、Log-rank检验、Spearman相关性分析和COX回归的单/多因素相关性分析等统计学方法，明确PIK3C2A的表达水平与肝癌病理特征和不良预后之间的关系。采用慢病毒转染技术下调PIK3C2A的表达，并通过一系列的体内外功能实验验证PIK3C2A对肝癌细胞生长和迁移运动的调控作用。

Description

PIK3C2A蛋白在治疗肝癌药物中的应用

技术领域

本发明涉及肝癌治疗领域，特别地，涉及一种PIK3C2A蛋白在治疗肝癌药物中的应用。

背景技术

肝细胞癌变在全球男性恶性肿瘤中位列第二位，在女性恶性肿瘤中位列第六位，是全球第三位的恶性肿瘤死因，中国每年死亡病例数约占全球因肝癌死亡病例总数的55％，因此肝癌已成为限制中国人民健康水平进一步提高的一大障碍。随着肝癌手术技术的发展，以往位于手术禁区的肝肿瘤也可安全地施行手术切除。因此，肝脏肿瘤的切除率得到了显著的提高，加之围手术期处理技术的进步，肝癌患者术后并发症发生率和死亡率已显著下降。此外，以索拉菲尼为代表的分子靶向药物的问世和各种化学药物治疗与生物治疗方法的发展，进一步降低了肝癌病人的死亡率。但是，针对肝癌患者的长期随访结果显示，肝癌患者远期生存水平仍然没有得到根本改观，肝癌病人五年生存率仅约40％到50％，肝癌病人术后五年的复发和转移率则高达70～80％。大量的临床资料显示，肝癌的高侵袭转移能力和术后高复发转移率是影响肝癌病人长期生存的重要因素。现有技术中仍然没有很好的方法与手段预防肝癌术后复发转移。

长期的科学研究表明，在肝癌的发生发展过程中很多细胞因子、癌基因和抑癌基因都会发生异常表达。目前针对肝癌分子机制的研究主要集中在肿瘤细胞的增殖、细胞膜上粘附因子的表达水平，细胞外多种多糖和蛋白的降解，肿瘤对血管和淋巴管的侵犯，细胞迁移和运动，诱导肿瘤血管新生生成等几个方面。目前的研究显示，在肿瘤发生和发展过程中细胞迁移与运动能力的提高是引起肿瘤侵犯周围组织和发生远处转移的关键因素。所以大量关于肿瘤调控机制的研究都侧重在肿瘤细胞的迁移和运动能力上。目前的研究仍远未阐明调控肝癌细胞运动侵袭能力的确切分子机制，所以难以开发出有效的抑制肝癌复发转移的药物，严重制约了肝癌病人长期生存率的进一步提高。

MacDougall LK等人1995年在果蝇中发现了三种不同的PI3Ks，分别为Class I PI3K、classII PI3K和class III PI3K。PIK3C2A属于class II PI3K，其基因定位在11p15.1。PIK3C2A蛋白由1686个氨基酸组成，分子大小为190.680KDa。PIK3C2A主要表达于上皮细胞，血管内皮细胞，平滑肌细胞等少数细胞上，PIK3C2A所编码蛋白主要位于这些细胞的网格蛋白有被小泡、内涵体、反面高尔基体管网状结构(TGN)上。前期的研究表明PIK3C2A在网格蛋白有被小泡的形成、胰岛素的释放和高血压血管内皮的收缩中发挥着重要作用。

发明内容

本发明目的在于提供一种PIK3C2A蛋白在治疗肝癌药物中的应用，以解决现有技术中肝癌患者术后肝癌细胞侵袭转移的技术问题。

为实现上述目的，本发明提供了一种PIK3C2A蛋白在治疗肝癌药物中的应用。

进一步地，药物含有效量的合成PIK3C2A蛋白的基因的病毒。

进一步地，PIK3C2A蛋白是由PIK3C2A基因在人体内经腺病毒转染进入宿主细胞后，在宿主细胞内经转录翻译产生的。

进一步地，PIK3C2A蛋白在抑制肝癌细胞的生长和侵袭转移的药物中的应用。

进一步地，PIK3C2A蛋白在治疗孤立性大肝癌和早期肝癌的药物中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明首先通过Real-time PCR和蛋白质免疫印迹法测定肝癌组织和肝癌细胞株中PIK3C2A mRNA和蛋白的表达量，然后运用免疫组化法比较肝癌组织和相邻正常肝组织中PIK3C2A染色程度的差别，并结合临床随访资料，采用Kaplan-meier生存分析、Log-rank检验、Spearman相关性分析和COX回归的单/多因素相关性分析等统计学方法，明确PIK3C2A的表达水平与肝癌病理特征和不良预后之间的关系。采用慢病毒转染技术下调PIK3C2A的表达，并通过一系列的体内外功能实验验证PIK3C2A对肝癌细胞生长和迁移运动的调控作用。

除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。

附图说明

构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1中示出了PIK3C2A mRNA在肝癌中低表达；A中示出了邻近非肿瘤肝组织中PIK3C2A mRNA的表达量明显高于其肝癌组织中的表达量P＜0.001，其中每个编号对应癌组织和ANLT的表达量；B中示出了qRT-PCR检测PIK3C2A在肝细胞系L02与五种肝癌细胞系中的mRNA水平，显示在肝癌细胞系中明显低于肝细胞系L02(P＜0.05)；C、D中示出了PIK3C2A mRNA在肝癌组织中的表达量显著低于其在邻近非肿瘤肝组织中的表达量0.0163±0.0017vs.0.0035±0.0010，P＜0.05；

图2中示出了PIK3C2A蛋白在肝癌组织中的含量低于癌旁肝组织；A中示出了用蛋白质免疫印迹实验检测PIK3C2A蛋白的表达水平；B示出了肝癌组织中PIK3C2A蛋白的表达水平也明显低于ANLT(0.8917±0.2071vs.2.6076±0.0956，P＜0.05)。将PIK3C2A蛋白在邻近非肿瘤肝组织中的含量设定为1，则肝癌组织中PIK3C2A蛋白的相对表达量中位值为0.3360；

图3中示出了肝癌细胞系中PIK3C2A mRNA及其蛋白的表达水平明显下调；A示出了采用RT-PCR方法检测正常肝细胞系L02和5种不同肝癌细胞系中PIK3C2A mRNA的表达水平；B示出了将RT-PCR方法测试正常肝细胞系L02和5种不同肝癌细胞系中PIK3C2A mRNA的表达水平进行定量分析，与正常肝细胞系L02比较，全部5种肝癌细胞系的PIK3C2A mRNA表达水平均明显下调(*P＜0.05)。；C示出了采用蛋白质免疫印迹法测试正常肝细胞系L02和5种不同肝癌细胞系中PIK3C2A mRNA的表达水平；D中示出了对蛋白质免疫印迹法的结果进行定量分析，与正常肝细胞系L02比较，肝癌细胞系中PIK3C2A蛋白表达水平也呈明显低表达(*P＜0.001)。

图4中示出了肝癌组织中PIK3C2A蛋白表达水平低于ANLT中的表达水平结果显示：A代表评分(-)、B代表评分(+)、C代表评分(2+)和D代表评分(3+)的典型组织图片；E为肝癌组织中PIK3C2A蛋白表达水平明显低于ANLT中表达水平的典型图片(P＜0.001)，放大100倍；F图为E图中方框所示部分放大400倍的结果；

图5中示出了PIK3C2A低表达与肝癌病人不良生存预后的关系，A示出了PIK3C2A高表达组和PIK3C2A低表达组患者的总体生存率对比；B示出了PIK3C2A高表达组和PIK3C2A低表达组患者的无瘤生存率对比；C示出了小肝癌(早期肝癌SHCC)组患者、、孤立性大肝癌(SLHCC)、结节性肝癌(NHCC)的总体存活率对比；D示出了小肝癌早期肝癌(SHCC)组患者、孤立性大肝癌(SLHCC)、结节性肝癌(NHCC)的无瘤生存率对比；

图6示出了慢病毒转染shRNA在SMMC7721细胞系中敲除PIK3C2A后得到的SMMC7721^shPIK3C2A和SMMC7721^Control细胞系的72小时后转染率；A中示出SMMC7721^shPIK3C2A的转染效率达96％；B示出对照组SMMC-7721^Control的转染效率达98％；蛋白质免疫印迹法检测了SMMC7721、SMMC7721^shPIK3C2A和SMMC7721^Control细胞中PIK3C2A蛋白的表达水平；

图7示出了下调PIK3C2A的表达可明显促进肝癌细胞的运动侵袭能力，A示出24小时后在100倍显微镜下观察到SMMC7721^shPIK3C2A和SMMC7721^Control细胞穿过的数目；B示出细胞划痕愈合实验中划痕经过48小时后的愈合情况，C示出采用罗丹明鬼笔环肽标记肝癌细胞的肌动蛋白以观察细胞骨架形态；

图8示出了下调PIK3C2A的表达可显著促进肝癌细胞的增殖；A示出了SMMC7721^shPIK3C2A和SMMC7721^Control细胞的集落形成的分别情况；B示出了MTT实验绘制肝癌细胞的生长曲线；

图9示出了下调PIK3C2A的表达在体内可明显促进肝癌细胞的增殖，A示出了SMMC7721^shPIK3C2A和SMMC7721^Control细胞注射到裸鼠左前肢腋下的皮下，一个月后将裸鼠处死，所得皮下瘤拍照体积；B示出了A中SMMC7721^shPIK3C2A和SMMC7721^Control细胞注射所得肿瘤体积对比图；C示出了SMMC7721^shPIK3C2A和SMMC7721^Control细胞将所得皮下瘤切成1mm³小块种植于裸鼠肝被膜下，1个月后原位肝肿瘤体积的差异；D示出了C中所得肿瘤体积的比较图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。

对于PIK3C2A蛋白对肝细胞癌生长和侵袭转移的抑制作用通过以下实验可以确知该蛋白具有该效果。

1.肝癌组织临床标本的采集

1.1 新鲜肝癌组织标本的收集

1.2 收集了从2006年12月到2012年3月之间在湘雅医院诊断为肝癌并接受手术切除的30例新鲜肝癌标本编号为：D478、D487、D207、D497、D486、D192、D240、D153、D465、D479、D482、D458、D488、D474、D480、D481、D256、D468、D470、D483、D484、D476、D205、D461、D475、D472、D466、D462、D459、D428。肝癌组织切除后，立即切取黄豆粒大小的肝癌组织和距离肿瘤边缘1cm的邻近非肿瘤肝组织(ANLT)，将组织置于无菌离心管(Axygen，UNION CITY，CA)中，并立即放于液氮中冻存。在收集组织的过程中应避免切取坏死的肝癌组织和血凝块。30例肝癌组织标本中包含14例结节性肝癌(NHCC，肿瘤结节数目≥2个者)，8例小肝癌(SHCC，肿瘤直径＜5厘米者)和8例孤立性大肝癌(SLHCC，肿瘤为单个肿块，有包膜，直径≥5cm者)。随后将离心管从液氮中取出，保存在-80度冰箱中(Thermo Scientific，，Waltham，，MA)备用。所收集的标本用于Real-time PCR、RT-PCR实验中RNA的提取和Western-blot实验中蛋白的提取。

1.3 肝癌石蜡临床标本的收集

1.4 本实验所用肝癌组织标本来源于2005年3月到2010年11月之间在湘雅医院诊断为肝癌并行手术切除的病人。从中随机选择了90例肝癌临床标本进行研究。切取所需肝癌组织标本后，将之放入5％的福尔马林溶液中固定，再将肝癌组织标本依次置于50％乙醇溶液、70％乙醇溶液、80％乙醇溶液、95％乙醇溶液和无水乙醇中各5分钟，进行梯度脱水，后置于二甲苯中使肝癌标本透明，将透明后的肝癌组织标本放入融化的石蜡中浸透。在包埋器中倒入融化的石蜡，在石蜡凝固之前迅速将组织标本放入其中，注意将所需断面朝下。石蜡凝固后将其切割成1立方厘米的方块。用Leica RM 2125RT切片机(Leica，Solms，Germany)切取3到5微米的连续切片，用于免疫组织化学实验。

2.肝细胞癌病理学特征的研究

详细检测并采集了上述90例肝癌标本的各种病理学特征。待肝细胞癌组织切除后，首先测量肿瘤组织的长径，用手术刀沿肿瘤的长径将肿瘤剖开，大体观察肿瘤的结节数目，是否有包膜或假包膜形成，有无静脉癌栓。切取所需肝癌组织和邻近非肿瘤正常肝组织，放入福尔马林溶液中固定，然后将标本进行石蜡包埋后切取连续切片。采用苏木精-伊红染色法染色后显微镜下观察。所有切片标本都由两名以上的病理科医师确诊为肝细胞癌，并由病理科医师详细观察记录所收集标本的乙型肝炎、肝硬化程度，是否有包膜和假包膜形成，是否存在镜下静脉浸润及癌栓等病理指标，并依据肝癌的病理学分级标准(Edmondson-Steiner)来确定肝细胞癌的分级；同时根据乙肝血清学检查确定是否有乙肝背景；根据Child-Pugh分级确定肝癌病人的肝脏储备功能；并根据巴塞罗那分期(Barcelona Clinic Liver Cancer Staging System，BCLC)和TNM分期(Tumor Node Metastasis Classification)确定肝癌的临床分期。最后根据肿瘤直径的大小将90例标本分为大肝癌组(LHCC，n＝75)和小肝癌组(SHCC，n＝15)；另根据结节数量和有无包膜等又进一步将大肝癌分层为结节性肝癌(NHCC，n＝47)和孤立性大肝癌(SLHCC，n＝28)。

3 临床随访研究

根据病人的病历收集病人的术前各种检查结果、手术日期、手术基本情况、术后恢复情况等信息，并把病人术后第一天作为随访的起点。通过门诊复查、电话或面对面沟通的方式定期进行临床随访，建立完善的随访数据库。肝癌病人术后是否发生复发转移则依据肝脏超声检查、CT、MRI、血清甲胎蛋白含量以及再次手术等方法确定。本研究的全部病人的访问截至到2013年3月15日。若病人在此时间内发生死亡或者复发转移则作为随访的终止点；若患者未因肝癌死亡或者未出现复发转移或因其他原因死亡者则作为删失数据。患者的生存时间为患者手术之日到患者死亡的时间。患者的无瘤生存时间为患者手术之日起到出现复发转移的时间。

4 荧光实时定量Real-time PCR与半定量RT-PCR

4.1 组织标本总RNA的提取

使用Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA)进行总RNA的提取，并根据试剂说明书和实验要求进行了下述操作过程：首先向研钵中倒入约4ml的液氮使研钵充分冷却，用组织剪剪取约绿豆粒大小的组织，放入冷却好的研钵中，再倒入约10ml的液氮，用钵杵快速研磨直至组织变成粉末状，在组织粉末融化之前将其放入离心管中。向离心管中加入1ml的Trizol，用涡旋器涡旋成匀浆，将匀浆放在15到30℃环境中孵育5分钟，使匀浆中的核蛋白体充分分离。向离心管中加入约400μl的氯仿，用涡旋器涡旋约10sec，此时可见管内液体变成乳糜状，将其放在20℃的环境中孵育3分钟；用离心机(Eppendorf，Hamburg，Germany)在4℃和12000rpm的条件下离心12分钟，此时可见管内液体分为三层，最下层主要为DNA，中间层主要是蛋白质，而所需的RNA则存在于最上的无色透明层中。小心用移液器吸取上层无色透明液体并转移到新的微量离心管中，并加入500μl的2-丙醇，在20℃的温箱中孵育8分钟，继之用离心机在2℃和12000rpm条件下离心12分钟，离心完成后RNA会在离心管底部形成胶冻状物质。小心的吸取上层液体并弃掉，向离心管中加入1.5ml80％乙醇，用涡旋器涡旋数次，在2℃7500rpm的条件下离心6分钟。将离心管倒扣在桌面上干燥10分钟后加入20到60μl的无RNA酶水，用移液器轻轻吹打几次使RNA充分溶解。

4.2 细胞总RNA的提取

细胞的总RNA同样使用Trizol进行提取，简要步骤如下：将培养皿中培基弃掉并加入5ml磷酸盐缓冲液洗涤细胞，用移液器将缓冲液吸净，将培养皿放到冰上，加入800μl的总RNA抽提试剂，用细胞刮匙反复刮培养皿底部，刮干净细胞后用巴氏吸管将混合液转移到微量离心管中，加入400μl的2-丙醇，用涡旋器将混合液涡旋至乳糜状，20℃温箱中孵育8分钟，在2℃和12000rpm的条件下离心12，离心完成后RNA在离心管底部形成胶冻状物质，用移液器小心的将上层液体弃掉，加入1.5ml 80％乙醇，用涡旋器涡旋数次，在2℃ 7500rpm的条件下离心6分钟，弃掉乙醇溶液，将离心管向下倾斜放置8分钟，用移液器吸取30μl的无RNA酶水加入离心管中，轻轻吹打使沉淀物充分溶解。

4.3 检测总RNA的质量与浓度

根据Ke AW等人的试验方法进行了总RNA质量和浓度的测定，简要步骤如下：在EP管中加入98μl的无RNA酶水和2μl的总RNA，扣紧盖后上下颠倒数次，使用DU-800型紫外线分光光度仪(Beckman，Fullerton，CA)测量每个样本在紫外线波长为260nm和280nm时的OD值，并计算二者的比值。实验开始时首先向比色皿中加入100μl的无RNA酶水校零，然后测定个样本的A260和A280值，计算A260/A280比值。比值在1.8到2.2之间的说明RNA纯度很高。当比值小于1.8时说明存在蛋白质或者其他有机物污染，而当大于2.2时，则提示RNA已被水解为单核苷酸。RNA浓度的计算公式为：RNA浓度＝A260×40×50(ng/μl)。

4.4 cDNA合成

采用东洋纺公司的FSK-100逆转录试剂盒(TYOBO，Osaka，Japan)合成cDNA。并根据试剂盒说明书进行了如下操作：实验开始时在反应管中加入1μl的多聚胸腺嘧啶-20和不多于1μg的总RNA，然后补无RNA酶水至12μl，将离心管放在PCR仪(BIO-RAD，Hercules，CA)中65℃加热5分钟后立即置于冰上，向第一步变性后的RNA溶液中加入4μl 5×RT Buffer、2μl dNTP Mixture、1μl RNase Inhibitor和1μl ReverTraAce，然后将混合液在PCR仪中30℃加热10分钟，42℃加热20分钟，99℃加热5分钟，4℃加热5分钟，瞬时离心。所的产物放到低温冰箱中储存。

4.5 实时定量Real-time PCR检测

Real-time PCR引物由上海生工设计并合成，引物的特异性和匹配性经NCBI的Primer-BLAST验证。PIK3C2A的正向引物序列为：5’-AAACCAACACCGAGCAGTAGAT-3’，PIK3C2A的反向引物序列为：5’-TCCTCCAAACAAAGAAGTCACA-3’，产物的大小为166bp。同时应用人GAPDH(甘油醛-3磷酸脱氢酶)基因来校正上样量差异，基因的正向引物序列为：5’-AGGTCGGAGTCAACGGATTTG-3’，反向引物序列为：5’-GTGATGGCATGGACTGTGGT-3’，产物的大小是532bp。将装有引物粉末的离心管在离心机上瞬时离心，加入无RNA酶水，引物溶液的终浓度为30μM。-20℃冰箱中储存。

Real-time PCR实验所用试剂为罗氏公司的Fast Start Universal SYBR Green Master(ROX)试剂盒(Roche，Frankfurt，Germany)，并严格遵循试剂盒和实验要求进行了以下操作：首先将Fast Start Universal SYBR Green Master(ROX)上下反转几次以使溶液混匀，将反应管(Axygen，UNION CITY，CA)置于冰上，向反应管中加入25μl的Fast Start Universal SYBRGreen Master(ROX)，0.5μl的正向引物(30μM)，0.5μl的反向引物(30μM)，19μl的无RNA酶水，5μl的初次实验所获得的cDNA模板，用移液器小心的将混合液混匀，用自黏箔封闭PCR板；Real-time PCR反应在ABI 7300实时PCR系统(Applied Biosysterm，Foster，CA)中进行，反应过程为：95℃3分钟起始模板变性，共1个循环；95℃15sec改变模板二级结构，60℃ 60sec降低温度使序列延伸，共40个循环；溶解程序为65℃20sec，95℃20sec，共1个循环。反应结束后记录各样本的Ct值，并进行统计学分析。肝癌组织中PIK3C2A mRNA表达量的计算方法为：ΔCt_{(tumor，PIK3C2A)}＝Ct_{(tumor，PIK3C2A)}-Ct_{(tumor，GAPDH)}，正常肝组织中PIK3C2A mRNA表达量的计算方法为：ΔCt_{(ANLT，PIK3C2A)}＝Ct_{(ANLT，PIK3C2A)}-Ct_{(ANLT，GAPDH)}，肝癌中PIK3C2A mRNA表达量相较于正常肝组织中表达量倍数的计算方法为：2^-ΔΔCt＝[Ct_{(tumor，PIK3C2A)}-Ct_{(tumor，GAPDH)}]-[Ct_{(ANLT，PIK3C2A)}-Ct_{(ANLT，GAPDH)}]。

4.6 半定量RT-PCR

反转录聚合酶连反应的引物由上海生物技术公司设计，正向引物的序列为：5’-CTGGTTCCTGCTTCCGATAC-3’，反向引物序列为：5’-CAGAGGTCCACAAACAACTGA-3’，产物的大小为392bp，以人的GAPDH基因作为内参。将装有引物粉末的离心管在离心机上瞬时离心，防止粉末飞扬，加入无RNA酶水，引物溶液的终浓度为10μM。

RT-PCR扩增反应使用康为世纪公司的2×Taq MasterMix(含染料)试剂盒进行。根据试剂盒说明书进行了如下操作：向反应管中加入25μl的2×TaqMasterMix，2μl的正向引物(10μM)，2μl的反向向引物(10μM)，不大于1μg的cDNA模板，补充无RNA酶水至50μl。在PCR仪中进行聚合酶连反应，反应过程为：93℃下3分钟使引物发生变性，共一个循环；96℃ 1分钟改变引物二级结构，58℃ 1分钟使温度缓慢下降，70℃ 20sec使序列延伸，所需循环数为38个；70℃ 5分钟条件下进行终末延伸，所需循环数为1个；最终产物放到低温冰箱中储存。

根据Huang XY等人的琼脂糖凝胶电泳实验方法并根据自身实验的需要对其方法进行了改进，简要操作步骤如下：在1L烧杯中加入108g Tris碱、55g硼酸和40ml的0.5M EDTA，补水至1L配制成10×TBE储存液，使用时将10×的TBE液稀释到1×。在烧杯中加入50ml的1×TBE液和0.5g的琼脂糖，煮沸使琼脂糖溶解，待温度降到70℃左右是加入5μl的溴乙锭混匀，将琼脂糖溶液倒入胶模中并插上齿梳，在水平的桌面上放置1小时，琼脂糖凝胶完全凝固后将齿梳拔掉；将琼脂糖凝胶放到电泳槽当中，并且有孔的一侧朝向负极，在电泳槽中加满1％Tris-硼酸溶液，向相应胶孔中加入5μl的DNA Marker(Invitrogen，Carlsbad，CA)或RT-PCR产物，盖上电泳槽盖子，在电压为80V条件下电泳30分钟，电泳完成后将凝胶放到Bio-Red Molecular Imager Gel Doc^TM XR Imaging System(BIO-RAD，Hercules，CA)成像仪中显影并拍照。每条条带的亮度值用Image J软件得出，将所得数值输入统计学软件中进行统计分析。

5 蛋白质免疫印迹实验(Western-blot)

1.1 提取组织总蛋白

根据Ke AW等人的蛋白提取方法进行了如下操作：因为蛋白容易降解，所以提取蛋白的操作过程应在冰盒中完成。操作前2到3分钟向1ml的RIPA裂解液(康为世纪，北京，中国)中加入10μl的蛋白酶抑制剂(康为世纪，北京，中国)，首先在研钵中倒入3ml的液氮使研钵冷却，用组织剪剪取绿豆粒大小的组织放入研钵中，再加入10ml的液氮，用钵杵快速研磨直至组织变成粉末状，在组织粉末融化前将其转移到离心管中，加入800μl的RIPA裂解液，用涡旋器涡旋混匀，每隔5分钟用涡旋器涡旋15sec，共40分钟，在14000rpm和2-8℃的条件下离心15分钟，离心完成后用移液器吸取液体层并转移到新的离心管中，液体层中含有总蛋白，将其放到超低温冰箱中存储。

1.2 蛋白浓度的测定

总蛋白的浓度采用BCA Protein Assay Kit试剂盒(Thermo Scientific，Waltham，MA)进行测定。根据试剂盒说明书要求进行了如下操作：首先按A溶液和B溶液50∶1的比例配制成BCA工作液。取9根洁净的2ml离心管按下表1进行操作。

表1 蛋白浓度测得操作表

管号	双蒸水(μl)	BSA标准品体积(μl)	蛋白终浓度(μg/ml)
				A	0	300	2000
B	125	375	1500
				C	325	325	1000
D	175	从B管中取175	750
				E	325	从C管中取325	500
F	325	从E管中取325	250
				G	325	从F管中取325	125
H	400	从G管中取100	25
				I	400	0	0

在96孔酶标板相应的孔中加入0.1ml的相应的标准蛋白或相应稀释倍数的待测蛋白，每个酶标板孔中加入2ml的AB工作液，用移液器轻轻吹打均匀，将酶标板盖扣紧后在37.5℃的温箱中存放40分钟，待冷却至室温后方在ELX800酶标仪(BIO-TAK，Hercules，CA)上测各孔在A562上的吸光度值。将每个样品的吸光度值输入到Graph Pad Prism统计学软件中并绘制标准曲线。将待测样品的吸光度值代入曲线函数公式中，所得数值为稀释后蛋白浓度，再根据稀释比例得出待测样品的蛋白浓度。

1.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western-blot实验

根据Western-blot通用实验方法和自身实验要求进行了如下操作：配制8％的聚丙烯酰胺分离胶，配方为：9.3ml的双蒸水，5.3ml的30％Acr-Bis，5.0ml的1.5M Tris(pH8.8)，200μl的10％SDS，200μl的10％过硫酸铵和12μl的TEMED，将配好的分离胶倒入夹好的两块玻璃板中并水封，待分离胶凝固后将上层水封倒掉，配制5％的浓缩胶，配方为：830μl的30％Acr-Bis，630μl的1.5M Tris(pH8.8)，50μl的10％SDS，50μl的10％过硫酸铵和5μl的TEMED，将配制好成层胶缓慢倒入玻璃板中，倒满后将梳子插入其中。将所提取的总蛋白和5×Lodding Buffer按4∶1的比例混合，在沸水中煮大约5分钟，然后将蛋白取出放在常温中冷却，蛋白冷却到大约60℃时，以13000rpm的速度离心5分钟。将已经凝固好的丙烯酰胺凝胶放到电泳槽中，把齿梳拔掉后相应孔中添加6μl的蛋白Marker(Thermo，Waltham，CA)或蛋白样品，将mini Protean Tetra Systerm小型垂直电泳系统(BIO-RAD，Hercules，CA)的电压设置为80V，当看到蓝色指示线到达折线以下的时候把电压调到120V，当蓝色指示线到达绿线以下的时候停止电泳，把玻璃板拿出来后用自来水冲洗一下，把两块玻璃板分离开来，取出凝胶放到盛有转膜缓冲液的搪瓷盘中，在转膜夹板的无色透明一边放上一层海绵，然后依次放3层滤纸，甲醇浸透的PVDF膜(Roche，Frankfurt，Germany)，凝胶，再放3层滤纸和1层海绵，然后将合起的夹板放入转膜电泳槽中，并将电泳槽中倒满转膜缓冲液，注意转膜夹板无色透明一边朝向正极，黑色一边朝向负极，将转膜电泳槽放入冰盒中并连接电泳仪(六一，北京，中国)，在200mA恒流的条件下转膜3小时。3小时过后，拆开夹板拿出PVDF膜，用磷酸盐缓冲液冲洗掉转膜缓冲液，7％的封闭液中浸泡40分钟，封闭完成后用PBS-T溶液(1L PBS溶液中加入1ml的Tween-20)洗净封闭液，用一抗稀释液(LEAGENE，北京，中国)按500∶1的比例与一抗混合，把PVDF膜放入其中，然后放到冷柜中14小时。第二天将PVDF膜从一抗溶液中取出，PBS-T溶液洗三次每次2分钟，然后将PVDF膜放入适当稀释的二抗溶液中，在30℃温箱中放置50分钟，然后用PBS-T溶液洗净残余二抗。将PVDF膜放入盛有Western BrightTM ECL-spary Western bloting detection system显影剂(ADBANSTA，Menlo Park，CA)无色透明盘中，将透明盘放入BID-RAD chemiDOCTM MP凝胶成像系统中(BIO-RAD，Hercules，CA)，在Image LabTM软件中选择蛋白质印迹并自动成像，成像后将所成的相片导出，利用Image J软件计算出各条带的灰度值，进行统计学分析。

本实验所用的一抗为兔抗人PIK3C2A蛋白(190kDa)多克隆抗体(Santa Cruz，Santa Cruz，CA)，鼠抗人β-Actin蛋白(43kDa)多克隆抗体(Sigma，LosAngeles，CA)，本实验所用的二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白抗体(中杉金桥，北京，中国)和辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠免疫球蛋白抗体(中杉金桥，北京，中国)。

6 免疫组织化学实验

采用2-step免疫组化检测试剂盒(GBI，Washington DC)开展免疫组化研究，并根据试剂盒说明书要求和Ke AW等人的试验方法进行了如下操作：(1)将组织切片竖直插入切片架中，然后放在75℃烤箱中烤45分钟，使组织中的石蜡全部融化后流出。(2)45分钟后，将切片浸泡在二甲苯中20分钟，使切片上残余石蜡全部溶解在二甲苯中。(3)切片从二甲苯中取出后依次在无水乙醇中浸泡10分钟，95％乙醇中浸泡3分钟，75％乙醇中浸泡3分钟，50％的乙醇中浸泡3分钟从而使切片水化。(4)将切片放到装有自来水的盒子中，每隔2分钟更换自来水，共更换5次。(5)秤取0.4g的柠檬酸和3g的柠檬酸三钠加水至1L配制成柠檬酸抗原修复液，将抗原修复液在微波炉中煮沸后把切片放入其中，继续煮沸15分钟，煮沸完成后将修复液和切片一同取出，在自然条件下使温度缓慢降到室温。(6)用磷酸盐缓冲液清洗切片2分钟×2次；将切片放于蒸馏水中过一下，向切片的标本处滴一滴试剂盒中的3％的H2O2，室温下孵育30分钟。(7)30分钟后将切片浸泡在双蒸水中6分钟，然后再在磷酸盐缓冲液中浸泡6分钟；用吸水纸擦净标本周围的水分，向切片标本处滴加30μl的5％封闭液，将切片平放在37℃温箱中静置35分钟。(8)滴加50μl的用PBS溶液按150∶1稀释的一抗溶液，首先把切片在37℃环境中放置40分钟，然后将切片放在4℃环境中静置14小时。(9)14小时过后先将切片在37℃环境中放置40分钟，然后用PBS缓冲液清洗切片2分钟×2次。(10)吸取30μl试剂盒中的试剂一滴加到切片标本处，在37℃环境中放置15分钟。(11)用磷酸盐缓冲液清洗切片2分钟×3次，然后吸取30μl试剂盒中的试剂二滴加到切片标本处。(12)配制DAB显色剂(LEAGENE，北京，中国)：在离心管中加入1ml的DAB底物液和50μl的浓缩DAB溶液(20×)，混匀后用锡箔纸将离心管包好避光，并在30分钟内使用。(13)加30μl的DAB显色剂在切片上，在100倍的显微镜底下控色。显色完成后用磷酸盐缓冲液冲洗切片5分钟。(14)滴加一滴苏木素溶液在切片上，复染大约10sec左右，然后立即放于自来水下冲洗10分钟。(15)将切片从自来水中取出，依次在双蒸水、50％乙醇、75％乙醇、90％乙醇、无水乙醇和二甲苯中浸泡4分钟，从而脱去标本中的水分。(16)滴加一滴封片剂在切片上，先将盖玻片底部接触封片剂，再缓慢放下使封片剂均匀分布，封完片后将切片放于37℃温箱中过夜使封片剂凝结。(17)将切片放于ECLIPSE 80i正置显微镜(Nikon，Tokyo，Japan)下观察，并选择代表性区域拍照。

免疫组织化学各标本染色程度的评级依据Shimizu评分方法。按着色细胞数目多少的评分标准为：没有细胞染色记为0分，小于1/3的细胞染色记为1分，小于2/3的细胞染色记为2分，大部分细胞染色记为3分。着色强度的评分标准为：0分为没有着色，1分为中等程度着色，在100倍显微镜下可看到明显着色的为2分；两者相乘后乘积为0分的记为(-)，1到2分的记为(+)，3到4分的记为(2+)，6分的记为(3+)。将(-)和(+)作为低表达，(2+)和(3+)作为高表达。

7 细胞培养

细胞培养的过程均严格按照正规操作步骤要求并全程在无菌环境中进行，同时根据自身实验的要求在合理的范围内进行了相应的调整和改进。以下对细胞培养的各过程进行了分条详述。

7.1 复苏细胞

(1)准备工作：将水浴箱提前加热到37℃，用75％的酒精擦拭生物安全工作台(AIRTECH，苏州，中国)并用紫外线照射1小时。(2)根据实验需要从液氮罐(Thermo Forma，Marietta，Ohio)取出相应细胞。(3)将冻存管插在漂浮板上，放入水浴箱中，当看到液体完全融化后取出，用消毒酒精消毒后放入操作台中，用移液器小心吸取细胞悬浮液并转移到EP管中(NEST，无锡，中国)；(4)扣紧EP管放在离心机中以600rpm的速度离心6分钟，离心完成后用移液器吸取上清并弃掉，加入800μl的完全培养基并吹打均匀。(5)用移液器将细胞悬液转移到新的细胞培养皿中(NEST，无锡，中国)，用移液管向培养皿中加入6ml完全培养基，轻轻吹打混匀。将培养皿放入37度、5％CO2的细胞培养箱(Thermo Forma，Marietta，Ohio)中培养。

7.2 细胞传代

在显微镜下看到细胞密集分布且没有足够生长空间时进行传代操作。(1)将培养皿中的培养基吸掉，加入3mlPBS磷酸盐缓冲液(LEAGENE，北京，中国)将残余培养基洗掉。(2)向培养皿中加入含有0.25％胰蛋白酶的细胞消化液(索莱宝，北京，中国)，左右反复倾斜培养皿若干次，然后将培养皿放回培养箱中消化2分钟。(3)显微镜下看到细胞之间无相互粘连后，再加入1ml完全培养基中和残余消化液，用吸管反复吹吸几次使细胞混匀，按1∶3的比例将细胞悬液分到其他培养皿中，加入5ml完全培养基后放回培养箱中。

7.3 冻存细胞

选取细胞密度达到80％以上的进行传代。(1)用移液器将培养基吸掉，加入2ml无菌磷酸盐缓冲液清洗细胞数次。(2)吸取500μl含0.25％胰蛋白酶的细胞消化液加入到培养皿中，左右倾斜数次后放回培养箱中消化2分钟。(3)显微镜下看到细胞之间无黏连后，再加入1ml完全培养基中和掉残余消化液。(4)用吸管吹吸数次使细胞全部悬浮，然后转移到离心管中，以700rpm的速度离心6分钟。(5)离心完成后，将上清液弃掉，加入2ml的细胞冻存液(凯基，南京，中国)并用移液器吹打为悬浮液。(6)将悬浮液转移到两个已标记好的冻存管中(NEST，无锡，中国)，然后将冻存管放入装有异丙醇的细胞冻存盒中，把冻存盒放到-80℃超低温冰箱中缓慢降温，24小时后取出冻存管并立即放入液氮中储存。

7.4 慢病毒细胞转染

实验组慢病毒所携带的shRNA序列为：5’-AAGGTTGGCACTTACAAGAAT-3’，对照组慢病毒所携带的shRNA序列为：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGTTTC-3’。根据慢病毒合成公司所提供的说明进行了如下操作：

1 预实验(1)在96孔细胞培养板的每个孔中加3.5×105个细胞和100μl的完全培养基，放到培养箱中培养。底部约一半的面积被细胞覆盖时进行转染操作。(2)将慢病毒从-80℃超低温冰箱中取出放于4℃冰箱中缓慢融化，向3个无菌离心管中加入90μl的细胞培养基，用移液器向一号管中加入10μl的9×109TU/ml的病毒原液，并用手轻轻摇匀，依次从前一个离心管吸取10μl的液体加入后一个离心管中，这样便得到了原液、10倍稀释、100倍稀释和1000倍稀释4个不同的梯度。(5)各取10μl的4个不同梯度的病毒加入到各组3个复孔中并摇匀，然后将培养板放入细胞培养箱中培养，培养72小时后在荧光显微镜下观察发出绿色荧光的细胞数目，依据细胞数目计算出感染效率，然后确定最适病毒量。

2 正式试验(1)在实验前一天将1×105个要进行转染的细胞接种到六孔细胞培养板上，加入3ml的完全细胞培养基，培养24小时，细胞的覆盖率达到55％到60％时进行转染。(2)实验时每个培养孔中加入1ml完全培养基，随后加入确定好的最适病毒量和1μl的转染增强剂，将培养板放回培养箱中，72小时后观察能够发出荧光的细胞数目。(3)当绿色荧光的表达效率大于70％后，扩增细胞系，提取细胞蛋白，采用Western-blot实验检测慢病毒转染后的敲除效率。

8 体外细胞功能试验

8.1 细胞划痕愈合实验

细胞划痕实验参照Ding W等人的实验方法进行，并根据实验要求进行了相应的调整，简要步骤如下：(1)吸取6×105个生长旺盛的细胞加入到无菌六孔培养板中(NEST，无锡，中国)，然后将其放置在细胞培养箱中，当达到90％的细胞覆盖率时开展划痕实验。(2)将培养皿中的培基完全吸掉后，用Tip头在培养皿中轻轻的快速划痕，注意不要划伤底部，然后用PBS缓冲液清洗细胞数次，最后加入1.5ml细胞培基。(3)将培养板放于倒置显微镜下观察并拍照，24小时和48小时再次观察并拍照。根据两组细胞划痕的愈合率来进行统计分析。

8.2 侵袭小室实验

侵袭小室实验参照SosinAM等人的实验方法进行，简要步骤如下：(1)将Matrigel胶(BD，Franklin Lakes，NJ)放于冰上缓慢融化，Matrigel胶和PBS溶液按1∶4混合，将20μl稀释后的Matrigel胶加入到Transwell板(Coring，Coring，NY)的上室中，轻轻摇匀后放到细胞培养箱中干燥24小时。(2)在下室中加入700μl的完全培养基，并把Transwell小室放于其中，然后将培养板放于细胞培养箱中水化10分钟。(3)在Transwell小室中加入1×105个细胞并添加200μl不含胎牛血清的细胞培养基，在细胞培养箱中放置24小时。(4)24小时后用棉团把上室内部的细胞和培养基擦掉，然后放在冰冷的甲醇中浸没8分钟。(5)将Tranwell小室倒扣在桌面上并在上面滴一滴结晶紫溶液，染色10分钟。(6)10分钟后用PBS溶液洗掉结晶紫溶液，干燥后放于倒置显微镜下观察。(7)在100倍显微镜下计数各组穿过的细胞数目，进行统计分析。

8.3 MTT实验

MTT实验参照Fransvea E等人的方法进行，简要步骤如下：吸取1×103个生长旺盛细胞分别加入到96孔培养板各孔中，在细胞培养箱中进行培育。每隔24小时选取一排孔测定光密度值。(1)将噻唑蓝配成5mg/ml的溶液，并用锡箔纸包裹避光低温保存。细胞培基吸掉后各孔加入20μl的噻唑蓝溶液，在培养箱中继续培育4小时。(2)4小时过后，将噻唑蓝溶液吸掉，然后在各孔中加入180μl的DMSO，在室温下轻摇15分钟；(3)使用EX900型全自动酶标仪测定紫外线波长为490nm时每孔的光密度值。根据各孔的光密度值在统计学软件中得出出生长曲线。

8.4 细胞集落形成实验

细胞集落形成实验根据Tsao CM等人的试验方法进行，简要步骤如下：吸取500个生长旺盛的细胞加入到六孔板各孔中，并加入2ml完全培基。两周后将细胞培养基吸掉后，用PBS磷酸盐缓冲液漂洗3次，然后加入500μl的结晶紫染色剂染色10分钟。10分钟后用PBS磷酸盐缓冲液漂洗3次，用相机拍照计数直径大于40μm的集落数目，进行统计学分析。

8.5 细胞骨架免疫荧光实验

细胞骨架免疫荧光实验参照Singh VP等人的方法并根据实验要求做了相应的调整，简要步骤如下：(1)实验前将盖玻片放于75％的酒精中浸泡24小时，紫外线照射30分钟。(2)将盖玻片用无菌PBS溶液清洗干净，在六孔板每孔放入一个盖玻片并加入2ml不完全细胞培基。(3)吸取8×104个细胞加入到六孔板各孔中，在培养箱中放置24小时。(4)24小时后，吸掉培基后用PBS溶液清洗细胞两次，各孔分别加入1ml 4％甲醛并静置12分钟。(5)PBS溶液清洗细胞数次，然后在每个孔中加入1.2ml 0.3％表面活性剂溶液，8分钟后吸掉。(6)PBS溶液洗涤三次，滴加一滴的5μg/ml的罗丹明鬼笔环肽(Sigma，St Louis，MO)在玻片上，在避光的条件下染色40分钟。(7)DAPI染核10sec，PBS溶液冲洗数次。(8)滴加防淬灭液并盖上盖玻片，在荧光正置显微镜下察看标本并扫描图像。

上述关于PIK3C2A蛋白的实验结果如下：

1.PIK3C2A mRNA和蛋白在肝癌组织和肝癌细胞系中表达明显下调

取新鲜肝癌组织和邻近非肿瘤肝组织(ANLT)抽提RNA，采用实时定量Real-time PCR测定肝癌组织和邻近非肿瘤肝组织中PIK3C2A mRNA表达水平。结果显示：肝癌组织中PIK3C2A mRNA表达水平的中位值为0.00445，范围在0.00006-0.05879，而在邻近非肿瘤肝组织中PIK3C2A mR NA的表达水平的中位值为0.04141范围在0.00023-1.42558。如果将邻近非肿瘤肝组织中PIK3C2A mRNA表达量设定为1，则肝癌组织中PIK3C2A mRNA的相对表达量的中位值则为0.1144。显然邻近非肿瘤肝组织中PIK3C2A mRNA的表达量明显高于其肝癌组织中的表达量，参见图1中的A。选定四对肝癌组织及其相对应的邻近非肿瘤肝组织另采用RT-PCR测定PIK3C2A mRNA表达量。结果显示：PIK3C2A mRNA在肝癌组织中的表达量显著低于其在邻近非肿瘤肝组织中的表达量，参见图1中的C、D。

参见图2，结果显示：PIK3C2A蛋白在肝癌组织中的含量也要显著低于邻近非肿瘤肝组织中的含量(0.8917±0.2071vs.2.6076±0.0956，P＜0.05)。若将PIK3C2A蛋白在邻近非肿瘤肝组织中的含量设定为1，则肝癌组织中PIK3C2A蛋白的相对表达量中位值为0.3360。

之后采用Real-time PCR、RT-PCR和Western-blot实验检测正常肝细胞系L02和5种不同肝癌细胞系HepG2、MHCC97-L、Huh7、SMMC7721和HCCLM3中PIK3C2A mRNA和蛋白表达水平。Real-time PCR的实验结果参见图1中的B，结果显示，若将正常肝细胞系L02中PIK3C2A的mRNA表达水平设为1，则HepG2、SMMC7721、MHCC97-L、HCCLM3和Huh7细胞系中PIK3C2A mRNA相对表达水平分别为0.126073±0.01136、0.08643±0.00549、0.08433±0.00929、0.01346±0.00963和0.01155±0.00616。这提示PIK3C2A mRNA表达水平在肝癌细胞系中也是显著下调(P＜0.05)。同样，RT-PCR的测试结果参见图3中的A、B，也提示与L02细胞系相比，肝癌细胞系中PIK3C2A mRNA的表达水平明显下调(P＜0.05)。对于PIK3C2A蛋白而言，蛋白质免疫印迹实验也同样提示肝癌细胞系中的含量是要低于L02细胞系中的含量(P＜0.001)，结果参见图3中的C、D。

2.PIK3C2A的低表达与肝癌临床病理特征和不良生存预后密切相关

进一步采用免疫组化法检测PIK3C2A表达量在肝癌和邻近的非肿瘤肝组织中的差异，并根据Shimizu免疫组化评分法对PIK3C2A的表达水平进行评分，并将所得数据输入SPSSStatistics 18中进行统计学分析。免疫组化结果表明：PIK3C2A主要表达于细胞的胞膜和胞浆中，细胞核未见染色结果参见图4。PIK3C2A的主要表达在细胞的胞膜和胞浆中，细胞核未见染色。在90例肝癌组织中，阳性染色的例数为73例(73/90，81.1％)；而在ANLT中，则均可见阳性染色(90/90，100％)。这表明肝癌组织中PIK3C2A的表达水平要明显低于ANLT的表达水平(P＜0.001)。在肝癌组织中PIK3C2A蛋白呈高表达的有53例(53/90，58.9％，表2)，而在邻近非肿瘤肝组织中PIK3C2A蛋白呈高表达的却多达82例(82/90，91.1％，表1)，统计学分析显示在相对应邻近非肿瘤肝组织中PIK3C2A蛋白的高表达数量显著多于肝癌组织中的高表达数量(P＜0.001，图4，E，F)。通过在相关性分析发现，PIK3C2A的低表达与肝癌有无包膜或假包膜形成(P＝0.028)、肝癌临床分型(P＝0.038)、肿瘤结节数量(P＝0.004)、有无静脉浸润(P＝0.010)、TNM分期(P＝0.003)、BCLC分期(P＝0.008)存在密切关系；而与其他的病理因素如：HBsAg、年龄、性别、肝硬化、Edmondson-Steiner分级、肿瘤大小、Child-Pugh分级等无明显的相关性(表3)。这些实验结果充分说明，PIK3C2A的表达水平和肝癌的临床病理特征及其肿瘤学生物学行为存在着密切的关联。

表2 肝癌组织中PIK3C2A蛋白呈高表达病例

Shimizu评分(-)和(+)为低表达，Shimizu评分(++)、(+++)为高表达。

表3 PIK3C2A表达水平与肝癌临床病理特征的相关性

注：PIK3C2A低表达组为免疫组化评分-～+，PIK3C2A高表达组为免疫组化评分2+～3+。

通过对90例肝癌病人术后随访观察研究PIK3C2A低表达与肝癌病人的不良生存预后的关系。我们根据90例肝癌组织中PIK3C2A蛋白表达的Shimizu评分将其分为低表达组(-～+，37例)和高表达组(2+～3+，53例)。根据病人的术后生存时间和术后无瘤生存时间，采用Kaplan-Meier法分别计算出了PIK3C2A低表达组和高表达组的术后的无瘤生存率和总体生存率，再用Log-rank检测两组的无瘤生存率和总体生存率有无差异。结果列于图5中，结果提示在总体生存时间上低表达组要明显短于高表达组，两组的平均生存时间分别为23.87±4.01个月和44.52±3.68个月，低表达组和高表达组的1、3、5年的总体生存率分别为65.1％vs.92.2％，28.5％vs.52.2％和20.3％vs.41.2％，P＝0.001，(图5.A)。无瘤生存率的统计结果同样显示，PIK3C2A低表达组的1、3、5年无瘤生存率也要明显低于高表达组(53.1％vs 80.4％，24.6％vs.48.0％，0％vs.24.6％，P＝0.001)；两组的平均无瘤生存时间分别为19.59±3.33个月和38.14±3.70个月(P＝0.001，图5.B)。

同时将全部标本按肿瘤大小和结节数量将之分成NHCC(n＝47)、SHCC(n＝15)和SLHCC(n＝28)，并采用Kanplan-Meier法和Log-rank法对三组的总体生存时间和无瘤生存时间的差异性进行了检测。结果显示，NHCC组的平均生存时间要明显短于SHCC组(26.51±3.27vs.49.18±6.56月，P＜0.001)和SLHCC组(26.51±3.27vs.39.54±4.01月，P＝0.006，图5.C)，NHCC组、SLHCC组和SHCC组的1、3、5年生存率分比为70.5％vs.92.3％vs.93.3％、24.8％vs.60.7％vs.64.1％和20.3％vs.52.6％vs.48.1％，NHCC组的1、3、5年生存率与SLHCC组和SHCC组相比均存在统计学意义(P＝0.006)，而SLHCC组和SHCC组的差异无统计学意义(P＞0.05)。无瘤生存时间的统计分析也显示NHCC组病人的无瘤生存时间也要明显短于SHCC组(23.07±3.23vs.45.38±6.75月，P＜0.001)和SLHCC组病人(23.07±3.23vs.33.58±4.10月，P＝0.017，图5.D)，无瘤生存率的结果显示：小肝癌组病人的1、3、5年无瘤生存率为86.2％、62.3％、34.6％；孤立性大肝癌组病人为1、3、5年无瘤生存率77.4％、43.8％、31.3％；而结节性肝癌组病人的1、3、5年无瘤生存率仅为59.5％、20.7％、4.8％。这一结果充分说明PIK3C2A表达水平相对较高的SHCC和SLHCC的预后要明显好于NHCC，同时也再次证明SLHCC的预后要明显优于NHCC，可以与SHCC相媲美。

3慢病毒转染下调PIK3C2A表达在体外可显著提高肝癌细胞的增殖和运动转移能力

为了研究PIK3C2A在体内外对肝癌细胞的影响。构建了pGLV4-shPIK3C2A慢病毒和相应的对照病毒(由上海吉玛基因公司构建)。慢病毒转染SMMC7721细胞系72小时后在荧光倒置显微镜下查看可以显现绿色荧光的细胞数目。由图6.A可见，SMMC7721^shPIK3C2A的转染效率达96％。由图6.B可见，对照组SMMC7721-Control的转染效率达98％。扩增SMMC7721、SMMC7721^shPIK3C2A和SMMC7721^Control细胞后分别提取其总蛋白。采用蛋白质免疫印迹法检测SMMC7721、SMMC7721^shPIK3C2A和SMMC7721^Control细胞中PIK3C2A蛋白的表达水平。结果列于图6.C、D中：SMMC7721、SMMC7721^Control和SMMC7721^shPIK3C2A细胞中PIK3C2A蛋白的相对表达水平分别为1.26±0.16、1.13±0.07和0.33±0.09。经统计学分析显示与SMMC7721和SMMC7721^Control细胞比较，PIK3C2A蛋白在SMMC7721^shPIK3C2A细胞中明显下调(P＜0.05)。

已通过前期PCR、蛋白免疫印迹和免疫组织化学试验观察到PIK3C2A mRNA和蛋白在肝癌组织中均呈显著低表达，而且证明PIK3C2A的低表达与肝癌临床病理特征和不良生存预后密切相关。为了进一步明确PIK3C2A功能，开展了一系列体外实验验证PIK3C2A在肝癌细胞系中的作用。Transwell侵袭小室实验表明SMMC7721^shPIK3C2A细胞侵袭能力明显高于SMMC7721^Control细胞。结果列于图7中。如图7中A所示，24小时SMMC7721^shPIK3C2A细胞穿过小室的数目要明显多于SMMC7721^Control细胞(182±8vs.62±4，P＜0.001)。图7中B示出细胞划痕愈合实验则显示相较于SMMC7721^Control细胞，SMMC7721^shPIK3C2A细胞的愈合能力明显增强。48小时划痕的愈合率分别为43.8％和91.7％。还采用了罗丹明鬼笔环肽标记肝癌细胞的肌动蛋白以此观察细胞骨架形态，对比SMMC7721^shPIK3C2A细胞和SMMC7721^Control细胞骨架形态的差异。如图7中C所示，在400倍荧光正置显微镜下看以清楚地观察到相较于SMMC7721^Control细胞，SMMC7721^shPIK3C2A细胞骨架亮度更强，排列也更加有序，细胞的形态也更加多变并伸出更多的伪足。

这些观察结果提示在肝癌细胞中下调PIK3C2A的表达可显著提高其运动和侵袭能力。

细胞集落形成实验结果列于图8中。如图8所示，在第二周时SMMC7721^shPIK3C2A细胞所形成的集落数目为167±8，而SMMC7721^Control细胞所形成的集落数目则为64±6，两者集落形成数目差异显著(P＜0.001，图8.A)。肿瘤细胞的MTT生长曲线实验结果显示，在第六天时SMMC7721^shPIK3C2A细胞的吸光度值为0.997，而SMMC7721^Control细胞的吸光度值为0.706，这表明SMMC7721^shPIK3C2A细胞增殖数目显著高于SMMC7721^Control细胞增殖的数目(P＜0.001)(图8.B)。以上的体外功能学实验结果充分表明下调PIK3C2A的表达水平能显著增强肝癌细胞的增殖能力。

通过以上多种实验结果我们不仅证实了肝癌组织和肝癌细胞中PIK3C2A的表达量均呈显著下调，而且也发现PIK3C2A与肝癌的多种临床病理因素密切相联关，也明确表明了PIK3C2A可作为独立危险因素用于预测肝癌病人不良预后和术后复发转移；同时在体内、外实验中也证实PIK3C2A对肝癌细胞的增殖和迁移运动能力具有明显的抑制作用。

PIK3C2A蛋白的给药方式可以采用蛋白的常用的给药方式。优选采用将合成PIK3C2A蛋白的基因经重组腺病毒转染后进入宿主细胞，在宿主细胞内经转录翻译，产生PIK3C2A蛋白，从而在体内发挥作用。如Xin Zeng，Yong Lin，Chuan Yin，Xin Zhang，z Bei-Fang Ning，Qing Zhang，Jun-Ping Zhang，Lei Qiu，Xiao-Ran Qin，Yue-Xiang Chen，and Wei-Fen Xie发表于《HEPATOLOGY》Vol.54，No.6，2011的《Recombinant Adenovirus Carrying the HepatocyteNuclear Factor-lalpha Gene Inhibits Hepatocellular Carcinoma Xenograft Growth in Mice》中公开的方法用重组腺病毒注射将抑癌基因导入体内，从而抑制肿瘤的生长。采用腺病毒作为基因治疗转移载体的优势：1.基因导入效率高，对人类安全；2.具有广泛的宿主范围；3.基因转导与细胞分裂无关；4.重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、喷雾吸入或气管内滴注，对患者进行治疗；5.腺病毒载体容量大，可插入7.5kb的外源基因；6.腺病毒在体外容易培养制备，可达较高的病毒滴度；7.以腺病毒为载体的外源基因不能整合到靶细胞的基因组DNA中，因此表达时间相对较短。用于肿瘤基因治疗时，尽管表达时间相对较短，但并不影响外源基因的表达水平，而高水平的外源基因表达可在杀死肿瘤细胞后迅速消退，从而减少外源基因可能的不良反应。

具有合成PIK3C2A蛋白的基因为PIK3C2A基因。PIK3C2A基因的序列表附于后续，采用常规方法按此基因序列表即可合成。

治疗所用的重组腺病毒的有效量依赖于，比如，治疗目标、给药的途径和患者的病情。因此，治疗学家优选滴定确定剂量并根据要求修改给药途径，以获得最佳治疗效果。一般情况下，临床医师将给药重组腺病毒直至达到实现所需效果的剂量。这种治疗方法的进行易于由常规检测方法监控。本发明中所提到的“有效量”与本领域通常的“有效量”含义相同；同样，本发明中所指的“有效抑制浓度”是临床医师将给药重组腺病毒直至达到实现所需效果的浓度。

采用病毒携带基因给药方式按常规方法进行即可。采用腺病毒给药约需10天注射一次。本发明中提供的含合成PIK3C2A蛋白的基因的重组腺病毒，可以同药用的载体制备成混合物。这种药物组合物可通过静脉、口服经肠道吸收、鼻或肺给药，优选为静脉注射给药。当全身给药时，治疗组合物应该是无菌、无热源，并且在可用于肠胃外的溶液中，并适当考虑到pH值、等渗压性和稳定性。这些条件均为本领域技术人员所公知的。简言之，将具有所需纯度的腺病毒同生理可用的载体、赋形剂或稳定剂混合。这些物质的使用量和浓度上对接受者是无毒的，包括缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐和其他有机盐；抗氧化剂如抗坏血酸；小分子量(小于10个氨基酸残基)肤如聚精氨酸，蛋白如血清蛋白、明胶或免疫球蛋白等。

具体采用腺病毒对人体给药的方式为本领域常用手段即可。例如Xin Zeng，Yong Lin，Chuan Yin，Xin Zhang，Bei-Fang Ning，Qing Zhang，Jun-Ping Zhang，Lei Qiu，Xiao-Ran Qin，Yue-Xiang Chen，and Wei-Fen Xie发表于《HEPATOLOGY》Vol.54，No.6，2011的《RecombinantAdenovirus Carrying the Hepatocyte Nuclear Factor-lalpha Gene Inhibits Hepatocellular CarcinomaXenograft Growth in Mice》中得到，区别仅在于按该文献中公开的方法采用本发明提供的PIK3C2A蛋白即可。

实施例

实施例1

动物体内试验

实验方法：

1.裸鼠皮下成瘤实验

BALB/C-nu/nu免疫缺陷鼠购买自长沙景达实验动物公司，并在中南大学动物学部SPF级环境中喂养。参照Xia L等人试验方法进行了如下操作：将状态良好的细胞用胰酶消化下来后用生理盐水制成悬浮液，并将细胞的浓度调整至3×107到6×107/ml。抽取200μl的细胞悬液注射到右前肢腋窝处。从第二天开始通过每天测量皮下瘤的长径和短径来比较两组皮下瘤生长速度的差异。一个月后待皮下瘤长到一定体积，将裸鼠用颈椎脱位法处死，取出皮下瘤并拍照，用游标卡尺测量皮下瘤的长径和短径。皮下瘤体积的计算公式为：体积(cm3)＝长径×短径2/2。

2 体内成瘤实验

体内成瘤实验根据Xia L等人的试验方法进行，并根据实验条件和实验要求做了相应的调整和改进，简要步骤如下：将皮下瘤放于生理盐水中，用手术刀片切割成约1mm3的小块。采用5％水合氯醛麻醉，每只裸鼠腹腔内注射100μl的5％水合氯醛溶液。待裸鼠麻醉后，用碘伏棉球擦拭消毒裸鼠胸腹部，用手术刀切开剑突左侧皮肤，再横向剪开腹壁肌层，将裸鼠肝脏挤出腹腔外。用眼科剪将左肝叶肝被膜剪开，将预先准备好的皮下瘤小块塞入肝被膜下，并用明胶海绵止血，将肝脏送回腹腔，缝线关闭腹腔。种植一个月后，将裸鼠用颈椎脱位法处死，完整取出裸鼠的肝脏和肺脏，并将裸鼠的肝脏依次排开观察并拍照。然后采用4％甲醛浸泡所取下来的肝脏和肺脏。将裸鼠肝脏和肺脏石蜡包埋后，用切片机切成厚度约5μm的切片，HE染色后显微镜下观察裸鼠肝脏和肺脏内的有无转移灶并计数。

动物实验结果：

下调PIK3C2A的表达在体内可明显提高其增殖能力。

进一步将SMMC7721shPIK3C2A细胞和SMMC7721Control细胞注射到裸鼠左前肢腋皮下，一个月后将裸鼠处死，取出皮下瘤拍照并测量皮下瘤体积。结果列于图9中，表明SMMC7721shPIK3C2A细胞所行成的皮下瘤体积明显大于SMMC7721Control细胞所形成的皮下瘤体积(0.567±0.205vs.0.12±0.058，P＜0.05，图9.A，B)。随后，为了更好的模拟肝细胞癌发生发展的过程和贴近肝细胞癌所处的环境，将皮下瘤切成1mm3的小块后种植于裸鼠肝被膜下，1个月后比较两组原位肝肿瘤体积的差异；结果显示：SMMC7721shPIK3C2A组的原位瘤体积要明显大于SMMC7721Control组(0.496167±0.132vs.0.103143±0.156，P＜0.05，图9.C，D)。上述实验结果充分证明，在肝癌细胞中下调PIK3C2A的表达水平，在体内同样可以明显提高肝癌细胞的增殖的能力。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种PIK3C2A蛋白在治疗肝癌药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物含有效量的合成PIK3C2A蛋白的基因的病毒。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述PIK3C2A蛋白是由PIK3C2A基因在人体内经腺病毒转染进入宿主细胞后，在宿主细胞内经转录翻译产生的。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述PIK3C2A蛋白在抑制肝癌细胞的生长和侵袭转移的药物中的应用。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述PIK3C2A蛋白在治疗孤立性大肝癌和早期肝癌的药物中的应用。