CN105039333A

CN105039333A - 肝癌靶向肽及其应用

Info

Publication number: CN105039333A
Application number: CN201510522717.7A
Authority: CN
Inventors: 尹海芳; 高先军; 赵静雯; 荆韧威; 左冰峰
Original assignee: Tianjin Medical University
Current assignee: Tianjin Medical University
Priority date: 2015-08-21
Filing date: 2015-08-21
Publication date: 2015-11-11
Anticipated expiration: 2035-08-21
Also published as: CN105039333B

Abstract

本发明公开了能与肿瘤特异性结合的靶向多肽，特别是能特异性结合于肝癌组织的靶向肽及其在肝癌诊断和治疗中的应用。本发明公开的肝癌靶向肽优选HCC-47，其氨基酸序列为：SQDIRTWNGTRS；其特异性结合于肝癌组织，而与宫颈癌细胞Hela、乳腺癌细胞MDA-MB231、肾癌细胞CRL-1932以及肺癌细胞A549无特异性结合。该多肽是利用噬菌体展示文库及活体切片技术相结合，通过体外生物淘选而获得；可应用于肝癌的早期诊断分子影像学制剂中；也可应用于肝癌治疗药物的靶向修饰及制剂；还可应用于对药物运输载体进行的靶向修饰，为肝癌患者的诊断或治疗提供新的途径。

Description

肝癌靶向肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种靶向多肽，特别是能特异性结合于肝癌组织的靶向肽及其在肝癌诊断和治疗中的应用。

背景技术

肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)是我国常见恶性肿瘤之一，死亡率高，在恶性肿瘤中死亡率仅次于胃癌和食道癌，居第三位。在所有的治疗措施中，手术治疗仍然是获得长期生存的首选方法。经过数十年的努力，肝癌术后10年生存率已经提高了近6倍，但是5年生存率仍不超过5％。传统的化疗药物在肝细胞癌的疗效十分有限且有可能发生严重的副作用。因此，肝癌治疗药物的靶向运输对于化疗药物的研发具有非常重要的作用。化疗药物的分子靶向治疗是针对癌细胞或是癌症组织微环境发展出来的治疗方法，其发展是近年来癌症治疗学最重要的进展之一。与传统化学药物相比，分子靶向治疗药物具有效率高、专一性强、副作用低的优势。利用噬菌体文库展示技术可以筛选到肝癌组织靶向性短肽，通过和化疗药物的偶联，达到提高靶向治疗效果、减少副作用等作用。

目前公开的关于肝癌靶向肽技术相关的研究主要是针对单一肝癌细胞，如中央研究院的专利CN101918433B公开的是特异性结合HCC细胞的肽；陕西师范大学的专利CN201110451767.2公开的是特异性结合肝癌HepG2细胞系的多肽；也有一些是针对肝癌肿瘤血管的靶向多肽，如复旦大学附属中山医院的专利CN1224630C中公开了采用噬菌体随机肽库体内展示技术及激光显微切割技术在高转移人肝癌裸鼠模型上筛选能与肝癌肿瘤血管内皮细胞特异结合的靶向多肽；在实际的靶向肽筛选过程中，有的是体外合成受体细胞或者利用模型鼠体内肿瘤进行肝癌靶向肽的筛选，并不能有效模拟肝癌患者体内的肿瘤生长环境，与临床应用的差别会比较大。

发明内容

本发明的目的在于针对肝癌的靶向性治疗提供更多高效、特异的肝癌组织靶向肽，为肝癌患者的诊断或治疗提供新的途径。

本发明提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码特异于肿瘤组织的多肽，并且所述多核苷酸包含选自SEQIDNO:1或SEQIDNO:3或SEQIDNO:5或SEQIDNO:7或SEQIDNO:9或SEQIDNO:11或SEQIDNO:13或SEQIDNO:15或SEQIDNO:17或SEQIDNO:19或SEQIDNO:21或SEQIDNO:23或SEQIDNO:25或SEQIDNO:27或SEQIDNO:29或SEQIDNO:31或SEQIDNO:33或SEQIDNO:35或SEQIDNO:37或与上述任一序列具有至少80％同源性的序列，再优选为至少具有90％相同性，更优选为至少具有95％、96％、97％、98％、99％的相同性。

本发明提供一种多肽，所述多肽特异于肿瘤组织，并且所述多肽包含选自SEQIDNO:2或SEQIDNO:4或SEQIDNO:6或SEQIDNO:8或SEQIDNO:10或SEQIDNO:12或SEQIDNO:14或SEQIDNO:16或SEQIDNO:18或SEQIDNO:20或SEQIDNO:22或SEQIDNO:24或SEQIDNO:26或SEQIDNO:28或SEQIDNO:30或SEQIDNO:32或SEQIDNO:34或SEQIDNO:36或SEQIDNO:38或与上述任一序列具有至少80％同源性的序列，再优选为至少具有90％相同性，更优选为至少具有95％、96％、97％、98％、99％的相同性。所述多肽优选SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的序列，更优选SEQIDNO:4的序列。

本发明提供一种多肽，能特异性结合于肿瘤组织，优选肝癌组织，而与宫颈癌细胞Hela、乳腺癌细胞MDA-MB231、肾癌细胞CRL-1932以及肺癌细胞A549无特异性结合。在某一实施方案中，所述多肽选自HCC-46(SEQIDNO：2)、HCC-47(SEQIDNO：4)、HCC-48(SEQIDNO：6)。

所述多肽特异性结合于肝癌组织但不限于肝癌组织，如还可能特异于胃癌组织、直肠癌组织、乳腺癌组织、肺癌组织、结肠癌组织、脑组织、骨骼组织等。

本发明提供一种偶联物，所述多肽与一种或多种药物偶联，用于癌症的治疗，其制备方法是将所述多肽作为靶向载体，加上制药学上可接受的药物，按照常规方法制备成抗肿瘤药物制剂即可。所述一种或多种药物选自多柔比星、长春瑞滨、长春新碱、帕利他塞、勒托替康、替莫唑胺、紫杉醇、柔红霉素、秋水仙碱、寡核苷酸、毒素、抗-VEGF适体以及放射分子等。

本发明提供一种与所述多肽修饰的生物载体，所述生物载体优选生物纳米材料，如脂质体或exosome或其他常规纳米材料。通过常规方法将本发明的多肽与生物纳米材料进行偶联，用于癌症的治疗。

所述与多肽修饰的生物载体应用于脂质体靶向治疗药物，脂质体靶向治疗药物包含选自多柔比星、长春瑞滨、长春新碱、帕利他塞、勒托替康、替莫唑胺、紫杉醇、柔红霉素、秋水仙碱、寡核苷酸、毒素、抗-VEGF适体以及放射分子的至少一种药物。

所述与多肽结合的生物载体为exosome靶向治疗药物，所述多肽与exosome特异性结合的小肽进行偶联。优选的，与exosome特异性结合的小肽为与exosome膜表面稳定表达的膜蛋白CD63具有特异性的小肽，其氨基酸序列为CP05(SEQIDNO:39)或CP07(SEQIDNO:40)，优选CP05(SEQIDNO:39)。

本发明提供了上述多肽在治疗哺乳动物中的疾病的用途；优选的，所述多肽在治疗哺乳动物的癌症疾病的用途；更优选的，所述癌症是肝癌；更优选的，所述哺乳动物是人。

本发明提供了上述多肽在诊断受试者癌症中的应用，将所述多肽与分子影像学造影剂进行连接，利用核磁共振检测对肿瘤组织进行活体影像学诊断；在某一实施方案中，将多肽HCC-47与分子影像学增强剂Gd经螯合剂DTPA进行连接，结果显示通过HCC-47连接的Gd能够清晰显示肝癌肿瘤所在位置。所述多肽不仅限于与分子影像学增强剂Gd连接，还可选择常用的其他分子影像学造影剂，如Mn-DPDP，SPIO(铁氧化物纳米颗粒造影剂)等。

本发明提供的多肽可利用本领域已知方法生产。可以基于细胞的方法和无细胞体外转录/翻译方法生产肽。也可以利用本领域已知的技术进行合成，如液相法、固相法、酶促合成法等进行合成。

本发明还提供了上述多肽的筛选和鉴定方法，利用噬菌体展示文库及活体切片技术相结合，通过体外生物淘选，进行肝癌组织特异性短肽的筛选和鉴定。

在所述多肽的筛选和鉴定方法，本发明还创建了一套肝癌活体组织体外培养平台，并将其与噬菌体展示技术相结合，以人活体肝癌组织切片为靶标，创造更加接近临床状态的筛选过程，筛选出与人肝癌组织高效、特异性靶向的短肽，并在人肝癌组织及肝癌模型鼠上进行验证。所述活体组织培养平台利用C57BL/6小鼠建立肝活体切片系统，优化肝活体切片的体外培养条件，并从形态学、细胞染色、ATP含量及LDH酶活性四个方面检测肝活体切片在体外培养的活力和生存周期，以确认最佳筛选时间。最佳筛选时间优选12小时以内，活体组织形态，细胞生物学特征等方面的指标均表现为正常。

本发明提供的多肽，筛选自人活体肝癌组织切片，并经过肿瘤靶向性的验证，其具有高效、特异的肝癌靶向性，能与现有的肿瘤药物、药物载体、以及分子影像学制剂等进行偶联，实现新的肿瘤治疗途径。

附图说明

图1为C57BL/6小鼠肝活体切片不同培养时间点H&E染色(scalebar＝100μm)

图2为C57BL/6小鼠肝活体切片不同时间点PI染色结果(scalebar＝50μm)

图3为C57BL/6小鼠肝活体切片不同时间点的PI染色定量分析结果

图4为C57BL/6小鼠不同时间点肝活体切片中ATP含量

图5为C57BL/6小鼠不同时间点肝活体切片细胞毒性结果

图6为噬菌体随机肽库在人肝癌活体切片上的筛选

图7为候选噬菌体在人肝癌活体切片中的回收量

图8a为荧光显微镜观察候选短肽进入肝细胞及肝癌细胞系的能力(scalebar＝100μm)

图8b为流式细胞术检测候选短肽进入肝细胞及肝癌细胞系的效率(scalebar＝100μm)

图9a为荧光显微镜观察候选短肽进入肝癌及非肝癌细胞系的能力(scalebar＝100μm)

图9b为流式细胞术检测候选短肽进入肝癌及非肝癌细胞系的效率(MHCC-LM3：高转移性肝癌细胞；Hela：宫颈癌细胞；MDA-MB231：乳腺癌细胞；CRL-1932：肾癌细胞；A549：肺癌细胞)

图10a为候选短肽HCC-46和HCC-47在肝癌模型鼠各组织中的分布；BF为明场下的原位肿瘤组织，箭头所示灰白色部分为瘤块

图10b为候选短肽在各组织中荧光定量分析(MFI＝MeanFluorescenceIntensity)

图11为候选短肽HCC-47经linker短肽CP05靶向修饰exosome后其在体内的组织分布情况

图12为候选短肽HCC-47在肝癌模型中的核磁共振成像图

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面对本发明的具体实施方式作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。

主要仪器设备说明：

活体切片机	Campden公司英国
		石蜡切片机	Leica公司德国
冷冻切片机	Leica公司德国
		CO₂培养箱	Thermo公司日本
纯水机	Millipore公司美国
		小动物活体成像仪	IVIS Spectrum PE公司美国
超净工作台	AIRTECH中国
		台式高速冷冻离心机	Eppendorf公司德国
PCR仪	BIO-RAD美国
		梯度PCR仪	Eppendorf公司德国
电泳仪	北京市六一仪器厂中国
		凝胶成像系统	上海Tanon公司中国
电热恒温培养箱	天津中环实验电炉有限公司中国
		高压蒸汽灭菌器	SANYO公司日本
流式细胞仪	BD FACS ArialⅡ美国
		正置荧光显微镜	Olympus BX51日本
倒置荧光显微镜	Olympus IX71日本
		全自动酶标仪	Bio-Tek Synergy HT美国
-80℃低温冰箱	SANYO公司日本
		-20℃低温冰箱	海尔公司中国
制冰机	GRANT公司美国
		分光光度计	NanoDrop 2000c美国
GloMax化学发光检测仪	Promega公司美国

菌株及噬菌体材料说明：

噬菌体随机展示文库	Ph.D-12,New England Bio-lab公司
		大肠杆菌	ER2738,New England Bio-lab公司

实施例1：多肽的制备方法

本实施例的多肽HCC-1(SEQIDNO：8)、HCC-5(SEQIDNO：10)、HCC-20(SEQIDNO：12)、HCC-46(SEQIDNO：2)、HCC-47(SEQIDNO：4)、HCC-48(SEQIDNO：6)由Chinapeptide公司制备。多肽合成步骤如下：

(1)树脂溶涨。将2-ChlorotritylChlorideResin放入反应管中，加二氯甲烷DCM(15ml/g)，振荡30min；

(2)通过沙芯抽滤掉溶液，加入摩尔数3倍过量的Fmoc-Leu-OH氨基酸，加入二甲基甲酰胺DMF溶解，再加入10倍摩尔过量的DIEA，振荡60min，用甲醇封闭；

(3)脱保护。去掉DMF，加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min；

(4)检测。抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入检测试剂检测，105℃－110℃加热5min,变深蓝色为阳性反应；

(5)DMF(10ml/g)洗两次，DCM(10ml/g)洗两次，DMF(10ml/g)洗两次；

(6)缩合反应。保护氨基酸三倍过量，HBTU三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入十倍过量的DIEA，反应30min；

(7)取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入检测试剂检测，105℃－110℃加热5min,无色为阴性反应；

(8)DMF(10ml/g)洗一次，DCM(10ml/g)洗两次，DMF(10ml/g)洗两次；

(9)重复三至六步操作，从C端到N端依次连接序列中的氨基酸；

(10)抽干。按照下列方法洗树脂。DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次，抽干10min；

(11)从树脂上切割多肽。配制切割液(10/g)TFA95％；水1％；EDT2％；TIS2％，切割时间为120min；

(12)吹干洗涤。将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥干；

(13)分析提纯。用高效液相色谱将粗品提纯；

(14)冻干。收集目标多肽溶液放入冻干机中进行浓缩，冻干成白色粉末。

实施例2：肝活体切片培养及活性鉴定方法

1.肝活体切片的制备与培养

1)取6-8周的C57BL/6小鼠，脱颈处死后，取出完整的肝叶，立即放入4℃预冷并提前通氧的KHB缓冲液中，用组织粘合剂将肝叶固定在粘合了琼脂片的样品托上。

2)活体切片机切厚度为250μm的肝切片，为了更好的保证组织的完整，减少切割对肝组织造成的损伤，使用不高于0.05mm/s的速度进行切片，刀片振幅为1.75mm，震动频率为75Hz。

3)将收集的切片在加入1％P/S的DPBS中漂洗3次后放置在加入肝活体切片培养基的培养板中，在含5％CO₂的37℃恒温培养箱中培养。

2.肝活体切片活力的检测

1)形态学检测

a.分别收集培养0h、3h、6h、12h、24h的肝活体切片固定在包氏液中，至少固定12小时后将组织取出，70％乙醇-80％乙醇-90％乙醇-无水乙醇Ⅰ-无水乙醇Ⅱ各级脱水半小时，在二甲苯中透明20分钟后浸泡在60℃融化的石蜡中至少4小时，将浸好蜡的组织用石蜡包埋好并固定在包埋盒上。

b.用石蜡切片机将包埋好的组织切成8μm厚的切片，在展片机中展片，再用载玻片捞起放置在烤片机上70℃烘烤至少2小时。

c.将烘烤好的切片在二甲苯Ⅰ-二甲苯Ⅱ各级15分钟脱蜡后梯度乙醇水化，无水乙醇Ⅰ-无水乙醇Ⅱ-90％乙醇-80％乙醇-70％乙醇-蒸馏水各级5分钟。

d.进行H&E染色，苏木素染色15分钟，蒸馏水冲洗后1％盐酸乙醇分色5秒钟，自来水冲洗数分钟返蓝；伊红染色3分钟，蒸馏水冲洗后梯度脱水，70％乙醇30秒-80％乙醇30秒-90％乙醇1分钟-无水乙醇Ⅰ3分钟-无水乙醇Ⅱ5分钟，二甲苯中透明5分钟后中性树胶封片。

e.待树胶完全晾干后，在正置显微镜下观察组织切片的细胞形态。

结果显示在体外培养24小时内肝切片仍具有完整的细胞形态，0～6小时内细胞完整，界限清晰，胞核大小正常；培养12小时后胞核逐渐开始皱缩，但仍具有正常肝细胞的形态(结果见图1)。

2)细胞活力检测

a.在肝活体切片培养0h、3h、6h、12h、24h时，取切片与浓度为10μg/mL的碘化丙啶PI溶液避光共孵育10分钟，DPBS漂洗3遍后将切片放置在涂好O.C.T的软木垫上，在提前冰冻好的异戊烷中迅速冷冻。

b.用冷冻切片机将冷冻好的肝切片组织切成8μm厚的切片，在正置荧光显微镜下观察PI染细胞核的情况。

c.利用Image-ProPlus软件定量分析荧光图片中PI染色的荧光强度及比例。

结果显示，在24小时以内，活体切片中的大部分细胞核未被染上红色(结果见图2)，Image-ProPlus软件定量分析的结果与图片中的染色情况一致(结果见图3)。

3)三磷酸腺苷(ATP)检测

a.将培养了0h、3h、6h、12h、24h的肝活体切片称重后在加入1mLddH₂O的匀浆器中研磨成组织匀浆液，12000g，4℃离心10分钟，取上清。以刚取下的新鲜肝组织作为对照按上述方法得到匀浆液，离心取上清。样品上清液均用ddH₂O稀释10倍待用。

b.将试剂盒(CellTiter-GloLuminescentCellViabilityAssay)中的ATP标准品用ddH₂O稀释到适当的浓度，例如：10nM、50nM、100nM、500nM、1000nM。

c.将试剂盒中提供的底物按照每孔中100μL的量加到不透光的96孔板中，再将不同浓度的标准品及样品稀释后的上清液各100μL加到孔中，轻轻晃动2分钟，使样品与底物充分混匀。

d.室温避光静置10分钟，使荧光信号稳定后在化学发光检测仪上检测荧光素发出的荧光值。

e.以ATP标准品浓度为横坐标，相应检测出的荧光值为纵坐标作标准曲线图。由标准曲线得到荧光值-ATP浓度的一次方程式，再根据公式及样品的荧光平均值计算出样品中的ATP浓度。根据：ATP含量(nM/g)＝ATP浓度×10/重量(公式2)计算出单位重量肝活体切片中的ATP含量。

结果显示：体外培养12小时以内的活体切片中ATP的含量与对照组相比无明显差异且含量稳定，这表明在12小时内活体切片中的蛋白未被降解，提示活体切片在体外培养12小时内能保持良好的活性。体外培养24小时的活体切片中ATP含量出现显著下降，提示体外培养24小时后肝活体切片活性出现显著下降(结果见图4)。

4)乳酸脱氢酶(LDH)检测

a.将肝活体切片按照不同重量培养15分钟后，分别收上清液和组织切片，静置在4℃待用。将上清液250g离心10分钟，取上清，此为LowControl样品。将肝组织切片以1mL含有2％TritonX-100的组织培养液充分匀浆，250g离心10分钟，取上清，此为HighControl样品。培养基为Background样品。

b.将试剂盒中bottle1中的粉末用1mLddH₂O溶解，保存在4℃待用。检测样品前，将bottle1与bottle2按照45:1的比例混合，现用现配。

c.分别取Background、LowControl、HighControl样品各100μL，加到96孔中，再将混合后的反应液每孔加100μL，室温避光静置30分钟，在492nm和620nm波长范围检测吸光值。

d.将LowControl和HighControl组的吸光值与Background组的吸光值相减，得到OD_492nm和OD_620nm，以组织切片的重量为横坐标，以LowControl和HighControl组的OD_492nm-OD_620nm值为纵坐标分别得到两组曲线，在曲线上取LowControl和HighControl差值最大的一组，此点对应的切片重量即为检测样品最佳的量，在后续的检测试验中，每个检测样品的量应尽量接近于此值。

e.按照前述得到的最佳重量将切片培养在培养板中，将培养了0h、3h、6h、12h、24h的上清液经250g离心10分钟后分别取上清，为Experiment组。同时按照前述方法得到Background、LowControl、HighControl组。

f.取96孔板，将Background、LowControl、HighControl、Experiment组样品分别取100μL加到孔中，配制反应混合液，每孔加100μL，室温避光静置30分钟，在492nm和620nm波长范围检测吸光值。

g.将所有组的吸光值减去Background的吸光值，得到的两个波长吸光值再相减OD_492nm-OD_620nm，每个样品的三个重复取平均值得到ExperimentValue，根据：Cytotoxicity(％)＝(ExperimentValue-LowControl)/(HighControl–LowControl)x100(公式3)计算出肝活体切片不同时间点的细胞毒性值。

结果显示，0～6小时LDH的值逐渐升高，12小时时间点下降，24小时又明显升高，因肝中释放的LDH半衰期为7～12小时。综合以上四个方面的结果，可判定肝活体切片在12小时内可以保持良好的活性，培养6小时内的活体切片用以筛选更佳(结果见图5)。

综上，本实验发明中建立了体外肝活体切片培养技术平台，并利用已建立的方法对肝切片进行体外培养。通过对不同培养时间点肝活体切片的组织形态、ATP含量、LDH酶活性等方面的测试，确定了肝切片体外培养的最佳时间为12小时以内，其组织形态，细胞生物学特征等方面的指标均表现为正常，满足后续实验要求。

实施例3：多肽的筛选方法

利用实施例2中建立的肝切片培养及活性鉴定方法，取临床肝细胞癌患者的新鲜肿瘤标本进行活体切片，将肝癌肿瘤组织切成250μm厚的切片，在培养箱中培养1小时后进行噬菌体生物淘选，结果4轮筛选后，收集最后一轮回收产物进行二代测序，选取克隆数最多的序列作为候选肝癌组织靶向肽。具体过程如下：

1)将刚取下的临床肝癌患者的组织标本按上述方法活体切片后培养，将滴度为1×10¹¹pfu的噬菌体与培养基混匀，加入到培养板中，与活体切片共孵育2小时。

2)将培养基吸出，用DPBS漂洗5遍，洗脱未与肝癌活体切片结合的噬菌体，用匀浆器将切片充分研磨，使组织分散为单个细胞。1500rpm离心5分钟，弃上清。

3)回收特异性结合噬菌体并扩增，测定扩增后的噬菌体滴度，按照1×10¹¹pfu加入到肝癌组织活体切片，进行下一轮的生物淘选。

4)为了得到更多的候选短肽，利用两种不同的测序方法对候选短肽进行检测。除了将20个单克隆基因组测序之外，利用primer5.0软件设计引物，对第二轮回收的噬菌体基因组DNA进行梯度PCR，得到最佳退火温度；大体系PCR后胶回收，进行第二代高通量测序。引物序列及退火温度见表1。

表1.噬菌体基因组DNA插入片段二代测序PCR反应引物

结果显示，经过四轮的筛选，随着筛选轮次的增加，回收的噬菌体滴度出现显著增加，提示筛选所得的噬菌体有明显的富集(结果见图6)。

将第四轮回收的噬菌体单克隆基因组进行测序，得到三条潜在的候选靶向短肽，命名为HCC-1、HCC-5、HCC-20。同时，将第二轮回收的噬菌体肽库进行高通量二代测序，得到三条潜在的候选短肽，命名为HCC-46、HCC-47、HCC-48，选择以上候选短肽进行功能验证。

实施例4：候选短肽的鉴定

1.候选噬菌体在活体切片上的验证

1)根据单克隆基因组的测序结果确定候选噬菌体及对照无插入片段噬菌体，将以上噬菌体单克隆扩增后测定滴度。

2)临床肝癌患者的肿瘤组织标本按上述方法活体切片后培养，候选噬菌体及对照噬菌体均按照1×10¹¹pfu的量与活体切片共孵育2小时。

3)将培养基吸出，用DPBS漂洗5遍后，用匀浆器将切片充分研磨，使组织分散为单个细胞。1500rpm离心5分钟，弃上清。

4)分别回收与活体切片结合的噬菌体，测定其滴度，比较不同候选噬菌体及对照噬菌体与目标组织结合的数量。

结果：根据单克隆基因组的常规测序结果，确定候选噬菌体HCC-1、HCC-5、HCC-20和对照的无插入片段的HCC-15噬菌体，将单克隆扩增后按照相同的滴度加入到人肝癌组织活体切片中，孵育2小时候回收结合的噬菌体，回收量如图7所示。三个候选噬菌体的回收量均高于对照噬菌体，提示噬菌体对于人肝癌组织活体切片具有一定的特异性结合能力。

2.候选短肽在细胞中的验证

1)接种适量的细胞(1×10⁵个/孔)到24孔板中，使之在次日长到70％～80％左右的密度，弃掉旧培养基，用DPBS温和地清洗细胞后，加入无血清的DMEM基本培养基。

2)将带有FAM荧光标记的候选短肽按照5μM的浓度在DMEM培养基中吹打混匀加到24孔板的细胞中，37℃,5％CO₂培养箱中避光培养6小时。每组实验作三个复孔及不加候选短肽的对照孔。

3)弃掉每孔细胞中的培养基，用DPBS温和地漂洗细胞5遍后，加500μLDPBS，利用倒置荧光显微镜观察候选短肽进入不同细胞的情况。

4)弃掉每孔细胞中的DPBS，加250μL0.25％胰蛋白酶，待大部分细胞消化呈圆形，加入等体积的培养基终止消化，并用枪头反复吹打使细胞尽量分散，转移至干净的1.5mLEP管中，1500rpm离心5分钟。

5)弃上清，用200μLDPBS将细胞充分重悬后，利用流式细胞仪分析候选短肽在不用细胞中的荧光强度。

结果：利用实施例1的制备方法合成六条候选短肽，标记FAM荧光，按照5μM的浓度分别与人正常肝细胞H7702和不同人肝癌细胞系SMMC-7721、HepG2、MHCC-LM3共孵育，在荧光显微镜下观察不同短肽进入不同细胞的效率(结果见图8a)，再利用流式细胞仪进行定量检测(结果见图8b)。六条候选短肽在人肝癌细胞系MHCC-LM3中的进入效率均高于正常肝细胞H7702，在其他人肝癌细胞中也有不同程度的结合。

为了验证候选短肽在肝癌细胞中的特异性，初步研究候选短肽的靶向位点，将荧光标记的六条候选短肽按照5μM的浓度分别与人高转移性肝癌细胞MHCC-LM3和宫颈癌细胞Hela、乳腺癌细胞MDA-MB231、肾癌细胞CRL-1932以及肺癌细胞A549四种其他癌细胞共孵育，并在荧光显微镜下观察6条候选短肽进入人不同癌细胞的效率(结果见图9a)，利用流式细胞仪进行定量检测(结果见图9b)。候选短肽HCC-46和HCC-47在MHCC-LM3细胞中的进入效率明显高于其他癌细胞；候选短肽HCC-48在MHCC-LM3细胞中表现出更高的摄取率，在乳腺癌细胞MDA-MB-231中的进入效率也高于其他癌细胞；候选短肽HCC-1、HCC-5和HCC-20在五种癌细胞系中的摄取率没有显著差异。

综上所述，候选短肽HCC-46、HCC-47和HCC-48在人肝癌细胞中都表现出了较高的特异性。

3.候选短肽在肝癌模型裸鼠上的验证

1)提前接种原位瘤小鼠，待小鼠产生肿瘤，按照25mg/kg的注射量将带有FAM标记的候选短肽通过尾静脉注射到肝癌模型鼠的体内，每组实验作三个重复。

2)注射30分钟后将模型鼠麻醉，肝门静脉灌流，利用小动物活体成像系统观察候选短肽在模型鼠体内的组织分布情况。

结果：将带有荧光标记的候选短肽HCC-46、HCC-47按照25mg/kg的剂量通过尾静脉注射到提前建立的肝癌模型鼠体内，利用小动物成像系统观察短肽在肝癌肿瘤组织及周围正常肝组织中的分布情况(结果见图10a)，并对分布情况进行荧光定量(结果见图10b)。结果显示候选短肽可特异性的富集在肝癌肿瘤组织中。表明筛选所得的候选短肽具有肝癌组织靶向特性。

实施例5：多肽HCC-47与exosome偶联组合物

1)体外重组exosome表面CD63的loop区，以该重组的loop区为底物进行噬菌体肽库筛选，获得与CD63的loop区特异性结合的小肽，其氨基酸序列为CP05(SEQIDNO:39)，或CP07(SEQIDNO:40)；

所述小肽的筛选方法为体外重组跨膜蛋白CD63的loop区，重组的该loop区的氨基酸序列为SEQIDNO:41，以该重组的loop区为底物进行噬菌体肽库筛选。在此需要说明的是，跨膜蛋白CD63在exosome膜外有大小两个loop区，本发明涉及的重组CD63的loop区，均为重组CD63的大loop区。

2)将所得小肽与靶向肽HCC-47以偶联的方式结合，结合所得嵌合短肽通过与exosome共孵育的方式连接到exosome表面CD63的loop区上。

结果表明，多肽HCC-47与exosome通过小肽CP05(SEQIDNO:39)偶联后的组合物对肝癌组织具有很好的靶向性(结果见图11)。

实施例6：多肽HCC-47与阿霉素偶联在肝癌治疗中的应用方法

1)称取4mgHCC-47多肽溶于1.5ml蒸馏水中。

2)称取阿霉素(DOX)2.5mg溶于1ml蒸馏水中，并加入多肽溶液中。

3)依次加入EDC-HCl0.9mg和2粒NHS。

4)前2小时放置常温搅拌，4℃搅拌48小时。

结果表明，多肽HCC-47与阿霉素偶联后的组合物对肝癌组织具有很好的靶向性。

实施例7：多肽HCC-47与诊断分子影像学中的应用方法

将候选短肽HCC-47与分子影像学造影增强剂Gd经螯合剂DTPA进行连接，利用核磁共振检测对肿瘤组织进行活体影像学诊断(结果见图12)。结果显示通过HCC-47连接的Gd能够清晰显示肿瘤所在位置。证明这一短肽能够被应用于分子影像学诊断。

本发明的肝癌靶向肽及其应用已经通过具体的实施例进行了描述。本领域技术人员可以借鉴本发明的内容适当改变其技术方案来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为包括在本发明的范围之内。

Claims

1.一种多核苷酸，包含选自SEQIDNO:1或SEQIDNO:3或SEQIDNO:5或SEQIDNO:7或SEQIDNO:9或SEQIDNO:11或SEQIDNO:13或SEQIDNO:15或SEQIDNO:17或SEQIDNO:19或SEQIDNO:21或SEQIDNO:23或SEQIDNO:25或SEQIDNO:27或SEQIDNO:29或SEQIDNO:31或SEQIDNO:33或SEQIDNO:35或SEQIDNO:37或与上述任一序列具有至少80％同源性的序列。

2.一种多肽，包含选自SEQIDNO:2或SEQIDNO:4或SEQIDNO:6或SEQIDNO:8或SEQIDNO:10或SEQIDNO:12或SEQIDNO:14或SEQIDNO:16或SEQIDNO:18或SEQIDNO:20或SEQIDNO:22或SEQIDNO:24或SEQIDNO:26或SEQIDNO:28或SEQIDNO:30或SEQIDNO:32或SEQIDNO:34或SEQIDNO:36或SEQIDNO:38或与上述任一序列具有至少80％同源性的序列；优选的，选自SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的序列。

3.权利要求2的多肽，与肿瘤组织，特别是肝癌组织特异性结合。

4.一种偶联物，由权利要求2的多肽与一种或多种药物偶联；优选的，所述一种或多种药物选自多柔比星、长春瑞滨、长春新碱、帕利他塞、勒托替康、替莫唑胺、紫杉醇、柔红霉素、秋水仙碱、寡核苷酸、毒素、抗-VEGF适体或者放射性分子。

5.一种组合物，由权利要求2的多肽与生物载体组合；优选的，所述生物载体为脂质体或exosome；更优选的，生物载体为exosome。

6.权利要求5的组合物，多肽与exosome特异性结合的小肽进行偶联；优选的，多肽与exosome特异性结合的小肽为与exosome膜表面稳定表达的膜蛋白CD63具有特异性的小肽；更优选的，所述小肽的氨基酸序列为SEQIDNO:39或SEQIDNO:40。

7.权利要求2所述的多肽在制备癌症治疗药物中的用途。

8.权利要求5所述的组合物在制备癌症治疗药物中的用途。

9.权利要求2所述的多肽在诊断受试者癌症中的用途。

10.权利要求9的用途，将多肽与分子影像学增强剂Gd经螯合剂DTPA进行连接，用于影像检测。