CN114196617B - 器官特异性的乳腺癌转移模型及其建立方法和应用 - Google Patents

器官特异性的乳腺癌转移模型及其建立方法和应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及器官特异性的乳腺癌转移模型及其建立方法和应用。具体而言，提供了一种肝特异性转移型乳腺癌细胞，所述细胞源自4T07细胞系。相较于4T07细胞系，本申请的转移型乳腺癌细胞具有更高的迁移和转移能力，可用于建立乳腺癌转移动物模型。本申请的细胞及其模型，为乳腺癌的药物筛选、研究转移型乳腺癌的机理、探索转移相关的危险因素和免疫调控机制、开发临床诊断和治疗方案提供了有用的工具。

Description

器官特异性的乳腺癌转移模型及其建立方法和应用
技术领域
本申请涉及医学、临床、生物学领域。具体而言，涉及一种细胞系；尤其涉及一种器官特异性的乳腺癌转移模型、及其建立方法和应用。
背景技术
现阶段，恶性肿瘤已经成为威胁人类生命健康的主要威胁。根据WTO组织公布的2020年全球癌症病例数据，全球癌症新发病例约为1930万例，死亡病例为996万例。我国新发癌症457万例，死亡病例约为300万例。恶性肿瘤毫无疑问严重影响着我国居民的身体健康。
乳腺癌是全球女性发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，在中国也是女性最常见的肿瘤，占各类肿瘤新增病例的15％[1]。乳腺癌远端器官转移显著影响预后，是乳腺癌患者死亡的主要原因[2]，其好发转移部位依次为骨、肺、肝、脑等[3]。30％以上的乳腺癌患者会出现肝转移，中位生存期仅为4.8至15个月[4]。乳腺癌不同亚型的优先转移部位存在差异，报道表明管腔型乳腺癌患者中主要发生骨转移，三阴性乳腺癌患者中肺转移的频率较高，而HER2+亚型有着高肝转移的风险。不同的亚型在远端转移器官方面具有一定独特性[5]。
乳腺癌肝转移患者早期病灶隐匿，当出现腹水、黄疸、肝肿大等临床症状时，疾病已经进入晚期。此外，与其他部位转移相比，肝转移对化疗、内分泌等全身治疗的反应较差，因此乳腺癌肝转移患者的预后水平不佳[6]。
目前对于乳腺癌肝转移患者的主要治疗方式分为两种，全身治疗和局部治疗。全身治疗包括化疗、内分泌治疗、生物治疗等；局部治疗包括手术切除、立体定位放疗、射频消融(radiofrequency ablation,RFA)等[3]。手术切除是目前治疗乳腺癌肝转移的首选方式，手术切除可以有效改善生存期，但是手术的并发症发生率较高。肝动脉灌注化疗可以提高对肝转移的局部控制率和有效率，但是转移复发率较高。随着近些年RFA技术的发展，临床尝试使用RFA的方式来治疗乳腺癌肝转移，发现RFA联合化疗治疗肝转移可能具有更佳的预后效果。总之目前对于乳腺癌肝转移的治疗尚无良好的手段进行干预，具体联合治疗方式仍有待探究。
乳腺癌转移模型是筛选乳腺癌转移相关基因、研究转移嗜器官性和探究肿瘤转移分子机制的重要研究工具。乳腺癌转移模型按照建立方法可以分为自发性转移模型和实验性转移模型[7]。
建立自发性肿瘤模型的一种常见方法是：基因编辑。通过全身性或组织特异性地过表达癌基因、或敲除抑癌基因，在小鼠体内形成肿瘤(如KRAS、MYC过表达的乳腺癌小鼠模型)。这些模型的优点是肿瘤的生长过程经历了免疫耐受、免疫编辑、免疫抑制的过程，比较接近native状态。但由于成瘤时间长，异质性的差异会导致小鼠间实验结果相差较大，重复率相对于同系肿瘤模型较低。
建立自发性肿瘤模型的另一种常见方法是：将肿瘤细胞或者组织接种于皮下、肌肉或乳腺脂肪垫组织，形成肿瘤后发生自发转移，包含了从原发灶产生到转移灶形成的乳腺癌转移的全过程，是研究乳腺癌转移机制的常用模型。该模型的特点是必须完成转移的全过程才能形成肿瘤转移灶。然而，许多肿瘤细胞在自发转移模型中不能有效转移，而且肿瘤接种时的细胞操作有可能混淆转移测定的结果。
实验性转移模型是将肿瘤细胞直接通过尾静脉或肝门静脉注射的方式进入血液循环系统，在远端驻留增殖形成转移灶，有着转移发生率高的特点。然而，该过程仅涉及肿瘤转移的最后阶段，是实验性转移而非自发转移，并且一次性大量的肿瘤细胞直接进入血液会影响血循环中抗肿瘤转移机制的正常发挥[8]。
鉴于此，本领域仍需要提供一种建立器官特异性高转移细胞模型的方法和细胞系。
发明内容
本申请提供了一种转移型乳腺癌细胞，其中所述转移型乳腺癌细胞是器官特异性的。
在一些实施方案中，转移型乳腺癌细胞是肝特异性的。
在一些实施方案中，转移型乳腺癌细胞源自(制备自、来源于)非人哺乳动物。
在一些实施方案中，转移型乳腺癌细胞源自(制备自、来源于)啮齿类哺乳动物；所述啮齿类哺乳动物选自以下的任一项：小鼠、大鼠、兔、豚鼠。
在一些实施方案中，转移型乳腺癌细胞源自(制备自、来源于)4T07细胞系。
本申请中的任何细胞均胞不能发育成胚胎或完整个体。
在一些实施方案中，提供了一种转移型乳腺癌细胞系，其于2021年08月12日以保藏编号CCTCC No.C2021212保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072)。
在本申请中，转移型乳腺癌细胞是CCTCC No.C2021212细胞系的细胞、或其后代、或其培养物。
在一些实施方案中，提供了一种获得转移型乳腺癌细胞的方法，包括步骤：
1)提供低转移型乳腺癌细胞(例如，选自以下任一细胞系：4T07、66c14、67NR、168FARN、D2.OR)；优选地，所述低转移型乳腺癌细胞是4T07细胞系的细胞或其培养物；
2)任选地，对低转移型乳腺癌细胞进行标记，获得带标记的低转移型乳腺癌细胞；优选地，所述标记是稳定表达的标记；优选地，所述标记选自以下的任一项：荧光蛋白、荧光素酶、表面标记物、同位素、量子点、染料；
3)使低转移型乳腺癌细胞或带标记的低转移型乳腺癌细胞体内接触哺乳动物的肝脏，并在肝脏处形成肿瘤；
4)从步骤3)的肿瘤中收获肿瘤细胞；
5)任选地，使肿瘤细胞体内接触哺乳动物的肝脏，并在肝脏处形成肿瘤，从肿瘤中再次收获肿瘤细胞；步骤5)进行1次至3次；
6)将步骤4)或5)获得的肿瘤细胞接种哺乳动物的乳房组织，并在肝脏处形成肿瘤，从肿瘤中收获转移的肿瘤细胞；
7)任选地，将转移的肿瘤细胞接种哺乳动物的乳房组织，并在肝脏处形成肿瘤，从肿瘤中再次收获转移的肿瘤细胞；步骤7)进行1次至3次；
其中，步骤6)或7)所得的转移的肿瘤细胞即所述转移型乳腺癌细胞。
在一些实施方案中，在肺、脑、和/或肾中没有可检测水平的转移型乳腺癌细胞。
在一些实施方案中，提供了一种转移型乳腺癌细胞，其是通过前述方法获得的。
在一些实施方案中，提供了一种转移型乳腺癌动物模型，其携带有本申请的转移型乳腺癌细胞。
在一些实施方案中，转移型乳腺癌动物模型在期望的病灶处(如原位和/或转移部位)携带本申请的转移型乳腺癌细胞。
在一些实施方案中，转移型乳腺癌动物模型是非人哺乳动物。
在一些实施方案中，转移型乳腺癌动物模型是啮齿类哺乳动物。
在一些实施方案中，转移型乳腺癌动物模型选自以下的任一项：小鼠、大鼠、兔、豚鼠。
在一些实施方案中，转移型乳腺癌动物模型是荷瘤小鼠。
在一些实施方案中，所述小鼠选自以下的任一项：A/He、A/J、A/SnSf、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、BALB/c、B6SJLF1、B6C3F1、B6D2F1、C3H、C3He、C3Hf、C57BR、C57L、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H、CB6F1、CD2F1、CFW、DBA/1、DBA/2、FACA、FVB、ICR、KM、NIH、NIH(S)、RF、SJL、SWR、TA1、TA2、129。
在一些实施方案中，所述动物模型是同种移植模型，而非异种移植模型。
在一些实施方案中，在动物模型的肺、脑、和/或肾中没有可检测水平的根据本申请的转移型乳腺癌细胞。
在一些实施方案中，提供了前述转移型乳腺癌细胞在建立疾病动物模型中的用途。
在一些实施方案中，提供了一种建立转移型乳腺癌动物模型的方法，包括步骤：将本申请的转移型乳腺癌细胞接种至哺乳动物的乳房组织(例如乳腺，优选乳腺脂肪垫)。
在一些实施方案中，本申请所建立的动物模型可用于以下方面的用途：乳腺癌肝转移的研究；转移型乳腺癌的药物筛选；筛选抑制肿瘤转移的药物靶点；研究免疫微环境对肿瘤特异性转移的作用；探索转移相关的危险因素和免疫调控机制；开发转移型乳腺癌的临床诊断和治疗方案。
附图说明
图1表示4T07 EGFP的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)在荧光显微镜下的表达情况，经嘌呤霉素筛选后，成功建立稳定表达EGFP的原代细胞系4T07 EGFP。
图2A至图2B：图2A表示4T07 EGFP细胞系通过肝门静脉建立实验性转移模型，2周后小鼠腹腔肿大，呈濒死状。解剖小鼠观测到肝脏肿大，肿瘤侵袭情况严重，研磨消化富集培养肝脏肿瘤细胞。图2B表示流式分选EGFP阳性的细胞系。
图3A至图3B表示成功建立特异性肝转移细胞系4T07LiM后，4T07和4T07LiM原位接种移植各5只雌性6-8周Balb/c小鼠，每隔2-3天测量小鼠重量和肿瘤体积；结果表示相较于原代4T07细胞系，4T07LiM组的肿瘤体积更大，且在25天后差异具有统计学意义。
图4表示42天后处死小鼠，4T07和4T07LiM肿瘤大小的图像(其中4T07组有一只小鼠出现了肿瘤消退的情况)。4T07LiM组肝脏出现明显的转移灶。
图5表示4T07和4T07LiM肝转移灶组织学HE病理切片染色图。
图6A至图6B表示4T07和4T07LiM肝转移灶组织学HE病例切片数字扫片图。
图7表示细胞划痕实验检测4T07和4T07LiM的0h、24h和48h的迁移率和统计结果。
图8表示transwell实验检测4T07和4T07LiM的细胞迁移能力和统计结果。
图9A表示4T07和4T07LiM组原位肿瘤微环境的流式圈门策略。
图9B至图9E流式细胞术分析结果及比例。
图10A至图10B表示4T07和4T07LiM组肝脏转移器官微环境的流式分析结果及统计结果。*p<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
具体实施方式
转移型乳腺癌细胞
本申请提供了一种转移型乳腺癌细胞。
本申请中的术语“一种转移型乳腺癌细胞”不应理解为仅限于单个细胞，应当给出最广泛的理解。其可以体现为单个细胞、细胞群、细胞系、细胞株、或培养物的形式。这些细胞可以源自相同的克隆、或不同的克隆。无论体现为哪种形式，它们具有本申请期望的理化特征或生物学特征，显示出期望的活性或功能。
在本申请中，除非有相反教导，否则术语细胞群、细胞系、细胞株、或培养物可以彼此互换使用。在一些示例中，细胞群(细胞系或细胞株或培养物)中所包含的细胞增殖/扩增/生长自单一的细胞克隆，具有无显著差异的遗传背景。
在具体的实施方案中，术语“一种转移型乳腺癌细胞”包含原代细胞，也涵盖其培养物或后代的范畴。培养物中的每个细胞往往并不是遗传物质或其含量上精确一致的，但是仍然保持和原代细胞相同的理化特征或生物学特征，显示出期望的活性或功能。后代的细胞往往并不是遗传物质或其含量上和原代细胞精确一致的，但是仍然保持和原代细胞相同的理化特征或生物学特征，显示出期望的活性或功能。
本申请提供的转移型乳腺癌细胞源自4T07细胞系。“源自”是直接来自，或间接来自。在具体的示例中，本申请的转移型乳腺癌细胞间接来自4T07细胞系，尤其是指经本申请的方法制备自4T07细胞系。
4T07细胞系是最初由美国斯克里普斯研究所(The Scripps ResearchInstitute)Ralph A.Reisfeld实验室建立的细胞系。4T07细胞系来自单个自发性BALB/cfC3H乳腺肿瘤的一个分离亚群。4T07细胞有能力离开原发部位，但并无法完成转移级联反应并形成可见的转移灶[9]。因而，本领域中将4T07视为一种低转移型乳腺癌细胞。
“低转移型乳腺癌细胞”的鉴定方法是本领域公知的，例如但不限于：细胞划痕实验和/或Transwell测试。再比如，采用以下公开中描述的方法：张涛等，不同转移潜能乳腺癌细胞亚系的建立与生物学特性的分析，第三军医大学学报，2008，30(18):4。
4T07细胞系可以商购获得(如BIOFENG.Ltd)；或获自细胞资源库(如国家人类疾病动物模型资源库、中国医学科学院医学实验动物研究所)。
本申请的转移型乳腺癌细胞源自低转移型乳腺癌细胞，而成为高转移型乳腺癌细胞。在一个实例中，由低转移型乳腺癌细胞经培养、筛选，而得到器官特异性的高转移型乳腺癌细胞。
本申请的转移型乳腺癌细胞是肝特异性转移的细胞系。
“肝特异性”是指细胞发生转移时，从原发部位优先迁移到肝脏或肝组织，并增殖形成肿瘤。应当理解，细胞也存在迁移至其他器官或组织的可能性，但相较于肝脏并不是优先的，或者以检测不到的水平而存在。
本申请的转移型乳腺癌细胞源自非人哺乳动物(尤其是啮齿类哺乳动物)。
本申请的转移型乳腺癌细胞不是生殖细胞、不是胚胎干细胞、不是受精卵、不能发育成完整的生命个体、不属于动物品种、也不涉及动物(包括人)发育过程中的任何阶段。
作为一个示例，本申请的转移型乳腺癌细胞尤其源自小鼠(Mus.musculus)。本申请中，对小鼠的品系没有特别的限制，只要其能携带肿瘤即可。
本申请的转移型乳腺癌细胞解决了现有技术中存在的一些问题，包括但不限于：实验性转移模型无法实现完整的转移级联反应；同种移植低转移型细胞难以建立转移模型。
方法
在一个获得转移型乳腺癌细胞的方法中，包括以下步骤：
1)提供低转移型乳腺癌细胞；
2)任选地，对低转移型乳腺癌细胞进行标记，获得带标记的低转移型乳腺癌细胞；
3)使低转移型乳腺癌细胞或带标记的低转移型乳腺癌细胞体内接触哺乳动物的肝脏，并在肝脏处形成肿瘤；
4)从步骤3)的肿瘤中收获肿瘤细胞；
5)任选地，使肿瘤细胞体内接触哺乳动物的肝脏，并在肝脏处形成肿瘤，从肿瘤中再次收获肿瘤细胞；该步骤可以重复1次至3次；
6)将步骤4)或5)获得的肿瘤细胞接种哺乳动物的乳房组织，并在肝脏处形成肿瘤，从肿瘤中收获转移的肿瘤细胞；
7)任选地，将转移的肿瘤细胞接种哺乳动物的乳房组织，并在肝脏处形成肿瘤，从肿瘤中再次收获转移的肿瘤细胞；该步骤可以重复1次至3次。
应当理解，前述步骤的编号不意图限制特定的排列顺序，仅用于将不同的步骤区别开。
“任选地”是指该术语后面跟随的特征或步骤可以存在，可以不存在。
本申请的方法中，允许以任何适用的方式“提供低转移型乳腺癌细胞”，例如在适当的培养环境中提供，这种培养环境(包括条件)可以按照低转移型乳腺癌细胞的供应商建议的方式，或者乳腺癌细胞常规培养条件。技术人员有能力根据低转移型乳腺癌细胞的随后操作而选择适当的提供方式。
在一个示例中，低转移型乳腺癌细胞提供于含有胎牛血清和青链霉素的RPMI1640培养基中，培养温度为37℃。但需要传代时，用胰蛋白酶消化细胞，进行传代培养。
本申请方法所要实现的目的之一在于：低转移型乳腺癌细胞经历肿瘤形成而随后发生自发性转移，成为肝特异性高转移型乳腺癌细胞。因此，对于该目的而言，标记低转移型乳腺癌细胞并不是必须的步骤。即便不标记细胞，当细胞接种至原位之后，仍会发生从肿瘤形成至转移的全过程。
出于方便定位、示踪、和/或鉴定的意图，可以选择对低转移型乳腺癌细胞进行标记。因此，任何本领域中可用的标记方式都适用于本申请，只要标记的存在不足以统计学上显著影响细胞的理化、生物学特征、活性或功能(如迁移、转移)。
作为一个示例，所述标记可以是瞬时的。在需要显示细胞定位、定性、定量的时候，使标记才出现或可被检测到。
作为另一个示例，标记是在感兴趣的癌细胞中稳定表达的标记。
这样的标记选自以下的任一项：荧光蛋白、荧光素酶、表面标记物、同位素、量子点、染料。
作为一个示例，用表达标记的载体(如病毒载体、质粒等)转染感兴趣的癌细胞。编码标记的核苷酸可以整合至基因组内，或基因组外。例如，表达荧光蛋白(GFP、RFP)的病毒载体转染4T07细胞，使得4T07细胞表达荧光蛋白，而可以被检测到。
使低转移型乳腺癌细胞(或带标记的低转移型乳腺癌细胞)在体内接触哺乳动物的肝脏，通过以下实现：将癌细胞直接注射入特异性器官(如肝)。作为一个示例，经由肝脏的静脉注射入肝脏，从而低转移型乳腺癌细胞在肝脏处形成赘生物。
肿瘤中收获肿瘤细胞，通过以下实现：取出肝脏肿瘤、剪切肿瘤、用酶消化肿瘤、研磨并滤膜、收获肿瘤细胞。
在一个示例中，将肿瘤细胞接种哺乳动物的乳房组织，通过以下实现：将肿瘤细胞注射于小鼠的乳房脂肪垫。
本申请以4T07为亲本细胞，通过利用小鼠肝门静脉注射的方式来完成实验性转移促转移灶的形成，经过体内连续筛选、体外扩增和传代的策略，得到了具有转移特异性的细胞系。又通过利用小鼠乳腺脂肪垫的原位接种，再次经过体内连续筛选、体外扩增和传代的方法，得到了具有高转移特性的细胞系。经过实验性转移(体现为步骤3至5)和自发性转移(体现为步骤6至7)的双重筛选，最后分离到了具有自发性肝特异性高转移潜能的小鼠乳腺癌细胞系。
与亲本细胞4T07相比，本申请的乳腺癌特异性肝转移细胞至少具有以下生物学特性：
-细胞形态较4T07细胞系没有明显改变，
-迁移和转移特性具有显著提高；
-肝特异性转移。
动物模型
动物模型是指各种医学、科学、研究中建立的具有人类疾病模拟表现的非人动物。
转移型乳腺癌动物模型，是指具有转移型乳腺癌模拟表现的动物。
转移型乳腺癌动物模型携带有本申请的转移型乳腺癌细胞；即荷瘤动物。
在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。
在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科或鼠总科超家族。在一个实施方案中，所述动物是啮齿动物。
在一个实施方案中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。
在一个实施方案中，所述动物来自选自：丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。
作为一个示例，转移型乳腺癌动物模型是荷瘤小鼠，所述小鼠选自以下的任一种品系：A/He、A/J、A/SnSf、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、BALB/c、B6SJLF1、B6C3F1、B6D2F1、C3H、C3He、C3Hf、C57BR、C57L、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H、CB6F1、CD2F1、CFW、DBA/1、DBA/2、FACA、FVB、ICR、KM、NIH、NIH(S)、RF、SJL、SWR、TA1、TA2、129。
在一个示例中，动物模型是BALB/c雌性小鼠。
在一个具体示例中，动物模型是同种移植模型；4T07细胞源自小鼠，因而将4T07LiM接种小鼠而制成同种移植模型。
用途
本申请进一步涉及一种前述转移型乳腺癌细胞、哺乳动物或其后代、或荷瘤哺乳动物、前述任一方法产生的转移型乳腺癌细胞在生产动物疾病模型中的用途、用于乳腺癌肝转移研究、和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用。
说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入此处。下面的实施例进一步详细说明本申请，不能认为是限制本申请的保护范围。虽然以下示例采用了特定的细胞株，但技术人员在本申请的教导下能够理解，其他小鼠低转移乳腺癌细胞系也适用于本申请的建立方法。
实施例
实验材料
1.细胞
4T07细胞系获自美国斯克里普斯研究所的Ralph A.Reisfeld实验室。
2.培养试剂及方法
细胞均培养于含有10％胎牛血清(ThermoFisher Scientific，Cat.No.10099-141)和100U/ml青链霉素(ThermoFisher Scientific，Cat.No.15140122)的RPMI 1640培养基(Biological Industries,Cat.No.01-100-1A)。
培养温度为37℃，气体环境为5％CO2/95％空气，湿度为饱和湿度。细胞传代时，使用0.25％胰蛋白酶-EDTA(ThermoFisher Scientific，Cat.No.25200072)消化细胞，按照1：3的比例进行传代培养。本申请所述的细胞系的培养符合ATCC指南。
实施例1.建立稳定表达示踪标签(如增强型荧光蛋白)的细胞系4T07 EGFP
使用慢病毒表达载体(如pLenti-CMV-EGFP-Puro)、慢病毒穿梭质粒、辅助包装元件载体质粒与转染试剂Lipofectamine 2000(ThermoFisher Scientific，Cat.No.11668027)，共转染293T细胞。
换液后2天，收集富含病毒的上清液。使用该慢病毒对4T07细胞感染，并添加浓度为2μg/mL助感染试剂聚凝胺(Polybrene)；6小时后换液，待感染病毒后的细胞生长密度达到80％时，更换为新鲜的含嘌呤霉素的培养基处理细胞。
2天后，采用荧光显微镜观察4T07 EGFP中的EGFP荧光表达情况，得到4T07 EGFP细胞系(图1)。
实施例1的目的之一在于使4T07细胞带有特异性的可检测标签，从而便于示踪和/或鉴定。因此，除绿色荧光蛋白外，还可以使用本领域中可用的其他标签对4T07细胞进行标记，例如但不限于RFP、荧光素酶、同位素、量子点、荧光染料、细胞表面特异性标记物。
实施例2.肝特异性转移模型的建立和筛选
将处于对数生长期的4T07 EGFP用0.25％胰蛋白酶-EDTA进行消化，制成单细胞悬液。细胞计数后，调整细胞数量为5×105细胞/100μL/只，在无菌条件下，放置于冰上进行保存。
在手术前1小时，使用100μL 0.015mg/mL的丁丙诺啡皮下注射于6-8周龄的Balb/c雌性小鼠，对小鼠进行止痛操作。在手术前20分钟，使用100μL 10mg/mL的戊巴比妥钠盐溶液腹腔注射于小鼠，进行麻醉操作。
将小鼠置于仰卧位，用酒精擦拭小鼠腹侧的区域。使用无菌手术刀片在小鼠腹部正中的皮肤切开一个3cm的切口，从肋骨下方开始，到第四对腹股沟乳腺连线处中止。使用高压灭菌的剪刀和镊子，在腹膜处同样切开一个3cm的切口，使用无菌棉签小心将内部小肠等器官放置于浸泡过无菌生理盐水的纱布垫上，保持内部的生理环境和无菌状态。
将4T07 EGFP通过29G的针头插入肝脏下方的门静脉，斜面朝上，进针角度约为5°，进针距离约为3至5mm，缓慢注射100μL的细胞悬液，拔出针头后用棉签在扎口处按压止血。止血5分钟后，将内部器官放置回腹腔内，使用无菌的3/8弧4-0的缝合针线通过连续缝合模式缝合皮肤，使用碘酒对缝合处进行消毒。
两周后，小鼠腹部出现明显的肿胀。在无菌的环境下，安乐处死小鼠，完整取出肝脏，生理盐水漂洗三次。剪碎肝脏肿瘤，使用IV型胶原蛋白酶(ThermoFisher Scientific，Cat.No.17104019)消化肿瘤，30分钟后研磨肿瘤于70μm的滤膜，过滤细胞悬液，放置于培养箱进行培养。4小时后待细胞贴壁，更换新鲜的完全培养基。
如图2A至图2B所示，体外继续扩增本轮筛选所得到的肿瘤细胞，部分用于流式分选4T07 EGFP阳性的细胞进行下轮筛选，部分进行细胞冻存。同法再进行两轮实验性转移筛选，共计三轮筛选后得到4T07EGFP-S3细胞系。
实施例3.自发性肝特异性转移模型的建立和筛选
将100μL浓度为5×106个/mL的4T07 EGFP-S3细胞悬液注射于BALB/c小鼠第四对乳房脂肪垫位置，于42天后安乐处死小鼠。
消化肝脏转移灶的细胞，并进行体外扩增培养，之后通过流式细胞分选技术分选得到EGFP阳性的细胞并且扩大培养；将分选得到的细胞重新注射于小鼠第四对乳房脂肪垫位置，再次重复自发性转移筛选两轮，得到了4T07LiM细胞系。
实施例4.肝特异性转移乳腺癌细胞系的验证
实施例3所得到的肝特异性的转移细胞(本申请命名为4T07LiM)具有以下特征：-与原代4T07细胞遗传背景相同、-高侵袭性、-器官特异性转移。4T07LiM细胞形态较原代4T07细胞系没有明显改变，但其转移特性具有明显改变。将细胞系4T07LiM于2021年08月12日以保藏编号CCTCC No.C2021212保藏于中国典型培养物保藏中心。
1.体外迁移能力
本申请所得到的4T07LiM相较于原代的4T07细胞迁移能力得到明显增强。
(1)细胞划痕实验
采用细胞划痕实验来检测两株细胞在0h、24h和48h的迁移情况，并且对结果进行统计分析。图7结果表明在24和48h时，4T07LiM组的划痕闭合要明显高于4T07组且具有统计学差异。
(2)Transwell迁移实验
对4T07/4T07LiM进行transwell迁移实验。图8结果表明，与4T07组相比，4T07LiM迁移过transwell小室的结晶紫染色细胞数量有明显提高且具有统计学差异。
两个实验均证明所得到的4T07LiM细胞系的迁移能力显著增强。观察48小时，4T07LiM细胞的迁移能力分别是亲代细胞4T07的1.44倍(p<0.05)和2.58倍(p<0.0001)。
2.体内转移能力
4T07和4T07LiM原位接种BALB/c小鼠第四对乳房脂肪垫，每隔2天测量小鼠体重和肿瘤体积。如图3A至图3B所示，相较于原代4T07细胞系，4T07LiM组的肿瘤体积更大，且在25天后差异具有统计学意义。42-45天后安乐处死小鼠，取出小鼠的肿瘤和肝脏。
如图4所示，小鼠肝脏处出现了明显的转移灶，亲代细胞4T07几乎不发生转移，且4T07LiM组肿瘤重量明显高于4T07组，体内实验结果与预期相符。
当4T07LiM转移到小鼠的肝脏中时，小鼠体态有弓背的现象，毛发凌乱且斜视，同时腹部会出现较为明显的肿胀，行动缓慢迟滞。
肝组织经HE染色切片后进行观察。如图5所示，4T07LiM组均可见核质深染的肝脏转移灶，而4T07组肝具有较为正常的组织形态学结构。通过数字扫片扫描仪进行全片观察。图6A至图6B结果发现4T07LiM组肝脏的肿瘤转移负荷要明显高于4T07组。
实施例5.肝特异性转移乳腺癌细胞系的免疫浸润
本申请所得到的4T07LiM细胞系的筛选过程是经由体内肝脏微环境的诱导形成的。推测4T07LiM细胞系在肿瘤形成过程中，对于免疫微环境的塑造也具有不同的效果。因此，通过流式细胞术的方式，检测了原位注射肿瘤42天后4T07和4T07LiM的原位肿瘤、脾脏和肝脏的免疫浸润情况。
与4T07组相比，4T07LiM组中介导负向免疫调控的细胞(如巨噬细胞、M2型巨噬细胞、B细胞)明显浸润增强。
CD47分子作为肿瘤表达的“别吃我”信号的关键分子，能够抑制吞噬细胞(如巨噬细胞)介导的对肿瘤自身ADCC吞噬杀伤作用，促进肿瘤免疫逃逸。图9B至图9E结果表明，4T07LiM组的CD47分子表达明显高于4T07组，提示4T07LiM肿瘤细胞可能更容易从原位发生免疫逃逸，发生侵袭转移。
肝脏作为特殊的免疫耐受器官，肝脏存在许多免疫细胞的免疫耐受机制，以避免从肠道摄取的饮食来源的抗原从肝门静脉进入肝脏，引起过度的免疫反应。由于特殊的免疫耐受环境，肝脏经常作为肿瘤侵袭转移的靶器官。
图10A至图10B肝脏的免疫浸润情况结果表明，CD8+T细胞作为杀伤肿瘤的正向调节免疫细胞，在4T07LiM组中浸润明显降低。而M2型巨噬细胞标志物CD206表达上调，肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)作为肿瘤组织中浸润的巨噬细胞，其主要表型为M2型巨噬细胞，M2型巨噬细胞的高表达也预示着巨噬细胞的抗原递呈能力和吞噬杀伤能力的下降，抑制肿瘤微环境的免疫反应，促进肿瘤的免疫逃逸。
本申请的有益效果分为两个方面：一方面是提供乳腺癌特异性肝转移细胞系在建立同种移植转移模型的应用；另一方面是探究模型用于免疫微环境对肿瘤特异性转移的影响。
低转移细胞系中分离得到自发器官特异性高转移的细胞系，相较基于高侵袭性肿瘤建立的转移模型而言，该模型更能够放大肿瘤自身特异性转移的影响因素。高转移细胞系往往难以建立肝特异性的转移模型，例如小鼠乳腺癌高转移细胞系4T1、Guo等[10]建立了4T1的原位高肺转移模型，分离和建立了具有明显转移倾向的4T1细胞系，但是与乳腺癌肺转移不同，同种原位移植模型的肝转移率非常低或者几乎不存在[11]，这使得现阶段乳腺癌的肝转移研究使用的是实验性转移模型。所以本申请提供的4T07LiM细胞系可以应用于对乳腺癌肝转移方面的探究，以及筛选相关抑制肿瘤转移的药物靶点。
本申请乳腺癌特异性肝转移细胞系可以应用在免疫微环境对肿瘤特异性转移的探究上。尽管人源的乳腺癌细胞系上可以实现建立自发转移模型，但是人源的乳腺癌细胞系需要接种在免疫缺陷的小鼠上，这样忽视了免疫微环境对肿瘤转移的影响。无论在肿瘤原位，还是转移器官的免疫微环境，对于肿瘤的侵袭和招募都有着一定的作用，乳腺癌的肝转移是多步骤多因素参与的复杂调控过程，研究人员可以借助该模型来探究可能存在的转移相关危险因素和免疫调控机制，寻找临床诊断和治疗方案。
参考文献
[1]Chen W,Zheng R,Baade P D等人，Cancer statistics in China,2015[J].CACancer J Clin,2016,66(2):115-32；
[2]Peng Z,Wei J,Lu X等人，Treatment and survival patterns of Chinesepatients diagnosed with breast cancer between 2005and 2009in Southwest China[J].Medicine,2016,95(25):e3865；
[3]白秀梅,杨薇,严昆.乳腺癌肝转移治疗现状及射频消融的应用及前景[J].世界华人消化杂志,2017(13):20-26；
[4]Goddard E T,Fischer J,Schedin P.A Portal Vein Injection Model toStudy Liver Metastasis of Breast Cancer[J].Journal of Visualized Experiments,2016(118)；
[5]Jin L,Han B,Siegel E等人，Breast cancer lung metastasis:Molecularbiology and therapeutic implications[J].Cancer Biol Ther,2018,19(10):858-868；
[6]姜军,柴凡.乳腺癌肝转移临床特点及外科治疗[J].Clinicalcharacteristics and surgical treatment for breast cancer patients with livermetastases,2011,31(11):1017–1019；
[7]潘秀华,冯玉梅.乳腺癌移植转移模型的建立与应用[J].中国肿瘤临床,2008,35(4):234-237；
[8]吴海燕,姚明,闫明霞等人，黑色素瘤小鼠高转移模型体内筛选和细胞的建立[J].28(2):67-73；
[9]H Heppner,G.,R Miller,F.&Malathy Shekhar,P.Nontransgenic models ofbreast cancer.Breast Cancer Res 2,331(2000)；
[10]Guo W,Zhang S,Liu S.Establishment of a novel orthotopic model ofbreast cancer metastasis to the lung[J].Oncol Rep,2015,33(6):2992-8；
[11]Doornebal C W,Klarenbeek S,Braumuller T M等人，A preclinical mousemodel of invasive lobular breast cancer metastasis[J].Cancer Res,2013,73(1):353-63。

Claims (11)

1.一种转移型乳腺癌细胞，其中：
所述转移型乳腺癌细胞是肝特异性的；
所述转移型乳腺癌细胞诱导自4T07细胞系；
所述细胞不能发育成胚胎或完整个体；
其是2021年08月12日以保藏编号CCTCC No. C2021212保藏于中国典型培养物保藏中心的细胞、或其后代。
2.一种获得转移型乳腺癌细胞的方法，包括步骤：
1）提供低转移型乳腺癌细胞；
所述低转移型乳腺癌细胞是4T07细胞系的细胞；
2）使低转移型乳腺癌细胞体内接触哺乳动物的肝脏，并在肝脏处形成肿瘤；
3）从步骤2）的肿瘤中收获肿瘤细胞；
4）使肿瘤细胞体内接触哺乳动物的肝脏，并在肝脏处形成肿瘤，从肿瘤中再次收获肿瘤细胞；步骤4）进行1次至3次；
5）将步骤3）或4）获得的肿瘤细胞接种哺乳动物的乳房组织，并在肝脏处形成肿瘤，从肿瘤中收获转移的肿瘤细胞；
6）将转移的肿瘤细胞接种哺乳动物的乳房组织，并在肝脏处形成肿瘤，从肿瘤中再次收获转移的肿瘤细胞；步骤6）进行1次至3次；
其中，步骤5）或6）所得的转移的肿瘤细胞即所述转移型乳腺癌细胞；
所述转移型乳腺癌细胞是肝特异性的；
所述哺乳动物是小鼠。
3.一种获得转移型乳腺癌细胞的方法，包括步骤：
1）提供低转移型乳腺癌细胞；
所述低转移型乳腺癌细胞是4T07细胞系的细胞；
2）对低转移型乳腺癌细胞进行标记，获得带标记的低转移型乳腺癌细胞；
3）使低转移型乳腺癌细胞或带标记的低转移型乳腺癌细胞体内接触哺乳动物的肝脏，并在肝脏处形成肿瘤；
4）从步骤3）的肿瘤中收获肿瘤细胞；
5）使肿瘤细胞体内接触哺乳动物的肝脏，并在肝脏处形成肿瘤，从肿瘤中再次收获肿瘤细胞；步骤5）进行1次至3次；
6）将步骤4）或5）获得的肿瘤细胞接种哺乳动物的乳房组织，并在肝脏处形成肿瘤，从肿瘤中收获转移的肿瘤细胞；
7）将转移的肿瘤细胞接种哺乳动物的乳房组织，并在肝脏处形成肿瘤，从肿瘤中再次收获转移的肿瘤细胞；步骤7）进行1次至3次；
其中，步骤6）或7）所得的转移的肿瘤细胞即所述转移型乳腺癌细胞；
所述转移型乳腺癌细胞是肝特异性的；
所述哺乳动物是小鼠。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中：
在所述哺乳动物的肺、脑、和/或肾中没有可检测水平的转移型乳腺癌细胞。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述标记是稳定表达的标记。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述标记选自以下的任一项：荧光蛋白、荧光素酶、表面标记物、同位素、量子点、染料。
7.一种转移型乳腺癌细胞，其是通过权利要求2至6中任一项所述方法获得的。
8.权利要求1或7所述的转移型乳腺癌细胞在建立疾病小鼠模型中的用途；
所述疾病是乳腺癌的肝转移；
所述小鼠模型是同种移植模型。
9.根据权利要求8所述的用途，其中：
所述小鼠选自以下的任一项：A/He、A/J、A/SnSf、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、BALB/c、B6SJLF1、B6C3F1、B6D2F1、C3H、C3He、C3Hf、C57BR、C57L、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H、CB6F1、CD2F1、CFW、DBA/1、DBA/2、FACA、FVB、ICR、KM、NIH、NIH(S)、RF、SJL、SWR、TA1、TA2、129。
10.一种建立转移型乳腺癌小鼠模型的方法，包括步骤：
将权利要求1或7所述的转移型乳腺癌细胞接种至小鼠的乳房组织；
所述小鼠模型是同种移植模型。
11.根据权利要求10所述的方法，其中：
所述小鼠选自以下的任一项：A/He、A/J、A/SnSf、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、BALB/c、B6SJLF1、B6C3F1、B6D2F1、C3H、C3He、C3Hf、C57BR、C57L、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H、CB6F1、CD2F1、CFW、DBA/1、DBA/2、FACA、FVB、ICR、KM、NIH、NIH(S)、RF、SJL、SWR、TA1、TA2、129。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1490404A (zh) * 2003-08-25 2004-04-21 复旦大学附属肿瘤医院 高转移人乳腺癌细胞系及其建立方法
JP2008237098A (ja) * 2007-03-27 2008-10-09 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 乳癌の肺及びまたは肝臓転移解析用動物モデル
CN101412986A (zh) * 2007-10-19 2009-04-22 天津医科大学附属肿瘤医院 一种小鼠高转移乳腺癌细胞系
CN101748097A (zh) * 2009-06-26 2010-06-23 复旦大学附属肿瘤医院 一种肺高转移性人乳腺癌细胞系
WO2012010904A1 (en) * 2010-07-23 2012-01-26 Procure Therapeutics Limited Mammalian model for amplification of cancer stem cells
CN116437919A (zh) * 2020-09-11 2023-07-14 中国科学院上海营养与健康研究所 用组织蛋白酶c抑制剂治疗转移的方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005099363A2 (en) * 2004-03-26 2005-10-27 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods of diagnosing, preventing and treating cancer metastasis

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1490404A (zh) * 2003-08-25 2004-04-21 复旦大学附属肿瘤医院 高转移人乳腺癌细胞系及其建立方法
JP2008237098A (ja) * 2007-03-27 2008-10-09 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 乳癌の肺及びまたは肝臓転移解析用動物モデル
CN101412986A (zh) * 2007-10-19 2009-04-22 天津医科大学附属肿瘤医院 一种小鼠高转移乳腺癌细胞系
CN101748097A (zh) * 2009-06-26 2010-06-23 复旦大学附属肿瘤医院 一种肺高转移性人乳腺癌细胞系
WO2012010904A1 (en) * 2010-07-23 2012-01-26 Procure Therapeutics Limited Mammalian model for amplification of cancer stem cells
CN116437919A (zh) * 2020-09-11 2023-07-14 中国科学院上海营养与健康研究所 用组织蛋白酶c抑制剂治疗转移的方法

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
David Manka等.Bcl-2/Adenovirus E1B 19kDa Interacting Protein-3 Knockdown Enables Growth of Breast Cancer Metastases in the lung,liver,and Bone.Cancer Research.2005,第65卷(第24期),第11689-11693页. *
Immunohistochemical analysis of mucinous tubular and spindle cell carcinoma and papillary renal cell carcinoma of the kidney: significant immunophenotypic overlap warrants diagnostic caution;Paner GP等;Am J Surg Pathol;第13-19页 *
三株荧光素酶标记的小鼠乳腺癌细胞 在小鼠体内生长及转移的比较;李小颖等;中国比较医学杂志;第23卷(第4期);摘要 *
乳腺癌实验动物模型的研究进展;李日飞;袁娜;冶冬阳;李日勇;李姚涵;左儒楠;时晰;陈强;李引乾;;中国比较医学杂志(02);第113-118页 *
乳腺癌移植转移模型的建立与应用;潘秀华;冯玉梅;;中国肿瘤临床(04);第234-237+239页 *
乳腺癌肝转移的机制及治疗;王竞翊;马哿;夏添松;王水;;中国肿瘤外科杂志(04);第375-379页 *
体内连续筛选法建立可视化乳腺癌肝转移裸鼠模型;杨敏;杨朝晖;侯致典;李学农;;南方医科大学学报(06);第944-947页 *
小鼠乳腺癌肺/肝器官特异性转移细胞亚系的建立和转移机制的初步探究;王子辕;中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）医药卫生科技辑;E072-1843 *

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