CN1490404A - 高转移人乳腺癌细胞系及其建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属微生物动物细胞系领域。本发明采用人乳腺癌MDA-MB-435细胞株作为建系的源细胞,通过裸鼠体内连续筛选的方法,建立了具有高自发性肺转移表形的人乳腺癌细胞系。所述细胞为亚三倍体核型,染色体数目50-52条,S期细胞的较源细胞比例提高15%,其浸润、迁徙能力是源细胞的2倍,裸鼠原位移植成瘤率高,肺转移时间早,转移灶数目多,8000点基因芯片检测其中60种基因表达差异。是一种理想的乳腺癌转移研究模型,在揭示乳腺癌的转移机制和抗转移药物筛选的应用中将有着广阔的前景。
Description
技术领域
本发明属微生物动物细胞系领域,具体涉及一种具有高自发性肺转移特性的人乳腺癌细胞系的建立及其建立方法。
背景技术
乳腺癌是危害女性身心健康的主要疾病之一。在西方发达国家和我国经济发达地区,其业已成为女性最常见的恶性肿瘤。随着乳房钼靶X线摄片的推广和女性对乳腺癌防范意识的加强,越来越多的患者得以在乳腺癌的早期发现。各种辅助治疗的应用使得乳腺癌患者的局部复发率和长期生存率都有了不同程度的改善。尽管如此,肿瘤的远处转移仍是其治疗失败的主要原因之一。仅在美国,每年就有4.5万名乳腺癌患者因肿瘤远处转移而死亡。因此,加强对乳腺癌细胞转移机制的研究,将有助于进一步提高乳腺癌的治疗水平。
在有关乳腺癌浸润、转移的研究中,MDA-MB-435是较为常用的人乳腺癌细胞株。文献报道,裸鼠乳腺脂肪垫原位接种该细胞4周、8周和12周时,鼠肺的转移率分别是30%、70%和100%。由此可见,虽然该细胞株最终可以有较高的肺转移率,但需较长的实验周期和较高的实验投入,故其在此领域的研究中具有较大的局限性,制约了对乳腺癌转移机制作更为深入地探讨。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有高自发性肺转移表形的人乳腺癌细胞系及其建系方法。
本发明采用MDA-MB-435细胞株作为建系的源细胞,通过裸鼠体内连续筛选的方法,建立了一种具有高自发性肺转移表形的人乳腺癌细胞系,命名为MDA-MB-435HM。与MDA-MB-435细胞相比,本细胞系具有以下特点:
细胞为亚三倍体核型,染色体数目50-52条;S期细胞的比例提高了15%;其浸润、迁徙能力是MDA-MB-435细胞的2倍;裸鼠原位移植瘤模型提示,本细胞还具有成瘤率高,肺转移时间早,转移灶数目多的特点。8000点基因芯片的检测结果显示,两者存在60种基因表达差异。
本发明通过下述方法和步骤建立高自发性肺转移的人乳腺癌细胞系。
1.按常规方法建立人乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型,
将人乳腺癌细胞株MDA-MB-435细胞悬液接种于裸鼠乳腺建立人乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型。
2.筛选肺转移细胞,
于体外进行肺转移灶细胞扩增,培养液为DMEM/F12(GIBCOBRL,Grand Island,NY,USA)加10%(V/V)胎牛血清(Hyclone,Utah,USA)。37℃,5%CO2/95%空气,饱和湿度培养。将培养所得的细胞按步骤1接种于裸鼠乳腺脂肪垫,按步骤2行体外扩增,同法重复4-6轮筛选。
3.建立细胞系,
将筛选所得的肺转移细胞行体外培养,培养条件同上。隔天更换培液,每4天传代一次,常规冻存后,复苏,建立具有高自发性肺转移的人乳腺癌细胞系MDA-MB-435HM(MDA-MB-435 highmetastasis)。
经常规系列实验检测,本发明的细胞系具有以下特点:
1.一般生物学特性表明,该细胞系外形呈梭型,贴壁生长,接触性生长抑止丧失,亚三倍体核型,染色体数目50-52条,细胞群体倍增时间约44小时。流式细胞检测结果表明,细胞各时相的百分率分别是凋亡细胞1.43%,G0-G1期43.44%,S期56.11%,G2-M期0.45%。体外侵袭实验显示,其浸润、迁徙能力是MDA-MB-435的2倍。
2.成瘤性与转移性检测表明,1×106细胞(0.1ml)接种于裸鼠乳腺脂肪垫的成瘤率是100%,成瘤潜伏期<7天。肿瘤生长迅速,至接种42天后,肿瘤体积平均可达1002.3mm3。接种4周时,其鼠肺转移率即可达100%。6周时,转移灶中位数为37个/肺。
3.8000点基因芯片(由联合基因公司提供)的检测结果显示,与MDA-MB-435相比,其有60种基因的表达水平发生改变。表1是基因芯片检测结果。
结果表明,本发明细胞系具有成瘤率高、转移时间早、转移数目多的特点,是一种更为理想的乳腺癌转移研究模型,其在揭示乳腺癌的转移机制和抗转移药物筛选的应用中将有着广阔的前景。
表1
Genbank_ID Definition Average_Ratio
Homo sapiens carbonic anhydrase VIII
NM_004056 (CA8),mRNA 0.130
Homo sapiens frizzled(Drosophila)
NM_003507 homolog 7(FZD7),mRNA 0.233
Homo sapiens,slug(chicken homolog),
zinc finger protein,clone MGC:10182
BC014890 IMAGE:3908245,mRNA,complete cds 0.248
Homo sapiens follistatin(FST),
NM_006350 transcript variant FST317,mRNA 0.261
Homo sapiens ectonucleotide
pyrophosphatase/phosphodiesterase 2
NM_006209 (autotaxin)(ENPP2),mRNA 0.273
Homo sapiens mRNA;cDNA DKFZp547J2313
AL512688 (from clone DKFZp547J2313) 0.301
Homo sapiens glutaminyl-peptide
cyclotransferase(glutaminyl cyclase)
NM_012413 (QPCT),mRNA 0.311
Homo sapiens mRNA;cDNA DKFZp434P0721
AL133623 (from clone DKFZp434P0721);partial cds 0.340
Homo sapiens phosphoribosyl
NM_002765 pyrophosphate synthetase 2(PRPS2),mRNA 0.344
Homo sapiens hypothetical protein
NM_015680 (CGI-57),mRNA 0.374
D86982 Human mRNA for KIAA0229 gene,partial cds 0.374
Homo sapiens ariadne (Drosophila)
nomolog,ubiquitin-conjugating enzyme
NM_005744 E2-binding protein,1(ARIH1),mRNA 0.391
Homo sapiens mRNA;cDNA DKFZp586F1924
AL117657 (from clone DKFZp586F1924) 0.395
Homo sapiens Fanconi anemia,
NM_004629 complementation group G(FANCG),mRNA 0.404
Homo sapiens ATPase,H+ transporting,
lysosomal(vacuolar proton pump),beta
polypeptide,56/58kD,isoform 2(ATP6B2),
NM_001693 mRNA 0.412
Homo sapiens YEAF1 mRNA for YY1 and E4TF1
AB029551 associated factor 1,complete cds 0.430
Homo sapiens chimerin(chimaerin) 1
NM_001822 (CHN1),mRNA 0.439
Homo sapiens,clone IMAGE:3947276,mRNA,
BC004538 partial cds 0.457
Homo sapiens nucleolar protein(KKE/D
NM_006392 repeat)(NOP56),mRNA 0.466
Homo sapiens mRNA for KIAA1902 protein,
AB067489 partial cds 0.480
Homo sapiens ribosomal protein S7(RPS7),
NM_001011 mRNA 0.482
Homo sapiens high-mobility group
(nonhistone chromosomal)protein 14
NM_004965 (HMG14),mRNA 0.489
Homo sapiens DKFZp564J157 protein
NM_018457 (DKFZP564J157),mRNA 2.113
Homo sapiens KIAA1094 protein(KIAA1094),
NM_014908 mRNA 2.116
Homo sapiens hypothetical protein MGC5576
NM_024056 (MGC5576),mRNA 2.117
Homo sapiens hypothetical protein
NM_018046 FLJ10283(FLJ10283),mRNA 2.135
Homo sapiens mRNA;cDNA DKFZp586K1922
AL110204 (from clone DKFZp586K1922) 2.178
Homo sapiens sparc/osteonectin,cwcv and
kazal-like domains proteoglycan
NM_004598 (testican)(SPOCK),mRNA 2.233
Homo sapiens T cell activation,increased
NM_005816 late expression(TACTILE),mRNA 2.245
Homo sapiens GRB2-associated binding
NM_002039 protein 1(GAB1),mRNA 2.253
Homo sapiens MADS/MEF2-family
transcription factor(MEF2C)mRNA,
L08895 complete cds 2.291
Homo sapiens mRNA for KIAA1325 protein,
AB037746 partial cds 2.301
Homo sapiens thromboxane A synthase 1
(platelet,cytochrome P450,subfamily V)
NM_001061 (TBXAS1),transcript variant TXS-I,mRNA 2.321
Homo sapiens hypothetical protein
NM_017918 FLJ20647(FLJ20647),mRNA 2.325
Homo sapiens hematological and
NM_016185 neurological expressed 1(HN1),mRNA 2.327
Homo sapiens mRNA;cDNA DKFZp586I1419
AL050107 (from clone DKFZp586I1419);partial cds 2.359
Homo sapiens epithelial membrane protein
NM_001423 1(EMP1),mRNA 2.392
NM_003928 Homo sapiens CAAX box 1(CXX1),mRNA 2.442
BC016962 Homo sapiens,clone IMAGE:4182947,mRNA 2.470
Homo sapiens mRNA;cDNA DKFZp761G02121
AL137 311 (from clone DKFZp761G02121);partial cds 2.564
Homo sapiens FXYD domain-containing ion
transport regulator 3(FXYD3),transcript
NM_02191O variant 2,mRNA 2.565
Homo sapiens hypothetical protein
NM_018355 FLJ11191(FLJ11191),mRNA 2.584
Homo sapiens plasminogen activator,
NM_002659 urokinase receptor(PLAUR),mRNA 2.589
Homo sapiens proteoglycan 1,secretory
NM_002727 granule(PRG1),mRNA 2.821
Homo sapiens,Similar to hypothetical
protein FLJ14627,clone MGC:20447
BC011878 IMAGE:3532898,mRNA,complete cds 2.843
Homo sapiens decidual protein induced by
NM_007021 progesterone(DEPP),mRNA 2.875
Homo sapiens loss of heterozygosity,11,
chromosoma 1 region 2,gene A(LOH11CR2A),
NM_014622 mRNA 2.936
Homo sapiens cDNA:FLJ23418 fis,clone
HEP21245,highly similar to HSU35048
AK027071 Human TSC-22 protein mRNA 2.938
Homo sapiens cDNA FLJ14821 fis,clone
OVARC1000556,highly similar to RIBOSOMAL
AK027727 PROTEIN S6 KINASE II ALPHA 2(EC 2.7.1.-) 2.971
Homo sapiens mRNA;cDNA DKFZp761E1512
AL157424 (from clone DKFZp761E1512) 3.025
NM_006818 Homo sapiens ALL1-fused gene from 3.045
chromosome 1q(AF1Q),mRNA
Human prostate catcinoma tumor antigen
L78132 (pcta-1)mRNA,complete cds 3.083
Homo sapiens serine(or cysteine)
proteinase inhibitor,clade A(alpha-1
ant iprote inase,antitrypsin),member 3
NM_001085 (SERPINA3),mRNA 3.253
Homo sapiens cDNA:FLJ22330 fis,clone
HRC05729,highly similar to AF131821 Homo
AK025983 sapiens clone 24877 mRNA sequence 3.254
Homo sapiens pleiotrophin(heparin
binding growth factor 8,neurite
NM_002825 growth-promoting factor 1)(PTN),mRNA 4.124
Homo sapiens nucleosomal binding protein
NM_030763 1(NSBP1),mRNA 4.813
Homo sapiens group-specitic component
NM_000583 (vitamin D binding protein)(GC),mRNA 4.882
Homo sapiens interleukin 13 receptor,
NM_000640 alpha 2(IL13RA2),mRNA 7.360
Homo sapiens cDNA FLJ14941 fis,clone
AK027847 PLACE1010944 10.618
Homo sapiens,clone MGC:16086
BC008915 IMAGE:3618167,mRNA,complete cds 20.706
附图说明
图1 MDA-MB-435HM裸鼠移植瘤组织学切片(HE×400)
图2 MDA-MB-435HM裸鼠原位接种4周时,其肺转移灶的组织学切片,箭头所示为肺转移灶(HE×200)
图3 MDA-MB-435HM染色体分析结果
具体实施方式
实施例1
按常规方法建立人乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型,
将人乳腺癌细胞株MDA-MB-435细胞悬液,调整细胞浓度为1×107/ml,取0.1ml细胞悬液接种于裸鼠乳腺脂肪垫,建立人乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型。所述人乳腺癌细胞株MDA-MB-435购自ATCC;裸鼠由中国科学院上海药物研究所提供,品系为BALB/C-nu/nu,均为雌性,4-6周龄,饲养于无特殊病原体环境中。
细胞接种后第6周,解剖实验动物,取出其肺转移灶,于体外进行细胞扩增,培养液为DMEM/F12(GIBCOBRL,Grand Island,NY,USA)加10%(V/V)胎牛血清(Hyclone,Utah,USA)。培养温度为37℃,气体环境为5%CO2/95%空气,湿度为饱和湿度。将培养所得的细胞按步骤1接种于裸鼠乳腺脂肪垫,按步骤2行体外扩增,同法重复6轮筛选肺转移细胞。
将第6轮筛选所得的肺转移细胞行体外培养,培养条件同上。隔天更换培液,每4天传代一次,常规冻存后,复苏成活良好。经上述连续6轮筛选,建立具有高自发性肺转移的人乳腺癌细胞系MDA-MB-435HM。
进行常规系列实验检测,包括一般生物学特性检测和成瘤性与转移性检测以及8000点基因芯片检测,结果表明,本发明细胞系细胞为亚三倍体核型,染色体数目50-52条;S期细胞的比例提高了15%;其浸润、迁徙能力是MDA-MB-435细胞的2倍;细胞中60种基因的表达水平发生改变。并且具有成瘤率高、转移时间早、转移数目多的特点。
Claims (4)
1、一种高转移人乳腺癌细胞系,其特征是所述细胞为亚三倍体核型,染色体数目50-52条,S期细胞的较源细胞比例提高15%,其浸润、迁徙能力是源细胞的2倍,裸鼠原位移植成瘤率高,肺转移时间早,转移灶数目多,8000点基因芯片检测其中60种基因表达差异。
2、按权利要求1所述的高转移人乳腺癌细胞系,其特征是所述源细胞是MDA-MB-435细胞。
3、按权利要求1所述的高转移人乳腺癌细胞系,其特征是所述裸鼠原位移植成瘤率是100%,肺转移时间为接种4周时,转移灶数目为37个/肺。
4、权利要求1所述的高转移人乳腺癌细胞系的建立方法,其特征是包括下述步骤,
1)按常规方法建立人乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型,
将人乳腺癌细胞株MDA-MB-435细胞悬液接种于裸鼠乳腺。
2)筛选肺转移细胞,
于体外进行肺转移灶细胞扩增,培养液为DMEM/F12加10%(V/V)胎牛血清,37℃,5%CO2/95%空气,饱和湿度培养。将培养所得的细胞按步骤1接种于裸鼠乳腺脂肪垫,按步骤2行体外扩增,同法重复4-6轮筛选。
3)建立细胞系,
体外培养所筛选的肺转移细胞,隔天换培液,每4天传代一次,常规冻存,复苏,建高自发性肺转移人乳腺癌细胞系
4)系列实验检测,验证细胞特征。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNA031505392A CN1490404A (zh) | 2003-08-25 | 2003-08-25 | 高转移人乳腺癌细胞系及其建立方法 |
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CN105850982A (zh) * | 2016-04-29 | 2016-08-17 | 绍兴市人民医院 | 一种新型组织冻存液 |
CN114196617A (zh) * | 2021-12-22 | 2022-03-18 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 器官特异性的乳腺癌转移模型及其建立方法和应用 |
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2003
- 2003-08-25 CN CNA031505392A patent/CN1490404A/zh active Pending
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CN105850981B (zh) * | 2016-04-29 | 2018-07-20 | 绍兴市人民医院 | 冻存肿瘤组织的方法 |
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CN114196617A (zh) * | 2021-12-22 | 2022-03-18 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 器官特异性的乳腺癌转移模型及其建立方法和应用 |
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