CN1292070C

CN1292070C - 同时表达两个反义bFGF的重组真核表达载体及其用途

Info

Publication number: CN1292070C
Application number: CN 200510051166
Authority: CN
Inventors: 祁雅慧; 温铭杰; 邴国英
Original assignee: Capital Medical University
Current assignee: Capital Medical University
Priority date: 2005-03-02
Filing date: 2005-03-02
Publication date: 2006-12-27
Anticipated expiration: 2025-03-02
Also published as: CN1654664A

Abstract

本发明属于基因工程领域，涉及一种能同时表达两个反义碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)的重组真核表达载体。将此重组载体导入细胞后，能更有效地阻止bFGF的翻译和表达，抑制肿瘤细胞的生长。

Description

同时表达两个反义bFGF的重组真核表达载体及其用途

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及核酸反义技术。具体地说，涉及一种能同时表达两个反义碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growthfactor，bFGF)的重组真核表达载体。将此重组载体导入细胞后，能更有效地阻止bFGF的翻译和表达，抑制肿瘤细胞的生长。

背景技术

研究表明，新生血管的形成是实体瘤生长的关键。肿瘤细胞可产生大量的血管生成因子促进血管的生成，其中VEGF和bFGF最为重要。bFGF是发现最早、研究最多、生物学效应最强、作用最广泛的成纤维细胞生长因子，是多种类型细胞的有丝分裂原，具有对成纤维细胞、血管内皮细胞和神经细胞的促生长作用，不仅能够刺激血管内皮细胞的有丝分裂和趋化性，还参与血管腔形成。

与传统化疗相比，靶向血管治疗因不易产生耐药性，毒副作用小，效率高，可用于多种肿瘤等优点，应用前景十分广阔。

靶向血管治疗的反义核酸技术发展很快，2000年Inoue等人用腺病毒为载体，将bFGF反义基因导入移植了人膀胱癌细胞系的动物模型，下调了bFGF分泌，阻碍了肿瘤血管生成及肿瘤的发展^[1]。2004年Kuhn等人将反义bFGF cDNA转染人非小细胞肺癌，抑制了肿瘤细胞的生长^[2]。

与人工合成寡核苷酸相比，质粒载体构建简单，扩增容易，使用方便，无免疫排斥，可反复使用，目前应用最为广泛。反义基因表达的量越多，对相应正义基因的封闭作用也越显著。但目前应用的反义bFGFcDNA真核表达载体均为单个基因反向插入，尚无多个基因反向插入的报道。

发明内容

本发明涉及一种能同时表达两个反义碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的真核表达载体。更具体地说，本发明中将两个bFGF基因同时反向插入质粒载体，形成重组载体。在本发明的具体实施方案中，所述两个bFGF基因被串联反向插入到pcDNA3.1(+)质粒载体中，形成重组载体pcDNA3.1-AS(bFGF)₂。

本发明的表达载体在载体用量一定的情况下，表达反义bFGF的量增多，可以更好地封闭正义bFGF基因，使bFGF蛋白表达量减少，更有效地抑制肿瘤细胞生长及微血管形成，从而用于肿瘤及血管增生性疾病的治疗。

因此，本发明另一方面涉及本发明的表达载体的用途，该表达载体可以用于肿瘤及血管增生性疾病的治疗。基于该表达载体的治疗用途，可以将其用于制备新的治疗肿瘤及血管增生性疾病的药物。

附图说明

图1为重组载体的构建图。

图2为HindIII、BamH I酶切图谱。

M1：λDNA/EcoR I+HindIII分子量标准

M2：50bp分子量标准(50、100、150、200、250、300、350、400、500bp)1-3：pcDNA3.1-bFGF、pcDNA3.1-As(bFGF)₂、pcDNA3.1-AsbFGF/HindIII酶切

4-6：pcDNA3.1-bFGF、pcDNA3.1-As(bFGF)₂、pcDNA3.1-AsbFGF/BamH I酶切

图3为Kpn I和Nhe I双酶切图谱。

M1：λDNA/EcoR I+HindIII分子量标准

M2：小分子量标准(200、400、600、800、1200、1600、2000bp)

1：Kpn I和Nhe I双酶切pcDNA3.1(+)

2：Kpn I和Nhe I双酶切pcDNA3.1-bFGF

3：Kpn I和Nhe I双酶切pcDNA3.1-As(bFGF)₂

4：Kpn I和Nhe I双酶切pcDNA3.1-AsbFGF

图4为T7引物测序结果。

图5为BGH引物测序结果。

图6为PCR产物的电泳图谱。

M：DNA分子量标准

1-4：未转染的SH-SY5Y细胞、转染空载体、单个反义bFGF重组质粒、两个反义bFGF重组质粒的SH-SY5Y细胞中反义bFGF基因PCR扩增结果

5-8：上述各细胞中α-actin基因PCR扩增结果

图7为重组质粒对肿瘤细胞体外生长的影响曲线。

具体实施方式

本发明的具体实施方案为：通过RT-PCR方法从人组织中扩增468bp片段的bFGF cDNA，并经测序证实，与genebank完全一致。bFGF cDNA两端有HindIII酶切位点。

本发明通过HindIII单个酶切位点将pcDNA3.1载体切开，再将目的片段与去磷酸化的线性载体连接，经过转化，质粒提取，用HindIII酶切确定有片段插入，BamH I酶切鉴定为反向插入；Kpn I和Nhe I双酶切鉴定插入片段为2个；最后经测序证实。

将该重组载体转染神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y，提取细胞基因组DNA，经PCR确定反义bFGF片段的完整性。

将该重组载体转染神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y，用MTT法检测细胞增殖情况，结果表明：随着培养时间的延长，与空载体组和转染单个反义bFGF cDNA重组质粒的细胞相比，转染两个反义bFGF cDNA重组质粒的肿瘤细胞生长受到明显抑制。

以下通过实施例来进一步阐明本申请的内容。应当理解，实施例仅用于示例性说明申请的技术方案的具体实施方式，而不是以任何方式限定本申请的范围。

实施例

一、单个及两个反义bFGF重组质粒(pcDNA3.1-ASbFGF及pcDNA3.1-AS(bFGF)₂)的构建及鉴定：

1、正义bFGF重组质粒(pcDNA3.1-bFGF)由本室构建保存^[3]。所用载体为pcDNA3.1(+)，5428bp。它含有CMV启动子，BGH多聚腺苷酸序列，在CMV和BGH之间依次有Nhe I、HindIII、Kpn I、BamH I等多克隆位点。bFGF基因片段长度为468bp。(如图1)

2、用限制性内切酶HindIII(购自Promega公司)将pcDNA3.1-bFGF切开。

酶切反应系统包括：质粒DNA： 4μg

10×反应缓冲液： 2μl

HindIII： 2μl(10u/μl)

水： to 20μl

混匀，短暂离心后，37℃保温1-2hr。经1％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下准确切取bFGF胶条。

3、用玻璃奶法回收bFGF片段(DNA片段玻璃奶回收试剂盒购自博大泰克公司)。

1)从琼脂糖凝胶上切下所需DNA片段(体积不超过100μl)，置于1.5mlEppendorf管中。

2)加入3倍体积的溶胶液，50℃保温3min，其间轻摇Eppendorf管几次使胶完全溶化。

3)加入10μl玻璃奶(用前充分混匀)，颠倒混匀，冰浴下放置10min，每隔2-3min混匀一次。12000rpm离心30秒，吸弃上清。

4)加250μl漂洗液，用加样器吹打漂洗液，轻柔地将玻璃奶悬浮混匀，12000rpm离心30秒，吸弃上清。

5)重复步骤4(尽量吸尽漂洗液)。吸取完漂洗液后再离心10秒钟，将最后一点漂洗液吸弃干净。然后，放置于37℃温箱干燥直至沉淀呈白色，约15-20min。

6)加适量无菌蒸馏水(20μl)，混匀，60℃水浴5min，12000rpm离心1min，回收上清备用。重复步骤6)，以提高回收率。

4、同样用HindIII切开pcDNA3.1(+)载体，玻璃奶法回收后，经过去磷酸化过程，防止自身环化。牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)购自Promega公司。

脱磷酸反应系统包括：CIAP： 1μl

10×反应缓冲液： 2μl

线性pcDNA3.1： 17μl

反应体系共20μl。37℃保温30min，再加CIAP 1μl，37℃保温30min后，玻璃奶法回收DNA片段。冻存于-20℃，以备连接。

5、将脱磷线性pcDNA3.1与bFGF以1∶3-1∶10质量比进行DNA连接反应。

T4DNA连接酶购自Promega公司。反应中加入PEG以促进连接。

DNA连接反应系统包括：载体DNA： 4μl

外源片段： 2μl

10×反应缓冲液： 1μl

T4DNA连接酶： 1μl

PEG： 0.5μl

水： 1.5μl

反应体系共10μl。混匀，离心。16℃过夜。

6、取5μl连接产物转化高效感受态DH5α细菌细胞(购自博大泰克公司)。冰浴20min，室温放置10min，加入400μl LB培养基，37℃150rpm振荡培养1hr。随后取100-200μl铺平皿，于37℃温箱培养12-16hr，氨苄青霉素筛选阳性转化子。

7、次日长出多个单菌落，扩增后小量提取质粒，酶切鉴定分析。HindIII酶切初步筛选是否有bFGF片段插入，BamH I酶切鉴定插入片段方向(结果见图2)，因pcDNA3.1上BamH I酶切位点在930bp，而外源bFGF上BamH I酶切位点在406bp处，故片段若为正向插入，则片段大小应为两个：80bp，5816bp；若为单个反向插入，片段为两个，大小分别为：424bp，5472bp；若为两个反向插入，片段应为三个，大小分别为：424bp，468bp，5472bp。

8、用插入片段上下游的两个酶切位点Kpn I和Nhe I双酶切鉴定插入片段数目(结果见图3)。可见酶切片段为两个：约936bp，5428bp。

9、取重组质粒经DNA序列测定(上海生工公司)确定其方向性、完整性及插入片段的数目。测序结果正确(结果见图4、5)。基因序列(SEQ IDNO：1)与预期相符。

二、按QIAGEN质粒纯化试剂盒操作说明，纯化重组的pcDNA3.1-ASbFGF及pcDNA3.1-AS(bFGF)₂载体，紫外分光光度计测得质粒A260/A280介于1.8-2.0，表明质粒纯化完全。

三、基因转染及稳定转染细胞株的筛选：

1、SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系(ATCC CRL-2266)为本室传代保存。用DMED完全培养液，37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱传代培养，对数生长期备用。

2、脂质体介导DNA转染SH-SY5Y细胞及稳定转染株的筛选。

实验分四组：空白组

空载体组

pcDNA3.1-ASbFGF组

pcDNA3.1-AS(bFGF)₂组

于转染前1天，将SH-SY5Y细胞用2.5g/L的胰酶消化、细胞计数按5×10⁴/孔接种于24孔板中。当细胞长满至80-90％时，分别以相应重组质粒转染SH-SY5Y细胞，具体操作按LipofectAMINE试剂盒(购自Invitrogen公司)中的说明书进行，同时设置未转染的对照。

将细胞置于37℃、5％CO₂孵箱中培养48h(期间不必换液)，48h后换以G418(200mg/L)进行筛选，3-4天换液1次，培养10天后，转染细胞呈克隆生长，扩大培养并提高G418浓度至400mg/L，持续筛选4周备用。筛出稳定表达外源基因的抗性克隆。

四、PCR检测反义bFGF片段的完整性：

(一)基因组DNA提取(鼎国公司基因组DNA提取试剂盒)：

1、培养细胞至对数生长期，≤10⁷细胞用0.25％胰酶消化后，PBS悬浮，1000rpm，5min。弃去上清。

2、将细胞悬浮于300μl溶液B(5N异硫氰酸胍)中，反复混匀，室温放置5min。

3、加入800μl溶液C(4N NaClO₄PH5.2)，20μl溶液A(RNase A 10mg/ml)，25μl溶液D(resin)，充分混匀，室温放置10-20min。

4、1000rpm离心5min，弃上清。

5、加入400μl溶液C，混匀，1000rpm离心1min，弃上清。

6、加入500μl溶液E(洗液)混匀，1000rpm离心30-60秒，弃上清。

7、重复步骤6。

8、15000rpm离心1min，吸干上清，室温晾干，约5-10min。

9、加入80μl无菌水，混匀，50℃保温5min。

10、15000rpm离心30-60秒，取上清，即为基因组DNA。可得基因大小约20kb，浓度约100ng/μl。

(二)PCR反应(rTaq酶购自TOYOBO^TM公司)：以确定bFGF片段的方向和完整性。

5’引物为bFGF cDNA序列：5’-TCA gCT CTT AgC AgA CAT Tgg-3’(SEQ ID NO：2)

3’引物为pcDNA3.1(+)序列：5’-TAg AAg gCA CAg TCg Agg-3’(SEQID NO：3)

引物由上海生工公司合成，每管1OD260，加无菌双蒸水溶解至终浓度为10μmol/L。

PCR反应体系包括：10×PCR缓冲液： 2μl

2mM dNTPs： 2μl

10mM 5’引物： 0.6μl

10mM 3’引物： 0.6μl

rTaqDNA聚合酶(5u/μl)：0.2μl

基因组DNA： 5μl

无菌水： to 20μl

PCR扩增条件：

94℃预变性5分钟；

94℃45秒，55℃45秒，72℃60秒，35个循环；

72℃后延伸10分钟。

反应完毕，取5μl电泳观察。(结果见图6)

单个bFGF反向插入，扩增片段597bp；

两个bFGF反向插入，扩增片段597bp、1071bp。

同时设置内参照：α-skeletal actin：

5’引物：5’-CgC gAC ATC AAA gAg AAg CT-3’(SEQ ID NO：4)

3’引物：5’-ggg CgA TgA TCT TgA TCT TC-3’(SEQ ID NO：5)

内参扩增片段367bp，PCR条件：

94℃预变性5分钟；

94℃15秒，55℃30秒，72℃60秒，30个循环；

72℃后延伸10分钟。

五、MTT法绘制细胞生长曲线：

1、将稳定转染pcDNA3.1-ASbFGF、pcDNA3.1-AS(bFGF)₂及空载体的SH-SY5Y细胞分别接种于25cm²培养瓶，对数生长期备用。

2、以PBS(PH 7.4)洗涤细胞3次，0.25％胰蛋白酶消化，用低血清(2％FBS)的DMEM培养液制成单细胞悬液，并按3×10³/孔细胞密度分种96孔培养板，37℃、5％CO₂培养6天，分别于5、24、48、72、96、120、144h，收取三孔细胞，按下述方法测定细胞增殖。

3、每孔加入20μl MTT(5mg/ml，Sigma公司)，继续培养4h。

4、弃去MTT，加150μl DMSO，反应15min，使细胞及胞内甲瓒溶解，最后于490nm处测定上述各时刻点细胞吸光值。每个样品三孔重复，另设对照孔，内含等体积培养基，不含细胞。

5、以时间(天数)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。(结果见图7)

结果表明：随着培养时间的延长，与空载体组和转染单个反义bFGFcDNA重组质粒的细胞相比，转染两个反义bFGF cDNA重组质粒的肿瘤细胞生长受到明显抑制。

参考文献

[1]Inoue K，Perrotte P，Wood CG，etc.Gene therapy of human bladder cancer withadenovirus-mediated antisense basic fibroblast growth factor.Clin CancerRes.2000，6(11)：4422-4431

[2]Kuhn H，Kopff C，Konrad J，etc.Influence of basic fibroblast growth factor on theproliferation of non-small cell lung cancer cell lines.Lung Cancer.2004，44(2)：167-174

[3]祁雅慧，王雅梅，孙丽翠，等。人碱性成纤维细胞生长因子基因的克隆、表达及生物活性分析。中华中西医杂志。2004，5(13)：1217-1220。

基因序列(SEQ ID NO：1)：

TCAGCTCTTAGCAGACATTGGAAGAAAAAGTATAGCTTTCTGCCCA

GGTCCTGTTTTGGATCCAAGTTTATACTGCCCAGTTCGTTTCAGTGC

CACATACCAACTGGTGTATTTCCTTGACCGGTAAGTATTGTAGTTAT

TAGATTCCAATCGTTCAAAAAAGAAACACTCATCCGTAACACATTT

AGAAGCCAGTAATCTTCCATCTTCCTTCATAGCCAGGTAACGGTTA

GCACACACTCCTTTGATAGACACAACTCCTCTCTCTTCTGCTTGAAG

TTGTAGCTTGATGTGAGGGTCGCTCTTCTCCCGGACCCCGTCAACTC

GGCCGTCGGGGTGGATGCGCAGGAAGAAGCCCCCGTTTTTGCGATA

CAGCCGCTTGGGGTCCTTGAAGTGGCCGGGCGGGAAGGCGCCGCT

GCCGCCATCCTCGGGCAAGGCGGGCAGCGTGGTGATGCTCCCGGCT

GCCATAAGCTTTCAGCTCTTAGCAGACATTGGAAGAAAAAGTATAG

CTTTCTGCCCAGGTCCTGTTTTGGATCCAAGTTTATACTGCCCAGTT

CGTTTCAGTGCCACATACCAACTGGTGTATTTCCTTGACCGGTAAGT

ATTGTAGTTATTAGATTCCAATCGTTCAAAAAAGAAACACTCATCC

GTAACACATTTAGAAGCCAGTAATCTTCCATCTTCCTTCATAGCCA

GGTAACGGTTAGCACACACTCCTTTGATAGACACAACTCCTCTCTC

TTCTGCTTGAAGTTGTAGCTTGATGTGAGGGTCGCTCTTCTCCCGGA

CCCCGTCAACTCGGCCGTCGGGGTGGATGCGCAGGAAGAAGCCCC

CGTTTTTGCGATACAGCCGCTTGGGGTCCTTGAAGTGGCCGGGCGG

GAAGGCGCCGCTGCCGCCATCCTCGGGCAAGGCGGGCAGCGTGGT

GATGCTCCCGGCTGCCAT

序列表

<110>首都医科大学

<120>同时表达两个反义bFGF的重组真核表达载体及其用途

<130>CP1050019

<160>5

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>942

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>反义序列

<400>1

tcagctctta gcagacattg gaagaaaaag tatagctttc tgcccaggtc ctgttttgga 60

tccaagttta tactgcccag ttcgtttcag tgccacatac caactggtgt atttccttga 120

ccggtaagta ttgtagttat tagattccaa tcgttcaaaa aagaaacact catccgtaac 180

acatttagaa gccagtaatc ttccatcttc cttcatagcc aggtaacggt tagcacacac 240

tcctttgata gacacaactc ctctctcttc tgcttgaagt tgtagcttga tgtgagggtc 300

gctcttctcc cggaccccgt caactcggcc gtcggggtgg atgcgcagga agaagccccc 360

gtttttgcga tacagccgct tggggtcctt gaagtggccg ggcgggaagg cgccgctgcc 420

gccatcctcg ggcaaggcgg gcagcgtggt gatgctcccg gctgccataa gctttcagct 480

cttagcagac attggaagaa aaagtatagc tttctgccca ggtcctgttt tggatccaag 540

tttatactgc ccagttcgtt tcagtgccac ataccaactg gtgtatttcc ttgaccggta 600

agtattgtag ttattagatt ccaatcgttc aaaaaagaaa cactcatccg taacacattt 660

agaagccagt aatcttccat cttccttcat agccaggtaa cggttagcac acactccttt 720

gatagacaca actcctctct cttctgcttg aagttgtagc ttgatgtgag ggtcgctctt 780

ctcccggacc ccgtcaactc ggccgtcggg gtggatgcgc aggaagaagc ccccgttttt 840

gcgatacagc cgcttggggt ccttgaagtg gccgggcggg aaggcgccgc tgccgccatc 900

ctcgggcaag gcgggcagcg tggtgatgct cccggctgcc at 942

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>2

tcagctctta gcagacattg g 21

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>3

tagaaggcac agtcgagg 18

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>4

cgcgacatca aagagaagct 20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>5

gggcgatgat cttgatcttc 20

Claims

1.一种重组真核表达载体，其中两个bFGF基因串联反向插入真核表达载体。

2.权利要求1的载体，其中所述真核表达载体是pcDNA3.1(+)。

3.权利要求2的载体，其中包括SEQ ID NO：1所示的序列。

4.权利要求1-3之一的重组真核表达载体在制备治疗肿瘤及血管增生性疾病的药物中的用途。