CN1807609A - 一种耐高温乳糖酶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的耐高温乳糖酶的制备方法，属于生物技术领域。本发明方法包括以下步骤：将耐高温乳糖酶基因构建到杆状病毒运载载体上，得到重组杆状病毒运载载体；通过体内或体外重组，将耐高温乳糖酶基因整合到杆状病毒的基因组上，得到重组杆状病毒；用所得到的重组杆状病毒感染昆虫宿主；培养被感染的昆虫宿主使其进行耐高温乳糖酶的表达；收集、纯化所表达的产物即得。本发明方法可以高效、廉价、大规模的生产耐高温乳糖酶，所获得的耐高温乳糖酶能够广泛的应用于食品及饲料生产领域。

Description

一种耐高温乳糖酶的制备方法

技术领域

本发明涉及一种酶的制各方法，尤其涉及一种利用杆状病毒表达系统生产耐高温乳糖酶的方法，属于生物技术领域。

背景技术

杆状病毒表达系统这一生物反应器是八十年代建立起来的。自从1983年首次利用杆状病毒表达系统高效表达了人的α-干扰素以来(Smith，Mol.CellBiol.，3：2156-2165，1983)，已有数十个外源基因得到了高效表达，仅我国就有α-干扰素(杨冠珍等，生物化学与生物物理学报，22：355-361，1990)、慈菇蛋白酶抑制剂(季平等，蚕业科学，21：223-227，1995)、马立克氏病毒糖蛋白B(肖庆利等，蚕业科学，23：104-108，1997)等多种。利用此系统来生产耐高温乳糖酶的优点在于：1.这一表达系统的表达效率极高，产量可达10毫克级/虫的水平，亦即每头蚕3000U以上。因而可大大降低耐高温乳糖酶的生产成本并使耐高温乳糖酶大规模生产成为可能；2.这一表达系统为真核表达系统，其表达的外源蛋白质可进行翻译后修饰，使其在生化性质和生物活性等与天然产品相似，这为表达出的耐高温乳糖酶具有正常的生物学活性提供了保证。3.用此系统生产的耐高温乳糖酶只需高温就可纯化，降低了生产成本。目前，杆状病毒表达系统，尤其是其中的家蚕(Bm)-家蚕杆状病毒(BmNPV)表达系统是世界上最具有商业开发价值的真核生物个体表达系统之一。

从耐高温古微生物中克隆的CelB基因曾在大肠杆菌表达系统(VoorhorstW.，et al，J.Bacteriol.，177，7105-7111，1995；Lebbink J.，et al，Methods Enzymol，330，364-379，2001)和毕赤酵母系统(Smith J.，et al.，Biotechnol.Bioeng.，79(7)：713-723，2002)中进行了表达，但是表达量均很低，不足以大规模生产。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种高效、廉价、大规模的耐高温乳糖酶的制备方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的：

一种耐高温乳糖酶的制备方法，包括以下步骤：

将耐高温乳糖酶基因构建到杆状病毒运载载体上，得到重组杆状病毒运载载体；通过体内或体外重组，将耐高温乳糖酶基因整合到杆状病毒的基因组上，得到重组杆状病毒；用所得到的重组杆状病毒感染昆虫宿主；培养被感染的昆虫宿主使其进行耐高温乳糖酶的表达；收集、纯化所表达的重组耐高温乳糖酶，即得。

上述制备方法中，所述的耐高温乳糖酶基因可以为来源于各种高温微生物、植物等的耐高温乳糖酶基因，优选为来源于强烈炽热古细菌(Pyrococcusfuriosus)菌株的CelB基因，该基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，该基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

所述的杆状病毒运载载体可以选自AcRP23-lacZ，AcRP6-SC，AcUW1-lacZ，BacPAK6，Bac to Pac，Bacmid，BlueBacII(pETL)，p2Bac，p2Blue，p89B310，pAc360，pAc 373，pAcAB3，pAcAB 4，pAcAS3，pAcC129、C4、DZ1，pAcGP67，pAcIE1，pAcJP1，pAcMLF2，pAcMLF 7，pAcMLF 8，pAcMP1，pAcMP 2，pAcRP23，pAcRP 25，pAcRW4，pAcsMAG，pAcUW1，pAcUW 21，pAcUW 2A，pAcUW 2B，pAcUW 3，pAcUW 31，pAcUW 41，pAcUW 42，pAcUW 43，pAcUW 51，pAcVC2，pAcVC 3，pAcYM1，pAcJcC5，pBac 1，pBac 2，pBlueBacIII，pBlueBacHis，pEV55，mXIV，pIEINeo，pJVETL，pJVNhe1，pJVP10，pJVrsMAG，pMBac，pP10，pPAK1，pPBac，pSHONEX1.1，pSYN XIV VI+，pSYNVI+wp，pSYNXIV VI-，pVL1391，pVL 1392，pVL1393，pVL941，pVL 945，pVL 985，pVL94，pVTBac，pBM030或pUAC-5，优选为pVL94。由于不同的转运载体对表达效率的影响非常大，AcMNPV的专用载体pVL1393系列的构建业已证明是比较成功的。据分析，在杆状病毒生物反应器中表达效率的关键在于启动子的优劣及翻译起始点附近的序列结构对外源基因的mRNA稳定性及翻译效率的影响。据此，我们构建了新型的适于家蚕杆状病毒BmNPV的专用表达载体pVL94(具体构建过程见实施例二)，该专用表达载体能够在家蚕杆状病毒中高效表达。

所述的重组杆状病毒运载载体优选为pVL94-CelB。

所述的杆状病毒选自BmNPV、AcMNPV、ApNPV、BsSNPV、CfMNPV、EoSNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、S1MNPV、SeMNPV或TeNPV，优选为BmNPV。

所述的重组杆状病毒优选为rBmNPVCelB，该重组杆状病毒可通过以下方法制备得到：将耐高温乳糖酶基因CelB重组到家蚕杆状病毒亲本株BmNPV的基因组上，替代病毒基因组上的Polyhedrin基因，然后通过空斑筛选技术和PCR检测技术，获得携带CelB的重组家蚕杆状病毒rBmNPVCelB。

所述的昆虫宿主包括对杆状病毒敏感的昆虫，如家蚕(Bombyx mori)、野蚕(Bombyx mandarina)、蓖麻蚕(Philosamia cynthia ricim)、樟蚕(Dictyoploca japanica)、樗蚕(Philosamia cynthia pryeri)、柞蚕(Antheraeapernyi)、日本柞蚕(Antheraea yamamai)、野天蚕(Antheraea polyphymus)、苜蓿尺蠖(Atographa califorica)、茶尺蠖(Ectropis obliqua)、甘兰夜蛾(Mamestra brassicae)、斜纹夜蛾(Spodoptera littoralis)、秋粘虫(Spodopterafrugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、行军虫(Thaumetopoea wilkinsoni)、棉铃虫(Heliothis armigera)、美国棉铃虫(Heliothis zea)、烟青虫(Heliothisassulta)、烟草夜蛾(Heliothis virescens)、东方粘虫(Pseudaletia separata)或舞毒蛾(Lymantria dispar)等，优选为家蚕(Bombyx mori)。

所述的感染是指将重组病毒通过口食或通过表皮的途径来感染1-5龄的昆虫幼虫或蛹体，其中，所述的昆虫幼虫优选为4或5龄的昆虫幼虫，所述的蛹体优选为1-3天的早期嫩蛹。

所述的纯化重组耐高温乳糖酶的方法优选为收集含重组耐高温乳糖酶的家蚕幼虫或蛹的体液或整体匀浆，将收集到的体液或整体匀浆高温处理后，再进行常温离心，取上清，用105-130℃喷雾温度进行喷雾干燥，即得纯化后的耐高温乳糖酶；其中所述的高温通常指80-95℃，优选为90℃；所述的常温通常指4-42℃，优选为30℃。

一般家蚕杆状病毒生物反应器的基因工程表达产品的纯化方法均在低温下进行，并要经过一系列的蛋白质(硫酸铵)沉淀、浓缩、透析、柱层析等方法以分离纯化所表达的表物。本发明根据表达产物的超耐高温的酶学特性设计了一个集蛋白质纯化和浓缩、干燥为一体的纯化方法，具有步骤简捷、廉价、快速、成本低、安全性高等优点。

本发明的一个最优选技术方案的整体描述：

将来源于高温古生物的耐高温乳糖酶基因CelB，插入到自行构建的病毒运载载体pVL94上，获得重组病毒运载载体；再通过体内重组将CelB基因转移到家蚕杆状病毒亲本株BmNPV的基因组上，替代基因组上的Polyhedrin基因，通过空斑筛选技术和PCR检测技术，获得携带CelB的重组家蚕杆状病毒rBmNPV(CelB)；将获得的重组家蚕杆状病毒rBmNPV(CelB)感染家蚕细胞系或穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫或蛹，大量繁殖rBmNPV(CelB)。当rBmNPV(CelB)在蚕体内复制时，CelB在多角体蛋白基因(polh)启动子控制下表达，产生耐高温乳糖酶。在感染3-6天(最佳为4.5-5天)后收集含耐高温乳糖酶的家蚕幼虫或蛹的体液(或整体匀浆)，高温处理后，进行常温离心，去除蚕体蛋白，取上清，用105-130℃喷雾温度进行喷雾干燥，即得耐高温乳糖酶。

本发明通过杆状病毒表达系统，应用昆虫幼虫及蛹作为生物反应器大规模生产耐高温乳糖酶，能够高效表达耐高温乳糖酶。例如，每毫升蚕血淋巴可产生3毫克以上的CelB蛋白，活力高达10000U以上，一条蚕(或蛹)产生的酶活力约为2万单位(或12000单位)以上，在pH 4.0-6.5，温度80-130℃范围内，所表达的酶均有很高的活力，有利于酶制剂加工。本发明生产的耐高温乳糖酶经过纯化后，能够添加到食品、奶制品或饲料中，改进食品、奶制品或饲料中的营养成分，提高食品和饲料的营养价值。

本发明方法生产耐高温乳糖酶的生产成本也明显低于利用大肠杆菌表达系统或酵母系统生产耐高温乳糖酶的成本。

总之，本发明提供了一种高效、廉价、大规模的生产耐高温乳糖酶的方法，能够广泛的应用于食品及饲料生产领域。

附图说明

图1 CelB基因在宿主昆虫体内的表达时相曲线。

图2耐高温乳糖酶进行纯化和加工后的SDS-PAGE蛋白电泳图谱。

1，4：10kDa标准蛋白分子量对照；2：未处理的β-glucosidase；3：初步纯化的β-glucosidase；5：野生型对照。

图3耐高温乳糖酶在不同pH值条件下的活性。

图4耐高温乳糖酶在不同温度条件下的稳定性。

以下通过实施例来进一步描述本发明的有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

具体实施方式

实验材料：

1.菌株、病毒株与载体：大肠杆菌株E.coli TG1和DH_5α购自Promega公司；pVL1393(购自Clontech公司)，家蚕细胞BmN、家蚕核型多角体病毒亲本株BmNPV(BmNPV、家蚕细胞BmN也可从Clontech公司购买得到)由中国科学院上海生化所吴祥甫研究员惠赠；家蚕品种JY1由中国农业科学院蚕业研究所农业部家蚕生物技术重点开放实验室保存；高温古菌菌株购自Japan Collection of Microorganisms，RIKEN。

2.酶与试剂：限制性内切酶、连接酶、RNA酶、Proteinase K为Promega公司产品。

3.生化试剂：IPTG、X-Gal、SDS及pNPG为Sigma公司产品。过硫酸铵、TEMED、丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺为Promega公司产品。Lipofectin、低融点琼脂糖LMP、PCR试剂盒、细胞培养基TC-100、胎牛血清及其他试剂购于GIBCO-BRL公司。

4.培养基：大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)；家蚕细胞培养基为TC-100(购自Gibco公司或Sigma公司)。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆试验手册》(Sambrook等编著，科学出版社，1992年版)一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例一、CelB基因的克隆和序列分析

1、含CelB基因的耐高温强烈炽热古细菌(Pyrococcus furiosus)基因组DNA的制备

(1)挑取单菌落，过夜培养。

(2)12,000rpm离心2min，去上清。

(3)沉淀中加入500μl含25％蔗糖的0.05M Tris-Cl(pH 8.0)缓冲液，混匀重悬，加入100μl5mg/ml溶菌酶，混匀，20℃温育1hr。

(4)加入SET溶液(150mM NaCl，1Mm EDTA，20mM pH 8.0的Tris-Cl)，500μl5％SDS和100μl20mg/ml蛋白酶K，混匀，于37℃温育1hr。

(5)加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1)，混匀，11,000g离心5min，上清移入新管。

(6)加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，混匀，11,000g离心5min，上清移入新管。

(7)加入等体积氯仿，混匀，11,000g离心5min，上清移入新管。

(8)加入2倍体积无水乙醇，轻轻混匀至DNA沉淀，11,000g离心5min，去上清。

(9)沉淀中加入1ml 70％酒精。

(10)11,000g离心5min，去上清，抽干后加入50μl 0.1×TE溶解，于-20℃保存。

2、PCR扩增CelB基因产物

化学合成CelB基因5’端和3’端引物：5’-GAG GGA TCC AAT ATG AAGTTC CCA AAA AAC TTC ATG T-3’(Forward)和5’-AAA GAA TTC TGGCTA CTT TCT TGT AAC AAA TTT GAG-3’(Revise)。用步骤1中制备的基因组DNA作为模板进行PCR反应，扩增CelB基因。

PCR反应体系见表1，PCR反应过程：94℃变性10分钟；94℃1分钟，53℃1分30秒，72℃3分钟，共35个循环。最后72℃延伸反应10分钟。

                       表1 PCR反应体系

加入物	体积
		灭菌ddH2O10×PCR Buffer2.5mM dNTP5‘引物3‘引物模板DNAPfu酶	36μl5μl4μl1μl1μl2μl1μl
Total	50μl

3、PCR产物的纯化

将PCR扩增的CelB基因产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，发现扩增出约1.4kb的片段。在紫外灯下用灭菌手术刀切取含相应DNA片段的凝胶，然后用Geneclean试剂盒进行纯化。方法如下：切取凝胶片段并称重，将其放入灭菌的1.5ml小离心管中，加入3倍(v/w)体积的6MNaI，37℃将凝胶溶解后，加入10μl玻璃奶(Glass milk)，混匀后室温下放置5分钟，使DNA充分吸附在玻璃奶上，12,000rpm离心5秒钟，再用New Wash溶液重悬沉淀并离心，重复3次。将沉淀晾干后加入30μl 0.1×TE Buffer溶解DNA，离心后取上清作进一步分析。

4、酶切与连接反应

酶切反应：纯化后DNA用BamHI和EcoRI双酶切分析，反应总体积为50μl，其中纯化的PCR产物10μl，10×酶相应缓冲液5μl，两种酶各为1μl，无菌水补足体积。37℃反应2小时以上。将转移质粒pGEM-3Z作同样酶切反应。反应结束后于65℃灭活10分钟。

连接反应：连接总体积15μl，PCR产物8μl，载体1μl，5×T₄DNA连接缓冲液3μl，T₄DNA连接酶1μl，无菌水补足体积，12～14℃连接过夜。

5、大肠杆菌的遗传转化

用75mM CaCl₂制备大肠杆菌TG1感受态细胞。取步骤4中制备的连接混合物5μl，加到200μl感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30分钟，42℃热激2分钟，迅速置于冰上1～2分钟，加入已温育至37℃的LB培养基500μl，37℃培养1小时，取100～200μl涂布于含100μg/ml氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养过夜。

6、质粒DNA的制备

(1)从转化的LB平板上挑取单个菌落，接种于3ml含100μg/ml Amp的LB培养基中，37℃培养过夜。

(2)取1.5ml菌液于小离心管中，3,500rpm离心4min，去上清。

(3)加入Solution I 150μl，混匀后置于冰上15min。

(4)加入Solution II 300μl，氯仿150μl，轻轻混匀后静置5min。

(5)加入Solution III 450μl，混匀后置于冰上15min。

(6)11,000g离心10min，上清移入新管。

(7)加入异丙醇450μl，混匀后置于4℃15min。

(8)11,000g离心6min，去上清。

(9)加入TER 250μl，混匀后置于37℃20min。

(10)加入PPt Buffer 300～350μl，混匀后静置15min。

(11)11,000g离心6min，去上清。

(12)加入75％乙醇400μl。

(13)11,000g离心3min，倒掉乙醇，抽干后加入0.1×TE Buffer 100μl溶解，于-20℃保存。

7、重组子的鉴定

用BamHI和EcoRI双酶切步骤6中制备的质粒DNA，电泳后出现约1.4kb的DNA条带的质粒为重组运载质粒。将重组质粒pGEM-3Z(CelB)进行双向测序，测序结果见SEQ ID NO：1，所推导的氨基酸序列见SEQ ID NO：2所示。

实施例二、重组转移载体pVL94(CelB)的构建

首先设计了一对突变引物，该引物序列如下：

Primer1：5’gggatcccgatggtgggggtgtatgaataattcggaatattt

Primer2：5’aaagcttaactttatcc aataatatat tatgtata

Primer1将多角体的起始密码子ATG突变为ATT，同时在5′端引入了BamH I位点，保留了35bp的多角体基因序列以稳定外源基因的转录产物和提高翻译效率；在反向引物Primer2中引入了HindIII位点以利于基因克隆。

以野生BmNPV的DNA为模板进行PCR扩增，将扩增片断用BamH I、HindIII双酶切后，克隆入pUC18(购自Gibco公司)的HindIII和BamH I位点，得载体pUC-BH，进一步用BamH I和Sal I酶切pVL1393载体(购自Clontech公司)得其3’端同源序列，将之克隆入已含有启动子及5′端同源序列的BamH I和EcoR I双酶切的载体pUC-BH中通过连接，Klenow补平，将连接产物转化大肠杆菌TG1，筛选得到适于家蚕杆状病毒高表达的转移载体pVL94。

将实施例一中所制备的质粒pGEM-3Z(CelB)用BamHI和EcoRI双酶切，按实施例一中步骤3的方法纯化CelB基因片段，与经同样酶切的杆状病毒转移载体pVL94连接后转化大肠杆菌TG1，筛选得到重组转移载体pVL94-CelB。

实施例三、家蚕核多角体病毒亲本株BmNPV的繁殖及病毒DNA的制备

按GIBCO公司产品说明配制1×TC-100培养基，用2N NaOH将pH调至6.22，过滤除菌后的培养基补加10％胎牛血清，27℃下培养家蚕细胞Bm-5。用家蚕核多角体病毒亲本株BmNPV感染对数生长期的细胞约50ml，感染复数为1，3～4天后收集病毒感染液，离心(5,000rpm×10min)，除去沉淀，上清用25,000rpm离心1小时，除上清，用1ml病毒DNA抽提液(1,000ml中含Tris 12.1g，EDTA 33.6g，KCl 14.1g，pH7.5)悬浮病毒粒子沉淀，转移至1.5ml离心管中，加入蛋白酶K至终浓度为50μg/ml，50℃保温2小时，再加入35％的Sarkorsel至终浓度为1％，继续于50℃保温2小时，分别用等体积的苯酚、苯酚∶氯仿(1∶1)氯仿依次抽提，将上层水相转移到一个新管中，加入1/10体积的3M NaCl，再加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置2小时以上沉淀病毒DNA，5,000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，冷冻干燥。溶解在100μl TE Buffer中，放4℃保存备用。

实施例四、重组家蚕杆状病毒rBmNPV(CelB)的构建和获得

1.重组杆状病毒rBmNPV(CelB)的构建

接种大约1×10⁶家蚕细胞于15cm²培养瓶中，细胞贴壁后，除去含胎牛血清(FBS)培养基，用不含FBS的培养基洗三次，加1.5ml无FBS培养基，备用。

向一灭菌管中依次加入1μg家蚕杆状病毒亲本株BmNPV DNA，2μg重组转移质粒pVL94-CelB DNA和5μl脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60μl，轻轻混匀，静置15分钟后，逐滴加入到上述培养瓶中进行共转染。27℃培养4小时后补加1.5ml无血清培养基和300μl FBS(购自Invitrogen公司)。27℃恒温培养4～5天，收集上清液用于重组病毒的筛选。

2.重组家蚕杆状病毒rBmNPV(CelB)的筛选和纯化

接种适量家蚕细胞(约70～80％)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将共转染上清进行不同浓度稀释，取1ml共转染液加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1小时后，吸去感染液，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与40℃预热的2×TC-100培养基(含20％FBS)混合均匀，每平皿加4ml胶，待凝固后用Parafilm封口，27℃倒置培养3～5天，显微镜观察。将不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmNPV(CelB)。

3.重组病毒rBmNPV(CelB)在家蚕细胞中的扩增

将重组家蚕杆状病毒rBmNPV(CelB)感染正常生长的BmN细胞，培养3天后收集上清液，上清液中即含有大量的重组病毒rBmNPV(CelB)。

4.重组病毒的鉴定

利用PCR方法分析外源基因整合。游离病毒基因组DNA的提取方法如下：取病毒上清150μl，加入150μl(0.5mol/L)的NaOH后混匀，再加入20μl(8mol/L)的醋酸铵，混匀后用等体积的酚和氯仿分别抽提一次，酒精沉淀后用20μl的TE溶解DNA。寡核苷酸引物为：

5’-GAG GAT CCA CGA TGA AAG CGA TCT TAA TCC CAT-3’

5’-TTG AAT TCA TTA CAA ACT GCA CGC CGG TAT-3’

取上述病毒基因组DNA 1μl进行PCR扩增，反应条件为：94℃变性5min、94℃ 1min、55℃ 1min、72℃ 1min，30个循环，最后72℃延伸5min。电泳鉴定扩增产物。

实施例五、CelB基因在家蚕中的表达

本实验所用的家蚕高表达品种为JY1(由本发明人实验室保存)。JY1品种家蚕饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。饷食后48h选择平均体重相同的15头家蚕为一组，每头蚕接种约1.0×10⁵rBmNPV(CelB)，即5μl接种液中含2.0×10⁷pfu/ml的rBmNPV(CelB)，共12组，在病毒感染后分别按60h、72h、84h、96h、108h、120h的时间取血样并测定CelB酶活力，重复三次。从感染病毒60h开始，CelB开始表达，随着时间的增加，所表达的酶活也随之增加，在病毒感染后120小时达最高，每ml蚕血淋巴CelB酶活力达10,199.5单位。表达时相曲线图见图1。

实施例六、CelB基因在家蚕蛹体中表达

本实验所用的家蚕蛹为高表达品种为JY1(由本实验室保存)。JY1品种家蚕饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。结茧七天后选择平均体重相同的15粒蚕蛹为一组，每头蛹接种约1.0×10⁵rBmNPV(CelB)，即5μl接种液中含2.0×10⁷pfu/ml的rBmNPV(CelB)，共12组，在病毒感染后按60h、72h、84h、96h、108h、120h的时间取血样并测定CelB酶活力，重复三次。从感染病毒60h开始，CelB开始表达，随着时间的增加，所表达的酶活也随之增加，在病毒感染后108至120小时达最高，每ml蚕血淋巴CelB酶活力大于10000单位，经酶活测定每条蚕和蛹的表达量高达20,000和12,000国际单位。

实施例七、耐高温乳糖酶的纯化

含耐高温乳糖酶的昆虫虫体用一定量的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH5.0，90℃)或醋酸—醋酸钠缓冲液稀释，高速匀浆，90℃保温15分钟，使宿主昆虫的蛋白和DNA充分变性，4℃，2000-10,000rpm×20min高速离心或过滤法去残渣和变性物，保留上清，用105-130℃喷雾温度进行喷雾干燥，获得纯化的高温乳糖酶，纯化产物的SDS-PAGE电泳图见图2。

实施例八、本发明所制备的耐高温乳糖酶的特性分析

供试酶：实施例七所纯化的耐高温乳糖酶。

1.耐高温乳糖酶的反应最适pH值

分别用不同缓冲液配制底物，调节底物pH值，0.1mol/L Na₂HPO₄-NaAC(Ph 2.5-3.0)、0.1mol/L NaAc-Hac(pH 2.5-6.5)、0.1mol/L Na₂HPO₄-NaH₂PO₄(pH 6.0-8.0)，测定在90℃时不同pH条件下反应10分钟的酶活力，CelB催化反应的最适pH为5.0，当pH值超过6.0时，酶活力急剧下降，在pH值超过8.0时，酶活力几乎测不出(图3)。

2.耐高温乳糖酶的温度稳定性

含耐高温乳糖酶的血样用0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH5.0，90℃)稀释后，分别在90-140℃下油浴15分钟，迅速用冰浴降温，10,000rpm×20min离心，取上清稀释后测定酶活力，以稀释后未经处理的样品作对照，比较酶活力。耐高温乳糖酶活力在温度90-110℃之间随温度的上升酶活没有改变，至120℃、130℃时则下降约20％，当温度超过140℃后酶迅速失活(图4)。

                                              序列表.txt

                         SEQUENCE LI STING

<110>  中国农业科学院生物技术研究所：中国农业科学院饲科研究所

<120>  一种耐高温乳糖酶的制备方法

<130>  P0089

<160>  2

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  1419

<212>  DNA

<213>  强烈炽热古细菌(Pyrococcus furiosus)

<400>  1

atgaagttcc caaaaaactt catgtttgga tattcttggt ctggtttcca gtttgagatg        60

ggactgccag gaagtgaagt ggaaagcgac tggtgggtgt gggttcacga caaggagaac       120

atagcatcag gtctagtaag tggagatcta ccagagaacg gcccagcata ttggcacctc       180

tataagcaag atcatgacat tgcagaaaag ctaggaatgg attgtattag aggtggcatt       240

gagtgggcaa gaatttttcc aaagccaaca tttgacgtta aagttgatgt ggaaaaggat       300

gaagaaggca acataatttc cgtagacgtt ccagagagta caataaaaga gctagagaaa       360

attgccaaca tggaggccct tgaacattat cgcaagattt actcagactg gaaggagagg       420

ggcaaaacct tcatattaaa cctctaccac tggcctcttc cattatggat tcatgaccca       480

attgcagtaa ggaaacttgg cccggatagg gctcctgcag gatggttaga tgagaagaca       540

gtggtagagt ttgtgaagtt tgccgccttc gttgcttatc accttgatga cctcgttgac       600

atgtggagca caatgaacga accaaacgta gtctacaatc aaggttacat taatctacgt       660

tcaggatttc caccaggata tctaagcttt gaagcagcag aaaaggcaaa attcaactta       720

attcaggctc acatcggagc atatgatgcc ataaaagagt attcagaaaa atccgtggga       780

gtgatatacg cctttgcttg gcacgatcct ctagcggagg agtataagga tgaagtagag       840

gaaatcagaa agaaagacta tgagtttgta acaattctac actcaaaagg aaagctagac       900

tggatcggcg taaactacta ctccaggctg gtatatggag ccaaagatgg acacctagtt       960

cctttacctg gatatggatt tatgagtgag agaggaggat ttgcaaagtc aggaagacct      1020

gctagtgact ttggatggga aatgtaccca gagggccttg agaaccttct taagtattta      1080

aacaatgcct acgagctacc aatgataatt acagagaacg gtatggccga tgcagcagat      1140

agatacaggc cacactatct cgtaagccat ctaaaggcag tttacaatgc tatgaaagaa      1200

ggtgctgatg ttagagggta tctccactgg tctctaacag acaactacga atgggcccaa      1260

gggttcagga tgagatttgg attggtttac gtggatttcg agacaaagaa gagatattta      1320

aggccaagcg ccctggtatt cagagaaata gccactcaaa aagaaattcc agaagaatta      1380

gctcacctcg cagacctcaa atttgttaca agaaagtag                             1419

<210>  2

<211>  472

<212>  PRT

<213>  强烈炽热古细菌(Pyrococcus furiosus)

<400>  2

Met Lys Phe Pro Lys Asn Phe Met Phe Gly Tyr Ser Trp Ser Gly Phe

1               5                   10                  15

                                                序列表.txt

Gln Phe Glu Met Gly Leu Pro Gly Ser Glu Val Glu Ser Asp Trp Trp

            20                  25                  30

Val Trp Val His Asp Lys Glu Asn Ile Ala Ser Gly Leu Val Ser Gly

        35                  40                  45

Asp Leu Pro Glu Asn Gly Pro Ala Tyr Trp His Leu Tyr Lys Gln Asp

    50                  55                  60

His Asp Ile Ala Glu Lys Leu Gly Met Asp Cys Ile Arg Gly Gly Ile

65                  70                  75                  80

Glu Trp Ala Arg Ile Phe Pro Lys Pro Thr Phe Asp Val Lys Val Asp

                85                  90                  95

Val Glu Lys Asp Glu Glu Gly Asn Ile Ile Ser Val Asp Val Pro Glu

            100                 105                 110

Ser Thr Ile Lys Glu Leu Glu Lys Ile Ala Asn Met Glu Ala Leu Glu

        115                 120                 125

His Tyr Arg Lys Ile Tyr Ser Asp Trp Lys Glu Arg Gly Lys Thr Phe

    130                 135                 140

Ile Leu Asn Leu Tyr His Trp Pro Leu Pro Leu Trp Ile His Asp Pro

145                 150                 155                 160

Ile Ala Val Arg Lys Leu Gly Pro Asp Arg Ala Pro Ala Gly Trp Leu

                165                 170                 175

Asp Glu Lys Thr Val Val Glu Phe Val Lys Phe Ala Ala Phe Val Ala

            180                 185                 190

Tyr His Leu Asp Asp Leu Val Asp Met Trp Ser Thr Met Asn Glu Pro

        195                 200                 205

Asn Val Val Tyr Asn Gln Gly Tyr Ile Asn Leu Arg Ser Gly Phe Pro

    210                 215                 220

Pro Gly Tyr Leu Ser Phe Glu Ala Ala Glu Lys Ala Lys Phe Asn Leu

225                 230                 235                 240

Ile Gln Ala His Ile Gly Ala Tyr Asp Ala Ile Lys Glu Tyr Ser Glu

                245                 250                 255

Lys Ser Val Gly Val Ile Tyr Ala Phe Ala Trp His Asp Pro Leu Ala

            260                 265                 270

Glu Glu Tyr Lys Asp Glu Val Glu Glu Ile Arg Lys Lys Asp Tyr Glu

        275                 280                 285

Phe Val Thr Ile Leu His Ser Lys Gly Lys Leu Asp Trp Ile Gly Val

    290                 295                 300

Asn Tyr Tyr Ser Arg Leu Val Tyr Gly Ala Lys Asp Gly His Leu Val

                                              序列表.txt

305                 310                 315                 320

Pro Leu Pro Gly Tyr Gly Phe Met Ser Glu Arg Gly Gly Phe Ala Lys

                325                 330                 335

Ser Gly Arg Pro Ala Ser Asp Phe Gly Trp Glu Met Tyr Pro Glu Gly

            340                 345                 350

Leu Glu Asn Leu Leu Lys Tyr Leu Asn Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Met

        355                 360                 365

Ile Ile Thr Glu Asn Gly Met Ala Asp Ala Ala Asp Arg Tyr Arg Pro

    370                 375                 380

His Tyr Leu Val Ser His Leu Lys Ala Val Tyr Asn Ala Met Lys Glu

385                 390                 395                 400

Gly Ala Asp Val Arg Gly Tyr Leu His Trp Ser Leu Thr Asp Asn Tyr

                405                 410                 415

Glu Trp Ala Gln Gly Phe Arg Met Arg Phe Gly Leu Val Tyr Val Asp

            420                 425                 430

Phe Glu Thr Lys Lys Arg Tyr Leu Arg Pro Ser Ala Leu Val Phe Arg

        435                 440                 445

Glu Ile Ala Thr Gln Lys Glu Ile Pro Glu Glu Leu Ala His Leu Ala

    450                 455                 460

Asp Leu Lys Phe Val Thr Arg Lys

465                 470

Claims (10)

1、一种耐高温乳糖酶的制备方法，包括以下步骤：

将耐高温乳糖酶基因构建到杆状病毒运载载体上，得到重组杆状病毒运载载体；通过体内或体外重组，将耐高温乳糖酶基因整合到杆状病毒的基因组上，得到重组杆状病毒；用所得到的重组杆状病毒感染昆虫宿主；培养被感染的昆虫宿主使其进行耐高温乳糖酶的表达；纯化所表达的重组耐高温乳糖酶，即得。

2、按照权利要求1的制备方法，其特征是：所述的耐高温乳糖酶基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

3、按照权利要求1的制备方法，其特征是：所述的杆状病毒运载载体选自AcRP23-lacZ，AcRP6-SC，AcUW1-lacZ，BacPAK6，Bac to Pac，Bacmid，BlueBacII(pETL)，p2Bac，p2Blue，p89B310，pAc360，pAc 373，pAcAB3，pAcAB 4，pAcAS3，pAcC129、C4、DZ1，pAcGP67，pAcIE1，pAcJP1，pAcMLF2，pAcMLF7，pAcMLF8，pAcMP1，pAcMP2，pAcRP23，pAcRP25，pAcRW4，pAcsMAG，pAcUW1、pAcUW21，pAcUW2A，pAcUW2B，pAcUW3，pAcUW31，pAcUW41，pAcUW42，pAcUW43，pAcUW51，pAcVC2，pAcVC3，pAcYM1，pAcJcC5，pBac1，pBac2，pBlueBacIII，pBlueBacHis，pEV55、mXIV，pIEINeo，pJVETL，pJVNhe1，pJVP10，pJVrsMAG，pMBac，pP10，pPAK1，pPBac，pSHONEX1.1，pSYN XIV VI+，pSYNVI+wp，pSYNXIV VI-，pVL1391、pVL1392、pVL1393，pVL941，pVL945，pVL985，pVL94，pVTBac，pBM030或pUAC-5。

4、按照权利要求3的制备方法，其特征是：所述的杆状病毒运载载体为pVL94。

5、按照权利要求1的制备方法，其特征是：所述的重组杆状病毒运载载体为pVL94-CelB。

6、按照权利要求1的制备方法，其特征是：所述的杆状病毒选自BmNPV、AcMNPV、ApNPV、BsSNPV、CfMNPV、EoSNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、SlMNPV、SeMNPV或TeNPV，

7、按照权利要求6的制备方法，其特征是：所述的杆状病毒为BmNPV。

8、按照权利要求1的制备方法，其特征是：所述的重组杆状病毒是rBmNPVCelB。

9、按照权利要求1的制备方法，其特征是：所述的昆虫宿主是家蚕(Bombyx mori)。

10、按照权利要求1的制备方法，其特征是：所述的纯化为收集含耐高温乳糖酶的家蚕幼虫或蛹的体液或整体匀浆，将收集到的体液或整体匀浆高温处理后，再进行常温离心，取上清，用105-130℃喷雾温度进行喷雾干燥，即得纯化后的产物。

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