CN1233826C - 一种重组毕赤酵母乳糖酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明包括一种性质优良的乳糖酶其编码基因的克隆、高效表达乳糖酶的重组毕赤酵母的构建以及重组酵母的高密度发酵大量产生乳糖酶的方法。重组酵母中乳糖酶的表达量可达到6mg/mL发酵液。高效表达乳糖酶的重组酵母可用来大规模工业化廉价生产乳糖酶。
Description
技术领域
本发明属于酶的基因工程领域，具体地说涉及一种重组毕赤酵母高效表达乳糖酶以及在工业酶制剂中的应用。
背景技术
β-半乳糖苷酶(β-D半乳糖苷半乳糖水解酶，β-D-galactosido-galatohydrolase，EC 3.2.1.23)通常被称为乳糖酶(Lactase)。这种酶能将乳糖水解成为半乳糖和葡萄糖，也具有半乳糖苷的转移作用(张树政等，酶制剂工业，科学出版社，1984，p818～819)。乳糖酶存在于植物(尤其在杏、桃、苹果)、细菌(乳酸菌、大肠杆菌等)、真菌(米曲霉、黑曲霉、硫球曲霉、脆壁酵母、乳结合酵母、乳酸酵母、热带假丝酵母)以及放线菌(天蓝链霉菌)、动物肠道(特别是乳婴)中。乳糖则是牛奶和乳清中的主要成分，乳糖约占牛奶干物质的30％，但溶解度低，在20℃水中溶解度仅为20％，而其甜度仅及蔗糖的16％，久贮的乳制品由于乳糖析出，呈砂样感觉，影响风味。此外，许多成人，特别是婴儿(因人种而异，西欧占2～8％，亚洲、非洲占60～90％)体内缺乏乳糖酶，因此他们很难消化牛奶，饮用牛奶后，乳糖到了肠里，被肠道细菌分解发酵，产生大量二氧化碳气体，使肠道膨胀，并兴奋肠道蠕动，使收缩加强，造成肠鸣和腹泻，这种疾病称作乳糖不耐受症(G.G.伯奇等，酶与食品加工，轻工业出版社，1991，p93～110)。
乳糖酶主要用来治疗乳糖不耐受症、处理加工牛乳、乳清等，生产低乳糖牛奶和低乳糖乳制品及减少环境污染。1.解决乳糖不耐受症患者食用乳制品的问题(G.G.伯奇等，酶与食品加工，轻工业出版社，1991，p93～110)。由于乳糖不耐受症患者体内缺乏乳糖酶，他们就不能充分利用乳制品中乳糖所提供的能量，乳糖在其体内不能被吸收，就成为肠道微生物菌系的能源，这样就导致乳酸和二氧化碳的形成，它们对肠道有刺激作用，并造成机体脱水进入结肠，最终会出现腹泻，同时发生肠梗塞和胀气等，造成肠道蠕动加快，还会减少蛋白质和无机盐类的营养吸收。腹泻还会带来卫生学方面的问题和造成重复感染的机会。可通过口服乳糖酶或将乳糖酶直接加到乳制品中来解决这一问题。在工业生产中可将乳糖酶加到乳制品中制成低乳糖的乳制品，一方面减轻乳糖不耐受症的影响，另一方面可提高乳制品的营养。2.改良浓缩乳和浓缩乳清的质量。由于乳糖的溶解度低，在低温下极易从浓缩乳和浓缩乳清中结晶析出，加入乳糖酶可防止冷冻乳及浓缩乳清中的乳糖结晶而引起乳酪蛋白的凝固。此外，乳清作为饲料的利用价值很高，但乳糖对家畜的生长有一定限制，使用乳糖酶将乳糖分解为单糖既提高了消化率，同时也消除了乳糖结晶所产生的操作不便。3.改良冰淇淋的品质。在冰淇淋混合物中，如有12％以上的脱脂乳固形物时，贮藏及销售中会产生乳糖结晶，此结晶在口中呈砂样感，降低了商品价值，如脱脂固形物为16％，用酶分解其50％的乳糖后，在冰箱中放置四个月仍稳定，而且，增加了甜味，冰淇淋混合物中的砂糖可减少1～2％用量。此外，水解乳清或乳糖在三明治、软饮料和纺织品上浆中都有很大用途，在纺织品上浆中使用水解乳清可省去使用白蛋白，降低生产成本。
近年来，利用β-半乳糖苷酶生产低聚半乳糖也受到重视。因此，乳糖酶在食品工业生产中的作用日益显著。但目前乳糖酶并未在食品工业中得到广泛应用，主要原因是：目前乳糖酶的产量较低，销售价格过高，添加成本昂贵；市场上销售的乳糖酶主要来源于酵母，此种酶耐热性差，适用范围窄，不能满足食品工业多方面的需要。随着基因工程技术的发展，寻找研制出成本低，产量高，热稳定性强，更适合食品工业生产的乳糖酶，已成为研究热点。
目前，商品化的乳糖酶主要来源于微生物(相尺孝亮等著，酶应用手册，上海科学技术出版社，1989，407～414)。以大肠杆菌(Escherichia coli)、黑曲霉(Aspergillus niger)、乳糖发酵酵母(Kluyveromyces lactis)及臭曲霉(A.foetidus)的变异株为适宜。在研究蛋白质合成及遗传因子抑制的关系中，广泛应用的大肠杆菌β-半乳糖苷酶是第一个被结晶的乳糖酶，分子量为850,000Da。从大肠杆菌(E.coli)ML309所产生的乳糖酶，推测其分子量为518,000Da。大肠杆菌的酶最适pH为7.0，但在Na+存在下最适pH变为6.6。
在乳品及其他食品工业中获得有效应用的乳糖酶主要是由克鲁维斯氏酵母(Kluyveromyces lactis)和黑曲霉(Aspergillus niger)中得到的。克鲁维斯氏酵母是从牛乳中分离到的，其产生的乳糖酶最适pH与新鲜牛乳的天然pH(6.6～6.8)相近，主要适用于分解牛乳及脱脂奶粉中的乳糖。该酶在pH6.2～7.0稳定，6.2～7.0以上或以下酶活迅速下降。最适温度为35～40℃。分子量为135000Da。40℃处理1hr，pH在6.5～8.5之间稳定，即使处理3hr也同样稳定，处理24hr pH7～8稳定。40℃以上就急剧失活。Ca2+、Cu2+、Fe2+可以使酶失活，Mn2+、Mg2+可恢复Ca2+对酶的抑制，K+单独存在就可以大大提高酶的热稳定性(谢毅等，复旦学报(自然科学版)，1999，Vol.38，No.5：523-528)。以ONPG(邻硝基苯酚-β-D半乳糖苷)为底物，40℃反应3min，Km为2.78mmol/L，最大反应速度为0.1umol/min，酶的水解产物半乳糖对酶的活性有强烈的抑制作用，值得注意的是，核糖的抑制作用也极为强烈，但其机理尚不清楚(沈为群等，生物工程学报，1993，9(4)：348～354；Dickson R C et al.，Journal of Bacteriology，1980，142(3)：777～785)。
从黑曲霉所得的乳糖酶pH较低，而且在高温下有活性。分子量为106000Da，最适温度60℃，最适pH在3.5～4.0。精制酶在pH4～8稳定，粗酶在pH2.2～8稳定，以ONPG和乳糖为底物，Km分别为7.2×10-4M，1.8×10-2M，最大反应速度分别为86.7umol/min/mg和121.9umol/min/mg(LEE et.al.，Archives of Biochemistry and Biophysics，1970，138：264～271；AKASAKI M，et al.，J.Biochem，1976，80：1195～1200)。酶的稳定与激活，均不需要金属离子。Mg2+能抑制活性。螯合剂使酶钝化，对微量的重金属离子也不显示敏感。硝基酚疏基半乳糖苷(半乳糖酸内酯)(TANAKA，et al.，J.Biochem，1975，77：241-247)及半乳糖是强抑制剂。从霉菌来的乳糖酶的最大特点是热稳定性高，最适pH值低，这样在食品工业上就不容易受到微生物的污染，更具有应用价值。
目前，被克隆的乳糖酶基因有多种，用于工业生产的细菌、酵母以及真菌的乳糖酶基因均已被克隆(Haijime SHIBUYA et al.，Biotech.Biochem.，1995，59(7)：1345-1348；Irma F.Den Herder，et al.，Mol Gen Genet，1992，238：404-410；Huo Keke.SCIENCE IN CHINA(Series B)，1995，38(11)：1332-1340)。这些乳糖酶基因虽然来源不同，但它们之间却具有较高的同源性。Oliver Poch et.al.(gene，1992，118：55～63)将来源于Kluyveromyceslactis乳糖酶基因同几种来源于原核生物(E.coli，Kl.pneumoniae，Lbulgaricus，C.thermosulfurogenes)的乳糖酶基因进行比较发现，这几种基因间具有很高的同源性，其中Kluyveromyces lactis与E.coli乳糖酶基因在一些区域的同源性高达80％，即385个相对保守的氨基酸中有150个是绝对保守的。而且他们发现绝大多数与催化活性有关的氨基酸残基都处于这些同源区域之中，例如，与酶的催化活性有密切联系的Glu461，Tyr503，Met502均处于这些保守区域中。由此可推测，乳糖酶基因在进化和结构上都是相对保守的。Yoshiyuki ITO(Biosci.Biotech.Biochem.，1997，61(8)：1270-1276)从Bacillus circulans ATCC 31382克隆到的乳糖酶基因的编码区有1758bp，编码586个氨基酸，分子量为66888Da，该基因与Xanthomonas manihotis的β1-3，1-4半乳糖苷酶(galactosidases)基因有43.3％的同源性，与一些动物、植物和真菌的乳糖酶基因也有较高的同源性，说明此基因在进化上与真核生物有较密切的关系。霉菌之间乳糖酶基因的同源性就更高，比较A.niger733A和A.oryzae ATCC 74285乳糖酶基因，A.nigerA733(Huang，et.al.，US patent：5821，350，1998)乳糖酶基因有3466bp，其中含有8个内含子，编码区有3057bp，编码1007个氨基酸，有一个19个氨基酸的信号肽，推测成熟蛋白中有13个糖基化位点；A.oryzaeATCC 74285(Berka，et.al.，US patent，5736374，1998)乳糖酶基因3515bp，也含有8个内含子，编码区为3015bp，编码1005个氨基酸，同样含有一个19个氨基酸的信号肽，二者的同源性高达71.9％。
乳糖酶基因的高效表达主要集中在来源于曲霉的乳糖酶基因上，因为曲霉的乳糖酶热稳定性好，pH低，更适合食品加工的需要。1993年Ramakrishnan等(Ramakrishnan et.al.，Applied and EnvironmentalMicrobiology，1993，59：4230-4235；Kumar，et.al.，BIO/TECHNOLGY，1992，10：82-85)将来源于A.niger的乳糖酶基因至于ADH1启动子和终止子下，导入Saccharomyces cerevisiae GRF 167中，阳性克隆子在好氧条件下可快速、完全地水解乳糖产生较高的乙醇(0.31g/g sugar)和生物量(0.24g/g sugar)，在厌氧条件下发酵乳糖、葡萄糖、半乳糖、乳清生成的乙醇量可达到理论值。Berka等(US patent，5736374，1998)将产乳糖酶的A.oryaze CCC28通过紫外诱变，NTG诱变处理获得乳糖酶表达量较高的突变株CCC161(ATCC74285)(亲本乳糖酶分泌量为5U/mL，突变株分泌量为50U/mL)，以其为受体，将其自身的乳糖酶基因至于GalA启动子之下，导入其中，阳性克隆子中的乳糖酶蛋白表达量为1mg/mL发酵液，乳糖酶活性达500U/mL以上。比原始菌提高了100倍。同样，Huang，et.al.，克隆了来源于A.niger的乳糖酶基因，并尝试将此基因分别在霉菌自身、E.coli及非人的哺乳动物细胞中表达。他们针对不同的受体，构建了不同的表达系统，值得注意的是：他们认为此乳糖酶可以不经过糖基化作用直接在原核生物(如E.coli)中表达仍具有乳糖酶活性。
综上所述，虽然针对乳糖酶基因的表达做了许多研究，但总体说来表达水平还较低，如何提高乳糖酶的表达水平将是研究的难点。
发明内容
本发明总的目的是通过基因工程的方法，利用生物反应器毕赤酵母(Pichia pastoris)高效表达具有优良性质的乳糖酶基因，以解决乳糖酶在原始天然菌株中产量太低、难以获得大量产品、生产成本过高的问题。
本发明从Aspergillus candidus CGMCC3.2919中分离克隆到乳糖酶编码基因，为此基因的改造并在各种外源基因表达系统中高效表达提供优良的基因材料。通过PCR和RT PCR的方法分离克隆了这一乳糖酶基因的基因组DNA和cDNA，全序列分析结果表明，乳糖酶基因组DNA序列长3458bp，其中含有八个内含子，编码区长3015bp，共编码1005个氨基酸，与已发表的不同来源的乳糖酶的氨基酸序列比较，与米曲霉的同源性最高，达到99％，与黑曲霉来源的乳糖酶同源性为64.8％，而与其他来源的序列无明显同源。虽然此乳糖酶基因与来源于米曲霉的乳糖酶基因(Berka，et.al.，US patent，5736374，1998)的同源性较高，但它们的酶学性质有显著差异(表1)，本专利中的乳糖酶具有更为优良的性质。
表1.Aspergillus candidus CGMCC3.2919与Aspergillus oryzae(US patent，5736374，1998)所产乳糖酶的比较
| Aspergillus candidusCGMCC3.2919 | Aspergillus oryzae ATCC20423 | |
| 最适PH | 5.2 | 5.2 |
| 最适温度 | 60℃ | 55℃ |
| PH稳定性 | 相近 | 相近 |
| 热稳定性 | 更稳定，60℃处理30min剩余酶活62％ | 稳定性较差，60℃处理20min剩余酶活6.5％ |
| 金属离子及相关试剂稳定性 | 更好 | 较差，尤其对Cu2+，Fe2+更敏感 |
| 比活(U/mg) | 706 | 531.8 |
| km | 1.67 | 3.67 |
| vmax | 3333.3 | 3333.3 |
| cDNA序列同源性 | 99.5％ | |
| 氨基酸序列同源性 | 99.0％ | |
本发明提供了一种使乳糖酶基因在表达系统中高效表达的方法。包括整套重组表达载体的构建、受体菌的遗传转化方法、重组子的筛选与分子鉴定方法以及重组子中乳糖酶的表达方法。本发明采用毕赤酵母(P.pastoris)做为乳糖酶基因的表达受体，是因为与Berka等的专利(US patent，5736374，1998)所采用的宿主菌霉菌相比，毕赤酵母具有很多方面的优势，第一，霉菌的生长繁殖周期比毕赤酵母长很多，生物体生长周期长是生物工程的大忌；第二，霉菌的营养生长是通过菌丝体尖端的伸长生长实现的，这种生长特性尤其适合固体培养，而并不适合现代发酵工艺所常用的液态发酵，一般而言固体发酵工效低，周期长，成本高，由此使获得大量发酵产品的成本比之液态发酵要增加很多。相比之下，毕赤酵母是通过裂殖而增加营养体的，这种繁殖特性十分适合液态发酵；第三，霉菌营养体在生长发育期间需要提供足够的较复杂的碳氮有机养分，这也会增加发酵成本，毕赤酵母营养体的生长发育主要利用廉价的简单养分如甲醇、葡萄糖和氨水等，获得同等量的营养体毕赤酵母比霉菌消耗的养分要便宜得多。酵母的高细胞密度、低成本发酵方法已经建立(Siegel R.S.，Biotechnol.Bioeng，34：403-404，1989)，发酵培养基中所使用的碳源、氮源、盐、微量元素和生物素等都很便宜；第四，在真核生物表达系统中，酵母，包括毕赤酵母在内无疑是研究得最为详透的，在进行分子生物学操作时，酵母比霉菌更为容易、方便和有效。到目前为止，我们还未见到有利用酵母表达、生产乳糖酶的报道，但酵母作为一种良好的真核表达系统已成功地高效表达出许多具有生物活性的外源基因产物，如1989年报道的在酵母中表达了具有全部生物性活性的溶菌酶(Diyan M.E.，Bio/Tech.7：160-164，1989)，其表达量达到了550mg/L发酵液。又如，鼠表皮生长因子也在酵母中得到了高效表达，其表达量达到450mg/L。第五、毕赤酵母本身具有很好的安全性，曾作为单细胞蛋白广泛应用，酵母培养基中不含有毒物质和致热源；第六、表达的乳糖酶在信号肽的引导下会分泌到培养基中，这使乳糖酶直接暴露出来而无需破碎酵母菌体，便于乳糖酶的纯化加工。以上这些优势都是利用曲霉做为乳糖酶表达受体所不具备的，它为利用重组酵母工业化大规模、低成本发酵生产乳糖酶奠定了基础。
本发明提供了重组的乳糖酶基因工程菌株的高密度发酵、乳糖酶蛋白大量产生的方法，为乳糖酶工业化发酵生产奠定基础。本发明提供的以葡萄糖为碳源、氨水为氮源、葡萄糖-甲醇(均为廉价的工业原料)混合饲喂的菌体高密度发酵方法，使用通用的发酵装置即可。
本发明分离克隆了一种性质优良的新乳糖酶基因，提供了一种在真核表达系统中高效表达乳糖酶基因的方法及一种利用重组表达系统廉价发酵生产乳糖酶的方法。本发明分离到的具有优良特性的乳糖酶基因为此基因在各种生物反应器如杆状病毒表达系统、曲霉表达系统及植物中高效表达、大量生产乳糖酶提供了优良的基因源。
附图说明
图1Aspergillus candidus CGMCC3.2919中乳糖酶基因组DNA的克隆
图2Aspergillus candidus CGMCC3.2919中乳糖酶cDNA的克隆
图3乳糖酶cDNA序列中信号肽序列的去除过程
图4重组酵母表达载体pPIC9-lacb’的构建过程
图5重组酵母表达的乳糖酶的SDS-PAGE分析
1.受体酵母P.pastoris GS115
2、3、4、5、6、7、8，9甲醇诱导12hr、24hr、48hr、60hr、84hr、96hr、108hr、120hr乳糖酶的积累量
9.蛋白分子量Marker，分子量大小依次为：
212kD，170kD，116kD，76kD，53kD
图6重组酵母在5L发酵罐中高细胞密度发酵中表达产物乳糖酶的积累与诱导时间的关系
具体实施方式
实施例1
菌株与载体大肠杆菌菌株E.coli DH5a购自Promega公司，酵母菌株Pichia pastoris GS 115(His-Mut+)，质粒pPIC9。
酶与试剂盒限制性内切酶、连接酶、Taq酶、Mung bean酶为Boehringer公司产品。T7DNA sequence试剂盒购于Pharmacia公司。PCR试剂盒、RNA提取试剂盒为Progema公司产品；反转录酶等购自GIBCO公司。
生化试剂DNA合成试剂为Milipore公司产品。引物合成用ABI公司Cyclone DNA合成仪。IPTG、X-Gal、SDS及植酸钠为Sigma公司产品。TEMED、过硫酸铵、丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺为Promega公司产品。ONPG购自Pierce公司。
培养基曲霉生长培养基为PDA(20％马铃薯、2％蔗糖、2％琼脂)；亮白曲霉产酶培养基为麸皮培养基(10g麸皮+1L自来水，121℃，15磅灭菌20min，待冷却后用8层纱布过滤)。大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。酵母完全培养基为YPD(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)；酵母转化培养基为RDB[18.6％山梨醇、2％葡萄糖、1.34％Yeast Nitrogen Base W/O amino acids(YNB)、0.00004％Biotin、0.005％谷氨酸、0.005％甲硫氨酸、0.005％赖氨酸、0.005％亮氨酸、0.005％异亮氨酸、2％琼脂糖)]；酵母选择培养基为MM(1.34％YNB、0.00004％Biotin、0.5％甲醇、1.5％琼脂糖)和MD(1.34％YNB、0.00004％Biotin、2％葡萄糖、1.5％琼脂糖)；酵母诱导培养基BMGY[1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、1％甘油(V/V)]和BMMY(除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份相与BMGY相同)。重组酵母发酵培养基为10×Basal Salts(2.67％磷酸、0.093％硫酸钙、1.82％硫酸钾、1.49％硫酸镁、0.413％氢氧化钾、4％甘油或葡萄糖)；发酵中所用的微量盐溶液PTM1(0.6％硫酸铜、0.008％碘化钠、0.3％硫酸锰、0.02％钼酸钠、0.002％硼酸、0.05％氯化钴、2％氯化锌、6.5％硫酸亚铁、0.025％生物素、0.5％硫酸)。
本发明从Aspergillus candidus CGMCC3.2919中克隆乳糖酶基因组DNA和cDNA的程序。
菌株Aspergillus candidus CGMCC3.2919总DNA的提取采用以下方法：将在麸皮培养基中培养了72hr的菌体离心，称取0.3g湿菌体在液氮中研磨成粉末，加入冰预冷的0.4mL提取液中(50mM tris-HCl pH8.0，150mM氯化钠，100mM EDTA，pH8.0)，振荡混匀，加入50 L 10％SDS，37℃保温1hr，再加入75L 5M NaCl，轻轻混匀，然后加入65LCTAB/NaCl(10％CTAB，0.7M NaCl)，65℃下保温10～20min，依次用等体积的酚∶氯仿(1∶1)、氯仿抽提，上清液用终浓度为75％的异丙醇沉淀，沉淀70％乙醇洗两次后，真空干燥，溶于TE中备用。
根据已发表的米曲霉(Aspergillus oryzae)的乳糖酶基因序列(Berka，et.al.，US patent，5736374，1998)设计合成PCR引物A1和A2，以亮白曲霉(Aspergillus candidus CGMCC3.2919)的总DNA为模板，PCR扩增乳糖酶的基因组DNA，扩增条件为94℃ 4min，94℃ 1min，57℃ 1.5min，72℃3.5min，共35个循环，最后72℃ 10min。扩增到一条约3.5kb的特异DNA条带，电泳回收后克隆到pGEM-T easy载体上(图1)，得到重组载体pTlacb-DNA，对乳糖酶基因组DNA进行序列测定。
A1：5’
TACGTAATGAAGCTCCTCTCTGTTGCT 3’
SnaBI
A2：5’
GCGGCCGCTTAGTATGCTCCCTTCCGCTG 3’
NotI
菌株Aspergillus candidus CGMCC3.2919总RNA的提取方法如下：将在麸皮培养基中培养54hr的菌体离心，取湿重100mg，用1mmol/L的磷酸缓冲液(PH7.0)洗三次，在液氮中研磨成粉末，加入冰预冷的600L变性液(26mM醋酸钠，pH4.0、0.5％十二烷基肌氨酸、0.125M β-巯基乙醇、4M硫氰酸胍)中，然后依次加入60L 2mol/L醋酸钠(PH4.0)，混匀，加入600L酚-氯仿-异戊醇(125:24:1，PH4.7)，剧烈振荡，在冰上放置15min，4℃下10000g离心20min，将上清吸出，加入等体积的异丙醇，-20℃放置30min，4℃下10000g离心10min，弃去上清，沉淀加入1mL冰预冷的75％乙醇洗涤后，沉淀RNA自然干燥，用Nuclease-free水溶解后备用。
乳糖酶cDNA的分离克隆采用RT-PCR的方法(克隆流程见图2)。以总RNA为模板，利用GIBCO反转录试剂盒进行第一链的合成，以此产物为模板，进行PCR扩增。PCR扩增采取分段PCR的方法获得全长的cDNA，两段片段长分别为1.7kb和1.3kb。设计的两对引物(B1与B2、C1与C2)分别为：
B1：5′TACGTAATGAAGCTCCTCTCTGTTGCT 3’
B2：5′CAGCCTTCACAATAATGGAGG 3′
C1 5′CTCTGCTTACAACTACTGGG 3′
C2 5′GCGGCCGCTTAGTATGCTCCCTTCCGCTG 3’
反应体系(25L)，采用GIBCO Pfx试剂盒来分别扩增，扩增参数为94℃，4min；94℃，1min；57℃，1min；68℃，2min，35个循环后，68℃保温10min。B1和B2引物扩增到一1.7kb的特异条带，C1和C2引物扩增到一1.3kb的特异条带，将它们电泳回收后分别克隆到pGEM-T easy载体上，得到重组载体pTlacb-1.7和pTlacb-1.3，分别进行序列测定。用SmaI和PstI将1.7kb的乳糖酶cDNA片段从pTlacb-1.7上切下来，插入到pTlacb-1.3载体上的SmaI和PstI双切位点上，得到含有完整乳糖酶cDNA的重组载体pTlac-3.0。
亮白曲酶来源的乳糖酶基因组DNA和cDNA的序列结果见乳糖酶基因DNA序列表，乳糖酶基因组DNA序列推导的酶的氨基酸序列见氨基酸序列表。该结果表明，其基因组DNA长3458bp，GC含量为50.28％，cDNA长3015bp，GC含量为51.73％，编码1005个氨基酸。基因组DNA中共有8个内含子。信号肽长57bp，编码19个氨基酸：MKLLSVAAVALLAAQAAGA。来源于Kluyeromyces lactis、一些原核来源的乳糖酶其氨基酸序列有同源的保守序列，如：GXN(R/K)HE，RXSHYP，LCDXXG，RDXNHP，WSXXNE，而亮白曲霉的氨基酸序列中均无这些保守序列。亮白曲霉与来源于酵母、各类细菌、拟南芥及人的乳糖酶基因、氨基酸序列同源性的比较也说明：该基因与它们的同源性很低，与黑曲霉的同源性也只有60％左右。虽然它与米曲霉来源的乳糖酶(Berka，et.al.，USpatent，5736374，1998)氨基酸同源性达到99％，但其表现出的酶学性质有显著差异。
通过SDS-PAGE电泳可知亮白曲霉的乳糖酶蛋白分子量约为120KD。因N-连接的糖基化位点的特定的三肽序列为Asn-X-Ser或Asn-X-Thr(X除Pro外)，根据乳糖酶cDNA序列，该乳糖酶的潜在的N-糖基化位点有11个：478NVS，156NGT，373NVT，402NLT，453NLT，522NVT，622NAT，760NET，777NST，805NWT，914NNT。
本发明乳糖酶基因cDNA的改造，pTlacb′表达载体的构建(图3)。为了使乳糖酶基因cDNA能在酵母中顺利异源表达，我们去掉了cDNA中信号肽编码序列，具体方法为，参照信号肽编码序列之后的核苷酸序列合成一个24个碱基的寡聚核苷酸片断D1(5′TACGTATCCATCAAGCATCGTCTC 3′)作为PCR引物，另一引物D2(5′TGAATACGGAGTTGATGGGC 3′)参照cDNA中+870bp处的互补链合成，用这对引物进行PCR扩增，得到一0.9kb的无信号肽编码序列的乳糖酶基因片段，将之克隆到pGEM-T east载体上，再用PstI和EcoRV双酶切切下5’端的200bp的片段，同时，将携带有信号肽编码序列的乳糖酶cDNA的重组载体pTlacb-3.0用PstI和EcoRV双酶切，回收载体，将上述的200bp片段插入到这两个位点上，就得到了已无信号肽编码序列的完整的乳糖酶结构基因编码序列，此时的载体命名为pT-lacb’。
本发明乳糖酶基因在酵母表达载体上的构建过程。用于构建酵母表达载体的质粒是pPIC9(带有α-因子分泌信号)。首先将去掉信号肽编码序列的乳糖酶基因插入到上述表达载体的信号肽序列的下游，与信号肽形成正确的阅读框架，然后通过载体与酵母(P.pastoris)染色体基因组之间的同源重组事件使目的基因稳定整合到酵母染色体上。具体的过程是：将乳糖酶基因用SnaBI和NotI从质粒pT-lacb’上酶切下后，电泳回收约3.0kb的DNA片段，再将其插入到酵母表达载体pPIC9上的SnaBI和NotI双酶切位点上，得到了一个用于酵母转化的表达载体—pPIC9-lacb’(图4)。这样就将带有分泌信号的目的基因克隆到了AOX启动子下游。
酵母转化及筛选重组酵母株系的过程。质粒pPIC9-lacb’的DNA经电击转化酵母细胞后，通过体内重组，目的基因可以整合到受体酵母基因组中。在外源诱导物甲醇存在的条件下，AOX1启动子可以启动其下游基因的表达，并且信号肽可以指导表达产物进入酵母的分泌途径，经过切割，外源蛋白产物最终分泌至胞外，所产生的乳糖酶氨基酸序列与天然存在的成熟乳糖酶完全相同。外源蛋白经过这样的代谢途径，可以进行翻译后修饰，例如糖基化、形成二硫键等，从而得到具有生物活性的蛋白产物。
首先用2～3倍过量的内切酶BglII消化质粒pPIC9-lacb’的DNA(经PEG法纯化)，电泳检测酶切是否完全，使之线性化。用酚抽提，乙醇沉淀，70％乙醇洗两次，冷冻干燥，无菌水溶解，-20℃保存备用。
酵母菌株GS115接种于5mLYPD中30℃培养过夜，取0.5mL接种于500mLYPD中30℃培养使O.D.600＝1.3～1.5，1500×g离心5分钟，用500mL冰预冷的无菌水洗涤沉淀，如上离心，以20mL冰预冷的1mol/l山梨醇悬浮沉淀，如上离心，以0.5mL冰预冷的1mol/l山梨醇悬浮沉淀。取40μl酵母细胞液加入线性化DNA1～5μg，转移到冰预冷的无菌电击杯中冰浴5分钟。在国产电击仪LN-101上进行电击转化酵母受体菌GS115(his-)，电击参数为0.8kv，11.5μF。电击后立即向电击杯中加入0.5mL冰预冷的1mol/l山梨醇，然后将电击杯中的溶液转移到无菌的Eppendorf管中在RDB固体培养基上涂板，每板涂0.1mL，将培养皿倒置30℃培养至转化子出现。转化子可在基本培养基(不含His)生长，由于载体中没有酵母复制子，所以his4基因必须整合进酵母基因组中才能表达。另外，由于转化的酵母细胞中AOX1基因受到破坏，所以它就不能再利用甲醇作为碳源。这样，在以甲醇作为唯一碳源的培养基上转化子就不会生长(或者生长极缓慢)，表现为甲醇利用缺陷型(Mut-)。
用无菌牙签从转化平板上挑取His+重组子，首先接种到MM固体培养基上，在接种到MD固体培养基上，如此挑取His+重组子，30℃培养2天。寻找在MD平板上生长正常但在MM平板上有一点生长或完全不生长的克隆子。
为了筛选得到高表达的重组酵母菌株，直接检测诱导培养基中乳糖酶的表达情况。将His+Mut-转化子首先在BMGY培养基(以甘油为碳源)中培养，待其生长至饱和状态，移去BMGY，换入诱导培养基BMMY(以甲醇作为诱导物)，在诱导培养36小时后取上清液进行乳糖酶酶活性分析。通过表达乳糖酶的酶活性测定，初步筛选到3株高水平表达乳糖酶的重组子。
实施例2
本实施例是说明重组酵母在5升发酵罐中高密度发酵生产乳糖酶的程序。重组酵母在BMGY培养基中30℃摇床培养24小时，然后按5～10％接种于3-5％葡萄糖发酵培养基中开始发酵。具体发酵方法如下：1)菌株培养阶段。发酵培养基接种前先加入28％氨水使培养基的pH达到5.0(氨水同时也做为菌株生长的氮源)，再按每升培养基加入4.37mL PTM1，5～10％接种种子液，通气搅拌培养14～24hr，在培养过程中随着菌株的生长，培养基中的溶氧量将由100％逐渐降低，当碳源消耗完后溶氧量将再度升高至80％以上，此时菌体湿重将达到110g/L。2)碳源饲喂阶段。14-24小时后，流加18～35％葡萄糖(包含7～18mL/L PTM1)，流加量为12～24mL/hr/L，培养2～8hr。调整通气量使溶氧量始终大于20％。此时菌体湿重将达到220g/L。3)碳源-甲醇混合饲喂阶段。流加18～35％葡萄糖∶甲醇(2～6∶1～4)培养2～8hr，流加量为2～8mL/hr/L，控制溶氧量始终大于20％。4)诱导表达阶段。加如甲醇(含7～18mL/L PTM1)，使甲醇终浓度维持在0.1～0.5％，继续培养5小时以上溶氧量始终大于20％。在诱导过程中每12小时取样一次测定表达的乳糖酶的积累量。
通过此发酵工艺，乳糖酶的表达量可达到6mg/mL发酵液，发酵诱导120小时，效价达到3600U/mL发酵液(图5，图6)，比国外专利利用基因工程曲霉表达乳糖酶(Berka，et.al.，US patent，5736374，1998)高6倍以上。
Claims (2)
1.一种发酵生产乳糖酶的方法，包括以下步骤：
a.将含有乳糖酶编码基因的重组酵母菌株接种培养，然后按5～10％接种量再接种于含3～5％葡萄糖发酵培养基10×Basal salts中；
b.通气搅拌培养，在整个培养过程中氧饱和度不低于20％；
c.14～24小时后，按照12～24mL/hr/L的流量流动加入18～35％的葡萄糖溶液继续培养2～8小时；
d.按照2～8mL/hr/L的流量流动加入18～35％葡糖糖∶甲醇＝2～6∶1～4混合溶液，继续培养2～8小时；
e.加入诱导剂甲醇，使甲醇的终浓度维持在0.1～0.5％，继续培养至少5小时；
其中，所述乳糖酶编码基因基于下述核苷酸序列：
1 ATGAAGCTCCTCTCTGTTGCTGCTGTTGCCTTGCTGGCGGCACAGGCAGCGGGTGCTTCCATCAAGCATCGTCTCAATGGCTTCACGATC
91 CTGGAACATCCGGATCCGGCGAAAAGAGACTTGCTGCAAGACATTGTATGTCGTCATCAAATCTGAATCACTAGCTATGCTCCATAGTGA
181 TTATGTAAACATACTGACCCTCTGCAGGTTACATGGGATGACAAATCTCTGTTCATCAATGGAGAGAGGATTATGTTATTCAGCGGAGAA
271 GCATCCTTTCAGGTACACTAGCCCCGCGTACTTCTATGGTTTAATTCTGATGAAAACAGATTGCCAGTACCTTCGCTTTGGCTTGATA
361 TTCCACAAGATCAGAGCTCTTGGTTTCAACTGTGTATCTTTCTATATTGATTGGGCTCTTCTGGAGGGAAAGCCTGGCGACTACAGAG
452 GAAGGCATCTTTGCTCTGGAACCCTTCTTCGATGCAGCCAAGGAAGCAGGCATTTATCTGATCGCCCGCCCCGGTTCGTACATCAATG
541 CCGAGGTCTCAGGCGGTGGCTTCCCTGGATGGTTGCAGAGGGTCAATGGCACTCTTCGCTCGTCTGATGAGCCATTCCTTAAAGCTACTG
631 AAGTATGGGCTCATTGATGAGCTACTTCAGACACTTGCTTACAGTGTGATTTTAGCTATATCGCCAATGCCGCTGCTGCCGTGGCGAA
721 GGCTCAAATCACGAATGGAGGGCCAGTAATTCTCTACCAGCCCGAAAACGAATACAGCGGTGGCTGCTGCGGTGTCAAATACCCCGATGC
811 AGACTACATGCAGTATGTTATGGATCAGGCCCGGAAGGCTGACATTGTTGTACCTTTCATCAGCAACGATGCCTCACCTTCTGGGCACAA
901 TGCTCCTGGAAGTGGAACGGGCGCTGTTGATATTTATGGTCACGATAGCTATCCGTAAGTTATTCTGCATATGAGCTCCTTTCTTTTAGA
991 GATTTTCCGTTTGACGGCAACTGACATTTACCTAGCCTTGGCTTTGATTGCGTATGTTCTATCCTGCGAGCGAGATTGAATACTTCTGAC
1081 GTATATAGGCAAACCCATCCGTATGGCCCGAGGGTAAACTGCCCGACAACTTCCGCACGCTCCATCTTGAGCAGAGCCCATCAACTCCGT
1171 ATTCACTTCTTGAGGTAAGTTACTACTCAGCCTCGAGGACTAGTAATGTGTCTCACTGTCTTTTAGTTCCAAGCGGGTGCTTTCGACCCA
1261 TGGGGTGGACCCGGCTTTGAAAAATGCTATGCCCTCGTTAACCACGAATTCTCGAGAGTTTTCTATAGGAACGACTTGAGTTTCGGAGTT
1351 TCTACCTTTAACTTATACATGGTATGGTCTATTCATATCTCTGGAACATACATCGCGCTGACAATATATAGACTTTCGGCGGAACAAACT
1441 GGGGTAACCTCGGACATCCCGGTGGATATACATCCTACGACTACGGCTCGCCTATAACTGAAACGCGAAACGTTACACGGGAGAAGTACA
1531 GCGACATAAAGCTCCTTGCCAACTTTGTCAAAGCATCGCCATCCTATCTCACCGCTACTCCCAGAAACCTGACTACTGGTGTTTACACAG
1621 ACACATCTGACCTGGCTGTCACCCCGTTAATGGGTGATAGTCCAGGCTCATTCTTCGTGGTCAGACATACGGACTATTCCAGCCAAGAGT
1711 CAACCTCGTACAAACTTAAGCTTCCTACCAGTGCTGGTAACCTGACTATTCCCCAGCTGGAGGGCACTCTAAGTCTCAACGGACGTGACT
1801 CAAAAATTCATGTTGTTGATTATAATGTGTCTGGAACGAACATTATCTATTCGACAGCTGAAGTCTTCACCTGGAAGAAGTTTGACGGTA
1891 ACAAGGTCCTGGTGTTATACGGCGGACCGAAGGAACACCATGAATTGGCCATTGCCTCCAAGTCAAATGTGACCATCATCGAAGGTTCGG
1981 ACTCTGGAATTGTCTCAACGAGGAAGGGCAGCTCTGTTATCATTGGCTGGGATGTCTCTTCTACTCGTCGCATCGTTCAAGTCGGTGACT
2071 TGAGAGTGTTCCTGCTTGGTAAGTGAATTCACAAGAAACTCGCGTTCACGACTAATGAATCCACAGATAGAAACTCTGCTTACAACTACT
2161 GGGTCCCCGAACTCCCCACAGAAGGTACTTCTCCCGGGTTCAGCACTTCGAAGACGACCGCCTCCTCCATTATTGTGAAGGCCGGCTACC
2251 TCCTCCGAGGGGCTCACCTGGATGGTGCTGATCTTCATCTTACTGCTGATTTCAATGCCACCACCCCGATTGAAGTGATCGGTGCTCCAA
2341 CAGGCGCCAAGAATCTGTTCGTGAATGGTGAAAAGGCTAGCCACACAGTCGACAAAAACGGCATCTGGAGCAGTGAGGTCAAGTACGCGG
2431 CTCCAGAGATCAAGCTCCCCGGTTTGAAGGATTTGGACTGGAAGTATCTGGACACGCTTCCCGAAATTAAGTCTTCCTATGATGACTCGG
2521 CCTGGGTTTCGGCAGACCTTCCAAAGACAAAGAACACTCACCGTCCTCTTGACACACCAACATCGCTATACTCCTCTGACTATGGCTTCC
2611 ACACTGGCTACCTGATCTACAGGGGTCACTTCGTTGCCAACGGCAAGGAAAGCGAATTTTTTATTCGCACACAAGGCGGTAGCGCATTCG
2701 GAAGTTCCGTATGGCTGAACGAGACGTATCTGGGCTCTTGGACTGGTGCCGATTATGCGATGGACGGTAACTCTACCTACAAGCTATCTC
2791 AGCTGGAGTCGGGCAAGAATTACGTCATCACTGTGGTTATTGATAACCTGGGTCTCGACGAGAATTGGACGGTCGGCGAGGAAACCATGA
2881 AGAATCCTCGTGGTATTCTTAGCTACAAGCTGAGCGGACAAGACGCCAGCGCAATCACCTGGAAGCTCACTGGTAACCTCGGAGGAGAAG
2971 ACTACCAGGATAAGGTTAGAGGACCTCTCAACGAAGGTGGACTGTACGCAGAGCGCCAGGGCTTCCATCAGCCTCAGCCTCCAAGCGAAT
3061 CCTGGGAGTCGGGCAGTCCCCTTGAAGGCCTGTCGAAGCCGGGTATCGGATTCTACACTGCCCAGTTCGACCTTGACCTCCCGAAGGGCT
3151 GGGATGTGCCGCTGTACTTCAACTTTGGCAACAACACCCAGGCGGCTCGGGCCCAGCTCTACGTCAACGGTTACCAGTATGGCAAGTTCA
3241 CTGGAAACGTTGGGCCACAGACCAGCTTCCCTGTTCCCGAAGGGATCCTGAACTACCGCGGAACCAACTATGTGGCACTGAGTCTTTGGG
3331 CATTGGAGTCGGACGGTGCTAAGCTGGGTAGCTTCGAACTGTCCTACACCACCCCAGTGCTGACCGGATACGGGGATGTTGAGTCACCTG
3421 AGCAGCCCAAGTATGAGCAGCGGAAGGGAGCATACTAA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述乳糖酶编码基因编码的是一种水解乳糖为半乳糖和葡萄糖的乳糖酶，它由如下所示的氨基酸序列组成：
1 MKLLSVAAVALLAAQAAGASIKHRLNGFTILEHPDPAKRDLLQDIVTWDDKSLFINGERIMLFSGEVHPFRLPVPSLWLDIFHKIRALGF
91 NCVSFYIDWALLEGKPGDYRAEGIFALEPFFDAAKEAGIYLIARPGSYINAEVSGGGFPGWLQRVNGTLRSSDEPFLKATDNYIANAAAA
181 VAKAQITNGGPVILYQPENEYSGGCCGVKYPDADYMQYVMDQARKADIVVPFISNDASPSGHNAPGSGTGAVDIYGHDSYPLGFDCANPS
271 VWPEGKLPDNFRTLHLEQSPSTPYSLLEFQAGAFDPWGGPGFEKCYALVNHEFSRVFYRNDLSFGVSTFNLYMTFGGTNWGNLGHPGGYT
361 SYDYGSPITETRNVTREKYSDIKLLANFVKASPSYLTATPRNLTTGVYTDTSDLAVTPLMGDSPGSFFVVRHTDYSSQESTSYKLKLPTS
1020082
451 AGNLTIPQLEGTLSLNGRDSKIHVVDYNVSGTNIIYSTAEVFTWKKFDGNKVLVLYGGPKEHHELAIASKSNVTIIEGSDSGIVSTRKGS
541 SVIIGWDVSSTRRIVQVGDLRVFLLDRNSAYNYWVPELPTEGTSPGFSTSKTTASSIIVKAGYLLRGAHLDGADLHLTADFNATTPIEVI
631 GAPTGAKNLFVNGEKASHTVDKNGIWSSEVKYAAPEIKLPGLKDLDWKYLDTLPEIKSSYDDSAWVSADLPKTKNTHRPLDTPTSLYSSD
721 YGFHTGYLIYRGHFVANGKESEFFIRTQGGSAFGSSVWLNETYLGSWTGADYAMDGNSTYKLSQLESGKNYVITVVIDNLGLDENWTVGE
811 ETMKNPRGILSYKLSGQDASAITWKLTGNLGGEDYQDKVRGPLNEGGLYAERQGFHQPQPPSESWESGSPLEGLSKPGIGFYTAQFDLDL
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