CN102002471B - 一种木聚糖酶及其基因、高效表达的方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种产木聚糖酶的菌株Escherichia coli，和从该菌株中得到的一种新型木聚糖酶V-XYL及其高效表达的方法和应用。本发明提供一种来源于Escherichia coli(保藏编号是：CGMCC No.4234)的木聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本发明提供了编码上述木聚糖酶的基因，其序列如SEQ ID NO.2所示。该木聚糖酶的最适温度为60℃，最适pH值为5.0，在酸性范围内具有良好的pH稳定性，具有良好的抗蛋白酶的能力。本发明还提供了该木聚糖酶基因高效表达的方法，其表达量可达到100000U/mL以上，其固体酶制剂具有良好的稳定性，可广泛的用于饲料、石油化工、酿酒工业中。

Description

一种木聚糖酶及其基因、高效表达的方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种木聚糖酶及其基因、高效表达的方法和应用。 

背景技术

木聚糖是植物细胞壁的主要成分之一，广泛存在于常用植物性饲料原料(玉米、小麦、菜粕和棉粕)中，属于非淀粉多糖(Non-starch polysaccharides，NSP)，是饲料中的主要抗营养因子之一。通常根据溶解性可分为水溶性木聚糖和不溶性木聚糖。大量研究证实可溶性木聚糖可增加小肠内容物粘度，从而阻碍营养物质与消化酶结合及营养物质在小肠粘膜上的消化吸收，而且粘度的增加会抑制内源消化酶的活性，降低食靡的通过速度，降低动物采食量，增加胃肠代谢和内源损失。此外，植物原料中不溶性木聚糖包裹淀粉、蛋白质等营养物质，阻止营养物质与消化酶的接触，降低营养物质的消化率。因此，消除木聚糖的抗营养作用对进一步提高饲料资源利用率、拓宽饲料资源和提高养殖经济效益具有重要意义。 

木聚糖酶是专一降解木聚糖的一类酶，对木聚糖酶的研究发现，它应用于饲料中通过降解木聚糖抗营养因子，可提高饲料营养价值以及动物对饲料的利用率，从而降低了饲料成本，减少饲料浪费；另外还减少了动物排泄物造成的污染等。因此，木聚糖酶作为一种环保添加剂，在发展绿色环保型畜牧养殖业中具有十分重要的意义和价值。 

近年来，随着人们对畜产品品质安全卫生的要求，开发使用高品质无毒、无害和无污染残留的绿色饲料添加剂已成为我国饲料工业面临的一个紧迫问题。中国饲料产量位居世界第二，然而饲料资源并不丰富，其中能量饲料缺口较大，据预测在2010～2020年将达0.43亿吨。规模化养殖的发展，使充分利用非常规饲料资源成为畜牧业长期、持续和健康发展的关键。我国长期以玉米为主要能量饲料原料的现状造成玉米供应日趋紧张，因此必须充分地开发利用资源丰富的麦类、谷物和糠麸。但麦类、谷物和糠麸等副产品中都存在抗营养因子-木聚糖，限制了其在饲料中的大量应用。随着生物技术的发展，饲用酶制剂和微生物制剂的产量得到了快速增长，质量也有了显著提高，酶制剂可以提高饲料利用率、促进动物生长、改善生态环境和防治动物疾病，避免了由于添加抗生素、激素和高铜等物质所产生的负面影响，具有明显的经济效益和积极的环保意义。我国饲料行业，在配合饲料中除一般玉米一豆粕型日粮，实际上更多的情况是在玉米一豆粕型日粮基础上可能加人10％-40％的大麦或小麦、次粉、麦麸、统糠、棉粕等非常规饲用原料，这使得木聚糖酶在饲料工业中占有重要地位。另外，中国已加人WTO，国外低价格小麦、大麦产品的涌人，将进一步刺激木聚糖酶的市场需求。添加以木聚糖酶为主的饲用酶制剂，消除抗营养因子的抗营养作用，市场前景极为广阔。

木聚糖酶是能专一性降解木聚糖为小分子的还原糖的一组酶的总称，主要包三类：1)β-1，4，D-内切木聚糖酶，从木聚糖主链的内部切割β-1，4-糖苷键，使木聚糖溶液的粘度迅速降低；2)β-1，4-D-外切木聚糖酶，以单个木聚糖为切割单位作用于木聚糖的非还原性末端，使反应体系的还原性不断增加；3)β-木糖苷酶，切割低聚木糖和木二糖，有助于木聚糖彻底降解为木糖。木聚糖酶破坏木聚糖分子中的共价交联及通过氢键形成的连接区，使用使木聚糖的水溶性大大下降，从而降低对肠道的负作用。具体功能如下： 

1、降低胃肠道食糜的粘性，促进动物生长及提高饲料利用率 

2、提高内源性消化酶的活性，促进养分的消化吸收 

3、减少肠道微生物数量，有利于畜禽的健康 

4、破坏植物细胞壁结构，减少粪便，降低污染 

对木聚糖酶的研究早在60年代就已开始，已经从不同来源的微生物中分离到大量的不同类型不同性质的木聚糖酶。木聚糖酶应用于饲料中提高了饲料营养价值，突破了饲料资源开发利用的局限，增强了动物的生产与抗病能力，减少了动物排泄物造成的污染，作为一种绿色环保饲用酶制剂，在发展环保型畜牧业中具有十分重要的意义与价值，近年来已成为国内外研究的热点之一。大量有关木聚糖酶结构与功能的研究不断展开，一方面加深了对木聚糖酶作用的了解，另一方面为通过基因工程和蛋白质工程改良木聚糖酶的性质、研制出符合不同应用领域要求的木聚糖酶产品提供了指导。 

筛选到更多的符合工业化生产的木聚糖酶基因是木聚糖酶更好的产业化的方法之一。目前，国内外木聚糖酶的研究及生产主要为霉菌，也有采用毕赤酵母的报道，其基因来源主要也是真菌类，如黑曲霉、米曲霉等。而大肠杆菌来源的木聚糖酶的功能研究及生产应用目前还未有报道。 

发明内容

本发明的目的是提供一种产木聚糖酶的大肠杆菌Escherichia coli，其保藏号为：CGMCC No.4234。 

本发明的再一目的是提供一种来源于上述大肠杆菌的木聚糖酶。 

本发明的再一目的是提供上述木聚糖酶的基因。 

本发明的再一目的是提供包含上述木聚糖酶基因的重组载体。 

本发明的再一目的是提供包含上述木聚糖酶基因的重组菌株。 

本发明的再一目的是提供一种高效表达上述木聚糖酶的方法。 

本发明的再一目的是提供上述木聚糖酶的应用。 

本发明从自然环境中筛选到一种天然菌株，大肠杆菌Escherichia coli，该菌株于2010年10月20日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，其保藏编号是：CGMCC No.4234。 

从上述菌株中分离得到了一种木聚糖酶V-XYL，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示： 

MVSRHLCSSR DLTSFKVTGN KVGTIGGVGY ELDMGSLNSA TFYSDGSFSC 

TFQNAGDYLC    60 

RSGLSFDSTK TPSQRILKIS FRGLVKQNSS NVGYSYVGVY GWTRSPLVEY 

YIVDNWLSPF    120 

PPGDGFEGSK HGSFTIDGAQ YTVYENNSRT VCYDGDTTFN QYFSIRQQAR 

ACVYQPLIVF    180 

FDQWEKLGMT MGKLHEAKVL GEAGNVNGGA SGTADFPYAK VYIDDIRSQV 

IRRIKTS       237 

该酶基因编码237个氨基酸，N端没有信号肽序列，其理论分子量为26.2kDa，该木聚糖酶的最适温度为60℃，在60℃下处理60分钟，酶活性维持在60％以上，在70℃下处理10分钟，酶活性还能维持在50％以上，最适pH值为5.0，在pH为3.0～7.0的条件下处理4个小时，酶活性均维持在85％以上，用人工胃液和肠液处理90分钟，酶活性均维持在80％以上，说明该酶具有良好的抗蛋白酶的能力，将该木聚糖酶制备成为固体酶制剂，在室温条件下保存12个月，酶活性维持在90％以上，说明该酶制剂具有良好的稳定性，适于工业生产和应用。 

本发明还提供了编码上述木聚糖酶的基因V-XYL，该基因的序列如SEQ ID NO.2 所示： 

atggtaagtc gacatctatg ttcaagtaga gatctcacgt ctttcaaggt aaccggcaac       60 

aaggttggaa ctattggtgg tgttggttac gaattagata tgggtagcta gttgaacagt       120 

gctactttct attctgatgg ttccttctca tgtactttcc aaaatgctgg ggattactta       180 

tgtcgtagtg gtctttcttt cgatagtact aagaccccat ctcagcgtat actgaaaatt       240 

agtttcagag gtcttgtcaa acaaaatagt tccaatgttg gttattccta tgttggtgtt       300 

tacggttgga ctagaagtcc acttgtcgaa tactacattg tcgataattg gcttagtcca       360 

ttcccaccag gtgacggatt tgaaggtagt aagcatggtt ctttcactat tgatggtgct       420 

caatacactg tttatgaaaa caactctcgt actgtctgct atgatggtga taccaccttc       480 

aatcaatact ttagtattcg tcaacaagct cgtgcatgcg tttatcaacc attgattgtg       540 

ttctttgatc aatgggaaaa gcttggtatg actatgggta aattacatga agccaaggtt       600 

ttaggtgaag ccggtaacgt taacggtggt gccagtggta ccgctgattt cccatacgca       660 

aaggtttaca ttgacgacat aagaagtcag gtcatcagaa ggattaaaac ttcttag          717 

本发明通过构建DNA文库的方法分离得到上述木聚糖酶基因V-XYL，该基因全长717bp，根据该基因推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，结果表明其氨基酸序列与来源于产琥珀酸丝状杆菌Fibrobacter succinogenes及单中心真菌Neocallimastix patriciarum表达的木聚糖酶具有较高的一致性，说明该木聚糖酶V-XYL是一种新的木聚糖酶。 

本发明还提供了包含上述木聚糖酶基因V-XYL的重组载体，优选为pPICzaA-V-XYL。将本发明的木聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的木聚糖酶基因插入到质粒pPICzalphaA上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPICzαA-V-XYL。 

本发明还提供了包含上述木聚糖酶基因V-XYL的重组菌株，优选重组菌株是毕赤酵母菌株X33。 

本发明还提供了一种高效表达上述木聚糖酶V-XYL的方法，包括以下步骤： 

1)用上述的重组载体转化毕赤酵母细胞，得重组菌株； 

2)重组菌株在发酵罐中进行发酵，诱导重组木聚糖酶的表达；以及 

3)发酵结束后，回收并纯化所表达的木聚糖酶V-XYL。 

其中，整个发酵过程可分为3个阶段：第一阶段为菌体培养阶段，按5％-10％比例接入种子，培养24-30小时，以补完甘油为标志；第二阶段为饥饿阶段，当甘油补 完之后，不流加任何碳源，当溶氧上升至80％以上即表明该阶段结束，为期约30-60min；第三阶段为诱导表达阶段，流加诱导培养基，并且保持溶氧在20％以上，培养时间在150-180小时之间。发酵结束后，发酵液可通过陶瓷膜或超滤膜处理后获得粗酶液。利用本发明的方法高效表达上述的重组木聚糖酶，可达到100000U/mL的发酵水平。本发明还提供了上述木聚糖酶V-XYL在饲料添加剂、石油化工、酿酒等工业中的应用。 

本发明是为了解决现有技术的不足，从自然环境中筛选、分离得到能够适用于饲料工业化生产的木聚糖酶。本发明的木聚糖酶V-XYL最适pH值为5.0，pH在3.0～7.0的条件下处理4个小时，酶活性维持在85％以上，说明其具有良好的pH稳定性；而且具有良好的抗蛋白酶降解的能力，可应用于饲料添加剂中，抵抗动物肠胃中蛋白酶的降解，同时有效降低胃肠道食糜的粘度，消除或降低因粘度增加而引起的抗营养作用，促进动物对于饲料的利用率。另外，该木聚糖酶制成酶制剂，在室温保存12个月后，酶活性维持在90％以上，具有好的稳定性，因此，本发明的木聚糖酶可在饲料、石油化工、酿酒等工业中显示出其巨大的应用潜力。 

附图说明

图1重组木聚糖酶V-XYL的最适反应pH。 

图2重组木聚糖酶V-XYL的pH稳定性。 

图3重组木聚糖酶V-XYL的最适反应温度。 

图4重组木聚糖酶V-XYL的热稳定性。 

图5重组木聚糖酶V-XYL的抗蛋白酶降解能力。 

图6重组木聚糖酶V-XYL固体酶粉在室温条件下贮存的稳定性。 

图7重组木聚糖酶V-XYL抗胃肠中蛋白酶降解能力的测定。 

图8重组木聚糖酶V-XYL在室温条件下的贮存稳定性能的测定。 

本发明从自然环境中筛选到一种天然菌株，大肠埃希氏菌EC080510(Escherichia coli)，该菌株于2010年10月20日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，其保藏编号是：CGMCC No.4234。 

具体实施方式

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。 

实验材料和试剂： 

1菌株与载体 

大肠杆菌菌株Top10、毕赤酵母X33、载体pPICzalphaA购自Invitrogen公司。 

2酶与试剂盒 

基因组DNA提取试剂盒，质粒DNA提取试剂盒，胶回收试剂盒，PCR纯化试剂盒购自上海生工公司。基因文库构建试剂盒Lamda Zap II购自Stratagene公司。限制性内切酶购自Fermentas公司。 

3反应底物 

Azo-xylan购自Megazyme公司。 

实施例1、产木聚糖酶大肠杆菌Escherichia coli的分离、培养 

将来源于内蒙古某养牛场的牛瘤胃内容物经富集培养后(富集培养基：(NH4)₂SO₄ 5g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，CaCl₂0.2g/L，玉米芯粉0.5％，麸皮0.5％，pH4)，按常规稀释后涂布于产酶培养基((NH₄)₂SO₄5g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，CaCl₂ 0.2g/L，木聚糖1％，琼脂糖1.5％，pH4)平板上，30℃培养5～6d，挑取产生透明圈菌落在产酶培养基平板划线分离，经过3轮重复划线分离，使菌株纯化。通过此方法筛选到表达木聚糖酶的菌株，经鉴定为大肠杆菌Escherichia coli，该菌株的保藏编号为：CGMCC No.4234。 

实施例2、大肠杆菌Escherichia coli木聚糖酶基因V-XYL的克隆 

木聚糖酶基因V-XYL的克隆采用构建基因组文库的方法，首先提取大肠杆菌Escherichia coli的基因组，按照基因文库构建试剂盒Lamda Zap II的说明书构建大肠杆菌的基因组文库。 

具体方法是，培养筛选获得的产木聚糖酶大肠杆菌菌株，提取其基因组DNA。获得的大肠杆菌基因组DNA和噬菌体载体Lambda Zap II通过限制性内切酶EcoRI酶切后，过夜连接。经过体外包装，转染大肠杆菌受体菌XL1-Blue MRF’后铺平板，37度过夜培养。 

鉴定构建得到基因文库滴度确保每个平板上获得密集的相对独立的噬菌斑。用含1％ azo-xylan，1.5％琼脂糖的产酶培养基平板平铺到噬菌斑平板上层。37度培养，4小时及过夜培养后观察透明圈。 

挑取产生透明圈最大的噬菌体，按照单噬菌斑Excision方法获得含有木聚糖酶基因的质粒pBluescipt SK，提取质粒DNA进行序列测定。 

测序结果表明获得克隆DNA插入片段含有木聚糖酶基因完整的开放阅读框。该木聚糖酶基因V-XYL，全长717bp，编码237个氨基酸，其氨基酸序列通过BLAST比对，与来源于产琥珀酸丝状杆菌Fibrobacter succinogenes及单中心真菌Neocallimastixpatriciarum的木聚糖酶具有较高的一致性，最高一致性为76％，表明该蛋白为一种新型木聚糖酶。 

实施例3、包含木聚糖酶基因V-XYL的毕赤酵母工程菌的构建 

根据基因序列设计带有EcoR I和Not I酶切位点的引物VXYL-eco和VXYL-not，将木聚糖酶基因V-XYL插入到质粒pPICzalphaA上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPICzαA-V-XYL。 

VXYL-eco：5’AGCTGAATTCATGGTAAGTCGACATCT3’ 

VXYL-not：5’TGGTGCGGCCGCCTAAGAAGTTTTAATCCTTCT3’ 

重组酵母表达质粒pPICzαA-V-XYL用SacI进行线性化，线性化后的重组载体电击转化毕赤酵母X33，得到毕赤酵母重组菌株X33/V-XYL。 

将上述重组菌株接种于BMGY培养液中，30℃ 250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于150mL BMMY培养基重悬，30℃ 250rpm振荡培养。诱导表达72h后，每天添加0.5％的甲醇，离心收集上清，同时，按木聚糖酶检测方法测定上清液中木聚糖酶的活力。 

通过检测各菌株在摇瓶中的发酵酶活，测定产酶性能菌株的摇瓶水平木聚糖酶的表达量达到666U/mL。 

采用GE蛋白纯化系统(型号：AKTA PRIMEPLUS)对酶液进行纯化，获得高纯度木聚糖酶，经检测，该木聚糖酶的比活为8345U/mg。 

实施例4、木聚糖酶重组菌株的高效表达 

在发酵罐上进行上述木聚糖酶重组菌株的发酵，发酵使用的培养基为BSM培养基。 

BSM培养基配方如下：磷酸26.7mL/L、硫酸钾18.2g/L、硫酸镁14.9g/L、氢氧化钾4.13g/L、甘油40g/L、微量元素(PTM1)4.4mL/L、消泡剂少量。 

PTM1(微量盐溶液)：硫酸铜0.6％、碘化钾0.018％、一水硫酸锰0.3％、二水钼酸钠0.02％、硼酸0.002％、六水氯化钴0.05％、氯化锌2％、七水硫酸铁6.5％、 浓硫酸0.5％、生物素0.02％。 

发酵生产工艺：pH值4.80、温度30℃、搅拌速率100-500rpm、通风量1.0-1.8(V/V)、溶氧DO控制在20％以上。 

整个发酵过程可分为3个阶段：第一阶段为菌体培养阶段，按5％-10％比例接入种子，培养24-30小时，以补完甘油为标志；第二阶段为饥饿阶段，当甘油补完之后，不流加任何碳源，当溶氧上升至80％以上即表明该阶段结束，为期约30-60min；第三阶段为诱导表达阶段，流加诱导培养基，并且保持溶氧在20％以上，培养时间在150-180小时之间。发酵结束后，发酵液可通过陶瓷膜或超滤膜处理后获得粗酶液。 

通过测定不同时间发酵液中的木聚糖酶活力及菌体量，可得发酵进程曲线，见图1和图2。 

由发酵结果可以看出，重组菌株最终的发酵能力最高可达到117293U/ml，大大高于目前的报道水平。 

实施例5、重组木聚糖酶的活性分析 

1、酶活单位的定义 

在37℃、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为5mg/mL的木聚糖溶液中释放1μmol还原糖所需要的酶量即为一个酶活力单位。 

2、测定方法 

吸取经适当的木聚糖底物，37℃平衡10min，加入到比色管中，再加入经37℃平衡的等量的纯化的重组木聚糖酶液，混匀，于37℃精确保温反应30min。反应结束后，加入适量的DNS试剂，混匀以终止酶解反应。然后沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至规定体积，混匀后以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光值A_E。 

酶活计算公式： 

$X=\frac{[(A_E-A_B)\×K+\mathrm{Co}]}{M\×t}\×N\×1000$

式中：X为试样稀释液中木聚糖酶活力，U/mL；A_E为酶反应液中的吸光度；A_B为酶空白样的吸光度；K为标准曲线的斜率；Co为标准曲线的截距；M为木糖的摩尔质量(150.2g/mol)；T为酶解反应时间，min；N为试样的稀释倍数；1000为转化因子，1mmol＝1000μmol 

实施例6、重组木聚糖酶V-XYL的性质测定 

1、重组木聚糖酶V-XYL的最适pH和pH稳定性的测定 

将纯化的重组木聚糖酶V-XYL在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物木聚糖用不同pH的缓冲液配置，在37℃下进行木聚糖酶活力测定。结果为如图3所示，表明重组酶V-XYL的最适pH为5.0。 

将纯化的重组木聚糖酶V-XYL于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理4h，再在pH5.0缓冲液体系37℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果如图4所示，表明木聚糖酶在pH 3.0-7.0之间均很稳定，在此pH范围内处理4h后剩余酶活性在85％以上，这说明此酶在酸性范围内具有较好的pH稳定性。 

2、重组木聚糖酶V-XYL的最适温度及热稳定性的测定 

木聚糖酶的最适温度的测定为在pH5.0缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。结果如图5所示，表明其最适温度为60℃。 

热稳定性测定为将纯化的重组木聚糖酶在不同温度下处理不同时间，再在37℃下进行酶活性测定。结果如图6所示，表明木聚糖酶V-XYL在60℃温度下具有很好的稳定性，处理1h后还有60％以上的相对活性，在70℃下温育10min，能保持50％以上的相对活性。 

3、不同金属离子化学试剂对重组木聚糖酶V-XYL酶活影响的测定 

在酶促反应体系中加入不同浓度的不同金属离子及化学试剂，研究其对重组木聚糖酶酶活性的影响，各种物质终浓度为1mmol/L。在37℃、pH5.0条件下测定酶活性。结果如下表所示。 

1mM金属离子             相对酶活(％) 

Cu²⁺                    71.48 

Fe²⁺                    85.20 

Fe³⁺                    91.60 

EDTA                    95.37 

Ca²⁺                    99.67 

Hg²⁺                    - 

Mg²⁺                    128.87 

Na⁺                     72.97 

Li⁺                     84.60 

Ag⁺                     - 

Co²⁺                    107 

Zn²⁺                    86.45 

表明，在离子和化学试剂的浓度为1mmol时，Mg²⁺可以明显促进重组木聚糖酶的活性，Cu²⁺、Fe²⁺、Na⁺、Li⁺、Zn²⁺对重组木聚糖酶的活性有轻微的抑制作用，其他离子和化学试剂对重组木聚糖酶的活力没有明显的影响。 

5、重组木聚糖酶V-XYL抗胃肠中蛋白酶降解能力的测定 

将纯化后的重组木聚糖酶V-XYL在人工胃液和人工肠液中处理不同时间(人工胃液组成：NaCl2克、胃蛋白酶3.2克、36.5％浓盐酸7ml、加水至1000ml，pH1.3；人工肠液组成：磷酸二氢钾0.029M、KCl 0.02M、牛磺胆酸钠5mM、磷酯酸胆碱1.5mM、pH 6.8)，然后取处理后的酶液在pH5.0及37℃条件下测定酶活性。实验结果如图7所示，表明木聚糖酶V-XYL用人工胃液和人工肠液中处理90min后，还有80％以上的相对活性，说明其具有良好的抗蛋白酶降解的能力。 

6、固体酶制剂在室温条件下的贮存稳定性能的测定 

重组木聚糖酶V-XYL经工业化的加工制成固体酶制剂，在室温条件下贮存12个月，每个月取一次样品测定酶活性，测定结果如图8所示，结果表明该木聚糖酶在室温条件下贮存12个月，酶活力基本上没有损失，还有90％以上的剩余活力，说明其具有良好的稳定性。 

Claims (9)

1.一种产木聚糖酶的大肠杆菌Escherichia coli，其保藏号为：CGMCC No.4234。

2.一种木聚糖酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种木聚糖酶基因，其特征在于，编码权利要求2所述的木聚糖酶。

4.如权利要求3所述的木聚糖酶基因，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

5.包含权利要求3或4所述木聚糖酶基因的重组载体。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的木聚糖酶的编码基因插入到质粒pPICzalphaA上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPICzαA-V-XYL。

7.包含权利要求3或4所述木聚糖酶基因的重组菌株。

8.一种高效表达木聚糖酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求6所述的重组载体转化毕赤酵母细胞，得重组菌株；

2)重组菌株在发酵罐中进行发酵，诱导重组木聚糖酶的表达；以及

3)发酵结束后，回收并纯化所表达的木聚糖酶V-XYL。

9.权利要求2所述的木聚糖酶降解木聚糖的应用。

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