CN102732496B - 一种木聚糖酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种木聚糖酶，名称为XYA6205，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO：1。本发明的木聚糖酶在烘焙中的应用效果较明显。由于小麦面粉中含有2-3%的阿拉伯木聚糖，其中水溶性阿拉伯木聚糖约占25-30%，水不溶性阿拉伯木聚糖约占70-75%。水溶性的阿拉伯木聚糖对面包品质有积极影响，而非水溶性的却会产生负作用。木聚糖酶可将水不溶性阿拉伯木聚糖降解为水溶性的阿拉伯木聚糖，从而改善面团中面筋网络的弹性，增强面团的乳化凝胶作用，使面团的内部气孔更加均匀细密，增大面包体积。本发明的木聚糖酶运用到面包烘焙中，可使面包体积增大10~15%。

Description

一种木聚糖酶及其应用

技术领域

本发明属于酶的提取、应用技术领域，具体涉及一种木聚糖酶及其应用。

背景技术

半纤维素占植物干重的35%，是自然界中含量仅次于纤维素的碳水化合物。与纤维素相比，半纤维素结构与组成十分复杂，包括木聚糖、甘露聚糖、阿拉伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖和葡聚糖等多种组分。其中木聚糖是细胞中最具代表性的半纤维素，它可以作为再生资源被人们利用。木聚糖的完全降解需要木聚糖水解酶系中各种酶相互之间协同完成。广义的木聚糖酶是指能够降解半纤维素木聚糖的一组酶的总称，包括内切-β-1，4-木聚糖酶（1，4-β-D-木聚糖酶水解酶，EC.3.2.1.8）、外切-β-1，4-木聚糖酶（1，4-β-D-木聚糖酶水解酶，EC.3.2.1.92）、β-木糖苷酶（1，4-β-D-木聚糖酶水解酶，EC.3.2.1.37），另外还包括α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、乙酰木聚糖脂酶和苯酚酸脂酶。其中以内切-β-1，4-木聚糖酶、β-木糖苷酶最为重要，作用于木聚糖主链。狭义上的木聚糖酶仅限于内切-β-1，4-木聚糖酶。内切-β-1，4-木聚糖酶作用于木聚糖和长链木聚糖，从β-1，4-木聚糖主链的内部切割木糖苷键，从而使木聚糖降解为木寡糖，其水解产物主要为木二糖与木二糖以上的寡聚木糖，也有些可以产生少量木糖和阿拉伯糖。

自七十年代末，八十年代初开展木聚糖酶基因的研究工作以来，已有上百种来自真菌和细菌的木聚糖酶基因被克隆并在大肠杆菌中表达。Lapidot(LapidotA,Mechaly A,Shoham Y.J.of Biotechnology，1996,51:259)等根据一个已知序列的芽孢杆菌木聚糖酶基因，重新设计引物，利用PCR方法克隆起始密码子ATG以后的结构基因(不带前导序列)，转到T-7RNA多聚酶表达载体pET3d上，在IPTG诱导下表达的木聚糖酶高达140U/ml。Jung(Jung KH,PackM Y.BiotechnologyLetters,1993,15(2):115-120)等用枯草芽孢杆菌染色体上的强启动子替换热纤维梭菌木聚糖酶基因自身的启动子，并去掉C末端与酶活无关的一段基因序列，把该基因转化到枯草芽孢杆菌中表达，胞外酶活可达30U/ml。Ghangas(Ghangas,GS,Hu,Y J,Wilson,D B.J.Bacteriol.,1989,171(6):2963-2969)等将褐色高温单孢菌的木聚糖酶基因用穿梭质粒转到浅青紫链霉菌中表达，其表达量是在大肠杆菌中表达量的10-20倍，但只有原始菌株表达量的四分之一。Herbers(Herbers K,WilkeI,Sonnewald U.Biotechnology，1995,13:63-66)等将热纤维梭菌的热稳定木聚糖酶基因转到烟草中，产生的木聚糖酶位于烟草的质外体空间，酶的热稳定性及活性都没有丧失而且酶易于提纯。另一例烟草中表达的是粪堆梭菌的木聚糖酶基因，该基因在烟草花叶病毒35S的启动子控制下表达，表达的木聚糖酶大部分在培养液的上清液中，一小部分在细胞内，木聚糖酶蛋白的量占可溶性总蛋白的5%。值得一提的还有Whitehead(Whitehead RT,Hespell B R.FEMS MicrobiologyLetters,1990,66:61-66)的工作，他们使用大肠杆菌--类菌体穿梭载体将栖瘤胃拟杆菌的木聚糖酶基因接合转移至脆弱拟杆菌和单形拟杆菌中，该基因在这两种菌中都能表达，粗酶液的比活分别是原始菌株的1400倍和1600倍。华中农业大学的张桂敏等采用不同的基因克隆方法分别从短小芽孢杆菌Bacillus pumilus、真菌Plectosphaerella cucumerina和Verticillium dahlia克隆到三个木聚糖基因，从土壤微生物DNA中克隆到10个木聚糖基因片段，并分别在毕赤酵母进行了高效表达，研究了重组酶的酶学性质，为木聚糖酶的有效应用奠定了基础。

对半纤维素能进行有效降解的生物包括细菌、丝状真菌、放线菌、软体动物、原生动物和昆虫在内的各种生物。对于不同来源的木聚糖酶，其分子量范围为8~45kDa，pI范围为pH3~10。通常细菌可产生两种木聚糖酶，即低分子量的碱性木聚糖酶和高分子量的酸性木聚糖酶。Wong等（1988）从芽孢杆菌中分离出分子量为24kDa的木聚糖酶，其最适pH为6.0，最适酶促反应温度为50℃。Winterhalter等（1995）从海栖热袍菌（Thermotoga maritima）中分离了两种极端耐热木聚糖酶，XynA和XynB，他们的分子量分别是120和40kDa，最适pH分别为6.2和5.4，在最适pH下，其最适反应温度分别高达92℃和105℃，为目前已知的对热最为稳定的木聚糖酶。多年来对真菌木聚糖酶的研究主要集中在里氏木霉（Trichoderma reesei）和绿色木霉(Trichoderma viride)上。以里氏木霉为例，它可以产生主要的木聚糖酶XynⅠ和XynⅡ，其分子量分别为19和21kDa，最适pH分别为3.5和4.5，但它们在温度超过60℃条件下均不稳定。Huang等（1991）从康宁木霉（Trichoderma koningii）中分离纯化到一种木聚糖酶，SDS-PAGE电泳分子量为21.5kDa，pI为8.9；Ujiie等（1991）则从T.viride中分离纯化到两种木聚糖酶，其分子量分别为19和20kDa，pI则在5.5和9.0。除了木霉外，一些曲霉也能产生木聚糖酶，如Krisana等（2005）从Aspergilluscf.niger BCC14405中分离到一种内切木聚糖酶，其分子量约为21kDa，最适pH为5.0，最适温度则为55℃。不同来源的木聚糖酶其最适pH和最适温度不同，应用范围也有较大差异。

发明内容

本发明的目的是提供一种木聚糖酶及其应用，以弥补现有技术的不足。

本发明的木聚糖酶，名称为XYA6205，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

酶活实验结果表明，本发明提供的木聚糖酶在pH5.0~9.0范围内均有较高的活性，在碱性范围内依然能保持60%以上活性，其最适pH为5.8；最适温度分析显示，该酶在20℃~70℃范围内均有活性，其最适温度为50℃。

本发明的木聚糖酶在烘焙中的应用效果较明显。由于小麦面粉中含有2-3%的阿拉伯木聚糖，其中水溶性阿拉伯木聚糖约占25-30%，水不溶性阿拉伯木聚糖约占70-75%。水溶性的阿拉伯木聚糖对面包品质有积极影响，而非水溶性的却会产生负作用。木聚糖酶可将水不溶性阿拉伯木聚糖降解为水溶性的阿拉伯木聚糖，从而改善面团中面筋网络的弹性，增强面团的乳化凝胶作用，使面团的内部气孔更加均匀细密，增大面包体积。本发明的木聚糖酶运用到面包烘焙中，可使面包体积增大10~15%。

附图说明

图1：本发明从葡萄穗霉基因组上PCR扩增木聚糖酶的电泳图片，

图2：本发明的木聚糖酶的蛋白电泳图片；

图3：发明的木聚糖酶在不同pH值条件下的酶相对活力曲线；

图4：发明的木聚糖酶在不同温度条件下的酶相对活力曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的木聚糖酶进行详细描述，如没有特别提及，是采用本领域的通用方法。对于实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

本发明的实施例中所用到的材料包括：大肠杆菌（Trans5α ChemicallyCompetent Cell，北京全式金生物技术有限公司）；穿梭质粒载体pGm（具有乙酰胺和氨苄选择标记）；黑曲霉G1；PCR试剂盒、质粒提取试剂盒、限制性内切酶、连接酶、纤维素酶、蛋白电泳试剂盒以及羧甲基纤维素等试剂购自TAKARA、SIGMA或MBI。

实施例1、木聚糖酶XYA6205编码基因的获得：

1.1木聚糖酶在葡萄穗霉全基因组上的挖掘

通过对葡萄穗霉(购自中国微生物菌种保管委员会普通微生物中心,CGMCC3.5365)全基因组进行比较基因组学的研究，挑选出具有木聚糖酶活性的xya6205基因（核苷酸序列为SEQ ID NO:1），此基因编码一个含227个氨基酸的蛋白质XYA6205，具有序列表SEQ ID NO:2的氨基酸残基序列。用DNAStar软件预测该蛋白质的理论分子量大小为25.071千道尔顿，SignaIP分析第1-18位氨基酸为信号肽。XYA6205同来源于Verticillium dahliae VdLs.17的内切木聚糖酶（GenBank索引号为EGY14130.1）具有较高同源性，为67%。

1.2重组载体pGm-xya6205的构建

1.2.1提取葡萄穗霉染色体DNA，PCR扩增xya6205

将葡萄穗霉孢子接于100ml液体CMC培养液中，震荡培养2天，条件为30℃，200rpm。培养好后用六层无菌纱布过滤，而后转移到预冷-80℃的无菌研钵中，迅速倒入液氮，稍挥发后立即用力研磨至粉末，最后用Fungal DNA kit按操作说明书进行提取。

通过分析xya6205基因序列，利用Primer Premier5软件设计引物，并在引物两头加上限制性酶切位点（用DNAMAN软件分析酶切位点）和保护碱基，引物如下：

XYA6205-F:CCATTACGTAAGAATGTTCTTCTCCCAAGTCATCA

SnaBI

XYA6205-R:CTAGTCTAGATCAACCACCATGCCGCATCCTT

XbaI

取提取的葡萄穗霉染色体DNA1.5ul，并向其中依次加入上下游引物2.0ul、KOD buffer 5ul、dNTP 4ul、Me²⁺2ul以及重蒸水34ul，最后加入KOD酶1ul，涡旋振荡混匀后开始PCR。最后用试剂盒回收PCR产物，并进行琼脂糖凝胶电泳初步查看结果。（图1）

1.2.2酶切pGm，与xya6205连接

取PCR产物基因40ul，并向其中依次加入Green buffer 6ul、SnaBI酶2ul、XbaI酶2ul及重蒸水10ul，上下缓慢吹吸混匀，37℃水浴1小时条件进行酶切。同时将pGm以同样的操作酶切。酶切结束后进行琼脂糖凝胶电泳，并用试剂盒切胶回收酶切产物。

取酶切后的xya6205基因10ul及酶切pGm2ul，加入1.5ulT4连接酶及连接酶缓冲液，利用PCR仪在16℃条件下连接12小时，最终完成重组质粒的制备。

1.2.3重组质粒在大肠杆菌中的转化与提取

取50ul冰浴上融化的感受态细胞（Trans5α Chemically Competent Cell，北京全式金生物技术有限公司），加入15ul连接液，在冰浴上继续放置30分钟；42℃金属浴中热激45秒，然后快速将管转移到冰浴中2分钟，该过程不要摇动离心管；向离心管中加入普通LB培养液1ml，混匀后置于37℃，200rpm培养一小时，使细菌复苏；低速（4000rpm）离心5分钟，去800ul上清，余下的立即用枪轻轻吹吸混匀，均匀涂布到含氨苄的LB平板上，直至完全吸收；37℃倒置培养16小时。

挑取五个单个菌落做PCR验证，对照组用空质粒，同时将挑取模板的牙签放入加氨苄的4mlLB培养液中，37℃，200rpm，培养24小时。将验证正确的LB管用质粒提取试剂盒提取质粒（同时再次质粒PCR验证)。

将该重组质粒pGm-xya6205寄送到博尚生物技术有限公司进行双向测序。测序结果用DNAMAN软件与正确序列进行比对，发现没有发生突变，完全正确，重组质粒pGm-xya6205构建成功。

实施例2、xya6205在黑曲霉G1中的表达

2.1重组菌G1-pGm-xya6205的构建

重蒸水（4ml）吹洗下新长出的黑曲霉G1孢子，转移至100ml的液体菌丝培养基中，30℃，200rpm摇床培养16小时；六层无菌纱布过滤培养好的G1菌液，并用Solution A冲洗纱布及菌丝，将氮源充分洗掉；过滤后菌丝转移到装有40mlSolution A、0.6g纤维素裂解酶（SIGMA）的无菌三角瓶中（30℃，160rpm预培养半小时左右），震荡使菌丝分散，继续摇床培养，30℃，160rpm，1小时后转速降为80rpm，继续培养1小时到1.5小时（镜检看消化情况确定培养时间）；用二层过滤纸将消化好的菌液过滤到50ml无菌离心管中，低速（4000rpm）离心5分钟后去上清，用20ml Solution B悬浮，继续低速离心，去上清，重复两次，最后一次留100ul；向15ml离心管中依次加入100ul菌液、12ul重组质粒、12.5ul Solution C，在冰上静置20分钟；加入1ml Solution C、2ml Solution B，轻摇混匀；将55℃的amds上层培养基（乙酰胺为唯一氮源）8ml倒入离心管中，上下倒置混匀，立即分倒到3个amds下层培养基（乙酰胺为唯一氮源）平板上，静置凝固后，30℃培养箱中培养5-7天。

挑取转化子到二次验证板上，同时挑取阳性对照和阴性对照，30℃继续培养，若能继续生长则为阳性转化子，进行菌丝PCR验证。验证正确的转化子转接到斜面上保存，同时保存孢子悬浮液，用甘油管储存于-80℃冰箱中。

菌丝PCR验证体系如下：从边缘用牙签挑取新长出的菌丝，在装有20ul稀释液（

植物组织直接PCR试剂）的小PCR管中混匀，作为模板；向另一PCR管中依次加入缓冲液10ul、重蒸水10ul、上下引物1ul、模板0.5ul及

热启动II DNA聚合酶（Finnzymes）0.4ul；按照适当的PCR条件做40个循环，完成后进行琼脂糖凝胶电泳查看。

摇瓶表达和蛋白电泳：

从斜面上用无菌竹签挑取孢子，接种到25ml的产酶培养基三角瓶中，摇床培养，30℃，200rpm；三天后取发酵液，10000rpm离心8:30min，取上清30ul，加入10ul 4倍上样buffer（已煮沸），水浴煮沸5min；10000rpm离心1min待用。

配置SDS-PAGE分离胶和浓缩胶，待凝固后点样，加入缓冲液，接通电源，首先80v电压跑胶，待蛋白样跑出凝缩胶后改电压为120v，直至其跑到最底线；考马斯亮蓝染色30min；脱色液脱色3次，每次30min，用清水浸泡过夜（图2）。

实施例3本发明XYA6205木聚糖酶的酶学特性的研究

3.1木聚糖酶的酶活测定采用DNS法，具体操作如下：

3.1.1配置DNS试剂：称取DNS6.3g，加入2mol/L的NaOH溶液262ml，再加到500ml含有185g酒石酸钾钠的热溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮存于棕色瓶中，避光放置一周后使用。

3.1.2葡萄糖标准曲线的绘制

取11只4ml离心管，按下表加入溶液

	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
												木糖标准液ml	0	0.4	0.8	1.2	1.6	2	2.4	2.8	3.2	3.6	4
缓冲液ml	4	3.6	3.2	2.8	2.4	2	1.6	1.2	0.8	0.4	0
													↓	↓	↓	↓	↓	↓	↓	↓	↓	↓	↓
木糖稀释液ul	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100
												木聚糖底物ul	900	900	900	900	900	900	900	900	900	900	900
DNS溶液ml	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5

混匀后在沸水中反应5分钟，流动水冷却至室温，加入1.5ml重蒸水，最后用分光光度计测A₅₄₀。

3.2酶活测定

取100ul获得的XYA6205酶液，加入900ul质量百分含量为1%木聚糖（溶剂为pH=5.0的0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液）溶液反应，在特定温度下（50℃）反应10分钟，待反应结束后加入1.5ml制备的DNS试剂，置于沸水中水浴5分钟，流动水冷却，加入1.5ml重蒸水，最后用分光光度计测A₅₄₀。

酶活（IU）定义为：1U为在pH值5.0和50℃条件下每分钟催化产生1umol还原糖所需的酶量。

结果表明，五天1L发酵液中XYA6205酶在pH值5.0和50℃下的酶活为69.43U/ml。

3.3酶的最适pH值的测定

测定XYA6205在50℃，pH范围为3.0~8.0的0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液中的酶活，梯度为0.5。具体方法为：取100ul获得的XYA6205酶液（XYA6205浓度为0.177mg/ml），加入900ul质量百分含量为1%木聚糖（溶剂为pH值相同的0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液）溶液反应，在50℃水浴中反应10分钟，待反应结束后加入1.5ml制备的DNS试剂，置于沸水中水浴5分钟，流动水冷却，加入1.5ml重蒸水，最后用分光光度计测A₅₄₀。酶活（IU）定义为：1U为每分钟催化产生1umol还原糖所需的酶量。在50℃的反应条件下，XYA6205在pH5.8的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中的比活力最高，以此为100%，换算各pH值下的相对酶活力，结果如图3所示，结果表明XYA6205的最适pH为5.8。

3.4酶的最适温度的测定

在最适pH5.8条件下测定不同浓度下（20℃~80℃）的XYA6205酶活。具体方法为：取100ul获得的XYA6205酶液（XYA6205浓度为0.177mg/ml），加入900ul质量百分含量为1%木聚糖（溶剂为pH值相同的0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液）溶液反应，分别置于20℃~80℃（梯度为10℃）反应10分钟，待反应结束后加入1.5ml制备的DNS试剂，置于沸水中水浴5分钟，流动水冷却，加入1.5ml重蒸水，最后用分光光度计测A₅₄₀。酶活（IU）定义为：1U为每分钟催化产生1umol还原糖所需的酶量。在pH为5.8的0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠缓冲液反应条件下，XYA6205在50℃时比活力最高，以此为100%，换算各温度下的相对酶活力，结果如图4所示，结果表明XYA6205的最适温度为50℃。

实施例4本发明XYA6205木聚糖酶在烘焙中的应用

采用一次发酵法工艺制作面包。面包粉选用鹏泰的面包基础粉（未加任何添加剂）；安琪牌面包酵母；加伦牌起酥油。木聚糖酶溶液的配制：量取30mlXYA6205木聚糖酶液到1000ml的容量瓶中，用蒸馏水定容，使最终酶活为2U/ml。

制作时实验组用本发明的XYA6205木聚糖酶液，对照组用同样稀释倍数的黑曲霉G1的发酵液和面。制作完成后，对照组面包直径平均为17.2cm，实验组面包直径平均为18.4cm，实验组体积增大14%左右。说明本发明的木聚糖酶具有很好的烘焙效果。

Claims (5)

1.一种木聚糖酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2 。

2.编码权利要求1所述的木聚糖酶的核苷酸，其序列为SEQ ID NO：1。

3.如权利要求1所述的木聚糖酶，其酶活最适pH 值为5.8

4.如权利要求1所述的木聚糖酶，其酶活最适温度为50℃。

5.权利要求1所述的木聚糖酶在烘焙中的应用。

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