CN104232610A - 一种ɑ-角蛋白底物特异性提高的角蛋白酶机器构建方法和应用 - Google Patents

一种ɑ-角蛋白底物特异性提高的角蛋白酶机器构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种ɑ-角蛋白(羊毛鳞片)的底物特异性提高的角蛋白酶及其应用，属于遗传工程领域。本发明采用定点突变技术将地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis BBE11-1的角蛋白酶(ker)基因进行定点突变并克隆连接到枯草芽孢杆菌表达载体pMA5，转化Bacillus subtilis WB600，经纯化验证得到一株可以产具有较好ɑ-角蛋白底物特异性的角蛋白酶的重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600-pMA5-kerMA，该菌株表达的角蛋白酶在对天青角蛋白(ɑ-角蛋白)的比酶活较野生型增加了50％。同时突变体较野生型角蛋白酶具有更好的羊毛织物防毡缩效果，这为角蛋白酶的应用奠定了良好的基础。

Description

一种ɑ-角蛋白底物特异性提高的角蛋白酶机器构建方法和应用
技术领域
本发明涉及一种ɑ-角蛋白(羊毛鳞片)的底物特异性提高的重组角蛋白酶及其构建方法和应用，属于遗传工程技术领域。
背景技术
角蛋白酶(Keratinase)是一种可以特异性降解角蛋白的酶类，由细菌、放线菌和真菌等多种微生物产生。角蛋白酶可以将羽毛角蛋白转化为可溶性蛋白以及氨基酸，可以代替粮食作物作为饲料喂养家禽。另外，角蛋白酶处理方法也可以应用在纺织物处理上取代污染较严重的化学处理方法进而在保护环境的前提下改善织物的性能。同样，角蛋白酶在其他领域如清洁剂、医药、化妆品、皮革等行业也具有广泛的应用价值。
羊毛是一种ɑ-角蛋白，其蛋白组成形式主要为ɑ螺旋，并含有较高含量的半胱氨酸残基(10.5-17％)形成二硫键。同时，羊毛鳞片蛋白还具有较高含量的精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和赖氨酸，众多的二硫键结构与赖氨酸和谷氨酸形成的离子键结构使得羊毛鳞片十分牢固因此很难被降解。由于羊毛鳞片是造成羊毛织物毡缩的主要原因，因此角蛋白酶能否对鳞片进行有效降解是评价该酶防毡缩应用价值的主要指标。
来源于地衣芽胞杆菌的角蛋白酶与subtilisin BPN’一样，具有较广的底物特异性。根据与底物结合位置的不同角蛋白酶底物结合区域可以分为S1、S2、S3、S4、S1’、S2’、S3’,其中起主要作用的为S1和S4底物结合区域，分别与底物的P1和P4位置残基相连。虽然角蛋白酶催化中心直接作用于与S1结合区域结合的底物P1位置的残基，但研究发现S4底物结合区域对底物的偏好性与S1结合区域一样同等重要。因此，本发明通过对角蛋白酶S4底物结合区域进行改造，提高了角蛋白酶对ɑ-角蛋白的底物特异性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种对ɑ-角蛋白(羊毛鳞片)的底物特异性提高的角蛋白酶，其是对现有的角蛋白酶S4底物结合区域进行定点突变。
所述角蛋白酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
AQTVPYGIPLIKADKVQAQGFKGANVKVAVLDTGIQASHPDLNVVGGASFVAGEAYNTDGNGHGTHVAGTVAALDNTTGVLGVAPSVSLYAVKVLNSSGSGSYSGIVSGIEWATTNGMDVINMSLGGASGSTAAKQAVDNAYARGVVVVAAAGNSGSSGNTNTIGYPAKYDSVIAVGAVDSNSNRASFSSVGAELEVMAPGAGVYSTYPTNTYATLNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNLSASQVRNRLSSTATYLGSSFYYGKGLINVEAAAQ
本发明还提供了一种获得所述角蛋白酶的方法，其特征在于以GenBank登录号为JX504681公布的基因序列基础上，对角蛋白酶S4底物结合区域进行分子改造，具体将134为Met替换为Ala。
产所述产角蛋白酶的基因工程菌或转基因细胞系也为本发明要求保护的范围。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种构建产角蛋白酶的基因工程菌的构建方法，具体包括如下步骤：
1)采用化学全合成或PCR方法克隆GenBank登录号为JX504681；
2)将步骤1)获得的角蛋白酶基因进行定点突变，将134位Met替换为Ala，
连接到枯草杆菌表达载体，得到重组表达载体；
3)将步骤2)获得的重组表达载体转化Bacillus subtilis WB600得到基因工程菌。
所述表达载体优选pMA5。
应用上述产角蛋白酶基因工程菌发酵生产角蛋白酶的方法，将其斜面活化制备种子后，以3％的接种量转入基本发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养24h。
所述基本发酵培养基组成为胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl10g/L，葡萄糖10g/L,MgSO4 0.1g/L。
ɑ-角蛋白活力测定方法：将发酵液离心10min(10000×g，4℃)取发酵上清液，吸取500uL适当稀释的酶液，加入2.5mL0.05mol/L gly-NaOH缓冲液(pH9.0)溶解1％的底物(天青角蛋白)，50℃培养60min，加入2mL4M TCA溶液以终止反应。离心10min，吸取上清液移入到新的试管中。空白为在加入酶液的同时，加入500uL TCA溶液，经过相同过程反应的过滤清液作为空白。在595nm处检测吸光值，与空白相比较在595nm处每增加0.01吸光度定义为一个酶活单位。
本发明采用定点突变技术将地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis BBE11-1的角蛋白酶(ker)基因进行定点突变并克隆连接到枯草芽孢杆菌表达载体pMA5，转化Bacillus subtilisWB600，经纯化验证得到一株可以产具有较好ɑ-角蛋白底物特异性的角蛋白酶的重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600-pMA5-kerMA，该菌株表达的角蛋白酶在对天青角蛋白(ɑ-角蛋白)的比酶活较野生型增加了50％。同时突变体较野生型角蛋白酶具有更好的羊毛织物防毡缩效果，这为角蛋白酶的应用奠定了良好的基础。
附图说明
图1：野生型角蛋白酶与突变体SDS-PAGE图
M：Marker；泳道1-4：野生型，I106A,M134A,Y103A。
图2：野生型与突变体角蛋白酶酶解后氨基酸分析。
图3：野生型与突变体角蛋白酶XPS分析。
图4：野生型及突变体角蛋白酶对羊毛防毡缩效果的影响。
具体实施方式
实施例1 ɑ-角蛋白底物特异性提高的角蛋白酶
本发明的角蛋白酶是在GenBank accession nos.JX504681公布的基因序列基础上，对S4底物结合区域进行分子改造，具体将134为Met替换为Ala。其获得方法为以GenBankaccession nos.JX504681公布的基因为出发基因,通过化学全合成或定点突变的方式进行氨基酸的取代。
实施例2 产角蛋白酶基因工程菌的构建及鉴定
构建产角蛋白酶基因工程菌的步骤如下：
1)以pMA5-ker为模板，采用PCR方法或化学全合成方法获得ker基因突变子kerTB；
2)S4底物结合区域的分子改造：Ile106以及Met134分别位于S4底物结合区域的两个不同位置的低端，其直接决定着S4结合区域的大小。同时，Tyr103被证明是另外一个决定S4区域大小的重要位置的氨基酸残基。为了保证S4结合区域的疏水框架结构，分别引入四个突变体来增大(I106A、M134A和Y103A)和减小(I106F)S4底物结合区域。
PCR方法突变引物序列如下：
PCR反应体系：0.2mL PCR管中按顺序加入以下试剂：5×prime STAR PCR buffer II(Mg2+plus)5μl；DNTP Mixture4μl；模板DNA1μl；上下游引物各1μl；Taq酶0.5μl；加双蒸水至终体积为50μl。
PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，61℃(根据不同突变引物而定)退火15s，72℃延伸3min20s(30个循环)；72℃延伸10min。
将胶回收纯化后的PCR产物在37℃,10min条件下用磷酸化试剂盒处理使之磷酸化。然后应用T4DNA连接酶于16℃过夜连接，连接产物用化学转化法转化宿主菌JM109，并挑选转化子。
3)挑选验证正确的转化子并提取重组质粒pMA5-kerTB。
大肠杆菌化学转化为：取连接产物5μl加入到含有100μl JM109感受态细胞中，充分混匀后，冰浴30min；将装有混合物的Eppendorf管，42℃水浴热休克90s，然后将Eppendorf管立即转移到冰上冷却2min；向管中加入600μl LB液体培养基，置于37℃200rpm恒温摇床上培养1h，然后涂布于含有卡那霉素的平板上，37℃向上放置1h，倒置培养12-16h后观察菌落。
4)将重组质粒pMA5-kerTB转化Bacillus subtilis WB600感受态细胞，得到能在含有卡那霉素(25μg/mL)的LB平板上正常生长的基因工程菌，并经过鉴定命名为Bacillus subtilisWB600-pMA5-kerTB。
实施例3 重组菌的酶活测定和蛋白电泳
ɑ-角蛋白活力测定方法：将发酵液离心10min(10000×g，4℃)取发酵上清液，吸取500uL适当稀释的酶液，加入2.5mL0.05mol/L gly-NaOH缓冲液(pH9.0)溶解1％的底物(天青角蛋白)，50℃培养60min，加入2mL4M TCA溶液以终止反应。离心10min，吸取上清液移入到新的试管中。空白为在加入酶液的同时，加入500uL TCA溶液，经过相同过程反应的过滤清液作为空白。在595nm处检测吸光值，与空白相比较在595nm处每增加0.01吸光度定义为一个酶活单位。
培养基：种子和斜面培养基为LB培养基(1L)：胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl10g；斜面培养基添加琼脂15g；基本发酵培养基为添加葡萄糖的LB培养基(1L)：胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl10g，葡萄糖10g；
培养方法：将37℃、200rpm下培养过夜的种子以3％的接种量转入基本发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养；
通过蛋白电泳(SDS-PAGE)得到一条分子量大小约为30kDa的蛋白条带(见图1)，纯化后测定突变体重组角蛋白酶的对天青角蛋白的比酶活较野生型提高了50％(表1)。
表1
实施例4 突变酶处理羊毛织物的分析及防毡缩效果评估
游离氨基酸的测定方法：采用相同酪蛋白酶活(400U/g羊毛纤维)的野生型及突变体角蛋白酶对羊毛纤维在pH为9的50mmol·L-1Glycine-NaOH缓冲液进行水解12h后，进行游离氨基酸检测。其中酶对羊毛纤维水解氨基酸的变化量的计算是将水解羊毛纤维后的游离氨基酸含量减去酶液中的氨基酸含量(图2)。
XPS样品表面元素检测方法：采用相同酪蛋白酶活(400U/g羊毛织物)的野生型及突变体角蛋白酶对羊毛织物在pH为9的50mmol·L-1Glycine-NaOH缓冲液进行水解12h。采用X-射线光电子能谱(XPS)分析羊毛织物表面的各元素相对含量比例。检测条件为铝/镁靶，高压14.0kV,功率250W,真空优于1×10-8Torr。采用美国RBD公司的RBD147数据采集卡和AugerScan3.21软件分别采集样品的0～1200(1000)eV的全扫描谱(通能为93.9eV)，而后采集各元素相关轨道的窄扫描谱(通能为23.5eV或46.95eV)，并采用AugerScan3.21软件进行数据分析。以C1s＝284.6eV为基准进行结合能校正，应用AugerScan3.21软件进行分峰拟合(图3)。
羊毛织物防毡缩处理：采用相同酪蛋白酶活(400U/g羊毛织物)的野生型及突变体角蛋白酶对羊毛织物在pH为9的50mmol·L-1Glycine-NaOH缓冲液进行水解12h。处理后样品用清水充分洗净、烘干后考察其防毡缩效果(图4)。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (8)

1.一种对ɑ-角蛋白底物特异性提高的角蛋白酶，其特征在于对现有的决定角蛋白酶底物特异性的S4底物结合区域进行定点突变，通过对决定S4底物结合区域小的关键位点氨基酸进行定点突变，提高了角蛋白酶对ɑ-角蛋白的底物特异性。
2.如权利要求1所述的角蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1所述的角蛋白酶，其特征在于以GenBank登录号为JX504681公布的基因序列基础上，对S4底物结合区域进行分子改造，具体为将134为Met替换为Ala。
4.产权利要求1-3任一所述产角蛋白酶的基因工程菌或转基因细胞系。
5.一种构建产权利要求1或3所述角蛋白酶的基因工程菌的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)采用化学全合成或PCR方法克隆GenBank登录号为JX504681；
2)将步骤1)获得的角蛋白酶基因进行定点突变，将134位Met替换为Ala，连接到枯草杆菌表达载体，得到重组表达载体；
3)将步骤2)获得的重组表达载体转化Bacillus subtilis WB600得到基因工程菌。
6.权利要求5所述的方法，其特征在于所述表达载体为pMA5。
7.一种发酵生产角蛋白酶的方法，其特征在于以权利要求5获得的产角蛋白酶基因工程菌为生产菌株，斜面活化制备种子后，以3％的接种量转入已优化的基本发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养24h。
8.权利要求7所述的方法，其特征在于基本发酵培养基组成为胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl10g/L，葡萄糖10g/L，0.1g/L MgSO4。
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