CN103555690A

CN103555690A - 一种新型果糖苷酶及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN103555690A
Application number: CN201310521419.7A
Authority: CN
Inventors: 陈臣; 周方方; 任婧; 刘景�; 张红发; 顾瑾麟; 王渊龙; 董懿樱
Original assignee: Shanghai Bright Dairy and Food Co Ltd
Current assignee: Shanghai Bright Dairy and Food Co Ltd; Bright Dairy and Food Co Ltd
Priority date: 2013-10-28
Filing date: 2013-10-28
Publication date: 2014-02-05
Anticipated expiration: 2033-10-28
Also published as: CN103555690B; CN105349508A

Abstract

本发明公开了一种新型果糖苷酶、其编码基因、包含该基因的重组表达载体及其转化体和所述酶的应用。所述的果糖苷酶具有如序列表中SEQ.ID NO:1所示的氨基酸序列。所述的编码基因具有如序列表中SEQ.ID NO:2所示的核苷酸序列。本发明还提供包含所述编码基因核酸序列的重组表达载体和重组表达转化体。该果糖苷酶来源于植物乳杆菌，与其他来源的果糖苷酶相比，该酶不仅具有分解低聚果糖并从中游离果糖基的酶活性，同时其还具有菊粉酶活性及果聚糖酶活性；于其他乳酸菌中异源表达该酶可以使得不具有利用低聚果糖的乳酸菌获得利用低聚果糖的能力。

Description

一种新型果糖苷酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新型果糖苷酶及其编码基因和应用。

背景技术

低聚果糖（Fructooligosaccharides，FOS）又名蔗果低聚糖，是指1～9个果糖基以β-2，1键或β-2，6键连接在蔗糖的D-果糖基上而形成的混合物。作为一种被广泛认可的益生元物质，低聚果糖不能被人体直接消化吸收，当它到达人体胃肠道时，可有选择性地刺激肠道中的有益菌（如双歧杆菌和部分乳酸菌）增殖，同时代谢产生的短链脂肪酸，使肠道内的pH值降低，抑制外源性致病菌和肠道内固有真菌等的生长繁殖，起到调节肠道菌群的作用。

微生物之所以具有利用低聚果糖的能力是因为它含有能分解低聚果糖糖苷键的酶，即β-呋喃果糖苷酶。β-呋喃果糖苷酶(β-fructofuranosidase，EC3.2.1.26)，又名转化酶，广泛地存在于生物界，属于糖苷酶32家族，具有催化β-呋喃果糖苷分子中非还原端的β-呋喃果糖苷键水解的功能，有的还具有转糖基作用，如用蔗糖作果糖基供体其能将果糖基转移蔗糖生产低聚果糖。乳杆菌双歧杆菌来源的β-呋喃果糖苷酶无转糖基作用，其主要功能是水解低聚果糖等碳源供菌体利用。研究发现，不同来源的β-呋喃果糖苷酶的性质不同，包括底物动力学、底物多样性、最适反应条件等，使得不同菌株利用低聚果糖的能力及特性不同。此外，许多具有益生功能的乳酸菌不具有利用低聚果糖的能力，如生产酸奶的常用菌株保加利亚乳杆菌就不能利用低聚果糖，这就限制了其在人体胃肠道中生长并保持活力。

因此，基于实际应用的需求，有必要开发新型的果糖苷酶，如果同时还能实现其异源表达，使得不具有利用低聚果糖能力的益生菌具有利用低聚果糖的能力，则具有更大的实际应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有的果糖苷酶类型还不够丰富，还不能满足实际应用需求的现状，而提供一种新型果糖苷酶、其编码基因、包含该基因的重组表达载体及其转化体和所述酶的应用，该果糖苷酶来源于植物乳杆菌，与其他来源的果糖苷酶相比，该酶不仅具有分解低聚果糖并从中游离果糖基的酶活性，同时其还具有菊粉酶活性及果聚糖酶活性；于其他乳酸菌中异源表达该酶可以使得不具有利用低聚果糖的乳酸菌获得利用低聚果糖的能力。

本发明提供的技术方案之一是：一种分离的蛋白质，其

（1）氨基酸序列如序列表中SEQ.ID NO:1所示；或

（2）为由氨基酸序列如序列表中SEQ.ID NO:1所示的蛋白质与蛋白纯化标签组成的融合蛋白。

本发明中，所述的蛋白质为一种新型的β-呋喃果糖苷酶，在本发明之前未见报道过，其具有高效的果糖苷酶活性，同时还兼有菊粉酶活性及果聚糖酶活性。本发明所述的蛋白质来源于植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）ST-III，其可以通过本领域常规的方法获得，如将编码所述蛋白质的基因导入合适的宿主细胞得到能够正常表达所述蛋白质的转化体，然后培养所述的转化体，从培养物中分离所述蛋白质即可。所述的蛋白质还可以通过人工全序列合成而得。

如本领域技术人员所知：所述蛋白质的氨基酸序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加一个或多个氨基酸而得所述蛋白质的同系物，只要该蛋白质的同系物依然能够保持所述蛋白质的功能即可，即在保持所述蛋白质的果糖苷酶催化活性、菊粉酶活性及果聚糖酶活性的前提下，可以进行适当程度的氨基酸序列改变。

本发明中，所述的蛋白纯化标签为本领域常规所述，较佳地为His纯化标签，即本发明所述的融合蛋白较佳地为由氨基酸序列如序列表中SEQ.IDNO:1所示的蛋白质与His纯化标签组成的融合蛋白。

本发明提供的技术方案之二是：一种分离的核酸，其编码氨基酸序列如序列表中SEQ.ID NO:1所示的蛋白质。

其中所述核酸的制备方法为本领域常规的制备方法，所述制备方法较佳地包括：从自然界中提取天然存在的编码氨基酸序列如序列表中SEQ.IDNO:1所示的蛋白质的核酸分子，或者通过基因克隆技术获得编码氨基酸序列如序列表中SEQ.ID NO:1所示的蛋白质的核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码氨基酸序列如序列表中SEQ.ID NO:1所示的蛋白质的核酸分子。

本发明中，所述的核酸优选地具有如序列表中SEQ.ID NO:2所示的核苷酸序列，更优选地，所述核酸的核苷酸序列如序列表中SEQ.ID NO:2所示。

如本领域技术人员所知：编码氨基酸序列如序列表中SEQ.ID NO:1所示的蛋白质的核苷酸序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加一个或多个碱基的方式来提供一个多聚核苷酸的同系物，只要该同系物编码的蛋白质依然能够保持氨基酸序列组成如序列表中SEQ.ID NO:1所示的蛋白质的功能即可，即在保持氨基酸序列组成如序列表中SEQ.ID NO:1所示蛋白质的果糖苷酶催化活性、菊粉酶活性及果聚糖酶活性的前提下，可以进行适当程度的核苷酸序列改变。

本发明提供的技术方案之三是：一种包含上述核酸的重组表达载体。

其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即：将上述核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体。所述载体较佳地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选质粒，本发明所述载体更优选为质粒pET-28a(+)，即本发明所述的重组表达载体更优选为将上述核酸连接于质粒pET-28a(+)上构建而成。

本发明提供的技术方案之四是：一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。

其中所述重组表达转化体的制备方法为本领域常规，如可以通过将上述重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且使所携带的编码氨基酸序列组成如序列表中SEQ.ID NO:1所示蛋白质的基因可被有效表达即可。其中所述宿主微生物较佳地为：大肠杆菌(E.coli)，更佳地为大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌DH5α。将前述重组表达载体转化至E.coli BL21(DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株。其中所述转化方法为本领域常规的转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。

本发明提供的技术方案之五是：一种重组乳酸菌，其特征在于，其基因组中含有能表达氨基酸序列组成如序列表中SEQ.ID NO:1所示蛋白质的外源基因。

本发明中，所述外源基因的核苷酸序列较佳地如序列表中SEQ.ID NO:2所示，其表达氨基酸序列组成如序列表中SEQ.ID NO:1所示的蛋白质。

所述的重组乳酸菌为一种能够利用低聚果糖、获得水解低聚果糖的重组乳酸菌，其为能表达氨基酸序列组成如序列表中SEQ.ID NO:1所示的蛋白质的重组乳酸菌。本发明中，所述的乳酸菌为本领域常规所述的不能产生果糖苷酶、不具有利用低聚果糖能力的常规的乳酸菌，优选保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）ATCC11842菌株。

本发明中，所述的重组乳酸菌可以通过常规方法获得，只要将能表达氨基酸序列组成如序列表中SEQ.ID NO:1所示的蛋白质的核酸分子（优选核苷酸序列如序列表中SEQ.ID NO:2所示）导入所述的乳酸菌基因组中，使之稳定表达即可。较佳地，所述的重组乳酸菌为通过穿梭质粒pSIP403将能表达氨基酸序列组成如序列表中SEQ.ID NO:1所示的蛋白质的核酸分子（优选核苷酸序列如序列表中SEQ.ID NO:2所示）导入所述的乳酸菌基因组中，即：将包含能表达产生氨基酸序列组成如序列表中SEQ.ID NO:1所示的蛋白质的核酸分子的穿梭质粒pSIP403（重组表达载体pSIP403-sacA）导入所述的乳酸菌中，筛选得到重组乳酸菌，所述的重组乳酸菌能够表达氨基酸序列组成如序列表中SEQ.ID NO:1所示的蛋白质。本领域技术人员知晓，其他能够携带常规核酸分子的穿梭载体也适用于本发明。

本发明提供的技术方案之六是：前述氨基酸序列如序列表中SEQ.IDNO:1所示的蛋白质作为果糖苷酶、菊粉酶或果聚糖酶的应用。

本发明中，所述的氨基酸序列如序列表中SEQ.ID NO:1所示的蛋白质具有果糖苷酶活性，其能够水解底物非还原末端的β(2-1)糖苷键，生成果糖；所述的氨基酸序列如序列表中SEQ.ID NO:1所示的蛋白质还具有菊粉酶活性，其能够将长链的菊粉水解为果糖或短链的低聚果糖；所述的氨基酸序列如序列表中SEQ.ID NO:1所示的蛋白质还具有果聚糖酶活性，其能够水解果聚糖酶中β(2-6)糖苷键，使得细菌来源的果聚糖也得以被利用。由于酶的专一性，其他来源的果糖苷酶主要作用于底物非还原末端的β(2-1)糖苷键，如大部分双歧杆菌的果糖苷酶；而本发明所述的果糖苷酶兼具有果糖苷酶、菊粉酶和果聚糖酶等多种酶活力，使得其可以作用于不同连接键和链长的底物，丰富了其宿主菌的糖类利用多样性，促进其在肠道中的增殖。

所述的氨基酸序列如序列表中SEQ.ID NO:1所示的蛋白质作为植物乳杆菌来源的果糖苷酶目前未见报道过，同时由于该酶兼有菊粉酶活性和果聚糖酶活性，其作为一个新的果糖苷酶的特性也未见报道过。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料除特别说明之外，均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

1、本发明所述的果糖苷酶为胞内酶，而其他目前报道的果糖苷酶有的为胞外酶，有的为与胞壁相连接的酶。果糖苷酶在细胞中的位置决定了低聚果糖水解发生的位置，在胃肠道中，低聚果糖在胞外或者胞壁水解会使水解产物被其他肠道菌所利用；而胞内水解则没有这个劣势，从而可以使得低聚果糖的益生功效充分发挥。

2、并不是所有的乳酸菌都可以利用低聚果糖，有些具有益生功能的乳酸菌不能利用低聚果糖就是因为其不编码可以水解低聚果糖的果糖苷酶。由于兼容性等的差异，在这些菌中异源表达其他来源的果糖苷酶也不一定会使其获得利用低聚果糖的能力。而本发明所述的果糖苷酶于保加利亚乳杆菌ATCC11842中异源表达，可以使得重组菌获得利用低聚果糖的能力，弥补了其不能利用低聚果糖的缺陷。同时，本发明的这一应用也给其他通过基因工程方法改造乳酸菌增加其代谢功能性的研究提供了有益借鉴。

3、本发明所述的果糖苷酶不具有转糖基能力，不能由蔗糖生成低聚果糖，但是该酶对于短链的低聚果糖有最佳的催化活力，同时兼具外切菊粉酶，外切果聚糖酶和转化酶等多种酶活力，会帮助其宿主菌更好的利用肠道中低聚糖等碳源，促进宿主菌在肠道中的增殖。

附图说明

图1中编号“1”的泳道为PCR产物；编号“2”的泳道为

-TEasy-sacA经NdeI和XhoI双酶切后的电泳图；编号“3”的泳道为pET-28a(＋)–sacA经NdeI和XhoI双酶切后的电泳图；M₁为DL2000Marker；M₂为1Kbladder。

图2为重组蛋白表达鉴定及纯化后的电泳结果图，其中，M为蛋白Marker；1为E.coli BL21-sacA诱导前细胞的破碎上清；2为E.coli BL21-sacA诱导后的细胞破碎上清；3为目的蛋白经Ni²⁺柱纯化后的电泳结果。

图3为MALDI TOF/TOF质谱检测蛋白质肽谱与SacA蛋白序列的对比图，加粗片段为液质联用得到的肽段，下划线片段为表达载体引入的肽段。

图4为pH（A）、温度（B，C）、金属离子（D）对重组SacA蛋白酶活的影响结果图。

图5为SacA水解低聚果糖产物的HPLC分析结果图，SacA在37℃分别作用于蔗糖(A)，蔗果三糖(B)，蔗果四糖(C)，蔗果五糖(D)0(I)，10(II)，30(III)和60(IV)分钟后，用配有氨基柱的HPLC检测，其中，各缩写词为：Glc，葡萄糖；Fru，果糖；Suc，蔗糖；1-K，蔗果三糖1-kestose；Nys，蔗果四糖；F-nys，蔗果五糖。

图6为保加利亚乳杆菌ATCC11842野生型菌株（左图）和含有pSIP403-sacA的重组菌株在含有1%的低聚果糖的改良MRS培养基上（含有25ng/mL的IP-673，10μg/mL的红霉素和30mg/L的溴甲酚紫，右图）的生长情况。

图7为表达载体pET-28a(＋)-sacA的构建示意图。

图8为表达载体pSIP403-sacA的构建示意图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1植物乳杆菌中β-呋喃果糖苷酶位置的确定和粗酶的提取

将植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）ST-III于37℃培养24h后，离心（4℃，12,000×g，10min）收集上清与菌体。上清用0.45μm的膜过滤除菌后，经25kDa超滤膜超滤浓缩至原体积的1/20，即为发酵液上清。菌体用50mM PBS（pH=6.0）离心洗涤2次后，加入溶菌酶至2mg/mL，37℃作用1h。在冰浴中超声波间歇破碎8min（400W，超声5s，间歇5s），后离心（4℃，12,000×g，10min）分别收集上清液与沉淀。沉淀重悬到等体积的上述PBS中，即为破碎细胞沉淀。上清液用截留分子量为25kDa超滤膜超滤浓缩至原体积的1/5，即为细胞破碎上清。分别测定发酵液上清，细胞破碎上清和沉淀的酶活，结果见表1。从结果可以看出，酶活几乎全部存在于细胞破碎上清中，表明该酶是胞内酶。

表1植物乳杆菌中β-呋喃果糖苷酶酶活分布

成分	发酵液上清	细胞破碎上清	细胞破碎沉淀
				酶活（U/mL）	0.01U/mL	5.75U/mL	0.03U/mL

因而上述方法得到的细胞破碎上清即为植物乳杆菌中β-呋喃果糖苷酶粗酶，酶活为5.75U/mL。

实施例2果糖苷酶的克隆表达及性质测定

1、重组表达质粒的构建

以SEQ ID No.3：5’-GGAATTCCATATGGAGCTCATCGTCATGATATGGAAT-3’和SEQ ID No.4：5’-CCGCTCGAGCCGCTAGCTTCGCAACATC-3’为引物，以植物乳杆菌ST-III基因组为模板，进行PCR反应。PCR反应体系为20.0μL，各反应物的终浓度为：1×PCR buffer，1mmol/L的Mg²⁺，0.2mmol/L的dNTP，0.4μmol/L上下游引物（SEQ ID No.3、SEQ ID No.4），0.1U/μL的Taq DNA聚合酶和2.0ng/μL的DNA模板，用ddH₂O补足至20.0μL。PCR反应参数为：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环；72℃延伸7min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。将已纯化的目的基因片段在T4连接酶的作用下连接至

-T Easy载体（购自美国Promega公司）上，连接体系、连接条件参考T4连接酶说明书。将连接产物电转化至大肠杆菌DH5α，通过蓝白斑筛选阳性克隆，并进行PCR鉴定及测序鉴定。抽提含有正确插入片段的重组质粒

-T Easy-sacA，与表达质粒pET-28a(＋)（购自美国Novagen公司）进行双酶切(NdeI，XhoI)，酶切体系参照限制性内切酶说明书，回收纯化酶切产物，进行4℃过夜连接。连接产物转化至BL21(DE3)（购自美国Novagen公司）中，涂布于含有硫酸卡那霉素的LB平板上，37℃培养16h，筛选阳性克隆并进行测序鉴定，得到正确的目标重组表达载体，将其命名为pET-28a(＋)-sacA，相应的重组菌命名为E.coli BL21-sacA。

2、目的蛋白的诱导表达

挑取E.coli BL21-sacA单菌落于20mL含100μg/mL的硫酸卡那霉素的液体LB培养基中，37℃，200rpm摇瓶培养过夜。将过夜培养液，接种至200mL含有卡那霉素的液体LB培养基中，接种量为1%，培养温度37℃，摇床振荡速率为200rpm，在OD₆₀₀达到0.5-0.7左右时，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1mmol/L，16℃，诱导12h。诱导完毕后，于4℃，10000g离心10min，收集菌体细胞。

3、蛋白纯化

每克湿菌体加入5mL细胞裂解缓冲液（50mM Tris-HCl，300mM NaCl，10mM咪唑，pH8.0）重悬菌体细胞，加入溶菌酶至1mg/mL，和苯甲基磺酰氟（PMSF）至终浓度1mM，冰浴30min后，进行超声破碎。破碎条件如下：超声300W，超声2s，间歇8s，作用10min，整个过程于冰浴中进行。细胞破碎液于4℃，16000g离心20min，收集上清。上清加入螯合有NiSO₄的Sepharose Fast Flow凝胶（美国GE公司）上，混匀，4℃，摇动1.5h。后4℃，3500g离心2min弃去上清，其余重新混匀，装入亲和层析柱后用10倍体积的洗涤溶液(50mM Tris-HCl，300mM NaCl，50mM咪唑，pH8.0)洗去杂蛋白后，不同浓度的洗脱缓冲液(含50mM Tris-HCl，300mM NaCl和不同浓度的咪唑)梯度洗脱目标蛋白，取50μL洗脱蛋白液与等体积的2×上样缓冲液混合，用以进行蛋白电泳分析。合并纯化蛋白浓度较高的洗脱液，用1000倍体积的50mM Tris-HCl（pH8.0，含20%甘油）于4℃透析24h，冻干备用。

4、SDS-PAGE电泳

将蛋白样品与等体积的2×上样缓冲液混合，于漩涡振荡器上振匀；沸水加热5min后，采用5%的浓缩胶和12%分离胶进行跑胶，电极缓冲液为Tris-甘氨酸缓冲液。当样品处于浓缩胶时的电压设定为90V，待溴酚蓝指示剂进入分离胶后改电压为120V；电泳完后，用考马斯亮蓝染色液于室温染色2h后，用脱色液脱色至蛋白条带清晰。染色与脱色过程中均在脱色摇床上完成。通过凝胶成像仪灰度扫描电泳胶板，分析蛋白分布与浓度。

5、MALDI TOF/TOF质谱检测蛋白质肽谱

将含有目的蛋白的胶块切成1mm³左右的小块，装入离心管中，水洗一次。用50％（v/v）乙腈/25mM碳酸氢铵（100μL，pH8.0）脱色15分钟。反复3次，直至将颜色脱尽，蒸馏水洗涤1次，将胶块浸入30μL100％乙腈中5分钟，脱水，胶块变白，然后室温抽干加8μl胰蛋白酶（Trypsin）酶液(0.005mg/ml)，37℃过夜16h左右。将0.3μL已酶解的样品加0.3μL的基质点到样品板上，室温晾干，上4700蛋白组分析系统（购自美国AppliedBiosystems公司）选用正离子反射模式进行质谱解析。

6、结果

以植物乳杆菌ST-III基因组作为模板，用SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列为引物进行PCR扩增反应，得到1.5kb左右的基因片段，大小与预期一致，结果如图1编号“1”泳道所示，目标片段中即包含了目的基因sacA。将扩增后回收纯化的PCR产物片段与

-T Easy载体连接，通过蓝白斑筛选阳性克隆，构建克隆载体

-T Easy-sacA，并通过测序和酶切验证。如图1中编号“2”泳道所示，其琼脂糖凝胶电泳显示有1.5kb和3kb的两个酶切片段，说明目的片段已插入-T Easy载体。将克隆载体

-T Easy-sacA用限制性内切酶NdeI和XhoI，酶切产物与对应双酶切载体pET-28b(a)进行连接，构建表达载体pET-28a(＋)-sacA。将重组质粒连接物转化至E.coli BL21(DE3)，37℃平板培养24h，挑选阳性转化子接种至LB液体培养基中培养过夜，离心收集菌体，提取重组质粒，用对应的限制性内切酶对重组质粒进行鉴定。pET-28a-sacA经NdeI和XhoI双酶切，得到5kb的pET28a线性片段和1.5kb的目的基因片段，如图1编号“3”泳道所示，证明表达载体pET-28a(＋)-sacA成功转入E.coli BL21(DE3)宿主菌中。阳性表达宿主命名为E.coli BL21-sacA。

E.coli BL21-sacA经IPTG诱导后，胞内上清在约66kDa处有一条明显的重组蛋白表达条带，见图2。重组蛋白因带有6×His标签可被特异性地吸附至亲和介质（Ni²⁺）上从而与杂蛋白迅速分离。低浓度的咪唑能起到去除杂蛋白并纯化蛋白的作用，而与介质亲和力强的重组蛋白能在高浓度的咪唑作用下洗脱下来。由E.coli BL21(pET-28a(＋)-sacA)表达的重组蛋白SacA通过Ni²⁺亲和色谱进行纯化，在吸附缓冲液中添加终浓度50mmol/L咪唑，即可以去除大部分的杂蛋白，使得重组蛋白最大限度地吸附到填料上；之后采用梯度浓度洗脱目标蛋白，300mmol/L浓度的咪唑能完全洗脱亲和填料上的目标蛋白。将咪唑洗脱蛋白用1000倍体积的50mmol/L Tris-HCL透析去除咪唑，冻干后约从1L发酵液中获得120mg纯化的SacA蛋白，比酶活达107.0U/mg。重组果糖苷酶在N端加上相应的6×his标签大小约为58.1kDa，然而实际得到的重组蛋白比理论值偏大约6KDa。纯化蛋白的电泳结果如图2所示。

为了验证表达蛋白是否为SacA，重组蛋白经切胶进一步纯化后，用胰酶酶解，对其酶解的肽段进行质谱检测，见图3。酶解片段中发现10个片段与SacA蛋白序列相一致，占蛋白序列全长的21%。该蛋白Mascot score数值（Koenig T,Menze B H,Kirchner M,et al.Robust prediction of the MASCOT score for an improved quality assessment in mass spectrometric proteomics[J].J Proteome Res,2008,7(9):3708-3717.）达到96（>86即为差异显著），表明SacA在E.coli BL21（DE3）中成功表达。

实施例3β-呋喃果糖苷酶性质的测定

1、β-呋喃果糖苷酶酶活测定

β-呋喃果糖苷酶测定以蔗果三糖为底物，体系包括：50μL20mM蔗果三糖，50μL50mM PBS（pH6.0），15μL酶液(11μg/mL)，用水补足体积为200μL。混匀后37℃左右10分钟，后100℃水浴5min。产生的果糖通过果糖测定试剂盒（美国BioVision公司）进行检测。β-呋喃果糖苷酶酶活定义：在37℃，pH6.0条件下，每分钟水解蔗果三糖产生1μmol果糖定义为一个单位。并通过测定蛋白质含量计算酶的比酶活。

2、β-呋喃果糖苷酶最适pH的测定

配制不同pH的缓冲液(pH3.0–8.0，0.2M Na₂HPO₄/0.1M柠檬酸盐缓冲液；pH8.5–9.0，50mM Tris–HCl缓冲液)原pH6.0缓冲溶液替换成现在的不同pH缓冲液，酶-底物反应体系在37°C反应10min，测定各pH下的酶活，研究其最适pH。

3、β-呋喃果糖苷酶最适反应温度的测定

将酶-底物反应体系分别置于pH6.0，30℃、37℃，40℃、50℃、60℃、70℃和80℃的水浴中反应5min，测定各温度下的果糖苷酶酶活，以研究温度对酶活的影响。

5、β-呋喃果糖苷酶温度稳定性的测定

为研究酶的热稳定性，将相同体积的酶液分别在pH6.0，4℃，30℃、50℃、60℃保温2h，每隔30min取样，迅速冷却，pH6.0，37℃测定残余酶活，以未保温的酶活力为相对酶活100%，计算相对酶活力。

6、金属离子对果糖苷酶活性影响的测定

酶液首先用含有10mM EDTA的磷酸盐盐缓冲液（100mM，pH6.0）4℃下透析12h，接着再用不含EDTA的磷酸盐缓冲液（100mM，pH6.0）4℃下透析12h。处理后的酶液加入相应的金属化合物溶液（KCl、AgNO₃、HgCl₂、MgCl₂、MnCl₂、CuCl₂、CaCl₂），使金属离子终浓度至5mM，37℃保温30min，冰浴5min左右，加入底物，测定酶活。以不含目标金属离子且未经保温的酶液的果糖苷酶活力为相对酶活100%，计算相对酶活力。

7、结果分析

结果见图4，从图4可以看出，该β-呋喃果糖苷酶最适合的pH值为6.0，与其他来源的果糖苷酶相类似；其最适温度为37℃，与植物乳杆菌最适生长温度相对应；热稳定性实验表明该酶在低温下较稳定，在高温下（50℃和60℃下）其活力迅速丧失；其酶活受到Ag+、Cu²⁺and Hg²⁺的强烈抑制。这些性质与其他β-呋喃果糖苷酶的常规性质相吻合。

实施例4β-呋喃果糖苷酶的底物特异性

1、动力学常数测定

测定0.2-200mmol/L的底物浓度下果糖苷酶的催化活力，按照双倒数做图法以1/V对1/[S]作图，得到果糖苷酶分别对蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、棉子糖、菊粉、细菌果聚糖、松三糖的K_m值和V_max值，并根据SacA的理论分子量与酶液浓度计算K_cat与K_cat/K_m值。

表2SacA对不同底物的动力学参数

2、水解产物的检测

SacA分别与蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖在37℃下作用0、10、30、60分钟后，离心(16,060×g for15min)，上清用膜过滤后采用HPLC来检测。条件如下：Kromasil氨基柱(200mm ID×4.6mm,5μm)；流动相：乙腈：水=70：30；洗脱流速：1mL/min；上样体积：10μL；检测器：示差折光检测器。

3、结果分析

分别测定不同底物的米氏常数（K_m）、最大反应速度（V_max）、转化数（K_cat）和K_cat/K_m的比值，结果见表2。在表2中，每个值为三个单独测定值的平均值，分别采用5.5和2000.0kDa做为菊粉和细菌果聚糖的分子量进行相应的计算。从结果可以看出，与其他底物相比，重组SacA对于水解低聚果糖类保持高的亲和力（低Km值），表明该酶对于低聚合度的果聚糖中两个果糖残基之间的β(2-1)的糖苷键具有更佳的偏好性，而其他已报道的乳杆菌都是对于细菌果聚糖有最高的亲和力。对于Vmax来说，底物是蔗糖和蔗果三糖时，该值最大，分别是蔗果四糖、蔗果五糖、棉子糖、菊粉、细菌果聚糖的1.3、1.5、3、15和24倍。对于所有底物来说，Kcat/Km的比值最大的是蔗果三糖，表明蔗果三糖是该酶的最适底物。从表2中还可以看出，该酶具有广泛的底物特性，不仅可以水解果糖苷酶的常见底物如低聚果糖、蔗糖等，还可以水解棉子糖、菊粉和细菌果聚糖，表明该酶还具有包括外切菊粉酶，外切果聚糖酶和转化酶等多种酶活力。

SacA分别与蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖在37℃下作用0、10、30、60分钟。水解产物通过HPLC分析，结果见图5。结果显示，在反应初期当酶与蔗糖作用时，产物为果糖和葡萄糖；与蔗果三糖作用时，产物为蔗糖和果糖；与蔗果四糖作用时，产物为蔗果三糖和果糖；与蔗果五糖作用时，产物是蔗果四糖和果糖。延长反应时间，蔗果四糖与五糖与酶作用可以产生蔗果二糖和蔗糖。以上结果表明，SacA是通过外切的方式水解底物中的β(2-1)糖苷键，从底物的非还原端释放果糖残基的。这种作用方式与其他报道的果糖苷酶类似。

实施例5果糖苷酶基因于保加利亚乳杆菌ATCC11842中的表达

1、果糖苷酶基因于保加利亚乳杆菌ATCC11842中表达载体的构建

以SEQ ID No.5：5’-AGGAGCTCATCGTCATGATATGG-3’和SEQ IDNo.4：5’-CCGCTCGAGCCGCTAGCTTCGCAACATC-3’为引物，以ST-III基因组为模版，进行PCR反应。PCR反应体系为20.0μL，各反应物终浓度为：1×PCR buffer，1mmol/L的Mg²⁺，0.2mmol/L的dNTP，0.4μmol/L上下游引物（SEQ ID No.3、SEQ ID No.4），0.1U/μL的Taq DNA聚合酶和2.0ng/μL的DNA模板，用dd H₂O补足至20.0μL。PCR反应参数为：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环；72℃延伸7min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。纯化目的片段后双酶切(BsphI，XhoI)，与双酶切(NcoI，XhoI)的穿梭质粒pSIP403（Sorvig E,MathiesenG,Naterstad K,et al.High-level,inducible gene expression in Lactobacillussakei and Lactobacillus plantarum using versatile expression vectors[J].Microbiology,2005,151(Pt7):2439-49.；该质粒由挪威食品研究所赠送）于4℃过夜连接。连接产物转化至大肠杆菌DH5α（购自美国Promega公司）中，并进行PCR及测序鉴定。抽提含有正确插入片段的重组质粒pSIP403-sacA，电转化入保加利亚乳杆菌ATCC11842（购自美国ATCC），涂布于含有红霉素的MRS平板上37℃培养48h，筛选阳性克隆并进行测序鉴定。

2、目的蛋白的诱导表达及利用低聚果糖能力的测定

挑取含有正确重组质粒pSIP403-sacA的保加利亚乳杆菌单菌落于20mL含10μg/mL的红霉素的MRS培养基液体中，37℃，静置培养过夜。将过夜培养液梯度稀释涂布于含有1%的低聚果糖的改良MRS培养基上，所述的改良MRS培养基含有浓度为25ng/mL的IP-673（Eijsink V G,Brurberg M B,Middelhoven P H,et al.Induction of bacteriocin production in Lactobacillus sakeby a secreted peptide[J].J Bacteriol,1996,178(8):2232-7.，其由Invitrogen公司合成，其氨基酸序列为MAGNSSNFIHKIKQIFTHR）、10μg/mL的红霉素和30mg/L的溴甲酚紫），37℃培养48h，观察菌落状况及培养基颜色变化。

3、结果分析

结果见图6，由图6可以看出，保加利亚乳杆菌ATCC11842野生型菌株不能利用低聚果糖作为碳源生长，在以低聚果糖为唯一碳源的含有溴甲酚紫的培养基上，该菌可以生长，但生长缓慢不产酸变色；将sacA通过穿梭质粒pSIP403在保加利亚乳杆菌中重组表达后，重组菌能生长迅速，并产生大于3mm的变色圈，表明该重组菌具有优异的利用低聚果糖的能力。

Claims

1.一种分离的蛋白质，其特征在于，其

（1）氨基酸序列如序列表中SEQ.ID NO:1所示；或

2.一种分离的核酸，其特征在于，其编码氨基酸序列如序列表中SEQ.IDNO:1所示的蛋白质。

3.如权利要求2所述的核酸，其特征在于，其核苷酸序列如序列表中SEQ.ID NO:2所示。

4.一种包含如权利要求2或3所述核酸的重组表达载体。

5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体通过将如权利要求2或3所述核酸连接于质粒pET-28a(+)上构建而成。

6.一种包含如权利要求4所述重组表达载体的重组表达转化体。

7.如权利要求6所述的重组表达转化体，其特征在于，所述重组表达转化体通过将如权利要求4所述重组表达载体转化至E.coli BL21(DE3)中制备而得。

8.一种重组乳酸菌，其特征在于，其基因组中含有能表达氨基酸序列组成如序列表中SEQ.ID NO:1所示蛋白质的外源基因。

9.如权利要求8所述的重组乳酸菌，其特征在于，所述的乳酸菌为保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）ATCC11842菌株。

10.氨基酸序列如序列表中SEQ.ID NO:1所示的蛋白质作为果糖苷酶、菊粉酶或果聚糖酶的应用。