CN109415747B

CN109415747B - 一种酶改质甜菊糖的制备方法和制备用酶及应用

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Publication number: CN109415747B
Application number: CN201880001975.2A
Authority: CN
Inventors: 傅荣昭; 刘立辉; 江名; 刘玉凤; 刘文山; 陈小春
Original assignee: Bontac Bio-Engineering (shenzhen) Co ltd
Current assignee: Bontac Bio-Engineering (shenzhen) Co ltd
Priority date: 2018-05-25
Filing date: 2018-05-25
Publication date: 2022-05-03
Anticipated expiration: 2038-05-25
Also published as: CN109415747A; US20200140836A1; WO2019100676A1; US11312948B2

Abstract

本发明提供了一种酶改质甜菊糖的制备方法，包括：在溶解有甜菊糖原料和蔗糖的溶液中加入β‑果糖苷酶得到反应液，调节所述反应液的pH为5.0‑8.0，反应温度维持在20‑45℃，搅拌反应后，收集得到酶改质甜菊糖，所述甜菊糖原料包括甜菊苷和莱包迪甙A中的一种或多种，所述β‑果糖苷酶来源于嗜酸微杆菌属或日本曲霉菌属。该制备方法高效简便，成本低，耗时短，转化率高，绿色环保，可以广泛适用于工业化规模生产。本发明还提供了一种酶改质甜菊糖的制备用酶及应用。

Description

一种酶改质甜菊糖的制备方法和制备用酶及应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种酶改质甜菊糖的制备方法和制备用酶及应用。

背景技术

甜菊糖，又名甜菊糖苷，甜度为蔗糖的200-350倍，具有无毒副作用，食用安全，并且研究表明甜菊糖可用于预防高血压、糖尿病、肥胖症、心脏病和龋齿等病症，是一种可替代蔗糖非常理想的甜味剂。甜菊糖是继甘蔗、甜菜糖之外第三种有开发价值和健康推崇的天然蔗糖替代品，被国际上誉为“世界第三蔗糖”。

甜菊糖是从菊科草本植物甜叶菊的叶子中提取出来的一类含多种成分的双萜糖苷的混合物。其中甜菊苷(Stevioside，St)、莱包迪甙A(Rebaudioside A，RA)和莱包迪甙C(Rebaudioside C，RC)的含量较高，共占90％以上。天然甜菊糖由于其本身的结构苷元甜菊醇无甜味且具有苦涩味，会带来不愉快的后味，严重影响了甜菊糖的味质，限制了其更为广泛的工业应用。因此，改善甜菊糖的甜味特征具有重要意义。

目前，有报道利用酶法或发酵法在甜菊糖组分中引入一些新的糖分子，得到的衍生物(或称酶改质甜菊糖)的甜味特性有较大的改善，并减弱后苦涩味。然而这些生产方法大多能耗高，耗时长，纯度与产率均偏低。因此，有必要发展一种工艺简单、耗时短、成本低、产率高且绿色环保的酶改质甜菊糖的制备方法。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种酶改质甜菊糖的制备方法和制备用酶及应用；本发明所述制备方法工艺简单、耗时短、产量高和绿色安全。

第一方面，本发明提供了一种酶改质甜菊糖的制备方法，包括：

在溶解有甜菊糖原料和蔗糖(Sucrose)的溶液中加入β-果糖苷酶(FFase)得到反应液，调节所述反应液的pH为5.0-8.0，反应温度维持在20-45℃，搅拌反应后，收集得到酶改质甜菊糖，所述甜菊糖原料包括甜菊苷和莱包迪甙A中的一种或多种，所述β-果糖苷酶来源于嗜酸微杆菌属(Microbacterium saccharophilum)或日本曲霉菌属(Aspergillusjaponicus)。

本发明中，所述甜菊苷(St)，或称甜菊甙，分子式为C₃₈H₆₀O₁₈，化学结构如式Ⅰ所示。所述莱包迪甙A(RA)，或称甜菊A苷，分子式为C₄₄H₇₀O₂₃，化学结构如式Ⅱ所示：

所述酶改质甜菊糖的制备方法的具体工艺路线如式(1)所示：

其中，所述工艺采用生物酶法，所述甜菊糖原料的化学结构通式如式Ⅲ所示，所述酶改质甜菊糖的化学结构通式如式Ⅳ所示，其中R基包括二糖基和三糖基。所述二糖基可为β-glc-β-glc-；所述三糖基课可以为(β-glc)₂-β-glc-；所述glc为葡萄糖(Glucose)。所述蔗糖(Sucrose)经β-果糖苷酶(FFase)催化作用下分解得到葡萄糖(Glucose)和果糖(Fructose，F)，其中果糖(Fructose，F)分子在β-果糖苷酶催化作用下以β-2,6糖苷键连接至19-O-β-葡萄糖基的6-OH上。

本发明中，所述甜菊糖原料为甜菊苷(St)时，所述酶改质甜菊糖的制备方法的具体工艺路线如式(2)所示：

其中，果糖(F)分子在β-果糖苷酶催化作用下以β-2,6糖苷键连接至甜菊苷的19-O-β-葡萄糖基的6-OH上，得到甜菊苷衍生物(St-F)如式Ⅴ所示。所述反应过程中还包括所述β-果糖苷酶催化蔗糖水解并得到葡萄糖。

本发明中，所述甜菊糖原料为莱包迪甙A(RA)时，所述酶改质甜菊糖的制备方法的具体工艺路线如式(3)所示：

其中，果糖(F)分子在β-果糖苷酶催化作用下以β-2,6糖苷键连接至莱包迪甙A的19-O-β-葡萄糖基的6-OH上，得到莱包迪甙A衍生物(RA-F)如式Ⅵ所示。所述反应过程中还包括所述β-果糖苷酶催化蔗糖水解并得到葡萄糖。可选地，所述酶改质甜菊糖包括酶改质的甜菊苷和酶改质莱包迪甙A中的一种或多种。具体地，所述酶改质甜菊糖包括所述甜菊苷衍生物(St-F)和所述莱包迪甙A衍生物(RA-F)中的一种或多种。

由于甜菊苷的19位连接的糖基与苦味密切相关，而甜菊苷13-糖基与甜味相关。本发明所述的制备方法通过所述β-果糖苷酶可以快捷、有效地改性甜菊糖原料，以改善甜菊糖的后苦味。通过所述酶改质甜菊糖的制备方法在甜菊糖原料(如St或RA)的19-O-β-葡萄糖基的6-OH上引入果糖基，得到酶改质甜菊糖(如St-F或RA-F)的甜味特性有较大改善。

可选地，所述β-果糖苷酶包括第一β-果糖苷酶或第二β-果糖苷酶，所述第一β-果糖苷酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述第二β-果糖苷酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

可选地，所述β-果糖苷酶通过微生物表达生成，所述微生物包括大肠杆菌、毕赤酵母和枯草芽孢杆菌中的一种或多种。进一步地，可选地，所述β-果糖苷酶通过大肠杆菌表达生成。所述β-果糖苷酶在所述大肠杆菌表达生成的体系中均属于异源表达。本发明优选地大肠杆菌表达系统，简单可行，培养周期短，发酵成本低，酶产量高。本发明所述β-果糖苷酶可以以冻干粉形式或粗酶液形式添加至反应体系中。

可选地，本发明所述制备方法中，调节所述反应液的pH为5.0-8.0。进一步可选地，所述反应液的pH为7.0-8.0。优选地，所述反应液的pH为7.2-8.0。本发明所述反应液的pH可偏碱性，有助于提升所述β-果糖苷酶反应活性，提高所述酶改质甜菊糖的产率，缩短反应时间。

可选地，所述反应液的反应温度维持在20-45℃。进一步地，可选地，所述反应液的反应温度维持在20-30℃。优选地，所述反应液的反应温度维持在20-28℃。例如，所述反应液的反应温度维持在20℃，或为25℃，或为28℃，或为35℃。

可选地，所述搅拌反应的反应时间为2-5小时。进一步可选地，所述搅拌反应的反应时间为2-4小时。本发明所述制备方法耗时短，所述反应时间为优选反应时间，当增加反应时间时，所述制备方法的得到的产品的转化率会降低。

可选地，所述搅拌反应的搅拌速率为200-300rpm。

可选地，所述收集得到酶改质甜菊糖的过程包括：对所述反应液加热以使所述β-果糖苷酶变性，过滤并收集滤液，将所述滤液纯化处理后得到酶改质甜菊糖，其中，所述加热的温度为85-100℃，时间为0.3-1小时。可选地，所述加热的温度还可以为90-100℃，时间为0.5-1小时。

可选地，所述甜菊糖原料在所述反应液中的质量分数为1％-20％。进一步地，可选地，所述甜菊糖原料在所述反应液中的质量分数为10％-20％。例如，所述甜菊糖原料在所述反应液中的质量分数为10％，或为12％，或为15％，或为20％。

可选地，所述甜菊糖原料与所述β-果糖苷酶的质量比为1：(0.1-2)。进一步地，可选地，所述甜菊糖原料与所述β-果糖苷酶的质量比为1：(0.5-2)。

可选地，所述甜菊糖原料与所述蔗糖的质量比为1:(1-10)。进一步地，可选地，所述甜菊糖原料与所述蔗糖的质量比为1:(2-5)。

可选地，，所述反应液中还包括缓冲液，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液和Tris-HCl缓冲液中的任意一种或多种。可选地，所述缓冲液还包括其他种类缓冲液。具体地，所述缓冲液包括磷酸钠缓冲液。可选地，所述缓冲液的浓度为10-1000mmol/L。进一步可选地，所述缓冲液的浓度为10-1000mmol/L。优选地，所述缓冲液的浓度为100-500mmol/L。例如，所述缓冲液的浓度为100mmol/L，或为200mmol/L，或为500mmol/L。

由于不同微生物种属来源的β-果糖苷酶的酶学性质存在差异，包括酶的比活性、酶作用的底物范围、最适pH、最适温度、作用时间和酶的稳定性等方面。本发明所述β-果糖苷酶包括第一β-果糖苷酶或第二β-果糖苷酶；其中，第一β-果糖苷酶来源于嗜酸微杆菌属，第二β-果糖苷酶来源于日本曲霉菌属。本发明所述β-果糖苷酶既具有水解酶性质，可以将蔗糖中的果糖分子水解下来，有具有逆向催化功能，能够将果糖分子加合上所述甜菊苷和莱包迪甙A的19-O-β-葡萄糖基的6-OH上。

本发明第一方面所提供的酶改质甜菊糖的制备方法，所述制备方法工艺简单，成本低廉，耗时短，绿色环保；由所述制备方法制得的酶改质甜菊糖具有极高的产率。在底物(甜菊糖原料)和酶的投料比相同的情况下，现有技术仅支持底物浓度在千分之几的酶催化反应进行，一般转化率仅为40-50％，且仅在底物浓度接近最低值时，转化率才能达到60％左右，或者通过补加原料用于提高转化率；而本发明所述的制备方法可支持较高的底物浓度(如5％-20％)下，转化率可接近90％左右；因此，本发明所述的制备成本低，适于工业化生产。

第二方面，本发明还提供了一种酶改质甜菊糖的制备用酶，其中，所述制备用酶包括β-果糖苷酶，所述β-果糖苷酶包括第一β-果糖苷酶或第二β-果糖苷酶，所述第一β-果糖苷酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述第二β-果糖苷酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；所述第一β-果糖苷酶来源于嗜酸微杆菌属，所述第二β-果糖苷酶来源于日本曲霉菌属。

可选地，所述第一β-果糖苷酶的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。所述第二β-果糖苷酶的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

其中，所述如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的基因编码序列如SEQ ID NO：1所示；可选的，所述第一β-果糖苷酶的氨基酸序列的基因编码序列应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:1具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:3。同样的，对于所述第二β-果糖苷酶，所述如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的编码基因同样应该考虑简并碱基。

可选地，所述β-果糖苷酶通过构建重组质粒在微生物中表达，所述重组质粒的载体质粒为pET28a(+)载体质粒。将所述第一β-果糖苷酶和/或第二所述β-果糖苷酶的基因编码序列插入至所述pET28a(+)载体质粒中得到重组质粒，所述重组质粒可以高效、高产的在微生物细胞中的异源表达得到所述第一β-果糖苷酶和/或所述第二β-果糖苷酶。

可选地，所述第一β-果糖苷酶和/或第二所述β-果糖苷酶的基因编码序列上增设His标签(组氨酸标签)的核苷酸序列，能使表达后的蛋白带上His标签，His标签有利于表达后蛋白的分离纯化，及在实验中的分析和追踪，比如用于免疫印迹实验时的分析。

本发明第二方面提供的酶改质甜菊糖的制备用酶—β-果糖苷酶，具有很好的生物活性，纯度高，可广泛应用于食品甜味剂制备、生物制药等领域。相比于传统其他发酵体系，本发明优选的β-果糖苷酶具有更高的产率，耗时短，具有更强的生物活性及特异性。

本发明第三方面提供了β-果糖苷酶以及含有所述β-果糖苷酶基因的微生物菌株在生物催化中的应用，其中，所述β-果糖苷酶由来源于嗜酸微杆菌属或日本曲霉菌属的β-果糖苷酶基因编码，所述β-果糖苷酶催化式Ⅲ所示的化合物转化成式Ⅳ所示的化合物，

R基是β-glc-β-glc-、(β-glc)₂-β-glc-、(β-glc，α-rha-)-β-glc-、α-rha-β-glc-、β-glc-、(β-glc，β-xyl)-β-glc-或H。其中，所述glc为葡萄糖(Glucose)，所述rha为鼠李糖(Rhamnose)，所述xyl为木糖(Xylose)。本发明所述β-果糖苷酶催化所述式Ⅲ所示的化合物转化成所述式Ⅳ所示的化合物的过程中还包括：催化水解蔗糖转化得到葡萄糖。

其中，当所述R基为β-glc-β-glc-时，所述式Ⅲ所示的化合物为甜菊苷(Stevioside)；当所述R基为(β-glc)₂-β-glc-时，所述式Ⅲ所示的化合物为莱包迪甙A(Rebaudioside A)；当所述R基为(β-glc，α-rha-)-β-glc-时，所述式Ⅲ所示的化合物为莱包迪甙C(Rebaudioside C)；当所述R基为α-rha-β-glc-时，所述式Ⅲ所示的化合物为杜克甙A(Dulcoside A)；所述R基为β-glc-时，所述式Ⅲ所示的化合物为甜茶苷(Rubusoside)；当所述R基为(β-glc，β-xyl)-β-glc-时，所述式Ⅲ所示的化合物为莱包迪甙F(Rebaudioside F)。具体地，所述β-果糖苷酶可以将果糖基以β-2,6糖苷键连接至所述式Ⅲ所示的化合物的19-O-β-葡萄糖基的6-OH上得到所述式Ⅳ所示的化合物。例如，所述β-果糖苷酶可以将果糖基以β-2,6糖苷键连接至所述甜菊苷的19-O-β-葡萄糖基的6-OH上得到甜菊苷衍生物；或将果糖基以β-2,6糖苷键连接至所述甜菊苷的19-O-β-葡萄糖基的6-OH上得到莱包迪甙A衍生物等。

可选地，所述β-果糖苷酶具有如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。所述β-果糖苷酶基因编码序列包括如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。本发明还提供了一种重组质粒，所述重组质粒包括第一β-果糖苷酶或第二β-果糖苷酶的基因编码序列，其中，所述第一β-果糖苷酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述第二β-果糖苷酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

可选地，所述第一β-果糖苷酶或所述第二β-果糖苷酶的基因编码序列插入到pET28a(+)载体质粒的BamH I和Hind III酶切位点之间。所述第一β-果糖苷酶或所述第二β-果糖苷酶的基因编码序列插入到pET28a(+)载体质粒时，所述第一β-果糖苷酶或所述第二β-果糖苷酶的基因编码序列的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pET28a(+)载体质粒中BamHⅠ酶切位点相连，3’端可加入终止密码子(如TAA)与pET28a(+)载体质粒中Hind III酶切位点相连。

本发明还提供了一种重组质粒的制备方法，包括：

(1)提供上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物的碱基序列分别如SEQID NO:5-SEQ ID NO:8所示；

(2)提供或制备第一β-果糖苷酶或第二β-果糖苷酶基因模板，并以步骤(1)所述上游引物和所述下游引物为PCR引物，扩增所述第一β-果糖苷酶或所述第二β-果糖苷酶基因片段；

(3)取pET28a(+)载体质粒，将步骤(2)扩增得到的所述第一β-果糖苷酶或所述第二β-果糖苷酶基因片段和所述pET28a(+)载体质粒利用相同的内切酶分别进行双酶切反应，纯化回收后进行连接，得到所述重组质粒。

可选地，所述步骤(3)中，所示双酶切反应的酶切位点可以为BamH I和Hind III内切酶。

本发明的有益效果包括以下几个方面：

1、本发明所述的制备方法采用生物酶法，操作简便，耗时短、转化率高和绿色安全，可以广泛适用于工业化规模生产；

2、本发明所述的制备方法，底物终浓度可高到达1％-20％，远远高于传统工艺底物终浓度；

3、由本发明所述的制备方法制备的酶改质甜菊糖，性质稳定，甜度高，后苦涩味极大改善，热值低，可广泛应用在食品工业及制药领域；

4、本发明所述制备用酶—β-果糖苷酶的生物活力好，特异性强。

附图说明

图1为本发明一实施例提供的pET28a-FFase01重组质粒的质粒图谱；

图2为本发明一实施例提供的pET28a-FFase02重组质粒的质粒图谱；

图3为本发明一实施例提供的RA-F的质谱图；

图4为本发明一实施例提供的St-F的质谱图。

具体实施方式

以下所述是本发明实施例的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。

若无特别说明，本发明实施例所采用的原料及其它化学试剂皆为市售商品。

(1)构建pET28a-FFase01、pET28a-FFase02重组质粒

a)提供上游引物和下游引物，并通过实验得到的β-果糖苷酶的基因编码序列。其中，所述β-果糖苷酶(FFase)包括第一β-果糖苷酶(FFase01)或第二β-果糖苷酶(FFase02)。所述第一β-果糖苷酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述第一β-果糖苷酶来源于嗜酸微杆菌属；所述第二β-果糖苷酶的基因编码序列包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，所述第二β-果糖苷酶来源于日本曲霉菌属。所述第一β-果糖苷酶对应的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:5所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO:6所示。所述第二β-果糖苷酶对应的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:7所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO:8所示。

b)将所述FFase01或FFase02的基因编码序列插入到pET28a(+)载体质粒的BamH I和Hind III酶切位点之间。所述FFase01或FFase02的基因编码序列插入到pET28a(+)载体质粒时，所述FFase01或FFase02的基因编码序列的5’端添加起始密码子(如ATG)与pET28a(+)载体质粒中BamHⅠ酶切位点相连，3’端还添加有终止密码子(如TAA)与pET28a(+)载体质粒中Hind III酶切位点相连。然后转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定。经过PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合目的片段大小和序列，成功构建pET28a-FFase01或pET28a-FFase02重组质粒。如图1和图2分别是所示为pET28a-FFase01或pET28a-FFase02重组质粒图谱。

(2)表达β-果糖苷酶FFase01或FFase02

将构建的重组质粒pET28a-FFase01和pET28a-FFase02中的一种或多种转入大肠杆菌BL21(DE3)中，并以1％的接种量接种至含有4mL的LB培养基中，维持恒定的37℃，200rpm的摇晃速率，过夜培养后，将菌液以1％的接种量转接到含有1L的LB培养基(50μg/mL卡那霉素)的2L三角瓶中，继续37℃恒温培养至培养基中的OD600值达到0.6左右，加入终浓度为度0.1mM-1mM的诱导剂IPTG，在20-37℃条件培养12-16小时后离心收集菌体。将菌体用50mM磷酸缓冲液(pH＝7.4)进行重悬并经超声破碎和离心，收集上清液得到含有FFase01或FFase02的粗酶液。

将表达获得的含有FFase01或FFase02的粗酶液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定。本实施方式表达获得的粗酶液中，所述FFase01和FFase02的分子大小均与相应蛋白的理论计算值相近，其中，FFase01的理论分子量为64kDa，FFase02的理论分子量为70kDa。此外，对收集得到的粗酶液可进行进一步纯化，可制得FFase01或FFase02的冻干粉。

(3)FFase01或FFase02催化活性比较

按上述步骤(1)及步骤(2)的操作过程，获取其他来源的β-果糖苷酶FFase03-FFase05；其中，β-果糖苷酶FFase03来源于许旺氏酵母(Schwanniomyces occidentalis)，β-果糖苷酶FFase04来源于卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)，β-果糖苷酶FFase05来源于菊苣(Cichorium intybus)。设计反应体系：在1mL的磷酸钠缓冲液中，分别加入甜菊苷或莱包迪甙A 5mg，加入蔗糖20mg，搅拌至完全溶解；继续加入上述FFase01-FFase05中的任意一种β-果糖苷酶的粗酶液200μL(50mg)，调节pH至7.4；在20℃、200rpm搅拌速率下反应5h，收集得到酶改质甜菊糖，并评估每种β-果糖苷酶的酶活情况，见下表所示：

实施例1

一种酶改质甜菊糖的制备方法，包括：

在500mL的磷酸钠缓冲液中，分别加入莱包迪甙A 50g和蔗糖100g，搅拌至完全溶解；继续加入10g FFase01冻干酶粉，调节pH至7.4；在35℃、250rpm搅拌速率下反应2h，反应完成后将反应液加热至100℃热处理0.5h，使FFase01蛋白变性并过滤除去蛋白，收集滤液后进行喷雾干燥得到酶改质甜菊糖粗品，将所述酶改质甜菊糖粗品经硅胶树脂分离、结晶等后处理纯化后得到酶改质甜菊糖RA-F 51.73g，纯度＞95％。本实施例中，每隔一定时间取反应液进行质谱分析；图3是实验过程中检测的酶改质甜菊糖RA-F的质谱图，并根据液相色谱对反应液进行测定的数据计算得到转化率为91.5％。

实施例2

一种酶改质甜菊糖的制备方法，包括：

在500mL的磷酸钠缓冲液中，分别加入甜菊苷50g和蔗糖100g，搅拌至完全溶解；继续加入10g FFase01冻干酶粉，调节pH至7.4；在35℃、250rpm搅拌速率下反应2h，反应完成后将反应液加热至100℃热处理0.5h，使FFase01蛋白变性并过滤除去蛋白，收集滤液后进行喷雾干燥得到酶改质甜菊糖粗品，将所述酶改质甜菊糖粗品经硅胶树脂分离、结晶等后处理纯化后得到酶改质甜菊糖St-F51.85g，纯度＞95％。本实施例中，每隔一定时间取反应液进行质谱分析；图4是实验过程中检测的酶改质甜菊糖St-F的质谱图，并根据液相色谱对反应液进行测定的数据计算得到转化率为92.0％。

实施例3

一种酶改质甜菊糖的制备方法，包括：

在500mL的磷酸钠缓冲液中，分别加入甜菊苷50g和蔗糖100g，搅拌至完全溶解；继续加入10g FFase02冻干酶粉，调节pH至7.4；在28℃、250rpm搅拌速率下反应2h，反应完成后将反应液加热至100℃热处理0.5h，使FFase02蛋白变性并过滤除去蛋白，收集滤液后进行喷雾干燥得到酶改质甜菊糖粗品，将所述酶改质甜菊糖粗品经硅胶树脂分离、结晶等后处理纯化后得到酶改质甜菊糖St-F52.64g，纯度＞95％；实验测得转化率为92.4％。

实施例4

一种酶改质甜菊糖的制备方法，包括：

在500mL的磷酸钠缓冲液中，分别加入甜菊苷50g和蔗糖200g，搅拌至完全溶解；继续加入5g FFase02冻干酶粉，调节pH至7.4；在28℃、250rpm搅拌速率下反应2h，反应完成后将反应液加热至100℃热处理0.5h，使FFase02蛋白变性并过滤除去蛋白，收集滤液后进行喷雾干燥得到酶改质甜菊糖粗品，将所述酶改质甜菊糖粗品经硅胶树脂分离、结晶等后处理纯化后得到酶改质甜菊糖St-F53.27g，纯度＞95％；实验测得转化率为93.5％。

实施例5

一种酶改质甜菊糖的制备方法，包括：

在500mL的磷酸钠缓冲液中，分别加入甜菊苷50g和蔗糖100g，搅拌至完全溶解；继续加入5g FFase02冻干酶粉，调节pH至8.0；在28℃、250rpm搅拌速率下反应2h，反应完成后将反应液加热至100℃热处理0.5h，使FFase02蛋白变性并过滤除去蛋白，收集滤液后进行喷雾干燥得到酶改质甜菊糖粗品，将所述酶改质甜菊糖粗品经硅胶树脂分离、结晶等后处理纯化后得到酶改质甜菊糖St-F51.98g，纯度＞95％；实验测得转化率为91.3％。

实施例6

一种酶改质甜菊糖的制备方法，包括：

在500mL的磷酸钠缓冲液中，分别加入甜菊苷50g和蔗糖100g，搅拌至完全溶解；继续加入5g FFase02冻干酶粉，调节pH至7.4；在28℃、250rpm搅拌速率下反应4h，反应完成后将反应液加热至100℃热处理0.5h，使FFase02蛋白变性并过滤除去蛋白，收集滤液后进行喷雾干燥得到酶改质甜菊糖粗品，将所述酶改质甜菊糖粗品经硅胶树脂分离、结晶等后处理纯化后得到酶改质甜菊糖St-F52.72g，纯度＞95％；实验测得转化率为92.6％。

实施例7

一种酶改质甜菊糖的制备方法，包括：

在500mL的磷酸钠缓冲液中，分别加入甜菊苷50g和蔗糖100g，搅拌至完全溶解；继续加入5g FFase02冻干酶粉，调节pH至8.0；在20℃、250rpm搅拌速率下反应4h，反应完成后将反应液加热至100℃热处理0.5h，使FFase02蛋白变性并过滤除去蛋白，收集滤液后进行喷雾干燥得到酶改质甜菊糖粗品，将所述酶改质甜菊糖粗品经硅胶树脂分离、结晶等后处理纯化后得到酶改质甜菊糖St-F52.39g，纯度＞95％；实验测得转化率为92.1％。

实施例8

一种酶改质甜菊糖的制备方法，包括：

在500mL的磷酸钠缓冲液中，分别加入甜菊苷100g和蔗糖200g，搅拌至完全溶解；继续加入20g FFase02冻干酶粉，调节pH至7.4；在28℃、250rpm搅拌速率下反应2h，反应完成后将反应液加热至100℃热处理0.5h，使FFase02蛋白变性并过滤除去蛋白，收集滤液后进行喷雾干燥得到酶改质甜菊糖粗品，将所述酶改质甜菊糖粗品经硅胶树脂分离、结晶等后处理纯化后得到酶改质甜菊糖St-F107.21g，纯度＞95％；实验测得转化率为91.3％。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 邦泰生物工程（深圳）有限公司

江西邦泰绿色生物合成生态产业园发展有限公司

<120> 一种酶改质甜菊糖的制备方法和制备用酶及应用

<150> PCT/CN2018/088358

<151> 2018-05-25

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1731

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acccatagca cccgcggccg cgtgcgccgc gtgctggcgg gcggcctggc gaccagcacc 60

ctggcggcgg cggtgctgat tgcgggcgcg gcgccggcga ccgcgcagag cggcctgcag 120

gatggcccgg aaccgaccat tcatacccag caggcgtatg cgccggaaga tgattttacc 180

gcgaaatgga cccgcgcgga tgcgcgccag ctgcagcgca tgagcgatcc gaccgcgccg 240

agccgcgaaa acagcatgcc ggcgagcgtg accatgccga ccgtgccgca ggattttccg 300

gatatgagca acgaacaggt gtgggtgtgg gatacctggc cgctgaccga tgaagatgcg 360

aaccagtata gcgtgaacgg ctgggaaatt atttttagcc tggtggcgga tcgcaacctg 420

ggctttgatg atcgccatgt gtttgcgaaa attggctatt tttatcgccc ggcgggcgtg 480

ccggcggcgg aacgcccgga aaacggcggc tggacctatg gcggcctggt gtttaaagaa 540

ggcgtgaccg gccagatttt tgaagatcag agctttagcc atcagaccca gtggagcggc 600

agcgcgcgcg tgagcaaaaa cggcgaaatt aaactgtttt ttaccgatgt ggcgttttat 660

cgcaacagcg atggcaccaa cattaaaccg tatgatccgc gcattgcgct gagcgtgggc 720

aaagtgaaag cgaacaaaaa aggcgtgacc ctgaccggct ttaacaaagt gaccgatctg 780

ctgcaggcgg atggcaccta ttatcagacc ggcgcgcaga acgaattttt taactttcgc 840

gatccgttta cctttgaaga tccggcgcat ccgggcgaaa cctttatggt gtttgaaggc 900

aacagcgcga tgcagcgcga aaccgcgacc tgcaacgaag cggatctggg ctatcgccag 960

ggcgatccgt atgcggaaac cgtggatgat gtgaacgcga gcggcgcgac ctatcagatt 1020

ggcaacgtgg gcctggcgaa agcgaaaaac aaacagctga ccgaatggga atttctgccg 1080

ccgattctga gcgcgaactg cgtgaccgat cagaccgaac gcccgcagat ttattttaaa 1140

gatggcaaaa gctatctgtt taccattagc catcgcggca cctttgcggc gggcctggat 1200

ggcccggaag gcgtgtatgg ctttgtgggc gatggcattc gcagcgatta tcagccgctg 1260

aacggcggca gcggcctggc gctgggcaac ccgaccaacc tgaactttct gggcggccag 1320

ccgtttgcgc cggattttaa ccagcatccg ggccattttc aggcgtatag ccattatgtg 1380

atgccgggcg gcctggtgca gagctttatt gataccattg gcacccatga tgattttgtg 1440

cgcggcggca ccctggcgcc gaccgtgaaa atggatattg gcgtgggcgg cgatccgacc 1500

aaaaccgcgg tggattatag ctatggcagc gaaggcctgg gcggctgggc ggatattccg 1560

gcgaacaaac atctgtttac caacggcaaa tttggcgtgg cggtgagcga tgaagcggcg 1620

cagaaaattc gcaaaattct gggcagcaaa tttgatgatt atctggatgg caaaccggtg 1680

agcgcgaccg tgcgcgcgct gattgaaaaa ctgctggcgc agtatggcgg c 1731

<210> 2

<211> 1911

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaactgacca ccaccaccct ggcgctggcg accggcgcgg cggcggcgga agcgagctat 60

catctggata ccaccgcgcc gccgccgacc aacctgagca ccctgccgaa caacaccctg 120

tttcatgtgt ggcgcccgcg cgcgcatatt ctgccggcgg aaggccagat tggcgatccg 180

tgcgcgcatt ataccgatcc gagcaccggc ctgtttcatg tgggctttct gcatgatggc 240

gatggcattg cgggcgcgac caccgcgaac ctggcgacct ataccgatac cagcgataac 300

tttctgattc agccgggcgg caaaaacgat ccggtggcgg tgtttgatgg cgcggtgatt 360

ccggtgggcg tgaacaacac cccgaccctg ctgtatacca gcgtgagctt tctgccgatt 420

tggagcattc cgtatacccg cggcagcgaa acccagagcc tggcggtggc gcgcgatggc 480

ggccgccgct ttgataaact ggatcagggc ccggtgattg cggatcatcc gtttgcggtg 540

gatgtgaccg cgtttcgcga tccgtttgtg tttcgcagcg cgaaactgga tgtgctgctg 600

gatgaagaag tggcgcgcaa cgaaaccgcg gtgcagcagg cggtggatgg ctggaccgaa 660

aaaaacgcgc cgtggtatgt ggcggtgagc ggcggcgtgc atggcgtggg cccggcgcag 720

tttctgtatc gccagaacgg cggcaacgcg agcgaatttc agtattggga atatctgggc 780

gaatggtggc aggaagcgac caacagcagc tggggcgatg aaggcacctg ggcgggccgc 840

tggggcttta actttgaaac cggcaacgtg ctgtttctga ccgaagaagg ccatgatccg 900

cagaccggcg aagtgtttgt gaccctgggc accgaaggca gcggcctgcc gccgcaggtg 960

agcagcattc atgatatgct gtgggcggcg ggcgaagtgg gcgtgggcag cgaacaggaa 1020

aaagtggaat ttagcccgag catggcgggc tttctggatt ggggctttag cgcgtatgcg 1080

gcggcgggca aagtgctgcc ggcgagcagc gcggtgagca aaaccagcgg cgtggaagtg 1140

gatcgctatg tgagctttgt gtggctgacc ggcgatcagt atgaacaggc ggatggcttt 1200

ccgaccgcgc agcagggctg gggcagcctg ctgctgccgc gcgaactgaa aaccgtggaa 1260

aacgtggtgg ataacgaact ggtgcgcgaa gaaggcgtga gctgggtggt gggcgaaagc 1320

gataaccaga ccgcgcgcct gcgcaccctg ggcattacca ttgcgcgcga aaccaaagcg 1380

gcgctgctgg cgaacggcag cgtgaccgcg gaagaagatc gcaccctgca gaccgcggcg 1440

gtggtgccgt ttgcgcagag cccgagcagc aaattttttg tgctgaccgc gcagctggat 1500

gcgagcgcgc gcagcagccc gctgcagagc ggctttgaaa ttctggcgag cgaactggaa 1560

cgcaccgcga tttattatca gtttagcaac gaaagcctgg tggtggatcg cagccagacc 1620

agcgcggcgg cgccgaccaa cccggatagc tttaccgaaa gcggcaaact gcgcctgttt 1680

gatgtgattg aaaacggcca ggaacaggtg gaaaccctgg atctgaccgt ggtggtggat 1740

aacgcggtgg tggaagtgta tgcgaacggc cgctttgcgc tgagcacctg ggcgcgcagc 1800

tggtatgata acagcaccca gattcgcttt tttcataacg gcgaaggcga agtgcagttt 1860

cgcaacgtga gcgtgagcga aggcctgtat aacgcgtggc cggaacgcaa c 1911

<210> 3

<211> 577

<212> PRT

<213> 嗜酸微杆菌属(Microbacterium saccharophilum)

<400> 3

Thr His Ser Thr Arg Gly Arg Val Arg Arg Val Leu Ala Gly Gly Leu

1 5 10 15

Ala Thr Ser Thr Leu Ala Ala Ala Val Leu Ile Ala Gly Ala Ala Pro

20 25 30

Ala Thr Ala Gln Ser Gly Leu Gln Asp Gly Pro Glu Pro Thr Ile His

35 40 45

Thr Gln Gln Ala Tyr Ala Pro Glu Asp Asp Phe Thr Ala Lys Trp Thr

50 55 60

Arg Ala Asp Ala Arg Gln Leu Gln Arg Met Ser Asp Pro Thr Ala Pro

65 70 75 80

Ser Arg Glu Asn Ser Met Pro Ala Ser Val Thr Met Pro Thr Val Pro

85 90 95

Gln Asp Phe Pro Asp Met Ser Asn Glu Gln Val Trp Val Trp Asp Thr

100 105 110

Trp Pro Leu Thr Asp Glu Asp Ala Asn Gln Tyr Ser Val Asn Gly Trp

115 120 125

Glu Ile Ile Phe Ser Leu Val Ala Asp Arg Asn Leu Gly Phe Asp Asp

130 135 140

Arg His Val Phe Ala Lys Ile Gly Tyr Phe Tyr Arg Pro Ala Gly Val

145 150 155 160

Pro Ala Ala Glu Arg Pro Glu Asn Gly Gly Trp Thr Tyr Gly Gly Leu

165 170 175

Val Phe Lys Glu Gly Val Thr Gly Gln Ile Phe Glu Asp Gln Ser Phe

180 185 190

Ser His Gln Thr Gln Trp Ser Gly Ser Ala Arg Val Ser Lys Asn Gly

195 200 205

Glu Ile Lys Leu Phe Phe Thr Asp Val Ala Phe Tyr Arg Asn Ser Asp

210 215 220

Gly Thr Asn Ile Lys Pro Tyr Asp Pro Arg Ile Ala Leu Ser Val Gly

225 230 235 240

Lys Val Lys Ala Asn Lys Lys Gly Val Thr Leu Thr Gly Phe Asn Lys

245 250 255

Val Thr Asp Leu Leu Gln Ala Asp Gly Thr Tyr Tyr Gln Thr Gly Ala

260 265 270

Gln Asn Glu Phe Phe Asn Phe Arg Asp Pro Phe Thr Phe Glu Asp Pro

275 280 285

Ala His Pro Gly Glu Thr Phe Met Val Phe Glu Gly Asn Ser Ala Met

290 295 300

Gln Arg Glu Thr Ala Thr Cys Asn Glu Ala Asp Leu Gly Tyr Arg Gln

305 310 315 320

Gly Asp Pro Tyr Ala Glu Thr Val Asp Asp Val Asn Ala Ser Gly Ala

325 330 335

Thr Tyr Gln Ile Gly Asn Val Gly Leu Ala Lys Ala Lys Asn Lys Gln

340 345 350

Leu Thr Glu Trp Glu Phe Leu Pro Pro Ile Leu Ser Ala Asn Cys Val

355 360 365

Thr Asp Gln Thr Glu Arg Pro Gln Ile Tyr Phe Lys Asp Gly Lys Ser

370 375 380

Tyr Leu Phe Thr Ile Ser His Arg Gly Thr Phe Ala Ala Gly Leu Asp

385 390 395 400

Gly Pro Glu Gly Val Tyr Gly Phe Val Gly Asp Gly Ile Arg Ser Asp

405 410 415

Tyr Gln Pro Leu Asn Gly Gly Ser Gly Leu Ala Leu Gly Asn Pro Thr

420 425 430

Asn Leu Asn Phe Leu Gly Gly Gln Pro Phe Ala Pro Asp Phe Asn Gln

435 440 445

His Pro Gly His Phe Gln Ala Tyr Ser His Tyr Val Met Pro Gly Gly

450 455 460

Leu Val Gln Ser Phe Ile Asp Thr Ile Gly Thr His Asp Asp Phe Val

465 470 475 480

Arg Gly Gly Thr Leu Ala Pro Thr Val Lys Met Asp Ile Gly Val Gly

485 490 495

Gly Asp Pro Thr Lys Thr Ala Val Asp Tyr Ser Tyr Gly Ser Glu Gly

500 505 510

Leu Gly Gly Trp Ala Asp Ile Pro Ala Asn Lys His Leu Phe Thr Asn

515 520 525

Gly Lys Phe Gly Val Ala Val Ser Asp Glu Ala Ala Gln Lys Ile Arg

530 535 540

Lys Ile Leu Gly Ser Lys Phe Asp Asp Tyr Leu Asp Gly Lys Pro Val

545 550 555 560

Ser Ala Thr Val Arg Ala Leu Ile Glu Lys Leu Leu Ala Gln Tyr Gly

565 570 575

Gly

<210> 4

<211> 637

<212> PRT

<213> 日本曲霉菌属(Aspergillus japonicus)

<400> 4

Lys Leu Thr Thr Thr Thr Leu Ala Leu Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala

1 5 10 15

Glu Ala Ser Tyr His Leu Asp Thr Thr Ala Pro Pro Pro Thr Asn Leu

20 25 30

Ser Thr Leu Pro Asn Asn Thr Leu Phe His Val Trp Arg Pro Arg Ala

35 40 45

His Ile Leu Pro Ala Glu Gly Gln Ile Gly Asp Pro Cys Ala His Tyr

50 55 60

Thr Asp Pro Ser Thr Gly Leu Phe His Val Gly Phe Leu His Asp Gly

65 70 75 80

Asp Gly Ile Ala Gly Ala Thr Thr Ala Asn Leu Ala Thr Tyr Thr Asp

85 90 95

Thr Ser Asp Asn Phe Leu Ile Gln Pro Gly Gly Lys Asn Asp Pro Val

100 105 110

Ala Val Phe Asp Gly Ala Val Ile Pro Val Gly Val Asn Asn Thr Pro

115 120 125

Thr Leu Leu Tyr Thr Ser Val Ser Phe Leu Pro Ile Trp Ser Ile Pro

130 135 140

Tyr Thr Arg Gly Ser Glu Thr Gln Ser Leu Ala Val Ala Arg Asp Gly

145 150 155 160

Gly Arg Arg Phe Asp Lys Leu Asp Gln Gly Pro Val Ile Ala Asp His

165 170 175

Pro Phe Ala Val Asp Val Thr Ala Phe Arg Asp Pro Phe Val Phe Arg

180 185 190

Ser Ala Lys Leu Asp Val Leu Leu Asp Glu Glu Val Ala Arg Asn Glu

195 200 205

Thr Ala Val Gln Gln Ala Val Asp Gly Trp Thr Glu Lys Asn Ala Pro

210 215 220

Trp Tyr Val Ala Val Ser Gly Gly Val His Gly Val Gly Pro Ala Gln

225 230 235 240

Phe Leu Tyr Arg Gln Asn Gly Gly Asn Ala Ser Glu Phe Gln Tyr Trp

245 250 255

Glu Tyr Leu Gly Glu Trp Trp Gln Glu Ala Thr Asn Ser Ser Trp Gly

260 265 270

Asp Glu Gly Thr Trp Ala Gly Arg Trp Gly Phe Asn Phe Glu Thr Gly

275 280 285

Asn Val Leu Phe Leu Thr Glu Glu Gly His Asp Pro Gln Thr Gly Glu

290 295 300

Val Phe Val Thr Leu Gly Thr Glu Gly Ser Gly Leu Pro Pro Gln Val

305 310 315 320

Ser Ser Ile His Asp Met Leu Trp Ala Ala Gly Glu Val Gly Val Gly

325 330 335

Ser Glu Gln Glu Lys Val Glu Phe Ser Pro Ser Met Ala Gly Phe Leu

340 345 350

Asp Trp Gly Phe Ser Ala Tyr Ala Ala Ala Gly Lys Val Leu Pro Ala

355 360 365

Ser Ser Ala Val Ser Lys Thr Ser Gly Val Glu Val Asp Arg Tyr Val

370 375 380

Ser Phe Val Trp Leu Thr Gly Asp Gln Tyr Glu Gln Ala Asp Gly Phe

385 390 395 400

Pro Thr Ala Gln Gln Gly Trp Gly Ser Leu Leu Leu Pro Arg Glu Leu

405 410 415

Lys Thr Val Glu Asn Val Val Asp Asn Glu Leu Val Arg Glu Glu Gly

420 425 430

Val Ser Trp Val Val Gly Glu Ser Asp Asn Gln Thr Ala Arg Leu Arg

435 440 445

Thr Leu Gly Ile Thr Ile Ala Arg Glu Thr Lys Ala Ala Leu Leu Ala

450 455 460

Asn Gly Ser Val Thr Ala Glu Glu Asp Arg Thr Leu Gln Thr Ala Ala

465 470 475 480

Val Val Pro Phe Ala Gln Ser Pro Ser Ser Lys Phe Phe Val Leu Thr

485 490 495

Ala Gln Leu Asp Ala Ser Ala Arg Ser Ser Pro Leu Gln Ser Gly Phe

500 505 510

Glu Ile Leu Ala Ser Glu Leu Glu Arg Thr Ala Ile Tyr Tyr Gln Phe

515 520 525

Ser Asn Glu Ser Leu Val Val Asp Arg Ser Gln Thr Ser Ala Ala Ala

530 535 540

Pro Thr Asn Pro Asp Ser Phe Thr Glu Ser Gly Lys Leu Arg Leu Phe

545 550 555 560

Asp Val Ile Glu Asn Gly Gln Glu Gln Val Glu Thr Leu Asp Leu Thr

565 570 575

Val Val Val Asp Asn Ala Val Val Glu Val Tyr Ala Asn Gly Arg Phe

580 585 590

Ala Leu Ser Thr Trp Ala Arg Ser Trp Tyr Asp Asn Ser Thr Gln Ile

595 600 605

Arg Phe Phe His Asn Gly Glu Gly Glu Val Gln Phe Arg Asn Val Ser

610 615 620

Val Ser Glu Gly Leu Tyr Asn Ala Trp Pro Glu Arg Asn

625 630 635

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgcggatcca tgacccatag cacccgcgg 29

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cccaagcttc ggcggtatga cgcggtcgt 29

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgcggatcca tgaaactgac caccaccacc 30

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cccaagcttc aacgcaaggc cggtgcgcaa t 31

Claims

1.一种酶改质甜菊糖的制备方法，其特征在于，包括：

在溶解有甜菊糖原料和蔗糖的溶液中加入β-果糖苷酶得到反应液，调节所述反应液的pH为7.2-8.0，反应温度维持在20-45℃，搅拌反应后，收集得到酶改质甜菊糖，所述甜菊糖原料包括甜菊苷和莱包迪甙A中的一种或多种，所述β-果糖苷酶来源于嗜酸微杆菌属或日本曲霉菌属，所述β-果糖苷酶包括第一β-果糖苷酶或第二β-果糖苷酶，所述第一β-果糖苷酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，所述第二β-果糖苷酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，所述甜菊糖原料在所述反应液中的质量分数为1%-20%，所述甜菊糖原料与所述β-果糖苷酶的质量比为1：（0.1-2）。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第一β-果糖苷酶的基因编码序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述第二β-果糖苷酶的基因编码序列为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述搅拌反应的反应时间为2-5小时。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述收集得到酶改质甜菊糖的过程包括：对所述反应液加热以使所述β-果糖苷酶变性，过滤并收集滤液，将所述滤液纯化处理后得到酶改质甜菊糖，其中，所述加热的温度为85-100℃，时间为0.3-1小时。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述将所述滤液纯化处理的步骤包括：喷雾干燥所述滤液得到酶改质甜菊糖粗品，将所述酶改质甜菊糖粗品经硅胶树脂分离、结晶处理后得到所述酶改质甜菊糖。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述反应液中还包括缓冲液，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液和Tris-HCl缓冲液中的任意一种或多种。

7.β-果糖苷酶以及含有所述β-果糖苷酶基因的微生物菌株在生物催化中的应用，其特征在于，所述β-果糖苷酶由来源于嗜酸微杆菌属或日本曲霉菌属的β-果糖苷酶基因编码，所述β-果糖苷酶催化式Ⅲ所示的化合物转化成式Ⅳ所示的化合物，

，

，其中，R基是β-glc-β-glc-、(β-glc)₂-β-glc-、(β-glc，α-rha-)-β-glc-、α-rha-β-glc-、β-glc-、(β-glc，β-xyl)-β-glc-或H，所述β-果糖苷酶包括第一β-果糖苷酶或第二β-果糖苷酶，所述第一β-果糖苷酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，所述第二β-果糖苷酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，所述应用包括在溶解有甜菊糖原料和蔗糖的溶液中加入所述β-果糖苷酶得到反应液，调节所述反应液的pH为7.2-8.0，反应温度维持在20-45℃，搅拌反应后，收集得到酶改质甜菊糖，所述甜菊糖原料包括甜菊苷和莱包迪甙A中的一种或多种，所述甜菊糖原料在所述反应液中的质量分数为1%-20%，所述甜菊糖原料与所述β-果糖苷酶的质量比为1：（0.1-2）。