CN110872586B

CN110872586B - 固定化葡萄糖基转移酶及制备方法及催化生产莱鲍迪苷d的方法

Info

Publication number: CN110872586B
Application number: CN201911096692.3A
Authority: CN
Inventors: 宋浩; 刘伟; 刘文斌; 马媛媛; 洪解放; 汪振洋; 来庆英
Original assignee: Tianjin University; Sinochem Health Co Ltd
Current assignee: Tianjin University; Sinochem Health Co Ltd
Priority date: 2019-11-11
Filing date: 2019-11-11
Publication date: 2024-01-30
Anticipated expiration: 2039-11-11
Also published as: CN110872586A

Abstract

本发明公开了固定化葡萄糖基转移酶及制备方法及催化生产莱鲍迪苷D的方法，制备方法：(1)配制壳聚糖溶液，滴入到NaOH水溶液中，静置，制成小球，冲洗，得到壳聚糖小球；(2)将壳聚糖小球与戊二醛水溶液混合，交联活化，清洗，得戊二醛交联的壳聚糖小球；(3)将戊二醛交联的壳聚糖小球与葡萄糖基转移酶水溶液混匀，反应，过滤，用水清洗，得到固定化葡萄糖基转移酶。固定化葡萄糖基转移酶易与反应产物分离，利于产物分离纯化和酶的回收。实现了多次重复利用，在使用第三次以后，随着固定化酶重复操作次数的增加，酶活逐渐升高，RD的产量逐渐升高，重复使用8次后，固定化酶的酶活逐渐降低，RD的产量降低，说明重复使用性较好。

Description

固定化葡萄糖基转移酶及制备方法及催化生产莱鲍迪苷D的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地涉及一种固定化葡萄糖基转移酶及制备方法及催化生产莱鲍迪苷D的方法。

背景技术

目前全世界的糖尿病患者大约占18岁以上总人口的9％，肥胖病患者更是超过了20亿。这些人群需要在饮食中严格控制糖类摄入，然而目前市场上大部分的无热量代糖都有健康隐患并不适合长期使用，因此市场需要新型安全代糖甜味剂。甜菊糖是从甜叶菊叶片中提取分离得到的一类甜菊糖苷类化合物，因其甜度高、热量低、无毒性等优点，被美国食品药品监督管理局认证为安全的食品添加剂，甜菊糖正被越来越多的国家组织认可，被誉为“世界第三糖源”。

甜野菊含有多种甜菊糖苷，其中甜菊苷(St)、莱鲍迪苷A(RA)的相对含量较高，共占90％以上，甜菊苷(St)、莱鲍迪苷A(RA)已广泛应用于饮料、食品、调味剂、酒类、乳制品等食品加工领域。

虽然St、RA具有高甜度，但是口感上还存在除甜味之外的苦后味，其甜味味质不如莱鲍迪苷D(RD)，RD不仅甜味相当于蔗糖的450倍，甜味特性也与蔗糖相接近，无后苦味，但其在甜叶菊中的含量极少，只有0.2％。而莱鲍迪苷D仅在莱鲍迪苷A的C19位上多了一个葡萄糖基，因此有研究人员采用酶催化的方式，利用大肠杆菌生产糖基转移酶UGT1重组酶，将尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)中的活泼葡萄糖基转移至RA，特性催化RA生成RD。但目前的生物酶催化法还存在游离酶不利于重复使用、不易与产物分离并回收等问题。

发明内容

本发明的目的克服现有技术存在的酶不能重复利用，不易于与产物分离的不足，提供一种固定化葡萄糖基转移酶。

本发明的第二个目的是提供一种固定化葡萄糖基转移酶的制备方法。

本发明的第三个目的是提供一种固定化葡萄糖基转移酶催化生产莱鲍迪苷D的方法。

本发明的技术方案概述如下:

一种固定化葡萄糖基转移酶的制备方法，包括以下步骤：

(1)以体积浓度为1％-3％的醋酸水溶液为溶剂，配制浓度为20-60g/L的壳聚糖溶液，将所述壳聚糖溶液滴入到1-4M的NaOH水溶液中，静置，制成直径0.5-3.5mm的小球，用水冲洗，得到壳聚糖小球；

(2)按1g:2-20mL的比例，将壳聚糖小球与体积浓度0.5％-10％的戊二醛水溶液混合，交联活化，用水清洗，得戊二醛交联的壳聚糖小球；

(3)将所述戊二醛交联的壳聚糖小球与葡萄糖基转移酶水溶液混匀，反应，过滤，用水清洗，得到固定化葡萄糖基转移酶。

步骤(3)优选为：按1g:5-10mL的比例，将所述戊二醛交联的壳聚糖小球与浓度为6-72μg/mL葡萄糖基转移酶水溶液混匀，在4-30℃，搅拌下，反应16-25h，过滤，用水清洗，得到固定化葡萄糖基转移酶，保存于pH＝6.5-8.5的水或磷酸盐缓冲液中。

葡萄糖基转移酶为葡萄糖基转移酶UGT1，所述葡萄糖基转移酶UGT1的氨基酸序列用SEQ ID NO.2所示。

上述方法制备的一种固定化葡萄糖基转移酶。

上述固定化葡萄糖基转移酶催化生产莱鲍迪苷D的方法，包括如下步骤：

向pH为6.5-8.5磷酸盐缓冲液中加入莱鲍迪苷A；加入尿苷二磷酸葡萄糖作为葡萄糖基供体；加入氯化镁或硫酸镁，加入权利要求4所述的固定化葡萄糖基转移酶，反应，得到莱鲍迪苷D。

上述方法优选的是

向pH为6.5-8.5磷酸盐缓冲液中加入莱鲍迪苷A，使莱鲍迪苷A终浓度为0.2-20mM，加入尿苷二磷酸葡萄糖作为葡萄糖基供体，使尿苷二磷酸葡萄糖和莱鲍迪苷A的摩尔比为0.5-3:1，加入氯化镁或硫酸镁，使终浓度为0.2-0.5mM，加入所述的固定化葡萄糖基转移酶，使述固定化葡萄糖基转移酶的终含量6-72μg/mL，25-40℃反应24-48h，得到莱鲍迪苷D。

本发明的优点

本发明的一种固定化葡萄糖基转移酶易与反应产物分离，有助于产物分离纯化和固定化葡萄糖基转移酶的回收。降低了固定化葡萄糖基转移酶的失活率。与游离酶相比，固定化酶能够实现多次重复使用，在使用第三次以后，随着固定化酶重复操作次数的增加，固定化酶的酶活逐渐升高，RD的产量逐渐升高，分析原因可能多次冲洗和反应之后，酶的活性位点被释放，重复使用8次后，固定化酶的酶活逐渐降低，RD的产量降低，第十次催化莱鲍迪苷A生产莱鲍迪苷D的收率依然为46％，说明重复使用性较好。

附图说明

图1为固定化葡萄糖基转移酶使用10次生成莱鲍迪苷(RD)的产量。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。

莱鲍迪苷A为商品。

实施例1重组质粒pET28a-UGT1的构建及葡萄糖基转移酶UGT1诱导表达纯化

葡萄糖基转移酶UGT1的制备：利用NCBI数据库对来源于水稻的葡萄糖转移酶基因序列进行筛选，对Gene Bank数据库中登陆号为AK121682的基因进行密码子优化，密码子优化工作由Gen Script公司完成。通过体外人工合成双链DNA分子的技术合成SEQ ID NO.1所示核苷酸序列(分泌表达葡萄糖转移酶UGT1的基因序列)，并设计将其插入到pET-28a载体(商品)上的NcoI和XhoI酶切位点之间，获得质粒pET28a-UGT1。

将重组质粒pET28a-UGT1转化入大肠杆菌BL21菌株中得到表达葡萄糖基转移酶UGT1的工程菌E.coli BL21-pET-28a(+)-UGT1，通过测序筛选出带pET28a-UGT1重组质粒的单个菌落，挑取菌落至0.5mL含卡那霉素的LB液体培养基中(蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、卡那霉素50μg/mL)，37℃、180rpm培养8h，加入0.5mL 30％甘油保菌处理。

将保存菌株接种至5mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃、180rpm培养过夜，以1％的接种量接种到400mL卡那霉素的LB培养基，37℃、180rpm培养至OD₆₀₀达到0.7时，在菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1mM,在18℃、150rpm摇床中诱导培养16h。

将诱导后的菌液在4℃、4000g的条件下离心10min，收集菌体，菌体用pH 7.2的PBS缓冲液洗涤两次；除尽培养基后，用30mL的破胞缓冲液(50mM Tris-Cl，300mM NaCl)重悬细胞，在冰浴中超声破胞60分钟，超声条件为150W下工作5s再间隙8s，超声后在4℃、12000g的条件下，离心30min，收集上清液，用0.45uM滤膜进行过滤制得UGT1酶的粗酶液；将UGT1粗酶液采用Ni-NTA亲和层析，对所得的粗酶液进行分离纯化，经上样、清洗和洗脱，收集洗脱液，超滤浓缩，过脱盐柱除去咪唑，用BCA试剂盒测得纯化后浓度为0.6mg/mL葡萄糖基转移酶UGT1,其氨基酸序列用SEQ ID NO.2。

实施例2

一种固定化葡萄糖基转移酶的制备方法，包括以下步骤：

(1)以体积浓度为2％的醋酸水溶液为溶剂，配制浓度为40g/L的壳聚糖溶液，将所述壳聚糖溶液滴入到2.5M的NaOH水溶液中，静置3小时，制成直径0.5-3.5mm的小球，水冲洗小球至无NaOH残留，得到壳聚糖小球；

(2)按1g:7mL的比例，将壳聚糖小球与体积浓度5％的戊二醛水溶液混合，在室温下交联活化3h，用水清洗，得戊二醛交联的壳聚糖小球；

(3)按1g:7mL的比例，将所述戊二醛交联的壳聚糖小球与浓度为30μg/mL葡萄糖基转移酶UGT1水溶液混匀，在20℃，搅拌下，反应20h，过滤，用水清洗，得到固定化葡萄糖基转移酶UGT1，保存于pH＝7.5的磷酸钠缓冲液中(也可以保存于pH＝7.5的水中)。

实施例3

一种固定化葡萄糖基转移酶的制备方法，包括以下步骤：

(1)以体积浓度为1％的醋酸水溶液为溶剂，配制浓度为20g/L的壳聚糖溶液，将所述壳聚糖溶液滴入到1M的NaOH水溶液中，静置2小时，制成直径0.5-3.5mm的小球，水冲洗小球至无NaOH残留，得到壳聚糖小球；

(2)按1g:2mL的比例，将壳聚糖小球与体积浓度0.5％的戊二醛水溶液混合，在室温下交联活化5h，用水清洗，得戊二醛交联的壳聚糖小球；

(3)按1g:5mL的比例，将所述戊二醛交联的壳聚糖小球与浓度为6μg/mL葡萄糖基转移酶UGT1水溶液混匀，在4℃，搅拌下，反应25h，过滤，用水清洗，得到固定化葡萄糖基转移酶UGT1，保存于pH＝6.5的磷酸钠缓冲液中(也可以保存于pH＝6.5的水中)。

实施例4

一种固定化葡萄糖基转移酶的制备方法，包括以下步骤：

(1)以体积浓度为3％的醋酸水溶液为溶剂，配制浓度为60g/L的壳聚糖溶液，将所述壳聚糖溶液滴入到4M的NaOH水溶液中，静置5小时，制成直径0.5-3.5mm的小球，水冲洗小球至无NaOH残留，得到壳聚糖小球；

(2)按1g:20mL的比例，将壳聚糖小球与体积浓度10％的戊二醛水溶液混合，在室温下交联活化2h，用水清洗，得戊二醛交联的壳聚糖小球；

(3)按1g:10mL的比例，将所述戊二醛交联的壳聚糖小球与浓度为72μg/mL葡萄糖基转移酶UGT1水溶液混匀，在30℃，搅拌下，反应16h，过滤，用水清洗，得到固定化葡萄糖基转移酶UGT1，保存于pH＝8.5的磷酸钾缓冲液中(也可以保存于pH＝8.5的水中)。

实施例5

固定化葡萄糖基转移酶催化生产莱鲍迪苷D的方法，包括如下步骤：

向pH为7.5磷酸钠缓冲液中加入莱鲍迪苷A使终浓度为10mM，加入尿苷二磷酸葡萄糖作为葡萄糖基供体，使尿苷二磷酸葡萄糖和莱鲍迪苷A的摩尔比为2:1，加入氯化镁使终浓度为0.3mM，加入固定化葡萄糖基转移酶UGT1(实施例2制备)使终含量30μg/mL，在35℃反应36h，过滤，固体为固定化葡萄糖基转移酶UGT1，滤液中含有得到莱鲍迪苷D。

以实际催化获得的莱鲍迪苷D产量除以理论完全转化获得莱鲍迪苷D的量为莱鲍迪苷D的收率,通过该方法催化莱鲍迪苷A生产莱鲍迪苷D的收率42.0％，

实施例6

向pH为6.5磷酸钠缓冲液中加入莱鲍迪苷A使终浓度为0.2mM，加入尿苷二磷酸葡萄糖，作为葡萄糖基供体，使尿苷二磷酸葡萄糖和莱鲍迪苷A的摩尔比为0.5:1，加入氯化镁使终浓度为0.2mM，加入固定化葡萄糖基转移酶UGT1(实施例3制备)使终含量6μg/mL，在25℃反应48h，过滤，固体为固定化葡萄糖基转移酶，滤液中含有得到莱鲍迪苷D。

莱鲍迪苷D的收率50.0％。

实施例7

向pH为8.5磷酸钾缓冲液中加入莱鲍迪苷A使终浓度为20mM，加入尿苷二磷酸葡萄糖，使尿苷二磷酸葡萄糖和莱鲍迪苷A的摩尔比为3:1，加入硫酸镁使终浓度为0.5mM，加入固定化葡萄糖基转移酶UGT1(实施例4制备)使终含量72μg/mL，在40℃反应24h，过滤，固体为固定化葡萄糖基转移酶，滤液中含有得到莱鲍迪苷D。

莱鲍迪苷D的收率33.0％。

实施例8

向pH为7的磷酸钠缓冲液中加入莱鲍迪苷A使终浓度为0.2mM(193.4mg/L)，加入尿苷二磷酸葡萄糖，使尿苷二磷酸葡萄糖和莱鲍迪苷A的摩尔比为1.5:1，加入氯化镁使终浓度为0.3mM，加入固定化葡萄糖基转移酶UGT1(实施例3制备)使终含量6μg/mL，在25℃反应24h，过滤，固体为固定化葡萄糖基转移酶，滤液中含有莱鲍迪苷D为82±1.6mg/L。

莱鲍迪苷D的收率36.0％。

分离出的固定化葡萄糖基转移酶UGT1用水清洗，过滤，重复使用,重复使用10次的结果见表1,第十次催化莱鲍迪苷A生产莱鲍迪苷D的收率依然为46％。

在使用第三次以后，随着固定化酶重复操作次数的增加，固定化酶的酶活逐渐升高，RD的产量逐渐升高，分析原因可能多次冲洗和反应之后，酶的活性位点被释放，重复使用8次后，固定化酶的酶活逐渐降低，RD的产量降低，第十次催化莱鲍迪苷A生产莱鲍迪苷D的收率依然为46％，说明重复使用性较好。

表1固定化葡萄糖基转移酶UGT1重复性使用效果

序列表

<110> 天津大学

中化健康产业发展有限公司

<120> 固定化葡萄糖基转移酶及制备方法及催化生产莱鲍迪苷D的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1386

<212> DNA

<213> 日本水稻(Oryza sativa Japonica)

<400> 1

atggacagcg gttacagcag cagctacgcg gcggcggcgg gtatgcacgt ggttatctgc 60

ccgtggctgg cgtttggtca cctgctgccg tgcctggatc tggcgcagcg tctggcgagc 120

cgtggccacc gtgttagctt cgtgagcacc ccgcgtaaca ttagccgtct gccgccggtt 180

cgtccggcgc tggcgccgct ggttgcgttc gtggcgctgc cgctgccgcg tgtggagggt 240

ctgccggatg gtgcggaaag caccaacgat gttccgcacg accgtccgga tatggtggag 300

ctgcatcgtc gtgcgtttga tggtctggcg gcgccgttca gcgaatttct gggtaccgcg 360

tgcgcggact gggtgatcgt tgatgtgttt catcactggg ctgcggcggc ggcgctggag 420

cacaaggttc cgtgcgcgat gatgctgctg ggtagcgcgc acatgatcgc gagcattgcg 480

gatcgtcgtc tggaacgtgc ggaaaccgag agcccggcgg cggcgggtca aggtcgtccg 540

gctgcggcgc cgacctttga ggtggcgcgt atgaagctga tccgtaccaa aggtagcagc 600

ggcatgagcc tggcggaacg tttcagcctg accctgagcc gtagcagcct ggtggttggt 660

cgtagctgcg ttgaatttga gccggaaacc gtgccgctgc tgagcaccct gcgtggcaag 720

ccgattacct tcctgggtct gatgccgccg ctgcatgagg gtcgtcgtga ggacggcgaa 780

gatgcgaccg ttcgttggct ggatgcgcag ccggcgaaga gcgtggttta tgttgcgctg 840

ggtagcgagg tgccgctggg cgttgagaaa gtgcacgaac tggcgctggg tctggaactg 900

gcgggtaccc gttttctgtg ggcgctgcgt aaaccgaccg gtgtgagcga tgcggatctg 960

ctgccggcgg gtttcgagga acgtacccgt ggtcgtggcg tggttgcgac ccgttgggtt 1020

ccgcaaatga gcattctggc gcatgcggcg gtgggtgcgt ttctgaccca ctgcggctgg 1080

aacagcacca ttgaaggtct gatgttcggc cacccgctga tcatgctgcc gatttttggt 1140

gaccagggcc cgaacgcgcg tctgattgag gcgaagaacg cgggtctgca agttgcgcgt 1200

aacgacggtg atggcagctt tgatcgtgaa ggcgtggctg cggcgatccg tgcggttgcg 1260

gtggaggaag agagcagcaa ggttttccag gcgaaagcga agaaactgca agagattgtg 1320

gcggacatgg cgtgccacga acgttacatc gatggtttca ttcagcaact gcgtagctat 1380

aaagat 1386

<210> 2

<211> 462

<212> PRT

<213> 日本水稻(Oryza sativa Japonica)

<400> 2

Met Asp Ser Gly Tyr Ser Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Ala Gly Met His

1 5 10 15

Val Val Ile Cys Pro Trp Leu Ala Phe Gly His Leu Leu Pro Cys Leu

20 25 30

Asp Leu Ala Gln Arg Leu Ala Ser Arg Gly His Arg Val Ser Phe Val

35 40 45

Ser Thr Pro Arg Asn Ile Ser Arg Leu Pro Pro Val Arg Pro Ala Leu

50 55 60

Ala Pro Leu Val Ala Phe Val Ala Leu Pro Leu Pro Arg Val Glu Gly

65 70 75 80

Leu Pro Asp Gly Ala Glu Ser Thr Asn Asp Val Pro His Asp Arg Pro

85 90 95

Asp Met Val Glu Leu His Arg Arg Ala Phe Asp Gly Leu Ala Ala Pro

100 105 110

Phe Ser Glu Phe Leu Gly Thr Ala Cys Ala Asp Trp Val Ile Val Asp

115 120 125

Val Phe His His Trp Ala Ala Ala Ala Ala Leu Glu His Lys Val Pro

130 135 140

Cys Ala Met Met Leu Leu Gly Ser Ala His Met Ile Ala Ser Ile Ala

145 150 155 160

Asp Arg Arg Leu Glu Arg Ala Glu Thr Glu Ser Pro Ala Ala Ala Gly

165 170 175

Gln Gly Arg Pro Ala Ala Ala Pro Thr Phe Glu Val Ala Arg Met Lys

180 185 190

Leu Ile Arg Thr Lys Gly Ser Ser Gly Met Ser Leu Ala Glu Arg Phe

195 200 205

Ser Leu Thr Leu Ser Arg Ser Ser Leu Val Val Gly Arg Ser Cys Val

210 215 220

Glu Phe Glu Pro Glu Thr Val Pro Leu Leu Ser Thr Leu Arg Gly Lys

225 230 235 240

Pro Ile Thr Phe Leu Gly Leu Met Pro Pro Leu His Glu Gly Arg Arg

245 250 255

Glu Asp Gly Glu Asp Ala Thr Val Arg Trp Leu Asp Ala Gln Pro Ala

260 265 270

Lys Ser Val Val Tyr Val Ala Leu Gly Ser Glu Val Pro Leu Gly Val

275 280 285

Glu Lys Val His Glu Leu Ala Leu Gly Leu Glu Leu Ala Gly Thr Arg

290 295 300

Phe Leu Trp Ala Leu Arg Lys Pro Thr Gly Val Ser Asp Ala Asp Leu

305 310 315 320

Leu Pro Ala Gly Phe Glu Glu Arg Thr Arg Gly Arg Gly Val Val Ala

325 330 335

Thr Arg Trp Val Pro Gln Met Ser Ile Leu Ala His Ala Ala Val Gly

340 345 350

Ala Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Thr Ile Glu Gly Leu Met

355 360 365

Phe Gly His Pro Leu Ile Met Leu Pro Ile Phe Gly Asp Gln Gly Pro

370 375 380

Asn Ala Arg Leu Ile Glu Ala Lys Asn Ala Gly Leu Gln Val Ala Arg

385 390 395 400

Asn Asp Gly Asp Gly Ser Phe Asp Arg Glu Gly Val Ala Ala Ala Ile

405 410 415

Arg Ala Val Ala Val Glu Glu Glu Ser Ser Lys Val Phe Gln Ala Lys

420 425 430

Ala Lys Lys Leu Gln Glu Ile Val Ala Asp Met Ala Cys His Glu Arg

435 440 445

Tyr Ile Asp Gly Phe Ile Gln Gln Leu Arg Ser Tyr Lys Asp

450 455 460

Claims

1.固定化葡萄糖基转移酶催化生产莱鲍迪苷D的方法，其特征是包括如下步骤：

向pH为6.5或7的磷酸盐缓冲液中加入莱鲍迪苷A；使终浓度为0.2mM，加入尿苷二磷酸葡萄糖作为葡萄糖基供体；使尿苷二磷酸葡萄糖和莱鲍迪苷A的摩尔比为0.5:1或1.5:1，加入氯化镁使终浓度为0.2或0.3mM，加入固定化葡萄糖基转移酶使终含量为6μg/mL，在25℃反应24或48h，过滤，固体为固定化葡萄糖基转移酶，滤液中含有莱鲍迪苷D；

所述固定化葡萄糖基转移酶用下述方法制成：

(1)以体积浓度为1％的醋酸水溶液为溶剂，配制浓度为20g/L的壳聚糖溶液，将所述壳聚糖溶液滴入到1M的NaOH水溶液中，静置2小时，制成直径0.5-3.5mm的小球，水冲洗，得到壳聚糖小球；

(2)按1g:2mL的比例，将壳聚糖小球与体积浓度0.5％的戊二醛水溶液混合，交联活化5h，用水清洗，得戊二醛交联的壳聚糖小球；

(3)按1g:5mL的比例，将所述戊二醛交联的壳聚糖小球与浓度为6μg/mL葡萄糖基转移酶水溶液混匀，在4℃，搅拌下，反应25h，过滤，用水清洗，得到固定化葡萄糖基转移酶，保存于pH＝6.5的水或磷酸盐缓冲液中；

所述葡萄糖基转移酶为葡萄糖基转移酶UGT1，所述葡萄糖基转移酶UGT1的氨基酸序列用SEQ ID NO.2所示。