JP6340005B2 - 3−エピメラーゼ - Google Patents
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Description
i)配列番号5、配列番号1、又は配列番号3に対して少なくとも70%、80%、90%、95%、又は99%の配列同一性を有するか、又は、配列番号5、配列番号1、又は配列番号3に対して100%の配列同一性を有し、又は
ii)高ストリンジェントな条件下において、配列番号5、配列番号1、又は配列番号3に規定の配列に対して相補的な配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズする
ポリヌクレオチド配列を含むのが有利である。
i)本発明の第1様態に係るタンパク質を提供するステップと、
ii)果糖基質をアルロースに転換する条件下において、前記タンパク質を前記果糖基質に接触させるステップを含む方法を提供する。アルロースの生成方法も本発明によって提供し、この方法は、果糖基質をアルロースに転換する条件下において、本発明の第1様態に係るタンパク質を前記果糖基質に接触させるステップを含む。
i)配列番号5、配列番号1、又は配列番号3に対して少なくとも70%の配列同一性を有し、又は
ii)高ストリンジェントな条件下において、配列番号5、配列番号1、又は配列番号3に規定の配列に対して相補的な配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズする
ポリヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。
i)配列番号5、配列番号1、又は配列番号3に対して少なくとも70%の配列同一性を有し、又は
ii)高ストリンジェントな条件下において、配列番号5、配列番号1、又は配列番号3に規定の配列に対して相補的な配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズする
宿主細胞を提供する。
i)配列番号5、配列番号1、又は配列番号3に対して少なくとも70%の配列同一性を有し、又は
ii)高ストリンジェントな条件下において、配列番号5、配列番号1、又は配列番号3に規定の配列に対して相補的な配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズする
ベクターを提供する。
i)ケトース3−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有する核酸分子を含むベクターを提供するステップを含み、前記ポリヌクレオチド配列は、a)配列番号5、配列番号1、又は配列番号3に対して少なくとも70%の配列同一性を有し、又は、b)高ストリンジェントな条件下において、配列番号5、配列番号1、又は配列番号3に規定の配列に対して相補的な配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズし、前記方法はさらに、
ii)前記ポリヌクレオチド配列にコードされたケトース3−エピメラーゼ活性を有する前記タンパク質を合成するステップと、
iii)果糖をケトース3−エピメラーゼ活性を有する前記タンパク質に接触させ、果糖からアルロースへの転換を可能にする条件下において、前記果糖及び前記タンパク質を維持するステップと、
iv)前記ステップiii)において生成した前記アルロースを少なくとも部分的に精製するステップとを含む方法を提供する。
化学式(II)
1)配列番号1、配列番号3、又は配列番号5と少なくとも70%の配列同一性を有する核酸分子を含むベクターを提供するステップ。
2)前記ベクターでコンピテント宿主細胞を形質転換するステップ。
3)形質転換された宿主細胞を任意で培養するステップ。
4)形質転換された細胞を果糖基質と混合し、果糖からアルロースへの転換を可能にする条件下に維持するステップ。
5)蒸発及び結晶化等、従来技術の標準の方法を使用して、生成されたアルロースを精製するステップ。
本例では、3つの推定ケトース−3−エピメラーゼ酵素の1つを発現するように宿主細胞を形質転換した。果糖基質で培養することにより、形質転換した宿主細胞のケトース−3−エピメラーゼについて試験した。
ホウ酸塩バッファー、1M、pH8
i)62gのホウ酸を1lの脱イオン水に溶解した
ii)10MのNaOHによりpH8に調整した
iii)1Lボトルに入れて4℃の冷蔵庫で保存した
ホウ酸塩バッファー果糖基質
i)970gの液体果糖(77%DS)を50mlのホウ酸塩バッファーpH8に入れた
ii)最終容量が1Lとなるように水を加えた
iii)5MのNaOHによりpH8に調整した
発現培地LB−4×2.8Lバッフル付シェイクフラスコ
i)10gのトリプトン、7gのNaCl、及び10gの酵母を1Lの脱イオン水に入れた
ii)オートクレーブ
Genscript USA,Inc.によって合成構築すべく、3つの推定ケトース−3−エピメラーゼ遺伝子配列及び1つの対照群配列を選択した。推定ケトース−3−エピメラーゼ配列は以下をコードした。
i)クロストリジウム・シンデンスATCC35704からの仮説タンパク質CLOSCI_02526(アクセッションZP_02432281)(配列番号2)
ii)クロストリジウム・ハイレモンアエDSM15053からの仮説タンパク質CLOHYLEM_05645(アクセッションZP_03778576.1)(配列番号4)
iii)デスモスポラ・エスピー8437からのD−タガトース−3−エピメラーゼ(アクセッションZP_08466075)(配列番号6)
3つのタンパク質配列を、ケトース−3−エピメラーゼタンパク質として試験すべく同定した。これらのタンパク質の配列を図1〜図3(配列番号2、4、及び6)に示す。対照群として使用したクロストリジウム・セルロリティカムH10からのキシロースイソメラーゼは、従来、果糖からアルロースを生成するものとして提案されていた。このアミノ酸配列を図4に示す(配列番号8)。
本例では、スケーラビリティを判定し、さらなる感覚調査及び臨床調査を行うべくアルロースを生成するために、18Lスケールにおいて細胞成長及び転換に関して現在の最高条件を実現した。転換に続いて、果糖を除去する最初の洗浄ステップを実施した。本例は、このプロセスのスケーラビリティと、スケールアップに伴う予期しない問題と、研究室で生成できるアルロースの妥当な量とを同定することを目的とするものであった。
イソプロピルチオガラクトピラノシド(IPTG)
ろ過滅菌したアンピシリン水溶液100mg/ml
結晶果糖グリーン
液体果糖(77%DS)
成長培地
i)25gのNaCl、25gのStaleydex333(登録商標)、6gのグリセロール、50gのトリプトン(Difco)、60gの酵母抽出物(Difco)、8gの第一リン酸カリウム、及び8gの第二リン酸カリウムを6lの脱イオン水に入れた
ii)トリス塩基(固体)でpHを〜7.8に調整した
iii)フォイルで頂上部を覆った6×2.8Lバッフル付きフラスコで、フラスコにつき1Lのオートクレーブを行った
トリスバッファー、1M、pH8
iv)121gを1Lの脱イオン水に入れた
iv)HClでpH8に調整した
iv)1Lボトルに入れて4℃の冷蔵庫で保存した
細胞を繁殖させるため、100μg/mlのアンピシリンを補った5mlのLB培地の6つのオーバーナイト培地から開始した。これらの培地に、大腸菌生成菌株(配列番号6のタンパク質を発現するBL21−DE3 pET15bDS−P3E)を植菌し、37℃オーバーナイト(〜16時間)で成長させた。6Lの成長培地を調製し、上述のようにオートクレーブし、5mlのオーバーナイト培地を各フラスコに添加し、190rpm、37℃で4時間これを震盪した。新たに1Mの溶液を調製し、フラスコにリットル当たり1ml添加することにより、1mMのIPTGを各フラスコに添加した。引き続き14〜16時間震盪を行うことにより、温度を25℃まで下げた。
約220gのBL21(DE3)pET−15b−DS P3E細胞を12Lの培養物から得て、上述のとおり2つの18Lの生物変換に分けた。従って、全細胞生体触媒の総濃度は、結晶果糖グリーン転換については5.6g/Lであり、液体果糖転換については6.7g/Lであった。
グルコース酵母抽出培地を用いるpH制御流加培養法を使用し、発酵研究室において2つの10L発酵により、新たに同定したDS P3Eタンパク質(配列番号6)を含有する大腸菌株を生成した。これらの発酵は、期待どおりに進行した。
4つ異なる酵素(配列番号2、4、6、及び8)による果糖の転換を、750g/Lにてトリスバッファー果糖基質上で比較した。25〜30℃でなく、16℃にて細胞を誘導し、転換率は前回の実験より低かった。200mLの基質に対して、500mLのバッフル付きフラスコ内で2gの湿重量の再懸濁細胞を添加し、90rpmの震盪にて55℃で培養した。HPLC解析を行うため、2時間及び3.5時間でサンプルを採った。結果を図12に示すが、ここではCC P3Eは配列番号8に対応し、CH P3E、CS P3E、及びDS P3Eが各々、配列番号4、2、及び6に対応する。この実験において、配列番号2、4、6、又は8に規定のタンパク質の1つを発現する4つの菌株はすべて、3.5時間で基質の約5%をアルロースに転換する略同一の活性レベルを有しているようであった。
本例では、固定化酵素を使用したアルロース生成の第1の試みを実施した。本例は、酵素の利用を改善することを目的としている。
Codexisより調製された凍結乾燥酵素粉末、Lot D13007又はD13008
デスモスポラ・エスピー、プシコース−3−エピメラーゼ
デュオライトA568(Dow)
アンバーライトXAD2(Sigma)
トリスバッファー1M
i)1Mの濃度で溶解することにより水中に調製
ii)HClでpHを8.0に調整
iii)使用前に100mMに希釈
結晶果糖グリーン、80%の乾燥固体で以下の組成を有する。
i)90%DSB果糖
ii)7%DSBデキストロース
iii)3%DP2+
iv)その他の単糖類
MnCl2(Sigma)
1)小規模の固定化
固定化の効率を試験するため、約30mlの容量の被覆カラム(11mm×300mmのカラム寸法)内で小さな固定床反応を実施した。XAD2樹脂及びA568樹脂の双方を水で数回洗浄することにより、微粒子(すなわち、樹脂作製時の副産物である樹脂微粒子(つまり、壊れた/割れた粒子))と作製時の残留物とを取り除いた。2gの凍結乾燥酵素(すなわち、エピメラーゼ)を約50mlの水に溶解し、2つのアリコートに分けた。pHを測定し、6.5であると判定した。約30mlの各樹脂を、室温で約1時間、軽い攪拌によって1つのアリコートのエピメラーゼ溶液とインキュベートした。その後、樹脂を被覆カラム内に詰め、蠕動ポンプを使用してさらに2時間、固定床を通じてエピメラーゼ溶液を循環させた。その後、10ベッド容積のトリスバッファー100mM、pH8.0でカラムを洗浄した。この時点での廃水は透き通って見え、A280では分光学的に測定されたタンパク質はなかった。結晶果糖グリーンをRO水で60%DSまで希釈し、pHを8.0に調整した後、28ppmのMnCl2及び10mMのトリスバッファーpH8.0を添加することにより、結晶果糖グリーン供給物を調製した。
固定化のスケールアップした効率を試験するため、約300mlの質量の被覆カラム内(25mm×600mmカラム寸法)により大型の固定床反応器を作製した。XAD2樹脂及びA568樹脂を水で数回洗浄することにより、微粒子や作製時の残留物を取り除いた。10gの凍結乾燥エピメラーゼを約100mlの水に溶解した。約300mlのA568樹脂を300mlの被覆カラムに詰め、蠕動ポンプを使用して室温で約2時間、固定ベッドを通じてエピメラーゼ溶液を循環させた。その後、室温にて、カラムを5ベッド容積のトリスバッファー100mM、pH8.0で洗浄した。この時点での廃水は透き通って見え、A280では分光学的に測定されたタンパク質はなかった。結晶果糖グリーンをRO水で60%DSまで希釈し、pHを8.0まで調整した後、28ppmのMnCl2及び10mMのトリスバッファーpH8.0を添加することにより、結晶果糖グリーン供給物を調製した。その後、再循環水浴で被覆カラムを57℃の温度まで加熱しながら、1時間当たり8ベッド容積(BV/h)の速度で、供給物を30ml固定床反応器を通じて供給した。反応器の廃液を回収し、FT−IRで解析してアルロースと果糖の相対濃度を出した。このプロセスを計4日間続けた。この供給速度は、試験的生成工程を通じて1時間当たり8ベッド容積から1時間当たり2ベッド容積に調整した。さらに、カラムを2週間、室温に置いた後、カラム保管中のエピメラーゼ安定性の判定を再開した。
XAD2を入れた30mlのカラムでは、いずれのサンプルにも顕著な転換が見られず、従って、さらなる解析を実施しなかった。しかしながら、DowexのA568で著しい転換が観察された。図13は、A568樹脂を入れた30mlの固定床反応器における反応の時間経過を示している。僅か1gのエピメラーゼを含有する固定床転換を120時間続けることで、4kg超のアルロースを生成した。転換率は、120時間を越えると徐々に低下し、これを補償すべくカラムの流量を72時間で低下させた。反応中、アルロースの平衡近傍濃度が得られた。
Claims (20)
- タンパク質であって、
配列番号6に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、
前記タンパク質は、プシコース3−エピメラーゼ活性を有し、前記ポリペプチド配列は配列番号6と同一ではないタンパク質。 - 前記ポリペプチド配列は、配列番号6に対して少なくとも95%、又は99%の配列同一性を有する請求項1に記載のタンパク質。
- 前記タンパク質は、固体基質上に固定化される請求項1又は2に記載のタンパク質。
- アルロース合成のためのタンパク質の使用であって、
前記タンパク質は、配列番号6に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、プシコース3−エピメラーゼ活性を有する、使用。 - 核酸分子であって、
請求項1〜3のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子。 - 配列番号5に対して少なくとも90%、95%、又は99%の配列同一性を有し、配列番号5と同一ではないポリヌクレオチド配列を含む請求項5に記載の核酸分子。
- 請求項5又は6に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項5又は6に記載の組換え核酸分子を含む宿主細胞。
- 前記宿主細胞は、酵母、バクテリア、若しくはその他の微生物であるか、又は、哺乳動物、植物、若しくはその他の培養細胞である請求項8に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞は大腸菌である請求項9に記載の宿主細胞。
- アルロースの生成方法であって、
果糖基質をアルロースに転換する条件下において、配列番号6に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、プシコース3−エピメラーゼ活性を有する、タンパク質を前記果糖基質に接触させるステップを含む方法。 - 前記タンパク質は、宿主細胞内に存在する請求項11に記載の方法。
- 前記タンパク質は、単離形態である請求項11に記載の方法。
- 前記条件には、前記タンパク質及び前記果糖基質を25℃〜75℃の温度範囲に維持することが含まれる請求項11〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記条件には、前記タンパク質及び前記果糖基質をpH4〜pH10の範囲に維持することが含まれる請求項11〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記条件には、前記果糖基質を75%〜95%(w/v)の濃度範囲に維持することが含まれる請求項11〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 配列番号5に対して少なくとも90%の配列同一性を有し、配列番号5と同一ではなく、プシコース3−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子。
- プシコース3−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含んだ組換え核酸分子を含む宿主細胞であって、
前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号5に対して少なくとも90%の配列同一性を有し、配列番号5と同一ではない
宿主細胞。 - プシコース3−エピメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んだ核酸分子を含むベクターであって、
前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号5に対して少なくとも90%の配列同一性を有し、配列番号5と同一ではない
ベクター。 - アルロースの生成方法であって、
i)プシコース3−エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を有する核酸分子を含むベクターを提供するステップを含み、前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号5に対して少なくとも90%の配列同一性を有し、前記方法はさらに、
ii)前記ポリヌクレオチド配列にコードされたプシコース3−エピメラーゼ活性を有する前記タンパク質を合成するステップと、
iii)果糖をプシコース3−エピメラーゼ活性を有する前記タンパク質に接触させ、果糖からアルロースへの転換を可能にする条件下において、前記果糖及び前記タンパク質を維持するステップと、
iv)前記ステップiii)において生成した前記アルロースを少なくとも部分的に精製するステップとを含む方法。
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