CN100577793C - 微生物转化d-果糖制备d-阿洛酮糖的菌种和方法 - Google Patents
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Abstract
微生物转化D-果糖制备D-阿洛酮糖的菌种和方法，属于食品生物技术领域。本发明涉及一株从鱼塘底泥中筛选获得的球形红杆菌(Rhodobactersphaeroides)SK011，保藏编号CCTCC NO：M 207185，及对其培养发酵，并用于转化D-果糖制备D-阿洛酮糖的方法。本发明以SK011作为菌种，采用碳源、氮源、诱导物和无机盐组成的发酵培养基，培养所得菌体进一步处理得到细胞生物催化剂，以D-果糖为底物，生物转化制备D-阿洛酮糖。在优化条件下发酵培养，发酵液或游离细胞或透性化细胞或冻干菌粉或其固定化细胞用于D-果糖转化0.5-48h，转化液中含D-阿洛酮糖2-50g/L。
Description
技术领域
微生物转化D-果糖制备D-阿洛酮糖的菌种和方法，本发明涉及一株筛选获得的球形红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)SK011，保藏编号为：CCTCC NO：M207185，及对其培养发酵，并用于转化D-果糖制备D-阿洛酮糖的方法。属于食品生物技术领域。
背景技术
近年来，功能食品成为广大消费者关注的热点，更是广大食品从业者研发的焦点。糖尿病、肥胖和心血管疾病人群的逐年增加和低龄化，使得低热量、具有更多功能营养特性的功能性甜味剂成为关注的热点。
D-阿洛酮糖是一种在自然界中较为稀有的天然己酮糖，属于稀有糖的一种。国际稀有糖协会(ISRS)对稀有糖的定义为“在自然界存在但含量极少的一类单糖及其衍生物”。D-可洛酮糖(D-Psicose)是D-果糖的“差向异构体”。在自然界中少量存在于通过蔗糖水解或者D-葡萄糖异构得到的D-葡萄糖和D-果糖的混合物中，少量出现于甘蔗和甜菜糖蜜加工过程，在小麦、鼠刺属植物和抗生素阿洛酮糖腺苷中也有少量存在。其甜味类似于蔗糖，甜味与D-果糖相当，而热量值只有0.007kcal/g，因此被称为零能量甜味剂。同时D-阿洛酮糖还具有良好的功能特性，如D-阿洛酮糖在消化道仅有少量吸收，且不产生能量，作为一个甜味剂被用作减肥辅助治疗；口服D-阿洛酮糖可抑制肠道α-葡萄糖苷酶活性，防止或减少口服蔗糖和麦芽糖后血糖升高；可抑制肝脏脂肪合成酶活性，减少脂肪沉积；体外实验发现具有神经保护作用，可抑制6-羟基多巴胺诱导的小鼠嗜铬细胞瘤细胞凋亡；与D-葡萄糖和D-果糖相比，具有较强的清除活性氧的能力等。
由于D-阿洛酮糖是一种较为罕见的单糖，其在自然界的含量极低，天然提取分离成本高，不适宜工业化大生产的要求，而化学催化法有许多不利的因素，例如形成许多副产物和化学污染物，而形成的众多副产物又使纯化步骤变得复杂。而生物法制备产物单一，且属于天然产品，符合消费者追求天然产品的消费心理，因此采用生物转化技术生产D-阿洛酮糖，巳成为研究的热点。
用生物转化法制备D-阿洛酮糖的研究已经有10余年的历史，但迄今为止，仅有三种微生物被发现具有生物转化D-果糖制备D-阿洛酮糖的功能，包括Pseudomonas cichorii(Ken Izumori et al.US 5679562，1997；US 5411880，1995)和基因工程菌(Oh D-K，et al.WO 2006129954)中提取得到的酶；以及采用Sinorhizobium sp.(Oh D-K，et al.World Journal of Microbiology and Biotechnology，2007)细胞转化D-果糖制备D-阿洛酮糖。因此，筛选新的微生物菌种进行生物转化制备D-阿洛酮糖成为食品工业从业者的新任务。
发明内容
本发明的目的是筛选出一种能有效生物转化D-果糖为D-阿洛酮糖的新菌株，并提供一种新的生物转化反应生成功能性甜味剂D-阿洛酮糖的方法。
本发明的技术方案：一株转化D-果糖制备D-阿洛酮糖的菌种，其分类命名为球形红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)SK011，保藏编号为CCTCC NO：M207185。
用所述球形红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)SK011菌株转化D-果糖制备D-阿洛酮糖的方法：
A、菌株的培养：
(1)出发菌株：球形红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)SK011；
(2)保藏培养基：葡萄糖营养琼脂培养基；
(3)种子培养基：葡萄糖1-10g/L，玉米浆10-100g/L，尿素1-20g/L，K2HPO4·3H2O 0.1-5g/L，KH2PO40.1-5g/L，MgSO4·7H2O 0.1-5g/L，pH 7.0，去离子水配制；
种子培养条件：用250mL三角瓶装25-70mL种子培养基，按常规方法灭菌、冷却、接种后于30-45℃，150-250r/min摇床培养12-24h作种子培养液；
(4)发酵培养基组成：玉米浆10-100g/L，尿素1-5g/L，K2HPO4·3H2O 0.1-5g/L，KH2PO40.1-5g/L，MgSO4·7H2O 0.1-5g/L，pH 7.0，去离子水配制；
发酵条件：用250mL三角瓶装25-70mL培养基，按常规方法灭菌、冷却、接种后于30-45℃，150-250r/min摇床培养12-24h后添加1.5g/L的D-塔格糖作为诱导物继续培养12-24h；
B、生物转化：
(1)将培养所得到的发酵液进一步处理得到的湿菌体、冻干菌粉、透性化细胞或固定化细胞作为细胞生物催化剂；
(2)将D-果糖按0.1％-75％的比例配制成水溶液作为生物转化底物反应液；
(3)将细胞生物催化剂，加入底物反应液进行转化反应；生物转化反应条件为：底物D-果糖浓度为0.1％-75％，细胞生物催化剂以游离细胞计对底物溶液的用量为10-200g/L；初始pH 5.0-10.0，转化反应温度为20-50℃，150-250r/min摇床培养，转化反应时间0.5-24h；在此条件下所得的转化液用高效液相色谱(HPLC)测定产物量。
C、提纯与精制：将转化反应结束后的反应液用D001型强酸性苯乙烯树脂进行离子交换，去离子水洗涤，再经U20专用树脂纯化，浓缩，结晶，干燥后即得成品D-阿洛酮糖。
一株从鱼塘底泥中筛选获得的微生物菌种SK011，其特征为能耐受高底物浓度，可将D-果糖转化为D-阿洛酮糖，经鉴定该菌株为球形红杆菌Rhodobactersphaeroides SK011(CCTCC NO：M 207185)。
微生物菌株的筛选与鉴定：
本发明从鱼塘底泥中采集土样，接种到富集培养基中进行光照厌氧培养，待培养液明显呈红色，再重复富集培养2次。对富集培养所得菌液采用半固体琼脂培养基梯度稀释厌氧培养，挑选单菌落平板划线得到单菌落后采用D-果糖为单一碳源进行摇瓶发酵，发酵液离心上清采用薄层层析法(TLC法)定性D-阿洛酮糖。将初筛得到的菌株进一步进行复筛，以HPLC法定量测定D-阿洛酮糖浓度，最终筛选出目标菌株SK011。
固定化细胞反复分批转化法是一批转化结束后，过滤，回收固定化细胞，作为下一次转化反应的催化剂，加入新配制的底物继续转化，固定化细胞分批转化试验表明可以连续反复进行多次。
检测D-阿洛酮糖含量的方法：
取反应液离心，上清液微孔滤膜过滤(0.22μm)，滤液上HPLC分析。HPLC条件：Waters2410色谱柱：Sugarpak1，6.5mm id×300mm钙型阳离子交换柱，流动相：纯水，检测器：示差折光检测器，柱温：85℃，流速：0.4mL/min，进样量：10μL，D-阿洛酮糖标样浓度：0.5％。
本发明的有益效果：本发明以SK011作为菌种，采用碳源、氮源、诱导物和无机盐组成的发酵培养基，培养所得菌体进一步处理得到细胞生物催化剂，以D-果糖为底物，生物转化制备D-阿洛酮糖。在优化条件下发酵培养，发酵液或游离细胞或透性化细胞或冻干菌粉或其固定化细胞用于D-果糖转化0.5-48h，转化液中含D-阿洛酮糖2-50g/L。筛选出的新的微生物菌种SK011进行生物转化制备D-阿洛酮糖比国外报道的野生菌转化制备D-阿洛酮糖的转化率为高。
生物材料样品保藏
一种用于微生物转化D-果糖制备D-阿洛酮糖的菌株，分类命名为球形红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)SK011，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，其保藏编号为CCTCC NO：M 207185，保藏日期：2007年11月26日。
具体实施方式
以下是SK011进行生物转化D-果糖制备D-阿洛酮糖的实施例，说明本发明的方法，但本发明并不限于所列出的几个实例。
实施例1
用SK011进行培养发酵，斜面培养基为葡萄糖营养琼脂培养基。种子培养基组成为葡萄糖3g/L；玉米浆20g/L；尿素10g/L；K2HPO4.3H2O 0.8g/L；KH2PO42.5g/L，MgSO4.7H2O 0.9g/L；pH 7.0；种子培养基培养条件：用250mL三角瓶装50mL培养基，按常规方法灭菌、冷却、接种后于30℃，180r/min摇床培养24h作为种子培养液。发酵培养基组成为：玉米浆30g/L，尿素2g/L，K2HPO4.3H2O 3g/L，KH2PO43g/L，MgSO4.7H2O 1g/L，pH 7.0，去离子水配制；发酵条件：用250mL三角瓶装45mL培养基，按常规方法灭菌、冷却、接种后于33℃，180r/min摇床培养12h后添加1.5g/L的D-塔格糖作为诱导物继续培养24h，最终获得细胞干重为2g/L的发酵液。
将50mL发酵液经5000g，4℃，离心10min得到湿菌体量0.5g，在50mL三角瓶中加入10mL 1％D-果糖溶液，初始pH值5.0，37℃，180r/min振荡转化24小时，测得反应液中D-阿洛酮糖浓度为4g/L。
实施例2
按实施例1方法用SK011进行培养发酵，得到的湿菌体0.8g，加入5％的十六烷基三甲基溴化铵对细胞进行透性化处理，室温处理20min后用生理盐水洗细胞2次后，在50mL三角瓶中加入10mL 10％D-果糖溶液，初始pH值8.0，25℃，180r/min振荡转化12小时，测得反应液中D-阿洛酮糖浓度为6g/L。
实施例3
按实施例1方法用SK011进行培养发酵，得到的湿菌体9g，加入1％甲苯对细胞进行透性化处理，室温处理20min后用生理盐水洗细胞2次后，在50mL三角瓶中加入10mL 50％D-果糖溶液，初始pH值10.0，45℃，180r/min振荡转化1小时，测得反应液中D-阿洛酮糖浓度为46g/L。
实施例4
按实施例1方法用SK011进行培养发酵，得到的湿菌体0.8g，用8mL生理盐水调成10％菌悬液；另用0.9g藻酸钠，20mL生理盐水，配制成4.5％浓度的海藻酸钠溶液，煮沸溶解，冷却至45℃左右；与菌悬液混合搅拌均匀，用胶头滴管滴入100mL 0.1M的CaCl2溶液中，于4℃下浸泡硬化4h后即为固定化细胞用于生物转化。按实施例2方式用8g固定化细胞与0.8g湿菌体细胞对照进行转化，反复分批转化结果如表1所示。
表1固定化细胞反复分批转化结果
Claims (2)
1、一株转化D-果糖制备D-阿洛酮糖的菌种，其分类命名为球形红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)SK011，保藏编号为CCTCC NO：M 207185。
2、用权利要求1所述球形红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)SK011菌株转化D-果糖制备D-阿洛酮糖的方法，其特征是
A、菌株的培养：
(1)出发菌株：球形红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)SK011；
(2)保藏培养基：葡萄糖营养琼脂培养基；
(3)种子培养基：葡萄糖1-10g/L，玉米浆10-100g/L，尿素1-20g/L，K2HPO4·3H2O 0.1-5g/L，KH2PO4 0.1-5g/L，MgSO4·7H2O 0.1-5g/L，pH 7.0，去离子水配制；
种子培养条件：用250mL三角瓶装25-70mL种子培养基，按常规方法灭菌、冷却、接种后于30-45℃，150-250r/min摇床培养12-24h作种子培养液；
(4)发酵培养基组成：玉米浆10-100g/L，尿素1-5g/L，K2HPO4·3H2O 0.1-5g/L，KH2PO40.1-5g/L，MgSO4·7H2O 0.1-5g/L，pH 7.0，去离子水配制；
发酵条件：用250mL三角瓶装25-70mL培养基，按常规方法灭菌、冷却、接种后于30-45℃，150-250r/min摇床培养12-24h后添加1.5g/L的D-塔格糖作为诱导物继续培养12-24h；
B、生物转化：
(1)将培养所得到的发酵液进一步处理得到的湿菌体、冻干菌粉、透性化细胞或固定化细胞作为细胞生物催化剂；
(2)将D-果糖按0.1％-75％的比例配制成水溶液作为生物转化底物反应液；
(3)将细胞生物催化剂，加入底物反应液进行转化反应；生物转化反应条件为：底物D-果糖浓度为0.1％-75％，细胞生物催化剂以游离细胞计对底物溶液的用量为10-200g/L；初始pH 5.0-10.0，转化反应温度为20-50℃，150-250r/min摇床培养，转化反应时间0.5-24h；
C、提纯与精制：将转化反应结束后的反应液用D001型强酸性苯乙烯树脂进行离子交换，去离子水洗涤，再经U20专用树脂纯化，浓缩，结晶，干燥后即得成品D-阿洛酮糖。
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