CN101531975B - 一种发酵乳酸杆菌及利用其制备d-塔格糖的方法 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明公开了一种发酵乳酸杆菌，其分类命名为发酵乳酸杆菌(Lactobacillusfermentum)NXTag-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号是CGMCC No.2921。本发明还公开了利用上述发酵乳酸杆菌制备D-塔格糖的方法，即将上述菌株接种于含碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中，经培养获得含L-阿拉伯糖异构酶的细胞，进而采用游离的或者经固定化的细胞转化D-半乳糖生成D-塔格糖。本发明筛选得到的发酵乳酸杆菌能够高效转化D-半乳糖生成D-塔格糖，转化液中D-塔格糖浓度可达45g/L，D-塔格糖对底物的转化率可达50％以上，且无副产物形成。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程和酶工程技术领域，具体涉及一种发酵乳酸杆菌及利用其制备D-塔格糖的方法。
背景技术
D-塔格糖(D-tagatose)是一种较为罕见的天然六碳酮糖，甜度为蔗糖的92％，而产生的热量只是蔗糖的1/3，具有改善肠道菌群、不致龋齿并对治愈II型糖尿病患者有辅助效果等生理功效，是一种很好的低能量食品甜味剂和填充剂。此外，因其具强抗氧化性和保护细胞效应，可作为有应用价值的药物中间体来显著抑制可卡因等对肝细胞的毒害和促进母体及胚胎健康，D-Tag将被广泛的应用于美容、食品和医药行业。
塔格糖的发展始于上世纪90年代中期，其早期的生产工艺由美国生物技术公司Spherix发明，2001年4月塔格糖正式被美国FDA批准为GRAS产品。同年7月联合国粮农组织和世界卫生组织联合食品添加剂委员会(JECFA)推荐塔格糖为一种新的低热量甜味剂，可以作为食品添加剂使用。1997年，丹麦MD食品公司获得美国Spherix公司的许可，生产和销售用作食品添加剂的塔格糖。2000年MD公司与Arla食品集团合并，组成了欧洲量大、世界第二大乳制品生产商，该公司生产干酪产生的大量乳清成为塔格糖原料的重要来源。几年来塔格糖的生产进展缓慢，产品迟迟不能上市，曾引起美国Spherix公司对MD公司的法律诉讼。直到2003年，Arla乳制品集团和德国食糖生产商Nordzucker达成协议，在德国的汉诺威建立了塔格糖的生产厂，年产塔格糖1250吨，并以Gaio商品名投放市场，2003年夏季产品正式上市。该产品最早在美国获准上市，2003年10月欧洲委员会正式批准Gaio塔格糖投入欧盟市场，获准塔格糖上市销售的还有澳大利亚、新西兰、韩国等国家。
目前国内还未有塔格糖的工业化报道，国外主要以乳糖水解液为原料，通过化学和生物法异构而成。Beadle等以乳糖为原料化学合成D-塔格糖，但化学法为高消耗、高污染，副产物多、不利于后续分离纯化、产率低。近年来D-塔格糖的研究集中在利用L-阿拉伯糖异构酶(L-AI)酶法转化D-半乳糖生成D-塔格糖，菌株包括Escherichia coli、Thermotoga neapolitana(陆地热泉高温神袍菌)、Geobacillus stearothermophilus(嗜热脂肪地芽孢杆菌)、Geobacillus thermodenitrificans(高温烷烃芽孢杆菌)、Thermus sp(栖热菌，温泉里可筛选)、Thermoanaerobacter mathranii(嗜热杆菌)、Thermotoga maritima(海栖热袍菌)、Alicyclobacillus acidocaldarius(酸热脂环酸芽孢杆菌)、Bacillusstearothermophilus US100(嗜热脂肪芽孢杆菌)等。其中乳酸菌为益生菌，生长适宜的pH和底物乳糖水解液pH一致，操作方便，故引人关注，有一些专利申请，如Lactobacillusplantarum(CN1948500A，2007)、L.pentose(US6057135，2000)，但是生成的产物在转化后期会被进一步代谢，从而转化率较低。因此，若能筛选获得一株性能良好、酶活高的D-塔格糖产生菌，对开发自主产权的D-塔格糖产业化具有重大的现实意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一株高产L-阿拉伯糖异构酶的发酵乳酸杆菌。
本发明还要解决的技术问题是提供利用上述发酵乳酸杆菌制备D-塔格糖的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
本发明人实验室选育并保藏的微生物菌株发酵乳酸杆菌(Lactobacillus fermentum)NXTag-1，目前该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，登记入册的编号是CGMCCNo.2921，保藏日期是：2009年02月25日，以此菌作为生产菌株。
CGMCC No.2921菌株具有下述性质：
1、菌落形态学特征：
在MRS培养基上，37℃培养48h出现边缘乳白色小菌落(
)，菌落呈圆形，表面光滑，中央凸起，透明。适当延长培养，菌落增大，细胞的尺寸和形状变化很小。
2、生理与生化特性：
a.培养温度：30～40℃，最适温度为37℃；
b.在pH 6.0～8.0范围内生长；
c.不产生色素；
d.耐NaCl浓度：在5％浓度可以生长。
3、16S rDNA序列分析：
测得16S rDNA大部分序列1408bp，如SEQ ID No：1所示。将所测序列从GeneBank数据库中的相关种进行比较，构建16S rDNA全序列为基础的系统发育树。结果表明：菌株NXTag-1与发酵乳酸杆菌达到100％同源。所以认定本发明使用的是发酵乳酸杆菌，具体为发酵乳酸杆菌NXTag-1(CGMCC No.2921)。
4、营养特征：
发酵乳酸杆菌NXTag-1的培养基中不需要添加生长因子，可以利用多种化合物作为碳源，这些物质既可以单独使用，也可以适当的比例复配充当碳源，有机氮或无机氮都可以作为氮源使用。培养基营养物质组分为：碳源用量1～50g/L，氮源用量的2～30g/L，无机盐用量为培养基的0.001～10g/L，其余为水。碳源为葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖和可溶性淀粉中的一种或多种；氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素和(NH4)2SO4中的一种或多种；无机盐为钾盐、镁盐、锰盐、钠盐、磷酸盐、磷酸二氢盐和盐酸盐中的一种或多种盐类。
利用上述发酵乳酸杆菌NXTag-1(CGMCC No.2921)制备D-塔格糖的方法：将保藏号为CGMCC No.2921的菌株接种于含碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中，在合适生长的条件下进行培养，经离心、絮凝或微滤获得含L-阿拉伯糖异构酶的细胞，进而采用游离的或者经固定化的含L-阿拉伯糖异构酶的细胞转化D-半乳糖生成D-塔格糖。
产酶条件：
将发酵乳酸杆菌NXTag-1(CGMCC No.2921)斜面活化二天后(斜面培养基成分除含有碳源、氮源、无机盐等之外，还含有2％的琼脂)，接种于含碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中。
其中，所述培养基中：碳源用量1～50g/L，氮源用量的2～30g/L，无机盐用量为培养基的0.001～10g/L，其余为水。其中，所述培养基中，碳源为葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖和可溶性淀粉中的一种或多种；氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素和(NH4)2SO4中的一种或多种；无机盐为钾盐、镁盐、锰盐、钠盐、磷酸盐、磷酸二氢盐和盐酸盐中的一种或多种。
其中，所述的合适生长的条件是：初始pH为6.0～8.0，培养温度为30～40℃，培养时间为8～20小时，细胞湿重达15～30g/L，发酵液酶活达1～10U/mL。
其中，若采用离心方法获得含L-阿拉伯糖异构酶的细胞，则离心条件为：室温条件下，5000～10000r/min，10～30min；若采用微滤的方法获得含L-阿拉伯糖异构酶细胞，所用的微滤膜孔径为0.1～0.45μm，操作压力0.01～3.0MPa。
L-阿拉伯糖异构酶酶活测定：用0.2M的磷酸钾缓冲液(pH7.0)配制含0.5M D-半乳糖(内含0.01mM MnCl2)加入细胞破碎离心后上清液，该混合物于60℃的水浴内反应60min后，置于100℃的沸水中2min以终止酶反应，然后用自来水冷却至室温。反应混合物适当稀释后经过离心和过滤后用HPLC法测定D-塔格糖生成量。一个单位的L-阿拉伯糖异构酶酶活定义为在60℃下，pH为7.0的条件下每分钟生成1μg的D-塔格糖的酶量。
酶法转化：
采用游离的或者经固定化的含L-阿拉伯糖异构酶的细胞转化D-半乳糖生成D-塔格糖是将游离细胞或者固定化后的细胞填充至反应容器中，加入1～100g/L的D-半乳糖(含0.01mM Mn2+)溶液进行酶转化反应，反应温度40～70℃，转化时间8～15h；或者，将固定化细胞装入填充床式柱反应器中，该反应器以0.5～5mL/min的流速单向流加或循环连续流加1～100g/L的D-半乳糖(含0.01mM Mn2+)溶液，进行酶转化反应，反应温度40～70℃，每批转化时间8～15h。
上述固定化方法为：配制1～5％(即1～5g/100mL)浓度的海藻酸钠，加入经10～25％的戊二醛处理后的细胞10～30％(即每100mL海藻酸钠溶液中加入10～30克的细胞)，再用浓度为1～4％的CaCl2溶液(g/100mL)将包埋材料海藻酸钠固定成型，以此作为酶源进行反应。除了海藻酸钠作为固定化载体包埋外，还可以卡拉胶、明胶或果胶钙等载体包埋细胞。
有益效果：本发明筛选得到一种能够高效转化D-半乳糖生成D-塔格糖的菌株，该菌是益生菌，能利用多种碳源和氮源发酵生产D-塔格糖，且发酵周期短，转化时间少，操作方便简单，D-塔格糖对底物的转化率可达50％，转化液中D-塔格糖浓度可达45g/L，且无副产物形成，另外随着反应进行也不会将产物D-塔格糖转化为其他成分。此外用固定化含L-阿拉伯糖异构酶的细胞转化可以反应20批次以上，平均转化率在50％以上，适用于工业化生产。
具体实施方式：
以下通过实施例对本发明作进一步说明，但对本发明没有限制。
实施例1：
斜面培养基：葡萄糖15g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，CaCO3 10g/L，琼脂20g/L，pH6.2～6.4。
种子培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，乙酸钠5g/L，K2HPO4 2g/L，MgSO4 0.58g/L，MnSO4 0.25g/L，pH6.2～6.4。
发酵培养基：葡萄糖20g/L，L-阿拉伯糖5g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，乙酸钠10g/L，K3PO4 0.2g/L，NaCl 0.01g/L，MgSO4 0.2g/L，MnSO4 0.1g/L，CaCO310g/L，pH6.8～7.0，121℃灭菌15分钟。
将保藏号为CGMCC No.2921的发酵乳酸杆菌(Lactobacillus fermentum)NXTag-1接两环于种子培养基中，37℃培养15h得种子液，将种子液按发酵液体积3％的接种量接入冷却后发酵培养基中，37℃好气培养14h，得到发酵液中菌体含量为16g/L，酶活达2.45U/mL，离心获得含L-阿拉伯糖异构酶的细胞，称取10g的湿菌体加入50mL 90g/L的D-半乳糖(含0.01mM Mn2+)溶液，60℃转化13h，终止反应，检测生成D-塔格糖45g/L，转化率达50％。
实施例2：
培养基配方同实施例1，将种子液按发酵液体积3％的接种量接入发酵培养基发酵液(厌氧装置)中，37℃静置培养14h，得到发酵液中菌体含量为10g/L，酶活达1.45U/mL，经微滤获得含L-阿拉伯糖异构酶的细胞，加入50mL 90g/L的D-半乳糖(含0.01mMMn2+)溶液，60℃转化13h，检测转化液中D-塔格糖30.34g/L，转化率为37.9％。
实施例3：
以15g/L D-葡萄糖为碳源，5g/L L-阿拉伯糖为诱导物，10g/L蛋白胨和5g/L酵母膏为氮源，培养基配方与培养方法同实施例1，将种子液按发酵液体积3％的接种量接入发酵培养基中，37℃好气培养14h，得到发酵液中菌体含量为20g/L，酶活达3.56U/mL，超滤获得含L-阿拉伯糖异构酶的细胞加入1g/L的D-半乳糖(含0.01mM Mn2+)溶液，60℃转化15h，检测转化液中D-塔格糖浓度为5.6g/L，转化率56％。
实施例4：
以20g/L乳糖为碳源，10g/L蛋白胨为氮源，培养基配方与培养方法同实施例1，将种子液按发酵液体积3％的接种量接入发酵培养基中，37℃好气培养3～4h，加入诱导剂10g/L L-阿拉伯糖，继续培养12h，得到发酵液中菌体含量为22g/L，酶活达3.12U/mL，离心获得含L-阿拉伯糖异构酶的细胞5g，加入10mL 100g/L的D-半乳糖(含0.01mMMn2+)溶液，60℃转化13h和24h，检测转化液中D-塔格糖浓度为51.34g/L和50.12g/L。
实施例5：
以20g/L麦牙糊精为碳源，15g/L豆粕粉为氮源，培养基配方与培养方法同实施例1，配制4％的海藻酸钠胶体溶液，与生理盐水调制的菌悬液混合均匀后，加入25％戊二醛处理10min，用注射器滴入1％的CaCl2溶液中固化，制成直径约为3～4mm的球状固定化细胞，于4℃冰箱中静置数小时。然后用pH7.0 0.2M磷酸钾缓冲溶液洗涤2次后，将5g湿细胞以海藻酸钠包埋得到10g固定化细胞(5g湿细胞/25mL4％的海藻酸钠溶液)加入50mL100g/L的D-半乳糖(含0.01mM Mn2+)溶液，60℃条件下在摇瓶中转化，每批转化时间13h，反应结束后，固定化颗粒取出，重复上述反应，转化20批次。D-塔格糖平均转化率均在50％以上。
实施例6：
以20g/L可溶性淀粉为碳源，15g/L玉米浆为氮源，培养基配方与培养方法同实施例1，称取50g湿菌体，加50mLpH7.5 50mM的Tris/HCl缓冲液中，混悬液中加入0.5％(v/v)TritonX-100，在55℃水浴保温15min；称取10g卡拉胶，加无菌水200mL，充分浸泡，加热溶解。将两者迅速混合，铺平板，于4℃冰箱放置静置数小时，凝固后切成2*2*2(mm3)左右大小的颗粒，再于1.5mol/L KCl溶液中浸泡1h，使其充分凝固。滤出颗粒分别用去离子水和50mL pH7.5 50mM的Tris/HCl缓冲液洗涤，4℃保存备用。所得菌体形成固定化细胞200g，装入4×45cm的填充床式柱反应器中，(三根串联的夹套式固定化柱)，固定化细胞的装柱量为70％(v/v)，以1mL/min的流速单向流加100g/L的D-半乳糖(含0.01mM Mn2+)溶液，60℃的条件下进行酶转化，13h为一个批次。该装置连续运行7天，生产率4.2g/(L·h)，转化D-半乳糖溶液12L，得到D-塔格糖的平均转化率为53.25％。
SEQUENCE LISTING
<110>南京工业大学
<120>一种发酵乳酸杆菌及利用其制备D-塔格糖的方法
<130>njut090222
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1408
<212>DNA
<213>发酵乳酸杆菌(Lactobacillus fermentum)
<400>1
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Claims (5)
1.一种发酵乳酸杆菌，其分类命名为发酵乳酸杆菌(Lactobacillus fermentum)NXTag-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号是CGMCC No.2921。
2.利用权利要求1所述的发酵乳酸杆菌制备D-塔格糖的方法，其特征在于将保藏号为CGMCC No.2921的菌株接种于含碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中，在合适生长的条件下进行培养，经离心、絮凝或微滤获得含L-阿拉伯糖异构酶的细胞，进而采用游离的或者经固定化的含L-阿拉伯糖异构酶的细胞转化D-半乳糖生成D-塔格糖；
其中，所述培养基中，培养基营养物质组分为：碳源用量1～50g/L，氮源用量2～30g/L，无机盐用量0.001～10g/L，其余为水；
所述培养基中，碳源为葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖和可溶性淀粉中的一种或多种；氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素和(NH4)2SO4中的一种或多种；无机盐为钾盐、镁盐、锰盐和钠盐中的一种或多种；
所述的合适生长的条件是：初始pH为6.0～8.0，培养温度为30～40℃，培养时间为8～20小时。
3.根据权利要求2所述的利用发酵乳酸杆菌制备D-塔格糖的方法，其特征在于采用离心、絮凝或微滤的方法获得含L-阿拉伯糖异构酶细胞，所用的微滤膜孔径为0.1～0.45μm，操作压力0.01～3.0MPa。
4.根据权利要求2所述的利用发酵乳酸杆菌制备D-塔格糖的方法，其特征在于采用游离的或者经固定化的含L-阿拉伯糖异构酶的细胞转化D-半乳糖生成D-塔格糖是将游离细胞或者固定化后的细胞填充至反应容器中，加入1～100g/L的D-半乳糖溶液进行酶转化反应，反应温度40～70℃，转化时间8～15h；或者，将固定化细胞装入填充床式柱反应器中，该反应器以0.5～5mL/min的流速单向流加或循环连续流加1～100g/L的D-半乳糖溶液，进行酶转化反应，反应温度40～70℃，每批转化时间8～15h。
5.根据权利要求4所述的利用发酵乳酸杆菌制备D-塔格糖的方法，其特征在于固定化细胞是采用海藻酸钙、卡拉胶、明胶或果胶钙作为固定化载体。
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2009
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