CN102533711A - 一种d-塔格糖3-差向异构酶固定化方法 - Google Patents
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Abstract
一种D-塔格糖3-差向异构酶固定化方法，属生物工程技术领域。本发明步骤是：（1）预处理菌体获得目的酶液；（2）预处理离子交换树脂；（3）向处理好的大孔离子交换树脂中加入D-塔格糖3-差向异构酶液进行吸附后，加入戊二醛溶液进行交联，用去离子水洗涤以除去游离酶和未交联的戊二醛，即得到固定化的D-塔格糖3-差向异构酶。本发明以离子交换树脂为载体，通过先吸附后交联的方法固定了D-塔格糖3-差向异构酶，该法操作简单，成本低廉，固定的D-塔格糖3-差向异构酶储存稳定性和操作稳定性高，有较宽的pH适应性，固定化酶活回收率可达50%以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种D-塔格糖3-差向异构酶固定化方法，属生物工程技术领域。
背景技术
国际稀有糖协会(ISRS)对稀有糖的定义为“在自然界存在但含量极少的一类单糖及其衍生物”。D-阿洛酮糖(D-Psicose)是一种在自然界中较为稀有的天然己酮糖，属于稀有糖的一种。D-阿洛酮糖是D-果糖在C3位置的差向异构体，其甜味类似于蔗糖，甜度相当于果糖的70%，而热量值却只有0.007kcal/g，因此被称为零能量甜味剂，同时D-阿洛酮糖还具有改善肠道菌群、降低血糖、抗龋齿等功能特性。
D-塔格糖3-差向异构酶(D-tagatose 3-epimerase，以下简称DTE)家族蛋白可催化D-果糖异构为D-阿洛酮糖，是D-阿洛酮糖生物转化生产的关键酶。由于固定化酶在稳定性、重复使用性、经济成本、特殊工艺需要等方面较游离酶制剂有着显著的优越性，为了更有效地利用各种游离酶制剂，酶的固定化研究也一直受到研究者的重视。而关于DTE家族的固定化研究并不多，目前仅有日本香川大学(Kagawa University)Izumori团队和韩国世宗大学(Sejong University) Oh团队对DTE家族的固定化进行过报道。其中，Izumori团队先后对菊芋假单胞菌(Pseudomonas cichorii)野生菌来源和重组表达的DTE固定化，进行D-阿洛酮糖的生物转化法生产研究，优化后的工艺以Chitopearl beads为载体，通过离子交换结合方法固定重组DTE；Oh团队以离子交换树脂Duolite A568对根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 来源重组表达的D-psicose 3-epimerase进行固定化，在硼酸盐存在下，D-阿洛酮糖的转化率达到65%。因此筛选新的树脂进行DTE家族的固定化成为食品从业者的新任务。
发明内容
本发明的目的在于提供一种D-塔格糖3-差向异构酶固定化方法。
本发明实现目的的技术方案是：
一种D-塔格糖3-差向异构酶固定化方法，包括下列步骤：
（1）获取酶液：称取R．sphaeroides SK01l发酵菌体，按质量体积比1:10的比例，加入缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，50mmol/L NaCl，pH7.0-8.0)重悬菌体，利用超声波细胞破碎仪处理菌体后，在转速为6000~10000r/min、温度为0~5℃的条件下离心10~30min，收集上清液，此上清液即为D-塔格糖3-差向异构酶液；
（2）离子交换树脂处理：采用313、或D301-Ⅲ离子交换树脂，先用去离子水浸泡胀润、去杂，接着用质量浓度4%NaOH溶液浸泡12h后去离子水清洗至中性，再用质量浓度4%HCl溶液浸泡12h后去离子水清洗至中性，最后用质量浓度4%NaOH溶液浸泡12h后去离子水清洗至中性，用两倍树脂体积的去离子水浸泡，4℃下保存；
（3）固定化：采用先吸附后交联的方法，向处理好的离子交换树脂中加入D-塔格糖3-差向异构酶液，每g树脂加入D-塔格糖3-差向异构酶粗酶液1-6mL，并加入上述Tris-HCl缓冲液补足6mL，于pH 7.0~8.0、20~40℃吸附6~12h后取出；加入戊二醛溶液至终浓度为0.01%~0.2%，于2~8℃轻轻振荡交联1~5h，用去离子水洗涤以除去游离酶和未交联的戊二醛，即得到固定化的D-塔格糖3-差向异构酶。
固定化酶液的制备
球形红杆菌(Rhodobacter sphaeroides，R．sphaeroides)，定名为R．sphaeroides SK01l，即CCTCC NO.M207185，通过发酵制备菌体（发酵具体条件见ZL200710191380.1）；离心发酵液(10000 g，10 min，4℃)收集菌体，用Tris-HCl缓冲液(50 mM，pH 8.0)洗涤细胞2次即得静息细胞；细胞按质量体积比1:10加入Tris-HCl缓冲液(50 mM，pH 8.0)重悬后超声破碎7 min(300 W，工作1 s，停3 s，冰浴)，离心(15000 g，20min，4℃)后对上清测定DTE活性，即为游离酶活。
游离DTE酶活力测定
取30 μL游离酶上清液，加50 μL 400 g/L D-果糖及120 μL Tris-HCl(50 mM，pH 8.0)缓冲液，50℃反应5 min，立即取出，加热煮沸10 min终止反应，冷却，12000 r/min离心15min后取上清，HPLC检测。
固定化DTE酶活力测定
称取固定化酶0.1g，加1mL 100 g/L D-果糖（用50 mM，pH 8.0的Tris-HCl缓冲液配制)，反应及测定方法同游离DTE酶活力测定。
酶活力定义
在50℃、pH 8.0条件下，以D-果糖为底物反应，每分钟生成1 μmol D-阿洛酮糖的酶量为一个酶活力单位。
酶活回收率定义
固定化酶的酶活回收率是指固定化酶的总活力与用于固定化的游离酶的总酶活力之比的百分率。
通过测定催化D-果糖发生差向异构生成的D-阿洛酮糖的数量来确定酶活。反应在含有50 mM D-果糖的甘氨酸／氢氧化钠缓冲液(50 mM，pH 9.0)中进行，加酶量0.1 U/mL。40℃保温10 min后对反应体系100℃加热10min中止酶反应，离心(15000 g，20min，4℃)后取上清微孔滤膜过滤(O.22μm)，HPLC测定滤液D-阿洛酮糖含量。
阿洛酮糖的检测方法
取酶反应液离心(10000 g，10 min)，上清液用微孔滤膜(0.22 μm)过滤，滤液用HPLC分析。HPLC分析条件：Waters 600高效液相色谱仪，Sugarpak-l钙型阳离子交换柱，Waters 2410示差折光检测器。流动相：纯水，柱温：85℃，流速：0.4 mL/min，
进样量：10μL。D-阿洛酮糖标样浓度1 mg/mL。
本发明的有益效果：本发明以离子交换树脂为载体，用戊二醛交联固定D-塔格糖3-差向异构酶，操作简单，成本低廉，固定的D-塔格糖3-差向异构酶储存稳定性和操作稳定性高，有较宽的pH适应性，固定化酶活回收率可达50%以上，具有一定的实际意义。
具体实施方式
以下通过具体实施例来说明本发明的技术方案，但这些实施例并不限制本发明的保护范围。
实施例1：
一种D-塔格糖3-差向异构酶固定化方法，步骤是：
(1)称取R．sphaeroides SK01l发酵菌体，按质量体积比1:10的比例，加入缓冲液A(50mmol/L Tris-HCl，50mmol/L NaCl，pH7.0)重悬菌体，用超声波细胞破碎仪处理后，在转速为6000r/min、温度为0℃的条件下离心10min，收集上清液，此上清液即为0.1 g/mL D-塔格糖3-差向异构酶粗酶液。
(2)313离子交换树脂先用去离子水浸泡胀润、去杂，接着用4%NaOH浸泡12h后去离子水清洗至中性，再用4%HCl浸泡12h后去离子水清洗至中性，最后用4%NaOH浸泡12h后去离子水清洗至中性，用两倍树脂体积的去离子水浸泡，4℃下保存。
(3)用滤纸吸干湿树脂表面的水后称取0.5g于三角瓶中，加入D-塔格糖3-差向异构酶粗酶液0.5mL，再加入缓冲液A 2.5mL，于20℃振荡吸附6h后取出，加入戊二醛溶液至终浓度为0.01%，于2℃轻轻振荡1h，用去离子水洗涤以除去游离酶和未交联的戊二醛，即得到固定化的D-塔格糖3-差向异构酶。测定固定化后的D-塔格糖3-差向异构酶的活性，与原酶液活力对比，固定化酶的酶活回收率为53.38%。
实施例2：
一种D-塔格糖3-差向异构酶固定化方法，步骤是：
(1)称取R．sphaeroides SK01l发酵菌体，按质量体积比1:10的比例，加入缓冲液B(50mmol/L Tris-HCl，50mmol/L NaCl，pH7.5)重悬菌体，用超声波细胞破碎仪处理后，在转速为8000r/min、温度为3℃的条件下离心20min，收集上清液，此上清液即为0.1 g/mL D-塔格糖3-差向异构酶粗酶液。
(2)D301-Ⅲ离子交换树脂先用去离子水浸泡胀润、去杂，接着用4%NaOH浸泡12h后去离子水清洗至中性，再用4%HCl浸泡12h后去离子水清洗至中性，最后用4%NaOH浸泡12h后去离子水清洗至中性，用两倍树脂体积的去离子水浸泡，4℃下保存。
(3)用滤纸吸干湿树脂表面的水后称取0.5g于三角瓶中，加入D-塔格糖3-差向异构酶粗酶液1.5mL，再加缓冲液B 1.5mL，于30℃振荡吸附9h后取出，加入戊二醛溶液至终浓度为0.1%，于5℃轻轻振荡3h，用去离子水洗涤以除去游离酶和未交联的戊二醛，即得到固定化的D-塔格糖3-差向异构酶。测定固定化后的D-塔格糖3-差向异构酶的活性，与原酶液活力对比，固定化酶的酶活回收率为60.14%。
实施例3：
一种D-塔格糖3-差向异构酶固定化方法，步骤是：
(1)称取R．sphaeroides SK01l发酵菌体，按质量体积比1:10的比例，加入缓冲液C(50mmol/L Tris-HCl，50mmol/L NaCl，pH8.0)重悬菌体，用超声波细胞破碎仪处理后，在转速为10000r/min、温度为5℃的条件下离心30min，收集上清液，此上清液即为0.1 g/mL D-塔格糖3-差向异构酶粗酶液。
(2)313离子交换树脂先用去离子水浸泡胀润、去杂，接着用4%NaOH浸泡12h后去离子水清洗至中性，再用4%HCl浸泡12h后去离子水清洗至中性，最后用4%NaOH浸泡12h后去离子水清洗至中性，用两倍树脂体积的去离子水浸泡，4℃下保存。
用滤纸吸干湿树脂表面的水后称取1g于三角瓶中，加入D-塔格糖3-差向异构酶粗酶液6mL，于40℃振荡吸附12h后取出，加入戊二醛溶液至终浓度为0.2%，于8℃轻轻振荡5h，用去离子水洗涤以除去游离酶和未交联的戊二醛，即得到固定化的D-塔格糖3-差向异构酶。测定固定化后的D-塔格糖3-差向异构酶的活性，与原酶液活力对比，固定化酶的酶活回收率为57.26%。
Claims (1)
1.一种D-塔格糖3-差向异构酶固定化方法，其特征在于包括下列步骤：
（1）获取酶液：称取R．sphaeroides SK01l发酵菌体，按质量体积比1:10的比例，加入50mmol/L Tris-HCl、50mmol/L NaCl、pH7.0-8.0缓冲液重悬菌体，利用超声波细胞破碎仪处理菌体后，在转速为6000~10000r/min、温度为0~5℃的条件下离心10~30min，收集上清液，此上清液即为D-塔格糖3-差向异构酶液；
（2）离子交换树脂处理：采用313、或D301-Ⅲ离子交换树脂，先用去离子水浸泡胀润、去杂，接着用质量浓度4%NaOH溶液浸泡12h后去离子水清洗至中性，再用质量浓度4%HCl溶液浸泡12h后去离子水清洗至中性，最后用质量浓度4%NaOH溶液浸泡12h后去离子水清洗至中性，用两倍树脂体积的去离子水浸泡，4℃下保存；
（3）固定化：采用先吸附后交联的方法，向处理好的离子交换树脂中加入D-塔格糖3-差向异构酶液，每g树脂加入D-塔格糖3-差向异构酶粗酶液1-6mL，并加入上述Tris-HCl缓冲液补足6mL，于pH 7.0~8.0、20~40℃吸附6~12h后取出；加入戊二醛溶液至终浓度为0.01%~0.2%，于2~8℃轻轻振荡交联1~5h，用去离子水洗涤以除去游离酶和未交联的戊二醛，即得到固定化的D-塔格糖3-差向异构酶。
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