CN101492666A - 离子交换树脂载体固定多酚氧化酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以离子交换树脂为载体来固定多酚氧化酶的方法。目前固定多酚氧化酶的载体主要为海藻酸钠和壳聚糖，可以实现酶分子不溶于水中，达到酶分子的固定化效果，但是同样增加了酶分子和底物结合作用的空间位阻，降低了酶的催化效率。本发明的特征在于采用酸洗－碱洗－酸洗的顺序对离子交换树脂载体进行活化，接着加入酶蛋白溶液，在恒温摇床中进行吸附固定化，然后加入交联剂进行交联，之后过滤，用缓冲液冲洗，得到微球状颗粒，即为高酶活性的固定化多酚氧化酶。本发明减少了底物与固定化酶作用的空间位阻，酶催化效率高。

Description

离子交换树脂载体固定多酚氧化酶的方法

技术领域

本发明涉及一种以离子交换树脂为载体来固定多酚氧化酶的方法。

背景技术

多酚氧化酶是一类氧化还原酶，其由铜离子辅基和主酶两部分组成，铜离子辅基不可透析。由于多酚氧化酶与食品加工和蔬菜保鲜与贮藏运输有着密切的关系，多酚氧化酶一直是研究的热点，尤其是在其生化、生理学性质方面取得了较大的进展。多酚氧化酶在有氧条件下能选择性催化酚类羟基化，把其氧化成醌，这一特性使得多酚氧化酶在工业、食品和环境保护等行业得到了广泛的应用，如利用多酚氧化酶来催化氧化儿茶素形成茶黄素及茶饮料中独特的风味物质，烟草中利用其来形成独特的品质，利用固定化多酚氧化酶来去除工业污水中的多酚类有毒物质等等。

20世纪60年代发展起来的酶固定化技术，它是通过化学或物理的处理方法，使游离酶和固态的水不溶性载体相结合或被包埋，将酶束缚或限制在一定的区域内，使酶分子在此区域进行特有和活跃的催化作用，并可回收及长时间重复使用的一种交叉学科技术。游离酶经固定化后，不仅保留了酶专一性、高效性、反应条件温和、无污染等特点的属性，而且使其稳定性和活性的半衰期都得到很大的提高，具有了易分离和连续化使用的优点，有效的降低了工业生产的成本，从而克服了游离酶稳定性差、易失活、不能重复使用，成本高的缺点。

目前国内外对多酚氧化酶的固定化做了部分研究，所采用的固定化载体主要为海藻酸钠和壳聚糖。这些固定化方法，把酶蛋白分子包埋到水不溶性的海藻酸钙和壳聚糖载体中，可以实现酶分子不溶于水中，达到酶分子的固定化效果，但是同样增加了酶分子和底物结合作用的空间位阻，降低了酶的催化效率。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术存在的缺陷，提供一种采用离子交换树脂载体固定多酚氧化酶的方法，以减少底物与固定化酶作用的空间位阻，提高酶的催化效率。

为此，本发明采用如下的技术方案：离子交换树脂载体固定多酚氧化酶的方法，其步骤如下：称取载体离子交换树脂，采用3～5倍树脂体积的1mol/L的盐酸和氢氧化钠溶液以每小时1～1.5倍柱床体积的速度，以酸洗-碱洗-酸洗的顺序对其进行活化，接着加入酶蛋白溶液，在恒温摇床中进行吸附固定化，然后加入交联剂进行交联，之后过滤，用缓冲液冲洗，得到微球状颗粒，即为高酶活性的固定化多酚氧化酶。

离子交换树脂表面有很多可与酶分子作用结合的功能基团，而且还有颗粒小、比表面积大的优点，这样，酶分子与树脂表面的功能基团作用从而连接到树脂载体上，实现了多酚氧化酶的固定化，而且由于其树脂载体的表面积大，以及酶分子都作用在树脂表面，这样就不会过多的增加酶分子与底物作用的空间位阻，影响酶的催化效率。

上述的方法，离子交换树脂载体选用大孔阳离子交换树脂，其优选D152型、D113型或凝胶型阳离子交换树脂，凝胶型阳离子交换树脂优选JK110型。

上述的方法，酶蛋白选用直接盐析后透析得到的粗多酚氧化酶蛋白、盐析后超滤得到的较纯的多酚氧化酶蛋白或盐析后经过层析柱精制的纯多酚氧化酶蛋白。粗酶级别的制备：植物组织经破碎浸提过滤后得到的滤液，再经过盐析，之后透析得到粗酶溶液，之后再经冷冻干燥得到粉状粗酶；较纯酶级别的制备：植物组织经破碎浸提过滤后得到的滤液，再经过盐析，之后超滤得到较纯酶溶液，之后再经冷冻干燥得到粉状较纯酶；纯酶级别的制备：植物组织经破碎浸提过滤后得到的滤液，再经过盐析，之后经过层析柱纯化得到的纯酶溶液，之后再经冷冻干燥得到粉状纯酶。

上述的方法，加入的树脂载体与酶蛋白的质量比为1∶0.1～100g/mg，加入的多酚氧化酶用4℃pH 5.6的磷酸缓冲液溶解；固定化条件为：温度0℃～45℃，摇床转速0～200rpm，吸附固定化的时间为0.5～24小时；所述的交联剂为戊二醛，其在溶液中的质量百分浓度控制在0.04％～5％，浓度过高会导致多酚氧化酶活性丧失，交联时间为0.5～24小时；过滤采用层析柱进行过滤清洗；得到的固定化多酚氧化酶经过冷冻干燥后直接制成干态的固定化多酚氧化酶。

本发明与海藻酸钠、壳聚糖作为固定化载体等其它一些固定化方法相比，本发明具有以下优点：机械强度高，稳定性高，水不溶性好，减少了底物与固定化酶作用的空间位阻，酶催化效率高。

下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。

具体实施方式

实施例1

称取10g未经活化的离子交换树脂D113，经活化后加入50mg粗多酚氧化酶(多酚氧化酶以50ml 4℃pH 5.6的磷酸缓冲液溶解)，在30℃下的恒温摇床下，以120rpm转速吸附固定化2h，之后过滤，用4℃pH 5.6的磷酸缓冲液冲洗5次，之后，加入50ml 0.04％的戊二醛溶液在30℃下的恒温摇床下，以120rpm转速交联2h，之后过滤，用4℃pH 5.6的缓冲液冲洗5次，得到固定化多酚氧化酶。得到的固定化多酚氧化酶的单位酶活性为0.222U/g*min，固定化效率为98.75％。

实施例2

称取10g未经过活化的离子交换树脂载体D152(细)，经活化后加入10mg纯多酚氧化酶(多酚氧化酶以50ml 4℃pH 5.6的磷酸缓冲液溶解)，在30℃下的恒温摇床下，以80rpm转速吸附固定化2h，之后过滤，用4℃pH 5.6的磷酸缓冲液冲洗5次，之后，加入50ml 0.04％的戊二醛溶液在30℃下的恒温摇床下，以120rpm转速交联2h，之后过滤，用4℃pH 5.6的缓冲液冲洗5次，得到固定化多酚氧化酶。得到的固定化多酚氧化酶的单位酶活性为0.348U/g*min，固定化效率为96.08％。

实施例3

称取10g经过活化的离子交换树脂载体JK110，加入50mg较纯多酚氧化酶(多酚氧化酶以50ml 4℃ pH 5.6的缓冲液溶解)，在30℃下的恒温摇床下，以180rpm转速吸附固定化2h，之后，加入50ml 0.04％的戊二醛溶液在30℃下的恒温摇床下，以120rpm转速交联2h，之后过滤，用4℃ pH 5.6的磷酸缓冲液冲洗5次，得到固定化多酚氧化酶。得到的固定化多酚氧化酶的单位酶活性为0.383 U/g*min，固定化效率为95.37％。

实施例4

称取10g经过活化的离子交换树脂载体D152(细)，加入50mg纯多酚氧化酶(多酚氧化酶以50ml 4℃pH 5.6的磷酸缓冲液溶解)，在30℃下的恒温摇床下，以180rpm转速吸附固定化2h，之后，加入400μl 25％的戊二醛溶液使得溶液中的戊二醛浓度为0.2％，在30℃下的恒温摇床下，以120rpm转速交联2h，之后过滤，用4℃pH 5.6的磷酸缓冲液冲洗5次，得到固定化多酚氧化酶。得到的固定化多酚氧化酶的单位酶活性为0.647U/g*min，固定化效率为97.18％。

实施例5

称取10g未经过活化的离子交换树脂载体D152(细)，经活化后加入50mg纯多酚氧化酶(多酚氧化酶以50ml 4℃pH 5.6的磷酸缓冲液溶解)，在30℃下的恒温摇床下，以120rpm转速吸附固定化2h，之后过滤，用4℃ pH 5.6的磷酸缓冲液冲洗3～5次，之后，加入50ml 0.04％的戊二醛溶液在30℃下的恒温摇床下，以120rpm转速交联2h，之后过滤，用4℃pH 5.6的磷酸缓冲液冲洗5次，得到固定化多酚氧化酶。得到的固定化酶的单位活性为0.521U/g*min，固定化效率为95.08％。

实施例6

称取10g经过活化的离子交换树脂载体D152(细)，加入50mg纯多酚氧化酶(多酚氧化酶以50ml 4℃ pH 5.6的磷酸缓冲液溶解)，在30℃下的恒温摇床下，以120rpm转速吸附固定化2h，之后加入400μl 25％的戊二醛溶液使得溶液中的戊二醛浓度为0.2％，在30℃下的恒温摇床下，以120rpm转速交联1h，之后过滤，用4℃ pH 5.6的磷酸缓冲液冲洗5次，得到固定化多酚氧化酶。得到的固定化酶的单位活性为0.799U/g*min，固定化效率为87.47％。

实施例7

称取10g经过活化的离子交换树脂载体，加入50mg纯多酚氧化酶(多酚氧化酶以50ml 4℃pH 5.6的磷酸缓冲液溶解)，在30℃下的恒温摇床下，以120rpm转速吸附固定化2h，之后加入400μl 25％的戊二醛溶液使得溶液中的戊二醛浓度为0.2％，在30℃下的恒温摇床下，以120rpm转速交联1h，之后过滤，用4℃pH 5.6的磷酸缓冲液冲洗5次，得到固定化多酚氧化酶，然后采用冷冻干燥得到干态的固定化多酚氧化酶。得到的固定化酶的单位活性为2.497U/g*min，固定化效率为93.28％。

本发明的保护范围并不只限于以上实施例，凡与本发明的技术路线、方案相同或等同的内容均落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1、离子交换树脂载体固定多酚氧化酶的方法，其步骤如下：采用酸洗-碱洗-酸洗的顺序对离子交换树脂载体进行活化，接着加入酶蛋白溶液，在恒温摇床中进行吸附固定化，然后加入交联剂进行交联，之后过滤，用缓冲液冲洗，得到微球状颗粒，即为高酶活性的固定化多酚氧化酶。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的离子交换树脂载体选用大孔阳离子交换树脂。

3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的大孔阳离子交换树脂选用D152型、D113型或凝胶型阳离子交换树脂。

4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的凝胶型阳离子交换树脂选用JK110型。

5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的酶蛋白选用直接盐析后透析得到的粗多酚氧化酶蛋白、盐析后超滤得到的较纯的多酚氧化酶蛋白或盐析后经过层析柱精制的纯多酚氧化酶蛋白。

6、根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于所加入的树脂载体与酶蛋白的质量比为1∶0.1～100g/mg。

7、根据权利要求1所述的方法，其特征在于固定化条件为：温度0℃～45℃，摇床转速0～200rpm，吸附固定化的时间为0.5～24小时。

8、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的交联剂为戊二醛，其在溶液中的质量百分浓度控制在0.04％～5％，交联时间为0.5～24小时。

9、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的过滤采用层析柱进行过滤清洗。

10、根据权利要求1所述的方法，其特征在于得到的固定化多酚氧化酶经过冷冻干燥后直接制成干态的固定化多酚氧化酶。