CN104962543B - 一种枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的定向固定化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的定向固定化方法，即首先获取枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的活性位点及结合位点，然后依次进行载体弱酸性阳离子交换树脂的预处理、活化、葡萄糖酸冼必泰的固定，得到固定有葡萄糖酸冼必泰的弱酸性阳离子交换树脂；然后将其置于枯草芽孢杆菌中性蛋白酶磷酸盐缓冲溶液中，使葡萄糖酸冼必泰的氨基与枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的结合位点进行充分对接，然后再与含有1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐和N‑羟基琥珀酰亚胺的交联溶液进行反应，即得催化效能高、稳定性好的定向固定化的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶。该制备方法制备过程简单，成本低，易于实现规模化生产。

Description

一种枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的定向固定化方法
技术领域
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌的中性蛋白酶的定向固定化方法。
背景技术
枯草芽孢杆菌来源的中性蛋白酶可以水解蛋白质中由苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的羧基所构成的肽键，具有反应条件温和、催化效率高、专一性强、污染低等优点，在食品、生物制品行业中应用很广泛。但采用传统的游离酶对蛋白进行水解时存在成本高、水解效率低、难以回收等缺陷。固定化酶是将酶束缚或限制于固体材料的一定区域内。固定化酶技术有如下优点：（1）可在常温下连续操作，无相变；（2）能使产物与工具酶迅速分开，简化了分离工艺；（3）可严格控制酶反应过程，并提高酶的稳定性和使用效率，从而降低成本。
目前常用的生物酶的固定化方法-随机固定化法常导致酶活力下降和酶活不均一的现象，这主要由三方面的原因造成：（1）较激烈的交联反应和共价结合反应，常使蛋白质构象发生不利于反应的变化；（2）酶蛋白常常通过赖氨酸残基上的ε-氨基与载体活性基团偶合，酶表面分布有多个赖氨酸残基，与载体作用时可以采取多种空间构象，因而酶蛋白的多点附着使得其结构发生了变异，也增加了底物接近酶活性中心时的空间位阻，不利于保留酶游离态的均相催化活性；（3）固定化载体一般是疏水性物质，当酶直接被固定在载体上时会改变酶的微环境，使酶蛋白构象发生折叠、失活。
综上所述，传统固定化方法中存在酶活性位点不能充分暴露、酶的固定化量较低等技术问题。近年来出现的定向固定化技术弥补了这些不足，定向固定化酶技术是将目标蛋白定向固定到载体表面，使酶的活性区域充分暴露，从而最大限度的保证该固定化酶的活性中心高效的与底物充分结合，以发挥最大的催化功能。定向固定化酶技术解决了传统酶固定化方法中酶在任意位点与载体进行连接，使酶活性位点不能充分暴露，且酶的固定化量较低等问题。由于具有容量大、活性高的优点，定向固定化技术日益受到重视。
发明内容
本发明的目的是为了解决传统固定化方法中酶活性位点不能充分暴露、酶的固定化量较低等技术问题，而提供一种枯草芽孢杆菌的中性蛋白酶的定向固定化方法，该固定化方法具有载酶量高、酶活性位点充分暴露及稳定性好等特点。
本发明的技术原理
以药物虚拟筛选理论为基础，采用计算机辅助设计技术筛选优先结合于枯草芽孢杆菌中性蛋白酶结合位点的亲和配基。将该亲和配基固定于载体上，并与枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的结合位点充分作用。再采用共价偶联的方法使枯草芽孢杆菌中性蛋白酶与亲和配基紧密连接，从而得到酶的活性区域充分暴露、稳定性好、活力高、可重复使用的定向固定化酶。
本发明的技术方案
一种固定化枯草芽孢杆菌的中性蛋白酶的定向固定化方法，具体包括如下步骤：
（1）、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的活性位点及结合位点的确定
①、从SWISS-PROT数据库中获取ID为C1KF31的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的三维结构，通过数据库给出的数据确定His-364、Glu-365、His-368、Tyr-379、Glu-388、Arg-417、Tyr-445和His-449组成的催化椭圆区作为枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的活性位点；
②、将枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的三维结构上传至蛋白表面三维结构计算平台，选择远离枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的活性位点，且与枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的活性位点的氨基酸带电性质、疏水性有明显区别的SER-358，LEU-359，ASP-360，ASP-399，GLU-401，GLU-407，ASP-408 7个氨基酸残基组成的区域作为枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的结合位点；
（2）、亲和配基葡萄糖酸冼必泰在载体弱酸性阳离子交换树脂表面上的固定
①、载体弱酸性阳离子交换树脂的预处理
将弱酸性阳离子交换树脂置于酶反应器内，按照弱酸性阳离子交换树脂重量：自来水重量=1：1.5的比例，将弱酸性阳离子交换树脂加入到自来水中搅拌清洗2遍，去除自来水；
然后，按照弱酸性阳离子交换树脂重量：双蒸水重量=1：1.5的比例，将弱酸性阳离子交换树脂加入到双蒸水中搅拌清洗3遍，然后去除双蒸水；
然后再按照酸-碱-酸的顺序，依次分别将弱酸性阳离子交换树脂加入到加入到0.55mol/L HCL、0.55mol/L NaOH和0.55mol/L HCL中对弱酸性阳离子交换树脂进行洗涤，每次洗涤完毕后用双蒸水清洗弱酸性阳离子交换树脂，直至流出液中pH至7为止，即得经预处理过的弱酸性阳离子交换树脂；
所述的弱酸性阳离子交换树脂为丙烯酸型DIAION WK40树脂；
②、载体弱酸性阳离子交换树脂的活化
称取6g步骤①所得的经预处理过的弱酸性阳离子交换树脂，加入到含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的交联溶液，在25℃恒温条件下搅拌活化1h，倒去含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的交联溶液，然后用双蒸水对弱酸性阳离子交换树脂进行洗涤，直至流出液在紫外区无吸收，即得活化后的弱酸性阳离子交换树脂；
上述的含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的交联溶液，即将10.0068 g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和 4.002 gN-羟基琥珀酰亚胺溶解于30mL，pH6.0，浓度为0.1mol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸的水溶液中；
③、亲和配基葡萄糖酸冼必泰在弱酸性阳离子交换树脂表面上的固定
取6g步骤②所得的活化后的弱酸性阳离子交换树脂，加入39mL浓度为200mg/mL葡萄糖酸冼必泰水溶液，室温下搅拌反应12h，反应完毕后，用双蒸水洗去未固定的葡萄糖酸冼必泰，即得固定有葡萄糖酸冼必泰的弱酸性阳离子交换树脂；
（3）、定向固定化枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的制备
①、亲和配基葡萄糖洗必泰与枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的结合位点的对接
将6g步骤（2）中的③所得的固定有葡萄糖酸冼必泰的弱酸性阳离子交换树脂置于30mL浓度为1mg/mL的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶磷酸盐缓冲溶液中，于25℃下反应2h，以使亲和配基葡萄糖酸冼必泰的氨基与枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的结合位点进行充分对接，反应完成后倒掉上清液，即得对接有枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的固定有葡萄糖酸冼必泰的弱酸性阳离子交换树脂；
上述的浓度为1mg/mL的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶磷酸盐缓冲溶液，配制所需的溶剂为pH7.5、浓度为0.02mol/L 的磷酸氢二钠水溶液或pH7.5、浓度为0.02mol/L 的磷酸二氢钠水溶液；
②、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶在载体弱酸性阳离子交换树脂上的固定
称取6g①中所得的对接有枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的固定有葡萄糖酸冼必泰的弱酸性阳离子交换树脂，加入到30ml含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的交联溶液，室温下搅拌反应12h，反应完毕后，用双蒸水洗去未固定的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶，即得定向固定化的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶；
上述的含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的交联溶液，即将10.0068 g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和 4.002 gN-羟基琥珀酰亚胺溶解于30mL，pH6.0，浓度为0.1mol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸的水溶液中所得。
本发明的有益效果
本发明的一种固定化的枯草芽孢杆菌的中性蛋白酶的制备方法，由于采用了计算机辅助设计技术对亲和配基进行虚拟筛选，使得枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的结合位点定向固定到载体表面，酶的活性区域充分暴露，从而最大限度的保证该固定化酶的活性中心高效的与底物充分结合，以发挥最大的催化功能。最终所得的固定化酶的活力达到64864U/g载体，固定化的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶在4℃贮藏30天后，仍保留初始活性的94%。用恒流泵以1mL/min的流速连续冲刷30mL后，固定化的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶仍保留初始活性的97%。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进一步阐述，但并不限制本发明。
本发明所用的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶购自于湖北盛天恒创生物科技有限公司（CAS 9068-59-1），其余试剂购自于国药集团化学试剂有限公司。
酶活力单位（U）定义为30℃时，pH 7.5，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需要的酶量。
本发明的实施例中所用的弱酸性阳离子丙烯酸型DIAION WK40树脂，购自于北京绿百草科技有限公司。
实施例1
一种枯草芽孢杆菌的中性蛋白酶的定向固定化方法，具体包括如下步骤：
（1）、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶活性位点及结合位点的确定
①、从SWISS-PROT数据库中获取ID为C1KF31的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的三维结构，确定其活性中心为由His-364, Glu-365, His-368, Tyr-379，Glu-388，Arg-417，Tyr-445和His-449组成的催化椭圆区作为枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的活性位点；
②、将步骤①中得到的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的三维结构上传至蛋白表面三维结构计算平台（http://sts.bioe.uic.edu/castp/），选择远离枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的活性位点，且与枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的活性位点的氨基酸的带电性质、疏水性有明显区别的SER-358，LEU-359，ASP-360，ASP-399，GLU-401，GLU-407，ASP-408 7个氨基酸残基组成的区域作为枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的结合位点；
（2）、适合于枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的结合位点的亲和配基的筛选
①、对ZINCID数据库中的亲和配基库进行初步筛选
上述初步筛选条件为：分子量为200-400Da，氢键供体数为7-10，氢键受体数为2-20，电荷数为1-5，供应商为Alfa Aesar；
通过以上筛选条件获得了137个亲和配基，具体如下：
②、采用PyRx虚拟筛选工具中的autodock vina软件（http://pyrx.scripps.edu/ downloads）将步骤①中筛选出的137个亲和配基与枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的三维结构进 行盲目对接，获得32个对接能量<-7.5 kcal／mol的亲和配基，具体如下：
序号 ZINCID 亲和配基的名称 序号 ZINCID 亲和配基的名称
1 18098302 葡萄糖冼必泰 17 89221436 喹喔啉-5-醇
2 5840701 苯腈盐酸盐 18 17300872 2-氨基苯并噻唑-6-甲酸
3 2560131 间氟苄胺 19 4658562 D-乳酸
4 4222893 3-(3-吡啶基)-DL-丙氨酸 20 404005 2,3-二氟苄胺
5 2384810 丁氧羰基-羟基化N-甲基丙酸铵 21 43509458 R,R)-1,2-二(4-乙酰氨基苯基)-1,2-乙二胺二盐酸盐
6 72284260 3-(6-硝基-2-苯并咪唑基)苄胺肟 22 12955176 (S)-1-Boc-2-异丙基哌嗪
7 1577085 2-二甲氨基氯乙烷盐酸盐 23 1559667 甲基哌啶
8 2381215 4-氨基哌啶盐酸盐 24 2000723 3,5-二硝基溴苯
9 153928 2-氨基-5-甲氧基苯甲酸 25 157349 2-氟-5-三氟甲基苄胺
10 167016 二氯苄胺3,5- 26 51270812 5-羟基-2-吡啶甲酸
11 72284312 4-（6-甲胺肟-2-苯并咪唑基)苄胺肟 27 43509467 (S,S)-1,2-双(4-乙酰胺基苯)-1,2-乙二胺二盐酸盐
12 6092332 3-（羟甲基）苯甲酸 28 16082784 1,3-苯基二乙酰胺肟
13 3861148 反-1,2-环己烷苯甲酸 29 12505592 5-三氟甲基吡啶-2-羧酸
14 3884325 2-甲基-4-三氟甲基-5-噻唑甲酸 30 2561349 庚炔酸
15 1842530 盐酸奎宁 31 1532525 L-精氨酸
16 1641228 3-乙酰苯甲酸 32 167016 3,5-二氯苄胺
③、采用 autodock 4.0软件（Olson实验室开发）将②中筛选出的32个亲和配基分 别与步骤（1）中的①和②所得的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的活性位点和结合位点进行对 接，对接后32个亲和配基与枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的结合位点的对接能量，与枯草芽孢 杆菌中性蛋白酶的活性位点的对接能量分别如下表所示：
序号 ZINCID 亲和配基的名称 与结合位点的对接能量（kcal/mol） 与活性位点的对接能量（kcal / mol）
1 18098302 葡萄糖冼必泰 -12.96 -10.34
2 5840701 苯腈盐酸盐 -8.81 -9.73
3 2560131 间氟苄胺 -9.66 -9.43
4 4222893 3-(3-吡啶基)-DL-丙氨酸 -10.45 -9.32
5 2384810 丁氧羰基-羟基化N-甲基丙酸铵 -8.11 -9.27
6 72284260 3-(6-硝基-2-苯并咪唑基)苄胺肟 -9.03 -8.76
7 1577085 2-二甲氨基氯乙烷盐酸盐 -11.18 -9.12
8 2381215 4-氨基哌啶盐酸盐 -8.36 -8.28
9 153928 2-氨基-5-甲氧基苯甲酸 -8.08 -8.94
10 167016 二氯苄胺3,5- -7.53 -8.86
11 72284312 4-（6-甲胺肟-2-苯并咪唑基)苄胺肟 -10.27 -8.83
12 6092332 3-（羟甲基）苯甲酸 -8.76 -8.65
13 3861148 反-1,2-环己烷苯甲酸 -7.73 -8.69
14 3884325 2-甲基-4-三氟甲基-5-噻唑甲酸 -9.23 -8.61
15 1842530 盐酸奎宁 -10.44 -8.56
16 1641228 3-乙酰苯甲酸 -7.81 -8.42
17 89221436 喹喔啉-5-醇 -9.47 -8.31
18 17300872 2-氨基苯并噻唑-6-甲酸 -6.47 -8.28
19 4658562 D-乳酸 -8.85 -8.13
20 404005 2,3-二氟苄胺 -6.26 -8.12
21 43509458 R,R)-1,2-二(4-乙酰氨基苯基)-1,2-乙二胺二盐酸盐 -4.56 -8.14
22 12955176 (S)-1-Boc-2-异丙基哌嗪 -9.19 -8.02
23 1559667 甲基哌啶 -7.58 -8.04
24 2000723 3,5-二硝基溴苯 -8.63 -8.02
25 157349 2-氟-5-三氟甲基苄胺 -6.97 -7.91
26 51270812 5-羟基-2-吡啶甲酸 -8.34 -7.92
27 43509467 (S,S)-1,2-双(4-乙酰胺基苯)-1,2-乙二胺二盐酸盐 -7.51 -7.74
28 16082784 1,3-苯基二乙酰胺肟 -7.88 -7.73
29 12505592 5-三氟甲基吡啶-2-羧酸 -6.61 -7.64
30 2561349 庚炔酸 -8.19 -7.60
31 1532525 L-精氨酸 -7.32 -7.54
32 167016 3,5-二氯苄胺 -8.20 -7.51
根据对接能量最小原则，从上表中可以看出，本发明优选葡萄糖冼必泰（ZincID18098320）为与枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的结合位点进行对接的亲和配基，其与枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的结合位点的对接能量为-12.96kcal/mol，低于与枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的活性位点的对接能量-10.34 kcal / mol；
（3）、亲和配基葡萄糖酸冼必泰在载体弱酸性阳离子交换树脂表面上的固化
①、载体弱酸性阳离子交换树脂的预处理
将弱酸性阳离子交换树脂置于酶反应器内，按照弱酸性阳离子交换树脂重量：自来水重量=1：1.5的比例，将弱酸性阳离子交换树脂加入到自来水中搅拌清洗2遍，除去自来水，然后用与自来水同样量的双蒸水对弱酸性阳离子交换树脂搅拌清洗3遍；
上述自来水、双蒸水清洗过程中每次搅拌15min，搅拌速度180r/min；
双蒸水清洗完后采用抽滤器除去弱酸性阳离子交换树脂中的双蒸水，然后按照弱酸性阳离子交换树脂重量：0.55mol/L HCL水溶液重量=1：1.5的比例，将弱酸性阳离子交换树脂加入到0.55mol/L HCL水溶液中，常温下搅拌45min，搅拌速度180r/min，完毕倒出0.55mol/L HCL水溶液，然后用双蒸水清洗弱酸性阳离子交换树脂，直至流出液中pH为7为止；
然后再按照弱酸性阳离子交换树脂重量：0.55mol/L NaOH水溶液重量=1：1.5的比例，将弱酸性阳离子交换树脂加入到0.55mol/L NaOH水溶液中，常温下搅拌45min，搅拌速度180r/min，完毕倒出0.55mol/L NaOH水溶液，然后用双蒸水清洗弱酸性阳离子交换树脂，直至流出液中pH至7为止；
然后再按照弱酸性阳离子交换树脂重量：0.55mol/L HCL水溶液重量=1：1.5的比例，将弱酸性阳离子交换树脂加入到0.55mol/L HCL水溶液中，常温下搅拌45min，搅拌速度180r/min，完毕倒出0.55mol/L HCL水溶液，然后用双蒸水清洗弱酸性阳离子交换树脂，直至流出液中pH至7为止，即得经预处理的弱酸性阳离子交换树脂；
所述的弱酸性阳离子丙烯酸型DIAION WK40树脂；
②、载体弱酸性阳离子交换树脂的活化
称取6g上述步骤①所得的经预处理的弱酸性阳离子交换树脂，加入到30ml的含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的交联溶液中，在25℃恒温条件下搅拌活化1h，倒去含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的交联溶液，然后采用双蒸水洗去弱酸性阳离子交换树脂中残余的含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的交联溶液，直至流出液在紫外区无吸收，即得活化后的弱酸性阳离子交换树脂；
上述的含1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的交联溶液，即将10.0068 g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和 4.002gN-羟基琥珀酰亚胺溶解于30mL，pH6.0，浓度为0.1mol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸的水溶液中所得；
③、葡萄糖酸冼必泰在弱酸性阳离子交换树脂表面的固定
取6g步骤②所得的活化后的弱酸性阳离子交换树脂，加入到39mL浓度为200mg/mL葡萄糖酸冼必泰水溶液中，室温下搅拌反应12h，反应完毕后，用双蒸水洗去弱酸性阳离子交换树脂上未固定的葡萄糖酸冼必泰，即得固定有葡萄糖酸冼必泰的弱酸性阳离子交换树脂；
（4）、定向固定化枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的制备
①、亲和配基葡萄糖酸冼必泰与枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的结合位点的对接
将6g步骤（3）中③所得的固定有葡萄糖酸冼必泰的弱酸性阳离子交换树脂置于5mL浓度为1mg/mL的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶磷酸盐缓冲溶液中，于25℃下反应2h，以使葡萄糖酸冼必泰的氨基与枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的结合位点进行充分对接，反应完成后倒掉上清液，即得对接有中性蛋白酶的固定有葡萄糖酸冼必泰的弱酸性阳离子交换树脂；
上述的浓度为1mg/mL的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶磷酸盐缓冲溶液，配制所需的溶剂为pH7.5、浓度为0.02mol/L 的磷酸氢二钠水溶液或pH7.5、浓度为0.02mol/L 的磷酸二氢钠水溶液；
②、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶在载体弱酸性阳离子交换树脂上的固定
称取6g①中所得的对接有中性蛋白酶的固定有葡萄糖酸冼必泰的弱酸性阳离子交换树脂，加入到30ml的含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的交联溶液中，室温下搅拌反应12h，反应完毕后，用双蒸水洗去未固定的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶，即得定向固定化的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶；
上述的含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的交联溶液，即将10.0068 g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和 4.002gN-羟基琥珀酰亚胺溶解于30mL，pH6.0，浓度为0.1mol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸的水溶液中所得。
将上述所得的固定化的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶在4℃贮藏30天后，仍保留初始活性的94%。
将上述所得的定向固定化的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶通过恒流泵用冲刷液以1mL/min的流速（所述的冲刷液为pH7.5、浓度为0.02mol/L 的磷酸氢二钠水溶液或pH7.5、浓度为0.02mol/L 的磷酸二氢钠水溶液)对其进行连续冲刷30mL后，固定化的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶仍保留初始活性的97%。
综上所述，本发明的一种定向固定化的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的固定化方法，由于采用了计算机辅助设计技术对亲和配基进行虚拟筛选，使得枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的结合位点定向固定到载体表面，枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的活性区域充分暴露，从而最大限度的保证该固定化的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的活性中心高效的与底物充分结合，以发挥最大的催化功能。最终所得的固定化酶的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的酶活力达到64864U/g载体，固定化的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶在4℃贮藏30天后，仍保留初始活性的94%。用恒流泵以1mL/min的流速连续冲刷30mL后，固定化的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶仍保留初始活性的97%。
以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种基于虚拟筛选技术的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的定向固定化方法，其特征在于具体包括如下步骤：
（1）、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶活性位点及结合位点的确定
①、从SWISS-PROT数据库中获取ID为C1KF31的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的三维结构，通过数据库给出的数据确定His-364、Glu-365、His-368、Tyr-379、Glu-388、Arg-417、Tyr-445和His-449和His-449组成的催化椭圆区作为枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的活性位点；
②、将枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的三维结构上传至蛋白表面三维结构计算平台，选择远离活性区域，且与枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的活性位点的氨基酸的带电性质、疏水性有明显区别的SER-358，LEU-359，ASP-360，ASP-399，GLU-401，GLU-407，ASP-408 7个氨基酸残基组成的区域作为枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的结合位点；
（2）、亲和配基葡萄糖酸洗必泰在载体弱酸性阳离子交换树脂表面上的固定
①、载体弱酸性阳离子交换树脂的预处理
将弱酸性阳离子交换树脂置于酶反应器内，按照弱酸性阳离子交换树脂重量：自来水重量=1：1.5的比例，将弱酸性阳离子交换树脂加入到自来水中搅拌清洗2遍，去除自来水；
然后，按照弱酸性阳离子交换树脂重量：双蒸水重量=1：1.5的比例，将弱酸性阳离子交换树脂加入到双蒸水中搅拌清洗3遍，然后去除双蒸水；
然后再按照酸-碱-酸的顺序，依次分别将弱酸性阳离子交换树脂加入到0.55mol/LHCl、0.55mol/L NaOH和0.55mol/L HCl中对弱酸性阳离子交换树脂进行洗涤，每次洗涤完毕后用双蒸水清洗弱酸性阳离子交换树脂，直至流出液中pH至7为止，即得经预处理过的弱酸性阳离子交换树脂；
所述的弱酸性阳离子交换树脂为丙烯酸型DIAION WK40树脂；
②、载体弱酸性阳离子交换树脂的活化
称取6g步骤①所得的经预处理过的弱酸性阳离子交换树脂，加入到含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的交联溶液，在25℃恒温条件下搅拌活化1h，倒去含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的交联溶液，然后用双蒸水对弱酸性阳离子交换树脂进行洗涤，直至流出液在紫外区无吸收，即得活化后的弱酸性阳离子交换树脂；
上述的含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的交联溶液，即将10.0068 g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和 4.002 gN-羟基琥珀酰亚胺溶解于30mL，pH6.0，浓度为0.1mol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸的水溶液中；
③、亲和配基葡萄糖酸洗必泰在弱酸性阳离子交换树脂表面的固定
取6g步骤②所得的活化后的弱酸性阳离子交换树脂，加入39mL浓度为200mg/mL葡萄糖酸洗必泰水溶液，室温下搅拌反应12h，反应完毕后，用双蒸水洗去未固定的葡萄糖酸洗必泰，即得固定有葡萄糖酸洗必泰的弱酸性阳离子交换树脂；
（3）、定向固定化枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的制备
①、亲和配基葡萄糖酸洗必泰与枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的结合位点的对接
将6g步骤（2）中的③所得的固定有葡萄糖酸洗必泰的弱酸性阳离子交换树脂置于30mL浓度为1mg/mL的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶磷酸盐缓冲溶液中，于25℃下反应2h，反应完成后倒掉上清液，即得对接有中性蛋白酶的固定有葡萄糖酸洗必泰的弱酸性阳离子交换树脂；
上述的浓度为1mg/mL的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶磷酸盐缓冲溶液，配制所需的溶剂为pH7.5、浓度为0.02mol/L 的磷酸氢二钠水溶液或pH7.5、浓度为0.02mol/L 的磷酸二氢钠水溶液；
②、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶在载体弱酸性阳离子交换树脂上的固定
称取6g①中所得的对接有中性蛋白酶的固定有葡萄糖酸洗必泰的弱酸性阳离子交换树脂，加入到30ml含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的交联溶液，室温下搅拌反应12h，反应完毕后，用双蒸水洗去未固定的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶，即得定向固定化的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶；
上述的含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的交联溶液，即将10.0068 g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和 4.002 gN-羟基琥珀酰亚胺溶解于30mL，pH6.0，浓度为0.1mol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸的水溶液中所得。
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