CN1796551A - 一种新型亲和载体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种金属螯合亲和载体及其制备方法。该金属螯合亲和载体以琼脂粉为基质，交联了螯合剂，并螯合有金属离子。其制备包括分别用酸性缓冲液和碱性缓冲液抽提琼脂粉、用活化剂活化抽提的琼脂粉、与螯合剂交联、与金属离子螯合。本发明的金属螯合亲和载体成本低、制作简便，而且不仅可作为纯化载体，还可以用作固定化载体，其作为亲和载体的性能与商品化的载体相比相当甚至要优异得多。

Description

一种新型亲和载体的制备方法

技术领域

本发明涉及以琼脂粉为基质制备亲和载体的方法，以及工业用酶的制备方法。

背景技术

固定化金属离子亲和层析，又称为金属螯合亲和层析(ImmobilizedMetal-Chelated Affinity Chromatography，IMAC)是近年来被普遍应用于蛋白质纯化的常用方法，其原理是利用Cu²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺等过渡金属离子与蛋白质表面的组氨酸、色氨酸或半胱氨酸配位结合。由于蛋白质表面这些氨基酸的种类、位置和空间构象不同，因而与金属螯合物的亲和力大小不同，从而可选择性地加以分离纯化。

基因工程的发展极大地促进了IMAC技术的应用。通常，利用基因工程技术在目标重组蛋白质的N端或C端接上一段多肽段，大多为多聚组氨酸，这样几乎不会改变酶活力与稳定性，而且可以提高目的蛋白质与载体的结合力。IMAC技术使纯化蛋白质更加方便，由于其简便、快速、专一和高效等特点，已逐渐应用于生命科学的各个领域，尤其是当前生物技术下游加工过程。而且，可以实现单步纯化固定化各种蛋白质及工业用酶。

随着人们对环境保护的日益重视，以及为了满足减少成本的要求，化学合成法逐渐被酶法合成所代替。针对酶的纯化，目前许多公司已经推出许多固定化金属螯合亲和层析载体，如Clontech、GE healthcare、Qiagen等公司，这些载体对用组氨酸标记的蛋白质结合量见表1。

         表1：各个公司推向市场的载体

公司	基质	螯合基
			Clontech	TALON Resin	IDA
Clontech	TALON superflow Resin	IDA
			GE healthcare	Hitrap chelating hp	IDA

Qiagen	Ni-NTA agarose	NTA
			Qiagen	Ni-NTA superflow column	NTA

这些载体均以琼脂糖为基质制备而成，载体机械强度高，能够快速、简单地纯化目的蛋白质，不仅可以用于实验室研究，也可用于工业大规模生产。但是这些载体价格昂贵，大批量应用时成本很高，很难在成本敏感的工业生产过程(比如工业用酶纯化和固定化)中推广。

因此，价格便宜且仍保留甚至具有性能更好的载体对于本领域来说仍然是非常有利的。

发明内容

本发明一方面涉及一种亲和载体，它以琼脂粉为基质，所述琼脂粉交联有螯合剂，其中，所述琼脂粉基质和螯合剂的质量比为800-1200∶10-45。

本发明另一方面涉及一种金属螯合亲和载体，它以琼脂粉为基质，所述琼脂粉交联有螯合剂，所述螯合剂螯合有金属离子，其中，所述琼脂粉基质、螯合剂和金属离子的质量比为800-1200∶10-45∶1-15。

本发明另一方面涉及以琼脂粉为基质的金属螯合亲和载体的制备方法，该方法包括：

(1)用pH3.0-6.8的酸性缓冲液抽提琼脂粉，然后用pH8.0-10.0的碱性缓冲液抽提琼脂粉，沥干，得到湿琼脂粉；

(2)用能使带有OH基的固体载体带有反应性官能团的活化剂处理步骤(1)得到的湿琼脂粉；

(3)使步骤(2)得到的琼脂粉与螯合剂交联，得到交联了螯合剂的琼脂粉；和

(4)使步骤(3)得到的琼脂粉与金属离子螯合，得到所述金属螯合亲和载体。

本发明还涉及琼脂粉在制备金属螯合亲和载体中的用途。

具体实施方式

从原理上来说，只要有自由羟基的聚合物，如琼脂糖、琼脂粉、壳聚糖、纤维素等，都可以作为IMAC制备的基质。纤维素虽然廉价、易得，但是非特异性吸附严重，影响蛋白质纯化效果。琼脂糖是由D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖相间结合的中性链状多糖组成，表面不带电荷，非特异性吸附低，而且具有大量的丰富的化学基团(如OH官能基)，易于改质，因此现有技术中常用其来制备IMAC载体，但是价格较贵，限制了它的工业规模应用。

琼脂粉价格低廉，由琼脂糖和果胶组成。其中的果胶据报道非特异性吸附蛋白质的能力较强，若用于亲和层析，将影响分离效果。到目前为止，还没有以琼脂粉为基质制备载体的报道。我们以琼脂粉为基质制备了金属鳌合亲和载体，用多种工业用酶进行测试，发现纯化和固定化结果较好，并没有出现严重的非特异性吸附现象。

因此，本发明涉及一种金属螯合亲和载体，它以琼脂粉为基质制得。琼脂粉先经缓冲液抽提，然后用活化剂活化，然后先后与螯合剂、金属离子的盐溶液相互作用，从而制得用于本发明金属螯合亲和载体。本发明金属螯合亲和载体中，琼脂粉、螯合剂和金属离子的质量比通常为800-1200∶10-45∶1-15，更通常为900-1000∶15-35∶3-10，更通常为1000∶18-33∶5-9。在一优选实施例中，交联了螯合剂后的琼脂粉基质可先不螯合金属离子，待到使用时再与所需的金属离子螯合。

本发明对用于抽提琼脂粉的缓冲液并无特殊限制。通常先使用pH为3.0-6.8、优选为4.0-6.0的酸性缓冲液抽提，然后使用pH7.5-11.0、优选为pH8.0-10.0的碱性缓冲液抽提。本发明对缓冲液的浓度也无特殊限制，通常为0.02-0.08mol/L，优选为0.03-0.06mol/L，更优选为0.04-0.05mol/L。通常使用的酸性缓冲液有醋酸缓冲液、磷酸缓冲液，碱性缓冲液有碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液。

在一优选的实施例中，按1克琼脂粉30-70毫升缓冲液的比例加入醋酸缓冲液，该醋酸缓冲液的pH范围为3.0-6.0，优选为4.0-5.0，更优选为4.0，其浓度为0.03-0.06mol/L，优选为0.04mol/L。通常用醋酸缓冲液进行两次抽提，当然，抽提的次数依实际情况而定，例如可以是3或4次，也可以是1次。当抽提多次时，更换缓冲液的间隔时间一般为2-5小时，较佳为2-3小时。除醋酸缓冲液外，还可以使用其它缓冲液，如磷酸缓冲液，其pH通常为6.8、浓度通常为0.03mol/L。

用醋酸缓冲液抽提结束后，通常用水洗多次，如2-3次，然后放置过夜。之后使用碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液抽提。用于本发明的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液的pH通常为8.0-10.0，较佳为9.0，其浓度通常为0.03-0.07mol/L，通常为0.05mol/L。通常，加入缓冲液后搅拌5-6小时，并放置过夜。之后可过滤沉淀物并水洗沥干。可再次用碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液抽提，即重复一次碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液抽提过程。在一优选实施例中，在40℃用pH9.0、0.05mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液进行抽提。

然后可使用抽提得到的琼脂粉制备本发明的亲和载体。首先可用活化剂处理上述抽提沥干得到的湿琼脂粉。通常，使琼脂粉与活化剂反应，使其带有高反应性的官能基，例如环氧基或氯甲酰基，以使其能与延伸臂或是螯合剂进行合成反应。常见的活化方法有溴化氰法、环氧化法、二乙烯法等。最常用的是环氧化法。在本发明的一个优选实施例中，本发明使用环氧氯丙烷作为活化剂用于处理琼脂粉。通常，每克抽提沥干的湿琼脂粉使用约0.45-0.85ml、较佳0.55-0.75ml的活化剂处理。在一优选实施例中，每克抽提沥干的湿琼脂粉用约0.65ml的活化剂处理。活化的琼脂粉中，琼脂粉与活化剂的质量比通常为800-1000∶5-35，更通常为800-1000∶10-30，更通常为1000∶13-25。

之后，可使用螯合剂处理经活化剂处理的琼脂粉。螯合剂的使用主要是协助金属离子以配位键的方式固定于固体载体上，而螯合剂主要以亚基与金属离子形成配位键，因此称为多亚基螯合剂，其亚基数分别为三、四及五个。一般过渡金属均有六个配位数，因此与螯合剂的亚基结合后，剩余的配位数可以与蛋白质上的特定氨基酸结合，而与没有特定氨基酸的蛋白质分离，常见的螯合剂有IDA(亚氨基二乙酸)、NTA(氨三乙酸)、TED〔N，N，N-三(羧甲基)乙二胺〕及CM-Asp(羧甲基化天冬氨酸)。其中最常用的螯合剂为IDA，其上的一个氮原子、两个氧原子与金属离子螯合后，金属离子还剩余三个空轨道与蛋白质结合。IDA体积小，与蛋白质结合时立体阻碍较小，并且IDA具有亲水性，带有二个负电荷，与金属离子螯合后呈电中性，这使固体载体蛋白质间的非特定性吸附减少到最小程度。在本发明的一个优选实施例中，使用IDA为螯合剂制备本发明的金属螯合亲和载体。通常，每克已活化的琼脂粉用0.15-0.25克、较佳0.18-0.22克的螯合剂。在一优选实施例中，螯合剂为IDA，每克活化的琼脂粉用0.18克的IDA。

然后，可使用金属离子的盐溶液处理所获得琼脂粉。通常使用最多的金属离子为第一列的过渡金属离子Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Co²⁺，因其具有较多的空轨道，所形成之配位化合物的稳定度较佳。金属离子与螯合剂间的稳定度一般为：Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Ca²⁺或Mg²⁺。在本发明一个优选的实施例中，金属离子为Co²⁺。在另一优选的实施例中，金属离子为Ni²⁺。本发明对所使用的金属离子的盐也无特殊限制，例如可使用这些金属离子的盐酸盐、硫酸盐等等。

本发明另一方面涉及所述金属螯合亲和载体的制备，包括先后用醋酸缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液抽提琼脂粉，用活化剂活化抽提的琼脂粉，用螯合剂交联，然后将所得产物与金属离子螯合。本发明金属螯合亲和载体中，干琼脂粉、螯合剂和金属离子的盐在载体制备过程中投入物料的质量比为0.8-1.2∶0.45-1.62∶0.2-0.36；对于自身呈液态的活化剂而言，每0.8-1.2克干琼脂粉活化剂的用量约为1-10毫升，较佳地约2-5毫升。当活化剂自身为非液态时，可将其溶解在合适的溶剂中，相对于每0.8-1.2克干琼脂粉的用量约为0.5-10g，较佳地约1-5克。

在本发明的一个优选实施例中，在1g琼脂粉加40-60ml缓冲液的比例加入pH4.0、0.04mol/L醋酸缓冲液(醋酸钠-醋酸缓冲液)搅拌抽提，隔2-5小时更换一次缓冲液，二次抽提后过滤沉淀物，水洗几次(较佳2-3次)后放置过夜。第二天，再以同样比例加入pH 9.0、0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液搅拌4-8小时并放置过夜。第三天，过滤沉淀物水洗沥干，再重复前一天的方法，水洗至中性，沥干。

亲和载体的制备方法也是周知的。通常，取醋酸缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液抽提沥干的湿琼脂粉，以约1g湿琼脂粉约0.5-2毫升氢氧化钠溶液的比例加入1.2-1.8mol/L氢氧化钠溶液(含硼氢化钠)，23-28℃边搅拌边加入丙酮和环氧氯丙烷，继续搅拌。以1g湿琼脂粉计，每克湿琼脂粉加入的丙酮约为0.1-0.5毫升，加入的环氧氯丙烷约为0.1-0.3毫升。反应至约2小时、4小时和8小时时再次分别按上述比例加入环氧氯丙烷，总共反应12小时后，用去离子水洗净至中性，沥干得到EPI-ARG。每100g EPI-ARG中加入190-220ml、0.05-0.2mol/L碳酸钠溶液(含7-10％亚氨基二乙酸)，用氢氧化钠调pH至10.5-11.5，25-28℃搅拌反应12-14小时，用去离子水充分洗净，沥干得EPI-ARG-IDA。每20g EPI-ARG-IDA加入60-100ml、30-70mmol/L、pH6.0磷酸钠缓冲液(含3-8mg/ml氯化钴、0.5-2mol/L氯化钠)，25-28℃搅拌反应12-14小时，用去离子水充分洗净，即得到载体。

在本发明的制备方法中，对环境温度、压力并无特殊要求，通常在大气压、室温下进行。

用于制备本发明金属螯合亲和载体的琼脂粉可从市场上购得，如上海双向西巴斯科技发展有限公司、中国医药集团上海化学试剂有限公司等等。

作为琼脂糖原料的琼脂粉，具备琼脂糖的优点，结构均匀，理化性质稳定，与蛋白质亲和力较弱，具有大量的OH官能基，易于改质，而且来源丰富，价格便宜。市场上琼脂粉的价格要比琼脂糖低4倍以上。因此，使用琼脂粉作为基质的本发明金属螯合亲和载体具有成本低的显著优点。而且，本发明所制备的载体不仅可作为纯化载体，还可以用作固定化载体，而且其作为亲和载体的性能与商品化的载体相比相当甚至要优异得多。此外，与螯合剂交联但未螯合金属离子的本发明琼脂粉基亲和载体在长时间放置后再螯合上金属离子，其性能与未放置的、直接螯合上金属离子的本发明金属螯合亲和载体基本相同。因此，该亲和载体可视为所述金属螯合亲和载体的中间体。

以下将以具体实施例的方式对本发明进行详细的阐述。应理解，本发明的范围并不限于这些优选的具体实施例，在不偏离本发明精神和范围的情况下可对本发明作出各种修改和变动。

实施例1

载体制备方法：称取30克琼脂粉，按1g琼脂粉加50ml缓冲液的比例加入pH4.0、0.04mol/L醋酸缓冲液(醋酸钠-醋酸缓冲液)搅拌抽提，隔3小时更换一次缓冲液，二次抽提后过滤沉淀物，水洗3次后放置过夜。第二天，再按照上述比例用pH9.0、0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液抽提，搅拌6小时并放置过夜。第三天，过滤沉淀物水洗沥干，再重复前一天的方法，水洗至中性，沥干，得到175g湿琼脂粉，再在其中加入175ml、1.6mol/L氢氧化钠溶液(含4g硼氢化钠)，于25℃边搅拌边加入57ml丙酮和28.5ml环氧氯丙烷，继续搅拌反应至2小时、4小时和8小时再分别加入28.5ml环氧氯丙烷。总共反应12小时后，用去离子水洗净至中性，沥干得到260g EPI-ARG。260g EPI-ARG中加入520ml、0.1mol/L碳酸钠溶液(含9％亚氨基二乙酸)，用6mol/L氢氧化钠调pH至11，25℃搅拌反应12小时，用去离子水充分洗净，沥得EPI-ARG-IDA。取20g EPI-ARG-IDA，加入80ml、50mmol/L、pH6.0磷酸钠缓冲液(含5mg/ml氯化钴、1mol/L氯化钠)，25℃搅拌反应12小时，用去离子水充分洗净沥干，即得到载体EPI-30-ARG-IDA-Co²⁺。

采用与以上方法相同的步骤，但用氯化镍替换上述氯化钴，可制得本发明的另一种载体，即EPI-30-ARG-IDA-Ni²⁺。

实施例2

具有不同金属离子密度的亲和载体固定化效率比较：

高金属密度的亲和载体制备方法同实例1。

低金属密度的亲和载体EPI-5-ARG-IDA的制备方法如下：琼脂粉用缓冲液溶涨，清洗，沥干得到湿琼脂粉。量取100ml湿琼脂粉，加入100ml 0.4N NaOH(含2g NaBH4)，加32ml乙二醇二甲醚，混匀，搅拌中加入16ml环氧氯丙烷(全需预冷)，25℃搅拌反应4小时后，用去离子水洗净至中性即得EPI-5-ARG100ml，EPI-5-ARG中加入100ml 0.1M Na₂CO₃(其中含亚胺基二乙酸9％)，用6N NaOH调至pH11，25℃搅拌反应16小时，用去离子水充分洗净，沥得EPI-5-ARG-IDA。取20g EPI-5-ARG-IDA，加入80ml、50mmol/L、pH6.0磷酸钠缓冲液(含5mg/ml氯化钴、1mol/L氯化钠)，25℃搅拌反应12小时，用去离子水充分洗净沥干，即得到载体EPI-5-ARG-IDA。

载体	载体酶活(U)
		EPI-30-ARG-IDA	16.3
EPI-5-ARG-IDA	2.14

注：该实例中检测制备亲和载体吸附能力所用的酶是氨甲酰水解酶，跟其他实例中所用的酶不同，只能作为检测载体吸附能力的参考。

实施例3

GL-7-ACA酰化酶一步纯化固定化过程：28ml(酶活力单位21.5U/ml)GL-7-ACA酰化酶无细胞抽提液中加入1.0g实施例1制得的载体，充氮气密封，18℃，170转每分钟，振荡保温24后，用20mmol/L磷酸钠缓冲液pH8.0(含0.2mol/L氯化钠，10％甘油)冲洗，用Bradford比色法检测流出液，至OD₅₉₅小于0.06时，用0.1mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.0)清洗，真空抽弃水分，测定固定化酶酶活。

本实施例中GL-7-ACA酰化酶无细胞抽提液参照文献制备：Armise′n P、Mateo C、Corte′s E、Barredo JL、Salto F、Di′ez B、Rode′s L、Garci′a JL、Ferna′ndez-Lafuente R、Guisa′n JM，1999，“多-His标记的戊二酰基酰基转移酶在特制的金属螯合载体上的选择性吸附”，J Chromatogr A，848：61-70。

GL-7-ACA酰化酶固定化酶酶活测定按K.Balasingham、D.Warburton、P.Dunnil、D.Lilly〔Boichim.Biophys.Acta，(1972)250-256〕所述的方法进行。

按照上述方法，测得GL-7-ACA酰化酶固定化酶酶活为100U/g，固定化收率：16.7％。

实施例4

本发明实施例1制得的载体的固定化酰化酶酶活与商品化载体的固定化酰化酶酶活比较：将3ml(酶活力单位17.5U/ml)GL-7-ACA酰化酶无细胞抽提液中分别加入三种不同载体(即EPI-30-ARG-IDA-Co²⁺、EPI-30-ARG-IDA-Ni²⁺和TALON金属亲和树脂)中，载体的量均为0.1g，酶与载体结合条件相同，具体如下。载体与酶的混合液充氮气密封，18℃、150转/每分钟保温24后，用20mmol/L、pH8.0磷酸钠缓冲液(含0.2mol/L氯化钠，10％甘油)冲洗，用Bradford比色法检测流出液，至OD₅₉₅小于0.06时，用0.1mol/L、pH7.0磷酸钠缓冲液清洗，真空抽弃水分，按实施例2中所述方法测定固定化酶酶活。

结果：EPI-30-ARG-IDA-Co²⁺的固定化酶酶活：95U/g；

      EPI-30-ARG-IDA-Ni²⁺的固定化酶酶活：32U/g；

      Clontech TALON金属亲和树脂的固定化酶酶活：30U/g；

结果显示，本发明制备EPI-30-ARG-IDA-Co²⁺的固定化酰化酶酶活比Clontech TALON金属亲和树脂的固定化酶酶活高2-3倍，EPI-30-ARG-IDA-Ni²⁺的固定化酶酶活与该Clontech TALON金属亲和树脂的固定化酶酶活相当。

实施例5

固定化GL-7-ACA酰化酶的连续转化

将3克GL-7-ACA溶解于50mmol/L、pH7.0磷酸钠缓冲液中，定容至100ml，用6mol/L的氨水调pH值为8.0，取5ml该溶液投入0.3g实施例2制得的GL-7-ACA酰化酶固定化酶，20℃水浴震荡反应，期间调节pH至8.0，第1、6、13、21、29、35、41、47和50次反应的30分钟、60分钟分别取样，HPLC测定。连续转化50次，转化效率如下：

转化次数	转化速度(U/g)	转化率(％)	未转化GL-7ACA所占百分比(％)
				1	49.78	86.6	2.3
6	50.70	86.1	1.95
				13	57.80	93.3	1.1
21	58.80	94.5	1.0
				29	56.80	90.8	2.6
35	50.00	91.4	3.1
				41	50.60	91.3	3.0
47	52.90	92.0	1.9
				50	49.60	90.3	1.0

实施例6

载体制备方法同实施例1。

青霉素G酰化酶一步纯化固定化过程：40ml青霉素G酰化酶粗酶液(20U/ml)加入0.4g载体，18℃、160转/每分钟保温24后，用20mmol/L磷酸缓冲液pH8.0(含0.2mol/L氯化钠，10％甘油)冲洗，用Bradford比色法检测流出液，至OD₅₉₅小于0.06，用0.1mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.0)清洗，真空抽弃水分。采用对二甲胺苯甲醛(PDAB)法测定此载体固定化青霉素G酰化酶酶活。

本实施例中青霉素G酰化酶粗酶按以下文献所公开的方法制备：YongWen、Xunlong Shi、Zhongyi Yuan和Pei Zhou，“从嗜柠檬酸克吕沃尔氏菌得到的His标记的青霉素G酰基转移酶在大肠杆菌中的表达、纯化和表征”，第24-28页，Protein Expression and Purification，38(2004)24-28。

固定化青霉素G酰化酶酶活参照文(Biochim.Biophys.Acta.，1972，276：250-256)所公开的对二甲胺苯甲醛(PDAB)法测定此载体固定化青霉素酰化酶对青霉素G盐水解制备6-APA的表观酶活。

按上述方法测得青霉素G酰化酶固定化酶活为400U/g，固定化收率：20％。

实施例7

载体制备方法同实施例1。

D-氨基酸氧化酶纯化过程：30ml D-氨基酸氧化酶粗酶液加入1g载体，15℃、140转/每分钟保温18小时后装柱。用50倍柱床体积的漂洗缓冲液(含0.1mol/L Tris-HCl、0.25mol/L氯化钠、5％甘油、5mmol/L咪唑，pH8.0)洗脱，用Bradford比色法检测流出液，至OD₅₉₅小于0.06，用洗脱缓冲液(含0.1mol/LTris-HCl、0.25mol/L氯化钠、5％甘油、250mmol/L咪唑，pH8.0)洗脱，收集纯酶。

本实施例中所用的D-氨基酸氧化酶粗酶液制备按文献：Jorge Alonso、Estrella Cortes等，“对从Trigonopsis variabilis得到的D氨基酸氧化酶进行遗传加工，以促进其在大肠杆菌中的超表达以及使用特制金属螯合载体进行的下游加工”，Enzyme and Microbial Technology 25(1999)88-95。

D-氨基酸氧化酶酶活测定方法参考文献：Tzann-Shun Hwang、Hui-Mei Fu、Long-Liu Lin和Wen-Hwei Hsu，“以乳糖为诱导子的Trigonopsis variabilis D氨基酸氧化酶在大肠杆菌中的高水平表达”，Biotechnology Letters，22；655-658，2000。

根据上述方法测得载体对于D-氨基酸氧化酶的吸附量：100U/g。

纯化倍数约6.4；纯化收率：31.6％。具体数据见下表。

组氨酸标记的D-氨基酸氧化酶用本发明中制备的金属螯合亲和载体的纯化

方法	总蛋白(mg)	总活性(U)	比活性(U/mg)	纯化倍数	纯化率(％)
						粗酶液	2085	5943.7	2.85	1	100
IMAC	103.2	1880.2	18.25	6.4	31.6

实施例8

按实施例1所述的步骤，用以下量的物质制备下述金属螯合亲和载体。

编号	干琼脂粉(g)	活化剂(ml)	螯合剂(克)	金属盐(种类/克)
					1	30	48	13.5	Co2+，6
2	30	80	20	Ni2+，8
					3	10	90	15	Co2+，3.5
4	10	30	5	Ni2+，3

按实施例3所述的步骤测试这些载体的固定化收率约为15-25％。

Claims (10)

1.一种金属螯合亲和载体，其特征在于，它以琼脂粉为基质，所述琼脂粉交联有螯合剂，所述螯合剂螯合有金属离子，其中，所述琼脂粉基质、螯合剂和金属离子的质量比为800-1200∶10-45∶1-15。

2.如权利要求1所述的金属螯合亲和载体，其特征在于，所述螯合剂选自亚氨基二乙酸、氨三乙酸、N，N，N-三(羧甲基)乙二胺或羧甲基化天冬氨酸。

3.如权利要求2所述的金属螯合亲和载体，其特征在于，所述螯合剂为亚氨基二乙酸。

4.如权利要求1所述的金属螯合亲和载体，其特征在于，所述金属离子选自Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Ca²⁺或Mg²⁺。

5.一种亲和载体，其特征在于，它以琼脂粉为基质，所述琼脂粉交联有螯合剂，其中，所述琼脂粉基质和螯合剂的质量比为800-1200∶10-45。

6.一种制备权利要求1所述的金属螯合亲和载体的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)用pH3.0-6.8的酸性缓冲液抽提琼脂粉，然后用pH8.0-10.0的碱性缓冲液抽提琼脂粉，沥干，得到湿琼脂粉；

(2)用能使带有OH基的固体载体带有反应性官能团的活化剂处理步骤(1)得到的湿琼脂粉；

(3)使步骤(2)得到的琼脂粉与螯合剂交联，得到交联有螯合剂的琼脂粉；和

(4)使步骤(3)得到的琼脂粉中的螯合剂与金属离子螯合，得到所述金属螯合亲和载体。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述活化剂是环氧氯丙烷。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述螯合剂选自亚氨基二乙酸、氨三乙酸、N，N，N-三(羧甲基)乙二胺或羧甲基化天冬氨酸；所述金属离子选自Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Ca²⁺或Mg²⁺。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在载体制备过程中干琼脂粉、螯合剂和金属离子的盐投入物料的质量比为0.8-1.2∶0.45-1.62∶0.2-0.36，每克湿琼脂粉使用0.45-0.85ml的活化剂处理。

10.琼脂粉在制备金属螯合亲和载体中的用途。