CN1120365C - 一种新的亲和介质和用该介质纯化白蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种新的亲和层析介质，它包含固相载体以及固定在该载体上的3-氨甲基吡啶。本发明还提供了一种纯化获得高纯度白蛋白的方法，该方法包括用本发明的亲和层析介质来亲和层析纯化含有白蛋白的原料。运用本发明的亲和层析介质，就能迅速、高效地大规模生产高纯度的白蛋白试剂级和医用级产品。
Description
本发明涉及生物技术和生物医药领域，尤其涉及生物制品纯化领域。具体地说，本发明涉及一种新的亲和层析介质用亲和层析纯化白蛋白的方法
白蛋白(Albumin)是最常见、含量最丰富的血浆蛋白，占健康人血浆蛋白总量的52-56％，基本由肝脏合成。它是一种单链多肽，分子量为66,300，含有584个氨基酸残基，N-端为Asp，C-端为Leu。由于含有大量Glu，Asp和Lys残基，白蛋白具有很高的极性和溶解性。同时，它具有一个游离的半胱氨酸残基和17个胱氨酸基团，使分子呈具有多个环和横向裂缝的紧密结构，成为小型的球蛋白，这种构造说明了白蛋白具有很强的非特异性结合能力。
血浆白蛋白的正常水平为3,500-4,500mg/100ml，男性的白蛋白水平比女性高200mg/100ml，而且随着年龄的增长，该水平会有所降低。在胎儿的血浆中，白蛋白浓度与α1-胎盘蛋白水平成反比。在血管间隙内的白蛋白占总体的40％左右，大约60％在血管外，这于白蛋白的分子大小有关。每小时约5％的白蛋白离开血浆。血管外的白蛋白大部分存在于皮肤和肌肉组织间隙的小淋巴管中，内脏只含少量。这可能和不同组织的毛细血管对白蛋白的通透性不同有关。正常成人每日白蛋白的合成约为16g。如一个70kg的人，正常血清白蛋白水平为4,500mg/100ml，血管内白蛋白为126g，血管外液内为189g，总身体白蛋白为315g，每失血500ml，这个人将丧失11g或3.5％的身体白蛋白。相当于4个单位(2,000ml)的出血中的白蛋白可能在3天内完全正常合成所补充。它具有多种生理功能，主要是：维持血液胶体渗透压：由于白蛋白的分子量较小，且在血浆中的浓度大，所以血浆胶渗压的维持主要靠白蛋白，白蛋白的胶渗压可占血浆总胶渗压的80％。1g白蛋白产生的渗透压相当于20ml液体血浆或40ml全血。抗休克作用：能增加血液的有效循环量，对创伤、手术或烧伤所引起的休克有明显疗效。运输和解毒作用：白蛋白能结合阳离子，也能结合阴离子，故能输送性质不同的物质，如脂肪酸、激素、金属离子、酶和药物，调节被运输物质的生理功能，并能结合有毒物质，运送至解毒器官，然后排出体外。20％-25％的白蛋白溶液是高渗溶液，能调节由于胶体渗透压紊乱而引起的机能障碍，如水肿，腹水。营养供给：组织蛋白和血浆蛋白可互相转化，在氮代谢障碍时，白蛋白可作为机体的氮源，为组织提供营养。白蛋白还能促进肝细胞的修复和再生。
5％和25％白蛋白溶液和血浆蛋白组分(plasma protein fraction，PPF)可用于血浆代用品。输入白蛋白有增加血液体积的作用，可以用来代替输入全血。下表1中列出了白蛋白制剂的各种适应症。
表1白蛋白制剂的适应症
| 使用指征 | 作用 |
| 血浆交换/透析 | 维持血液的张力 |
| 新生儿溶血症 | 在置换输血中与胆红素间接结合 |
| 失蛋白性肾病/肠病 | 液体负荷过重时增加利尿及急性低血压时提高血压 |
| 烧伤 | 24小时后出现低蛋白血症，补充血浆蛋白 |
| 急/慢性肝功能障碍 | 液体负荷过重时增加利尿及急性低血压时提高血压 |
| 腹水、脑水肿 | 增加利尿，可有暂时性效果 |
| 休克 | 急性烧伤休克，可维持血容量及心搏出量 |
| 心肺手术体外循环 | 维持血液的渗透压于20mmHg |
自健康人血浆或血清分离而得的血浆蛋白质，有两种制品：一为自健康人血浆或血清分离而得的人血清白蛋白，一为自健康产妇胎盘血分离而得的胎盘白蛋白。成品内含蛋白质5、10或25％，其中95％以上为白蛋白。临床用于抢救失血、烧伤性休克、由脑水肿或大脑损伤所致的脑压增高、低蛋白血症、由肝硬化和肾疾所致的水肿和腹水。
目前，血液制品的生产技术主要采用低温乙醇沉淀法。这种工艺已经有50年的历史了。这些传统方法操作步骤多，产品种类有限，血浆中的很多其他有效物质被浪费掉了。如：生产灭毒合格的白蛋白和抗体，需要10步操作。这种工艺生产的白蛋白和抗体，产品纯度不够高，虽然生产过程中使用了病毒灭活步骤，但潜在病毒的遗传物质(DNA和RNA)和组成蛋白并没有去除干净，在某些条件下仍然有危险。虽然近年来发展出了以离子交换和凝胶过滤为中心的层析法生产工艺，但是生产灭毒合格的白蛋白和抗体仍需要10步左右的操作。使用这种工艺，产品的纯度有所提高，但生产成本并没有降低，产品种类也没有增加，血浆中许多其它含量较少的宝贵蛋白质仍被浪费掉了。低温乙醇法的操作相对简单，产量高，适宜工业化规模生产。保持蛋白质的天然性质：乙醇沉淀血浆蛋白在接近血浆溶液冰点温度下进行，能使蛋白质变性降至最低限度，保持其天然状态。低温乙醇法分离过程中有抑菌作用。近年来的研究证明适当的低温乙醇工艺(6+9法、Kistler和Nitschmann法)有杀灭和清除艾兹病毒的作用，增强了制品的安全性(低温乙醇法的工艺流程见图4)。乙醇作为主要原材料，价格低廉，易于获得。但低温乙醇法的应用，应具备低温冷室及连续冷冻离心机等设备条件，需要相当的资金。另外，工作人员需在相对低温条件下操作。产品的纯度有限，最终产品种难免含有微量的杂质和变性产品，易于引起负反应。层析法近年来越来越广泛地应用于生物制剂的纯化制备。Curling等1978年发表了应用离子交换层析(Ion-Exchange chromatography)分离白蛋白的方法，Suomela等描述了小规模离子交换层析分离免疫球蛋白。凝胶过滤(Gel filtration，又称分子筛层析)与离子交换及超滤技术的结合，用于大量血浆蛋白的分离是可行的。瑞典Amershan PharmaciaBiotech和Pharmardule联合发展的血液制品层析生产工艺PharmaFrac。该工艺利用了四步层析，白蛋白的产率为25g/L血浆。因此，层析法制备的产品纯度高，能很好的保持蛋白质的天然性质。但生产成本偏高，生产效率低，用于步骤多，产品回收率并没有提高。其它的方法还有盐析法(硫酸铵盐析)、利凡诺(Rivanol)沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、热乙醇/PEG法等，但由于各种因素，没有在工业上得到广泛采用。因此，目前仍然需要有一种新的纯化方法来高效快速地大规模纯化白蛋白。
本发明的一个目的是提供一种新的亲和层析介质。
本发明的另一个目的是提供一种用该亲和层析介质来纯化获得高纯度白蛋白的方法。
一方面，本发明涉及一种新的亲和层析介质，其特征在于，它包含固相载体以及固定在该载体上的3-氨甲基吡啶。
本发明中的固相载体是本领域技术人员所熟知的、通常用于亲和层析的固相载体，通常有琼脂糖和纤维素。它们包括(但不局限于)：葡聚糖凝胶(Sephadex)、PDX(交联的葡聚糖珠)、聚丙烯酰胺葡聚糖复合凝胶(Sephacryl)、琼脂糖凝胶(Sepharose、Sepharose CL、Sepharose FF)、Superdex(琼脂糖和葡聚糖交联的复合物)、Superose(高度交联的琼脂糖和葡聚糖)、Trisacryl(N-三[羟甲基]甲基丙烯酰胺和羟化交联接头(cross-linker)的珠状共聚物)、Ultrogel A(珠状琼脂糖)、Ultrogel AcA(聚丙烯酰胺/琼脂糖的珠状复合物)、珠状纤维素(多孔性再生的纤维素珠)、聚合物涂覆的硅胶等。其中较佳的是琼脂糖凝胶、珠状纤维素和Trisacryl。
用于本发明亲和层析介质的配基是商业上可购得的化合物3-氨甲基吡啶。该化合物是通过大规模筛选的方法，以人血浆为样品、以经亲和层析后的白蛋白纯度为标准，从数百种亲和配基中挑选出来的。将该化合物固定在前述固相载体上就可制得本发明的亲和层析介质。固定技术是本领域普通技术人员所熟知的(例如参见Turkoya，J.(1993)″生物亲和层析(Bioaffinity Chromatography)″，ElsevierScience，London，UK)。每1000毫升固相载体中通常可加入10-30克3-氨甲基吡啶，但是优选加入15-20克3-氨甲基吡啶。
另一方面，本发明涉及一种获得高纯度白蛋白的纯化方法，该方法包括用亲和层析纯化含有白蛋白的原料液，其特征在于，该亲和层析采用本发明的亲和层析介质。
在本发明的一个较佳实例中，纯化白蛋白的亲和吸附条件为pH5.0-9.0、0.005-0.03M的缓冲液，优选pH6.0，20mM的Tris·HCl缓冲液。
在本发明的另一个较佳实例中，亲和洗脱白蛋白的洗脱条件为pH2.0-5.0或9.5-11.0、0.005-2.0M的缓冲液，优选pH4.6，25mM NaAc-HAc缓冲液。
在本发明还有一个实例中，在进行所述亲和层析纯化后，还可用任选的阴离子交换、阳离子交换和凝胶过滤层析以及超滤对白蛋白进行进一步纯化。
利用本发明的纯化方法，就可以从含有白蛋白来源的各种原料中纯化获得高纯度的白蛋白。这些原料包括(但不局限于)采集的血浆、胎盘血、基因工程菌或细胞和动物生物反应器表达的人白蛋白的发酵液、细胞培养液或上述原料经低温乙醇法处理得到的各组分。在这里，用本发明的纯化方法获得的白蛋白的纯度在95％以上，较佳的在98％以上，更佳的在99％以上。
本发明的纯化方法是一种低成本的、高效快速地纯化白蛋白(尤其是人白蛋白)的亲和技术。这种亲和技术工艺，可以在大规模生产和实验室中经济高效地制备高纯度的白蛋白，其成本和生产效率可以与低温乙醇法相当，而产品的纯度和质量与层析法相同。另外，固定在固相载体上的本发明的亲和配基很稳定，它能耐受医药生产中必需的现场在线清洗和消毒，可以方便地满足GMP(GoodManufacturing Practice)标准。
图1显示了化合物3-氨甲基吡啶的结构。
图2是分子筛层析(Superosel2，1×30cm)测定白蛋白的流出峰结果。
图3显示了白蛋白经AT23亲和层析纯化后再经Q-Sepharose(5×20cm)纯化后的电泳结果。图左侧为分子量标记，中间的泳道为血浆，泳道1为纯化的产物。
图4显示了Kistler和Nitschmann低温乙醇法组分IV溶液中纯化出的蛋白电泳图。
图5是不同盐浓度下AT23亲和层析介质与白蛋白之间结合曲线图。
图6是不同pH下AT23亲和层析介质与白蛋白之间结合曲线图。
图7是不同pH下从AT23亲和层析介质上洗脱白蛋白的曲线图。
图8是不同盐浓度下从AT23亲和层析介质上洗脱白蛋白的曲线图。
下面结合附图对本发明作进一步的说明：
实施例1：
取化合物3-氨甲基吡啶(15g)，溶解于50ml Na2CO3(0.5M，pH11.0)，加入到盛环氧基Sepharose 6B(1000ml)的可密封瓶中，60℃摇振过夜。在停止之前，加入2ml的乙醇胺，保温振荡2小时。最后取出反应瓶中Sepharose 6B，经0.5M醋酸(1000ml)，0.1M NaOH(1000ml)和蒸馏水(1000ml×5)分别洗涤后，得到亲和层析介质，命名为AT23，加入20％乙醇储存待用。
实施例2：
取化合物3-氨甲基吡啶(20g)，溶解于400ml Na2CO3(0.2M，pH8.0)，加入到盛环氧基珠状纤维素(1000ml左右)的可密封瓶中，50℃摇振过夜。在停止之前，加入5ml的乙醇胺，保温振荡2小时。最后取出反应瓶中珠状纤维素，经0.5M醋酸(1000ml)，0.1M NaOH(1000ml)和蒸馏水(1000ml×5)分别洗涤后，得到所需的纤维素基质的亲和层析介质，命名为AT24，加入20％乙醇储存待用。
实施例3：
取化合物3-氨甲基吡啶(18g)，溶解于50ml Na2CO3(0.8M，pH12.0)，加入到盛环氧基Trisacryl(1000ml左右)的可密封瓶中，40℃摇振过夜。在停止之前，加入10ml的乙醇胺，保温振荡2小时。最后取出反应瓶中Trisacryl，经0.5M醋酸(1000ml)，0.1M NaOH(1000ml)和蒸馏水(1000ml×5)分别洗涤后，得到所需的Trisacryl基质的亲和层析介质，命名为AT25，加入20％乙醇储存待用。
实施例4：
亲和层析介质AT23(1000ml)，装入层析柱(10×50cm)中。用4000ml TrisHCl(5mM，pH6.0)平衡后，把人血浆(500ml，已经将缓冲液换为Tris·HCl，20mMpH6.0)加到柱上。用3000ml Tris·HCl(5mM，pH6.0)洗去未吸附的物质后，再用1500ml醋酸溶液(15mM，pH4.6)洗脱被吸附的白蛋白，收集洗脱组份。用12％的SDS-PAGE检测产品发现产品大小和含量与血浆中的白蛋白相同，产品的主要成份为白蛋白。用分子筛层析(Superose12，1×30cm)测定(图2)可以看出产品的流出峰是比较完美的正态分布。对峰面积积分可以算出，白蛋白的纯度为99％以上，结果列在下表2中。白蛋白的总回收率为(88％)。
表2
| 吸收峰 | 保留体积(ml) | 峰面积(mAU*ml) | 峰面积/总峰面积(％) |
| 1 | 7.89 | 5.15 | 1.81 |
| 2 | 10.78 | 278.74 | 98.19 |
| 测出的峰数 | 2 | ||
| 总峰面积(mAU*ml) | 285.40 | ||
| 空柱体积(ml) | 7.77 | ||
实施例5：
调节实施例4中的白蛋白洗脱液至pH到4.5、离子强度0.02。再上到Q-Sepharose柱(5×20cm)，收集流穿液，白蛋白的回收率＞81％，纯度为99.99％(图3)。
实施例6：
亲和层析介质AT24(10ml)，装入层析柱(1.0×5.0cm)中。用100ml TrisHCl(5mM，pH6.0)平衡后，把10ml低温乙醇血液制品生产工艺中的II+III沉淀溶液(见Kistler和Nitschmann低温乙醇法工艺)(0.2g/10ml，已经将缓冲液换为Tris·HCl，20mM，pH6.0)加到柱上。用100ml Tris·HCl(5mM，pH6.0)洗去未吸附的物质后，再用50ml醋酸溶液(15mM，pH4.6)洗脱被吸附的白蛋白，收集洗脱组份。用12％的SDS-PAGE检测产品发现产品大小和含量与血浆中的白蛋白相同，为白蛋白。用分子筛层析(Superose12，1×30cm)测定并对峰面积积分可以算出，白蛋白的纯度大于98％以上。白蛋白的回收率为(89％)。
实施例7：
亲和层析介质AT25(10ml)，装入层析柱(1.0×5.0cm)中。把1000ml低温乙醇血液制品生产工艺中的组份IV溶液1000ml，超滤除去乙醇，并将缓冲液换为TrisHCl，20mM，pH6.0，制备成60mg/ml的溶液，并加到已经平衡好的亲和层析柱上。用100ml Tris·HCl(5mM，pH6.0)平衡后，用100ml Tris·HCl(5mM，pH6.0)洗去未吸附的物质后，再用50ml醋酸溶液(15mM，pH4.6)洗脱被吸附的白蛋白，收集洗脱组份。用12％的SDS-PAGE检测产品发现产品大小和含量与血浆中的白蛋白相同，为白蛋白(图4)。用分子筛层析(Superose12，1×30cm)测定并对峰面积积分可以算出，白蛋白的纯度大于98.5％以上。白蛋白的回收率为(88％)。
实施例8：
亲和层析介质AT23(10ml)，装入层析柱(1.0×5.0cm)中。把10ml酵母表达的人白蛋白发酵上清液的缓冲液换为Tris·HCl，20mM，pH6.0，然后加到已经平衡好的亲和层析柱上。用100ml Tris·HCl(5mM，pH6.0)平衡后，用100ml Tris·HCl(5mM，pH6.0)洗去未吸附的物质后，再用50ml醋酸溶液(15mM，pH4.6)洗脱被吸附的白蛋白，收集洗脱组份。用12％的SDS-PAGE检测产品发现产品大小与人血浆中的白蛋白相同。用分子筛层析(Superose12，1×30cm)测定纯度，并对峰面积积分可以算出，白蛋白的纯度大于98.5％以上。白蛋白的回收率为(86％)。
实施例9：
调节实施例8中的白蛋白洗脱液至pH到4.5、离子强度0.02。再上到S-Sepharose柱(5×20cm)上，用NaCl浓度到1M的直线梯度洗脱，得到白蛋白的回收率＞80％，纯度为99.99％。
实施例10：
亲和层析介质AT23(10ml)，装入层析柱(1.0×5.0cm)中。把10ml狗血浆的缓冲液换为Tris·HCl，20mM，pH6.0，然后加到已经平衡好的亲和层析柱上。用100mlTris·HCl(5mM，pH6.0)平衡后，用100ml Tris·HCl(5mM，pH6.0)洗去未吸附的物质后，再用50ml醋酸溶液(100mM，pH2.4)洗脱被吸附的白蛋白，收集洗脱组份。用12％的SDS-PAGE检测产品发现产品大小与狗血浆中的白蛋白相同。用分子筛层析(Superose12，1×30cm)测定纯度，并对峰面积积分可以算出，白蛋白的纯度大于95％。白蛋白的回收率为(90％)。
实施例11：
对亲和层析中结合条件和洗脱条件的优化
在该实施例中，分别对亲和层析中结合条件和洗脱条件(盐浓度和pH值)进行优化。选用实施例1制备AT23亲和层析介质，在中性条件下进行结合条件的盐浓度优化→在缓冲液电导率不变情况下进行结合酸碱度条件优化→在缓冲液电导率不变情况下进行洗脱酸碱度条件优化→在缓冲液电导率不变情况下进行洗脱盐浓度条件优化。
结果如图5-8所示，在白蛋白的结合的盐浓度为0.005-0.03M，更佳地0.01-0.02M(图5)，pH条件为pH5.0-9.0更佳地pH5.5-7.0(图6)。
洗脱条件是洗脱缓冲液的盐浓度为0.005-2.0M，较佳地，盐浓度为0.01-0.50M(图8)。pH条件为pH2.0-5.0或pH9.5-11.0(图7)，较佳地，pH3.5-4.8。
本文公开和揭示的所有组合物与方法可通过借鉴本文公开内容无需进行过多试验而制得和实施。尽管本发明的组合物和方法已经通过较佳实例进行了描述，但是本领域技术人员明显能在不脱离本发明的内容、精神和范围内对本文所述的组合物、方法、以及方法步骤和步骤次序作改动。更具体地，明显可用化学和生理上相关的某些试剂代替本文所述的试剂来获得相同或相似的结果。所有这些相似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括附加权利要求定义的本发明精神、范围和内容中。
Claims (9)
1.一种新的亲和层析介质，其特征在于，它包含固相载体以及固定在该载体上的3-氨甲基吡啶。
2.按权利要求1所述的亲和层析介质，其特征在于，所述固相载体选自葡聚糖凝胶、PDX、聚丙烯酰胺葡聚糖复合凝胶、琼脂糖凝胶、琼脂糖和葡聚糖交联的复合物、高度交联的琼脂糖和葡聚糖、N-三[羟甲基]甲基丙烯酰胺和羟化交联接头的珠状共聚物、珠状琼脂糖、聚丙烯酰胺/琼脂糖的珠状复合物、珠状纤维素、聚合物涂覆的硅胶。
3.一种获得高纯度白蛋白的纯化方法，该方法包括用亲和层析纯化含有白蛋白的原料，其特征在于，所述亲和层析采用权利要求1所述的亲和层析介质。
4.按权利要求3所述的纯化方法，其特征在于，纯化白蛋白的亲和吸附条件为pH5.0-9.0、0.005-0.03M的缓冲液。
5.按权利要求4所述的纯化方法，其特征在于，纯化白蛋白的亲和吸附条件为pH6.0，20mM Tris·HCl缓冲液。
6.按权利要求3所述的纯化方法，其特征在于，白蛋白的洗脱条件为pH2.0-5.0或9.5-11.0、0.005-2.0M的NaAc-HAc缓冲液。
7.按权利要求6所述的纯化方法，其特征在于，白蛋白的洗脱条件为pH4.6，15mM NaAc-HAc缓冲液。
8.按权利要求3所述的纯化方法，其特征在于，所述含白蛋白的原料选自血浆、胎盘血、基因工程菌或细胞和动物生物反应器表达的人白蛋白发酵液、细胞培养液或上述原料经低温乙醇法处理得到的各组分。
9.按权利要求3所述的纯化方法，其特征在于在进行所述亲和层析纯化后，还用任选的阴离子交换、阳离子交换和凝胶过滤层析以及超滤对白蛋白进行进一步纯化。
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