CN1296951A - 白蛋白和抗体的亲和生产工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时生产白蛋白和抗体(丙种球蛋白)的生产工艺,包括将原料先用亲和技术分离出白蛋白,然后用离子交换层析或疏水层析精制出抗体(丙种球蛋白),即可得到高纯度的白蛋白和丙种球蛋白的试剂级和医用级产品。本发明还公开了用于此工艺的新颖的亲和层析介质。

Description

白蛋白和抗体的亲和生产工艺

本发明涉及生物技术和生物医药领域，更具体地，本发明涉及一类新的白蛋白亲和层析介质及其制备方法。本发明还涉及用这类新的亲和层析介质纯化生产白蛋白和丙种球蛋白的新方法。

血浆蛋白成份在动物体内具有重要的生理功用。这些蛋白成份可以分离、加工成适合临床治疗用的各种制剂，分别供临床上对症治疗用。目前，国际上从血浆中制备的蛋白制品有白蛋白(albumin)制剂、免疫球蛋白(immunoglobulin)制剂、凝血因子Ⅷ制剂、凝血因子Ⅸ制剂、抗凝血酶Ⅲ(antithrombin Ⅲ)、纤维结合蛋白(fibronectin)、α₂-巨球蛋白(α2-macroglobulin)、α₁-抗胰蛋白酶(α₁-antitrypsin)等。

通过充分合理的综合利用血浆中的有效成份和血浆成份，可以达到全面综合利用宝贵血浆的目的。既减少了输用全血造成的不必要的浪费，又可以减少血源性疾病的传播。这些制品大多都应用在人的生命受到危险和遗传性疾病方面，需要输入的量大，或持续时间长。因此，对产品的质量和安全性要求高，市场需求稳定。根据血液制品种类和生产技术的水平的不同，国际市场的容量为数百亿美元。

目前，血液制品的生产技术主要采用低温乙醇沉淀法。这种工艺已经有50年的历史了。这类传统方法操作步骤多，产品种类有限，血浆中的很多其他有效物质被浪费掉了。比如，生产灭毒合格的白蛋白和抗体，需要10步操作。这种工艺生产的白蛋白和抗体，产品纯度不够高，虽然生产过程中使用了病毒灭活步骤，但潜在病毒的遗传物质(DNA和RNA)和组成蛋白并没有去除干净，在某些条件下仍然有危险。

虽然近年来发展出了以离子交换和凝胶过滤为中心的层析法生产工艺，但是生产灭毒合格的白蛋白和抗体仍需要10步左右的操作。使用这种工艺，产品的纯度有所提高，但生产成本并没有降低，产品种类也没有增加，血浆中许多其它含量较少的宝贵蛋白质仍被浪费掉了。

低温乙醇法的操作相对简单，产量高，适宜工业化规模生产。低温乙醇法还有保持蛋白质天然性质的优点：乙醇沉淀血浆蛋白在接近血浆溶液冰点温度下进行，能使蛋白质变性降至最低限度，保持其天然状态。此外，低温乙醇法分离过程中有抑菌作用。近年来的研究证明，适当的低温乙醇工艺(6+9法、Kistler和Nitschmann法)有杀灭和清除艾滋病毒的作用，增强了制品的安全性。乙醇作为主要原材料，价格低廉，易于获得。但低温乙醇法的应用，应具备低温冷室及连续冷冻离心机等设备条件，需要相当的资金。另外，工作人员需在相对低温条件下操作。产品的纯度有限，最终产品种难免含有微量的杂质和变性产品，易于引起负反应。国际上除一些发达国家之外的大多数国家，目前主要仍然采用传统的乙醇沉淀及其改进工艺生产血液制品。由于工艺的限制，产品只有白蛋白制剂和免疫球蛋白制剂，其余的大部分宝贵成份都成了生产过程的废料。

近年来，层析法被越来越广泛地应用于生物制剂的纯化制备。Curling等人1978年发表了应用离子交换层析(Ion-Exchange chromatography)分离白蛋白的方法。Suomela等人描述了小规模离子交换层析分离免疫球蛋白。将凝胶过滤(Gelfiltration，又称分子筛层析)与离子交换及超滤技术相结合，用于大量血浆蛋白的分离是可行的。然而，虽然柱层析法制各的产品纯度较高，能很好的保持蛋白质的天然性质而且产品收获率也较高，但是生产成本偏高，生产效率低。

近年来，西方国家采用的瑞典Amershan Pharmacia Biotech和Pharmardule联合发展的血液制品层析生产工艺PharmaFrac。该工艺利用了四步层析，白蛋白的产率为25g/L血浆，丙种球蛋白的产率为5g/L血浆。这个工艺虽然可以避免微量组份变性成为废料，并可通过增加生产线生产其它产品(如九因子)，但这些工艺没有减少生产步骤，没有提高产品的产率，也没有降低生产成本，因而市场竞争力并不强。

其它的方法还有盐析法(硫酸铵盐析)、利凡诺(Rivanol)沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、热乙醇/PEG法等，由于各种因素，没有在工业上得到广泛采用。

因此，本领域迫切需要开发高效率、低成本、步骤简便的大规模生产生产血液制品的方法和材料，尤其是用于同时生产白蛋白和丙种球蛋白的方法和材料。

本发明的一个目的是提供一类新的亲和层析介质，该亲和介质可与白蛋白高亲和性的结合，因而用于免疫球蛋白的亲和纯化。

本发明的另一目的是提供这类亲和层析介质的制备方法。

本发明的另一目的是提供一种低成本、高效率、步骤简便的大规模生产人白蛋白和丙种球蛋白的亲和技术工艺。

在本发明的第一方面，提供了一种亲和层析介质，它包括：固相载体以及偶联在固相载体上的3-氨甲基吡啶亲和配位体。

在本发明的第二方面，提供了一种分离纯化白蛋白和丙种球蛋白的方法，它包括：

用亲和层析柱对含白蛋白和丙种球蛋白的原料进行亲和层析，从而使白蛋白固定于亲和层析介质，而丙种球蛋白则随流穿液流过亲和层析柱；

对固定于亲和层析介质上的白蛋白进行洗脱，从而获得纯化的白蛋白；以及

对含丙种球蛋白的该流穿液进行离子交换层析或疏水层析，从而获得纯化的丙种球蛋白。

较佳地，在亲和层析中所用的亲和层析介质包括固相载体以及偶联在固相载体上的3-氨甲基吡啶亲和配位体。

在一个优选例中，该方法还包括还包括步骤：在进行亲和层析之前，对含白蛋白和丙种球蛋白的原料进行换缓冲液(buffer-exchange)处理。

在本发明的一个优选例中，对含丙种球蛋白的该流穿液的进一步分离纯化是通过离子交换层析进行，其中使用含DEAE-或S-基团的离子交换树脂，从而吸附除丙种球蛋白之外的杂质。

本发明的发明点在于，发现了一种新颖的高亲和力的白蛋白亲和层析介质，并在此基础上首次将白蛋白的亲和层析和丙种球蛋白的分离纯化结合在一起，形成了一种新的大规模生产白蛋白和丙种球蛋白的亲和技术生产工艺。

该工艺的特点是低成本、高效率和步骤简便。这种亲和技术工艺，成本和生产效率可以与低温乙醇法相当，产品的纯度和质量与PharmaFrac层析工艺相当，但生产步骤减少一半，产品回收率提高20％以上。此外本发明的亲和纯化工艺具有生产快速、工艺稳定的特点，可以耐受医药生产中必需的现场在线清洗和消毒，方便地满足GMP(Good Manufacturing Practice)标准。

亲和层析，又称为生物选择性吸附层析，已经成为纯化生物大分子活性物质不可缺少的分离技术。随着对生物制品中活性成分的纯度和需求量的增加，杂质含量的降低，传统分离技术如凝胶过滤和离子交换层析技术再也不能满足工业生产和学术研究的要求。

与其它方法相比，亲和层析方法具有以下几个明显的特点。亲和层析介质允许对生物分子选择地吸附和解离，可以取得很高的纯化倍数，常常为1000多倍。此外，蛋白在纯化过程中不仅得到浓缩，当结合到亲和配位体上时，蛋白的性质也更加稳定；其结果又提高了目标产品的活性回收率。因此，亲和分离技术非常适用于处理体积大，浓度低的生物活性物质。

在大规模生产的纯化工艺中，采用亲和层析技术可以大大减少纯化过程的步骤，从而减少了合格产品的生产时间和成本。当下游生产成本占总生产成本的80％时显得更加重要。在纯化过程的任何环节都可以使用亲和层析技术，但采用的越早，获得的经济效益越大。J.Bonnerjea(Biotechnology,4,954-958,1986)对生物制品生产工艺调查的结果显示，在所有被考察的工艺中，一步纯化效果最佳的单元操作中，有45％是利用亲和步骤获得的。

亲和分离介质的关键是亲和配位体(也可称为“亲和配位体”)。亲和配位体必须能够选择性地和可逆地吸附生物大分子。传统的亲和配位体为亲和介质的成功使用奠定的基础。然而，在工业生产中，天然的亲和配位体，如抗体、辅酶、氨基酸、多肽、蛋白、凝集素，具有不可克服的缺点：最突出的因素是成本昂贵，生物和化学性质不稳定，生产中难于维持结合活性，也不能经受在线清洁和消毒，因此，还可能被其它物质，如病毒和内毒素污染。

针对根据白蛋白的结构和性质，本发明人筛选发现了一种成本低，亲和力高的亲和配位体3-氨甲基吡啶。将该化合物固定于层析介质上后，不仅能够提供高效的纯化倍数、重复性的结果，而且配位体极少脱落。更适合工业化、大规模生产医用和试剂用白蛋白。而且，原料在去除了白蛋白之后的残液，主要含有丙种球蛋白和其他杂质。对丙种球蛋白进行进一步的分离纯化(如离子交换层析或疏水层析)之后，就可获得高纯度的丙种球蛋白。

用于本发明的亲和配位体3-氨甲基吡啶是一种已知的化合物，可用常规方法合成或购得。

可用于本发明的固相载体可以是亲和层析领域中任何具有活性连接基团(如羟基、氨基、羧基、环氧基、卤素等)的固相载体。本发明的新颖的亲和层析配位体还可通过桥连分子而连接于常用的固相载体上。代表性的固相载体包括(但并不限于)：葡聚糖凝胶如Sephadex，交联的葡聚糖珠如PDX，烯丙基葡聚糖和N,N’-亚甲基双(丙烯酰胺)的交联共聚物如Sephacryl，琼脂糖凝胶如Sepharose、Sepharose CL、Sepharose FF，琼脂糖和葡聚糖的交联共聚物如Superdex、高度交联的琼脂糖和葡聚糖如Superose,N-三[羟甲基]甲基丙烯酰胺和羟基化交联接头的共聚物珠如Trisacryl、Trisacryl plus，琼脂糖珠如Ultrogel A，聚丙烯酰胺/琼脂糖复合物珠如Ultrogel AcA，纤维素珠如高孔隙度的再生纤维素珠、涂有聚合物的硅胶，或它们的混合物。

将本发明的3-氨甲基吡啶偶联于或固定于固相载体的方法可选用本领域常规的方法，这取决于所用的固相载体种类。例如用环氧氯丙烷作为交联剂或马来酸酐等进行偶联。对固定化技术的一般综述，可参见Turkova,J.(1993)“Bioaffinity Chromatography”,Elsevier Science,London,U.K。

在本发明的新工艺中，可用本发明方法分离纯化的含白蛋白和丙种球蛋白的原料可以是任何含白蛋白和丙种球蛋白的原料，例如人血浆，动物血浆、基因工程表达产物、低温乙醇生产工艺中含白蛋白和丙种球蛋白的中间产物(例如，上清Ⅰ、上清a、上清b、上清Ⅳ、上清C以及沉淀A(组份Ⅱ+Ⅲ)、沉淀B(组份Ⅲ)、沉淀GG(组份Ⅱ)、沉淀Ⅳ)(见Kistler and Nitschmann法工艺)。

首先将含白蛋白和抗体的原料作适当稀释，例如配成1-12％(较佳地2-10％，最佳地4-8％)的溶液。

为了提高亲和层析的效率，可以对含白蛋白和抗体的原料或其稀释液进行换缓冲液处理。例如经过Sephadex G-25凝胶过滤层析柱，将缓冲液交换为结合缓冲液，如磷酸缓冲液(20mM,pH6.0)。

之后，对于经过换缓冲液处理之后的样品，进行亲和层析，从而获得纯化的白蛋白。具体地，白蛋白的亲和层析可以包括上样(吸附)、洗涤和洗脱步骤。此外，对于亲和层析后的白蛋白洗脱液，还可阴离子交换、阳离子交换和凝胶过滤层析以及超滤等方法对白蛋白进行进一步纯化。

在白蛋白的亲和层析步骤中，一种结合条件是使用如下结合缓冲液：缓冲液的盐浓度为0.005-0.03M,pH5.0-9.0；更佳地，0.01-0.02M,pH5.5-7.0；最佳地，是5mM磷酸缓冲液(pH6.0)。

一种洗脱条件是使用如下的洗脱缓冲液：缓冲液的盐浓度为0.005-2.0M,pH2.0-5.0或9.5-11.0；较佳地，盐浓度为0.01-0.50M,pH3.5-4.8；最佳地是15mM醋酸缓冲液(pH4.6)(如果需对白蛋白进行再纯化，这样就不必再换缓冲液)。

在亲和层析同时，可收集上样和洗涤过程中含丙种球蛋白和其他杂质的缓冲液，以用于丙种球蛋白的分离纯化。

对于丙种球蛋白的分离纯化，可选用离子交换层析、疏水层析和其他本领域常用于丙种球蛋白分离的方法。较佳地，选用离子交换层析，尤其是用含DEAE-或S-基团的离子交换树脂(如DEAE-Sepharose、DEAE-Sepharose FF、S-Sepharose和S-Sepharose FF。)直接吸附除丙种球蛋白之外的杂质，从而直接从流穿液获得纯化的丙种球蛋白。在一种优选例中，是用DEAE-Sepharose FF进行离子交换层析，其中条件为pH为5.0-6.8，盐浓度为1mM-50mM。

在本发明的一个具体优选例中，将原料用装有层析介质AT23的亲和层析柱，在磷酸缓冲液(20mM,pH6.0)的条件下吸附白蛋白。用足够量的磷酸缓冲液(20mM,pH6.0)洗去未吸附的杂质后，再用醋酸溶液(15mM,pH4.6)专一洗脱白蛋白。从AT23的亲和层析柱流穿的原料液，直接上到用磷酸缓冲液(20mM,pH6.0)平衡的DEAE-Sepharose FF离子交换柱上。原料液中的杂质被吸附，抗体直接流穿。这个工艺制备的白蛋白和抗体的半成品的纯度为98％左右。高于中国药典和美国药典的标准。产品回收率在80％以上。

在说明书附图中，

图1显示了化合物3-氨甲基吡啶的结构式。

图2是用12％SDS-PAGE检测亲和层析后白蛋白的电泳图。

图3是用分子筛层析(Superose 12,1×30cm)测定白蛋白的流出峰结果。

图4用10％SDS-PAGE检测离子交换层析后丙种球蛋白的电泳图。

图5是用分子筛层析(Superose 12,1×30cm)测定丙种球蛋白的流出峰结果。

图6是不同盐浓度下AT23亲和层析介质与白蛋白之间结合曲线图。

图7是不同pH下AT23亲和层析介质与白蛋白之间结合曲线图。

图8是不同盐浓度下从AT23亲和层析介质上洗脱白蛋白的曲线图。

图9是不同盐浓度下从AT23亲和层析介质上洗脱白蛋白的曲线图。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

制备亲和层析介质AT23

取化合物3-氨甲基吡啶(15g)，溶解于50ml Na₂CO₃(0.5M，pH11.0)，加入到盛环氧基Sepharose 6B(1000ml)的可密封瓶中，60℃摇振过夜。在停止之前，加入2ml的乙醇胺，保温振荡2小时。最后取出反应瓶中Sepharose 6B，经0.5M醋酸(1000ml)，0.1M NaOH(1000ml)和蒸馏水(1000ml×5)分别洗涤后，得到亲和层析介质，命名为AT23，加入20％乙醇储存待用。

实施例2

制备亲和层析介质AT24

化合物3-氨甲基吡啶(20g)，溶解于50-400ml Na₂CO₃(0.2-0.8M,pH8.0-12.0)，加入到盛环氧基珠状纤维素(又称为纤维素珠)(1000ml左右)的可密封瓶中，40-60℃摇振过夜。在停止之前，加入1-10ml的乙醇胺，保温振荡2小时。最后取出反应瓶中珠状纤维素，经0.5M醋酸(1000ml),0.1MNaOH(1000ml)和蒸馏水(1000ml×5)分别洗涤后，得到所需的纤维素基质的亲和层析介质AT24，加入用20％乙醇储存待用。

实施例3

制备亲和层析介质AT25

将化合物3-氨甲基吡啶(18g)，溶解于50-400ml Na₂CO₃(0.2-0.8M,pH8.0-12.0)，加入到盛环氧基Trisacryl(1000ml左右)的可密封瓶中，40-60℃摇振过夜。在停止之前，加入1-10ml的乙醇胺，保温振荡2小时。最后取出反应瓶中Trisacryl，经0.5M醋酸(1000ml)，0.1M NaOH(1000ml)和蒸馏水(1000ml×5)分别洗涤后，得到所需的Trisacryl基质的亲和层析介质AT25，加入用20％乙醇储存待用。

实施例4

(1)换缓冲液处理

取500ml的冰冻的人血浆，于4℃融化，过滤除去沉淀。上样到已经用磷酸缓冲液(20mM,pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱(25×40cm)上，继续用磷酸缓冲液(20mM,pH6.0)洗脱。收集280nm的吸收峰，得到980ml样品。放置约30分钟以上，如该样品有沉淀，则弃去沉淀。

(2)亲和层析

将实施例1制备的亲和层析介质AT23(1000ml)，装入层析柱(10×50cm)中。用4000ml磷酸缓冲液(5mM,pH6.0)平衡后，把已换为结合缓冲液的900ml人血浆样品加到柱上。同时开始收集流穿液(含丙种球蛋白和其他杂质)。再用3000ml磷酸缓冲液(5mM,pH6.0)洗涤，去除未吸附的物质。同时继续收集流穿液，直至用核酸蛋白检测仪在280纳米处检测没有蛋白流出为止，收集到流穿液共1500ml。

之后，用1500ml洗脱缓冲液(15mM醋酸缓冲液，pH4.6)洗脱被吸附的白蛋白，收集洗脱组份。用12％的SDS-PAGE检测产品(图2)，发现产品大小和含量与血浆中的白蛋白相同，产品的主要成份为白蛋白。用分子筛层析(Superose 12,1×30cm)测得(图3)白蛋白的纯度为98％以上。白蛋白的总回收率为(88％)。

(3)分离纯化丙种球蛋白

对应上述收集的亲和柱AT23的流穿液(1500ml)，全部上到已经用磷酸缓冲液(5mM,pH6.0)平衡的DEAE-Sepharose FF柱(5×30cm)上，收集全部流穿液(含丙种球蛋白)。用10％的还原性SDS-PAGE检测产品(图4)，发现产品大小和含量与血浆中的抗体相同。用分子筛层析(Superose 12,1×30cm)测定(图5)，得到抗体的纯度为99％以上。抗体的总回收率为(90％)

实施例5

(1)换缓冲液处理

将30g低温乙醇工艺生产的中间产品(组份Ⅱ+Ⅲ)，于4℃溶解于500ml磷酸缓冲液(20mM,pH7.0)，过滤除去沉淀。上样到已经用磷酸缓冲液(20mM,pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱(25×40cm)上，继续用磷酸缓冲液(20mM,pH6.0)洗脱。收集280nm的吸收峰，得到1000ml样品。

(2)亲和层析

亲和层析介质AT23(1000ml)，装入层析柱(10×50cm)中。用4000ml磷酸缓冲液(5mM,pH6.0)平衡后，把950ml经过Sephadex G-25柱的样品加到柱上。用3000ml磷酸缓冲液(5mM,pH6.0)洗脱，去除未吸附的物质后，再用1500ml醋酸溶液(15mM,pH4.6)洗脱被吸附的白蛋白，收集洗脱组份。用12％的SDS-PAGE检测产品，发现产品大小和含量与血浆中的白蛋白相同，产品的主要成份为白蛋白。用分子筛层析(Superose 12,1×30cm)测定，白蛋白的纯度为98％以上。白蛋白的回收率为(80％)。

在亲和层析过程中，如实施例4一样收集含丙种球蛋白和其他杂质的流穿液。

(3)分离纯化丙种球蛋白

收集亲和柱AT23的流穿液共1400ml，全部上到已经用磷酸缓冲液(5mM,pH6.0)平衡的DEAE-Sepharose FF柱(5×30cm)上，收集流穿液。用10％的还原性SDS-PAGE检测产品，发现产品大小和含量与血浆中的抗体相同。用分子筛层析(Superose 12,1×30cm)测定得抗体的纯度为98.5％以上。抗体的总回收率为(85％)

实施例6

(1)换缓冲液处理

500ml的冰冻狗血浆，于4℃融化，过滤除去沉淀。上样到已经用磷酸缓冲液(20mM,pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱(25×40cm)上，继续用磷酸缓冲液(20mM,pH6.0)洗脱。收集280nm的吸收峰，得到900ml样品。

(2)亲和层析

亲和层析介质AT23(1000ml)，装入层析柱(10×50cm)中。用4000ml磷酸缓冲液(5mM,pH6.0)平衡后，把900ml经过Sephadex G-25柱的狗血浆加到柱上。用3000ml磷酸缓冲液(5mM,pH6.0)洗脱，去除未吸附的物质后，再用1500ml醋酸溶液(0.1M AcH,pH4.6)洗脱被吸附的白蛋白，收集洗脱组份。用10％的SDS-PAGE检测产品，发现产品大小和含量与血浆中的白蛋白相同，产品的主要成份为白蛋白。用分子筛层析(Superose 12,1×30cm)测定可以看出产品的流出峰是比较完美的正态分布。对峰面积积分可以算出，白蛋白的纯度为97％以上。白蛋白的总回收率为(87％)。

在亲和层析过程中，如实施例4一样收集含丙种球蛋白和其他杂质的流穿液。

(3)分离纯化丙种球蛋白

收集亲和柱AT23的流穿液共1300ml，全部上到已经用磷酸缓冲液(5mM,pH6.0)平衡的DEAE-Sepharose FF柱(5×30cm)上，收集流穿液。用10％的还原性SDS-PAGE检测产品，发现产品大小和含量与血浆中的抗体相同。用分子筛层析(Superose 12,1×30cm)测定算抗体的纯度为96％以上。抗体的总回收率为(90％)

实施例7

将亲和层析介质AT24(1000ml)，装入层析柱(10×50cm)中。用4000mlTris·HCl(5-100mM,pH5-9.0)平衡后，把人血浆(500ml，已经将缓冲液换为Tris·HCl(5-100mM,pH5-9.0)加到柱上。用3000ml Tris·HCl(5-100mM,pH5-9.0)洗去未吸附的物质后，再用1500ml醋酸溶液(15-200mM,pH2.4-5.0)洗脱被吸附的白蛋白，收集洗脱组份。用12％的SDS-PAGE检测产品发现产品大小和含量与血浆中的白蛋白相同，产品的主要成份为白蛋白。用分子筛层析(Superose 12,1×30cm)测定表明，产品的流出峰是比较完美的正态分布。对峰面积积分可以算出，白蛋白的纯度为99％以上(表1)。白蛋白的总回收率为(88％)。

表1

吸收峰	保留体积(ml)	峰面积(mAU*ml)	峰面积/总峰面积(％)
1	7.89	5.15	1.81
2	10.78	278.74	98.19
测出的峰数		2
				总峰面积(mAU*ml)		285.40
空柱体积(ml)		7.77

对于含丙种球蛋白和其他杂质的流穿液，按实施例6所述的方法处理。

实施例8

在该实施例中，将实施例4中的获得白蛋白洗脱液调节pH至pH4.8、离子强度0.05。再上到Q-Sepharose柱(5×20cm)，收集流穿液，白蛋白的回收率＞81％，纯度为99.99％。

实施例9

对亲和层析中结合条件和洗脱条件的优化

在该实施例中，分别对亲和层析中结合条件和洗脱条件(盐浓度和pH值)进行优化。选用实施例1制备AT23亲和层析介质，在中性条件下进行结合条件的盐浓度优化→在缓冲液电导率不变情况下进行结合酸碱度条件优化→在缓冲液电导率不变情况下进行洗脱酸碱度条件优化→在缓冲液电导率不变情况下进行洗脱盐浓度条件优化。

结果如图7-9所示，在白蛋白的结合的盐浓度为0.005-0.03M，更佳地0.01-0.02M(图6)，pH条件为pH5.0-9.0更佳地pH5.5-7.0(图7)。

洗脱条件是洗脱缓冲液的盐浓度为0.005-2.0M，较佳地，盐浓度为0.01-0.50M(图8)。pH条件为pH2.0-5.0或pH9.5-11.0(图9)，较佳地，pH3.5-4.8。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1．一种亲和层析介质，其特征在于，它包括：固相载体以及偶联在固相载体上的3-氨甲基吡啶亲和配位体。

2．如权利要求1所述的亲和层析介质，其特征在于，所述的固相载体选自：葡聚糖凝胶、交联的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N,N’-亚甲基双(丙烯酰胺)的交联共聚物、琼脂糖凝胶、琼脂糖和葡聚糖的交联共聚物、高度交联的琼脂糖和葡聚糖、N-三[羟甲基]甲基丙烯酰胺和羟基化交联接头的共聚物珠、琼脂糖珠、聚丙烯酰胺/琼脂糖复合物珠、纤维素珠、和涂有聚合物的硅胶。

3．如权利要求1所述的亲和层析介质，其特征在于，所述的固相载体选自：Sephadex、PDX、Sephacryl、Sepharose、Sepharose CL、Sepharose FF、Superdex、Superose、Trisacryl、Trisacryl plus、Ultrogel A、UltrogelAcA、高孔隙度的再生纤维素珠。

4．一种分离纯化白蛋白和丙种球蛋白的方法，其特征在于，它包括：

用亲和层析柱对含白蛋白和丙种球蛋白的原料进行亲和层析，从而使白蛋白固定于亲和层析介质，而丙种球蛋白则随流穿液流过亲和层析柱；

对固定于亲和层析介质上的白蛋白进行洗脱，从而获得纯化的白蛋白；以及

对含丙种球蛋白的该流穿液进行离子交换层析或疏水层析，从而获得纯化的丙种球蛋白。

5．如权利要求4所述的方法，其特征在于，亲和层析中所用的亲和层析介质包括固相载体以及偶联在固相载体上的3-氨甲基吡啶亲和配位体。

6．如权利要求4所述的方法，其特征在于，还包括步骤：在进行亲和层析之前，对含白蛋白和丙种球蛋白的原料进行换缓冲液处理，从而使缓冲液的盐浓度为0.005-0.03M且pH为5.0-9.0。

7．如权利要求4所述的方法，其特征在于，对含丙种球蛋白的该流穿液进行离子交换层析，使用含DEAE-或S-基团的离子交换树脂，从而吸附除丙种球蛋白之外的杂质。

8．如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的离子交换树脂选自下组：DEAE-Sepharose、DEAE-Sepharose FF、S-Sepharose和S-Sepharose FF。

9．如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的含白蛋白和丙种球蛋白的原料选自下组：人血浆、动物血浆、低温乙醇生产工艺的含白蛋白和丙种球蛋白的中间产物。

10．如权利要求4所述的方法，其特征在于，亲和层析中所用的亲和层析介质包括固相载体以及偶联在固相载体上的3-氨甲基吡啶亲和配位体；

而且在进行亲和层析之前，对含白蛋白和丙种球蛋白的原料进行换缓冲液处理，从而使缓冲液的盐浓度为0.005-0.03M且pH为5.0-9.0；

而且对结合的白蛋白进行洗脱时，所用的条件是：0.005-2.0M的盐，pH2.0-5.0或9.5-11.0的缓冲液。

Images