CN102443055B

CN102443055B - 一种重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的纯化工艺

Info

Publication number: CN102443055B
Application number: CN201110328798.9A
Authority: CN
Inventors: 王二文; 朱永芳; 王海彬; 白骅
Original assignee: Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2011-10-26
Filing date: 2011-10-26
Publication date: 2017-07-28
Anticipated expiration: 2031-10-26
Also published as: CN102443055A

Abstract

本发明公开了重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的新型纯化工艺。本发明采用锌离子螯合层析、两步疏水层析就能得到纯度高、生物活性良好的重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体。本发明利用重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体需要锌离子维持其三级结构和生物活性的特点，采用锌离子螯合层析，避免了使用其它金属离子导致的残留；采用疏水层析而非离子交换，避免了重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体在低盐条件下溶解度较小而需要高比例稀释的问题，同时省略了超滤脱盐的步骤。

Description

一种重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的纯化工艺

技术领域

本发明涉及一种蛋白的纯化方法。具体而言，本发明公开了一种新型的重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的纯化工艺。

背景技术

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor Necrosis Factor Related Apoptosisinducing ligand，TRAIL)属II型跨膜蛋白。其全序列分为分胞外段、跨膜区及胞内段。胞外段为40-281氨基酸，在体内能被切割形成包含114-281氨基酸的可溶活性肽段，被称为可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体。全长的与膜结合的TRAIL和可溶的TRAIL具有相同的促凋亡活性。但由于全长的TRAIL蛋白是一个跨膜蛋白，表达存在困难，目前，多个研发小组开发了多种形式的TRAIL，只含胞外区114-281氨基酸的TRAIL分子能自发的形成三聚体。TRAIL蛋白形成三聚体才有生物学活性，但只有在有锌离子的情况下TRAIL蛋白才能维持的稳定的三聚体结构。所以锌离子是TRAIL蛋白维持结构和活性稳定的必须成分。

TRAIL作用的主要途径是通过TRAIL活性三聚体诱发细胞膜的表面死亡受体DR4和DR5三聚化，并与死亡受体胞外富含Cys区域相结合，激活DR4、DR5分子中的死亡结构域，使其死亡结构域相互聚集，并进一步通过同嗜作用招募FADD(Fas-associated death domainprotein)。FADD是通过两个DD之间的相互作用来结合受体，并同时通过DED之间的相互作用来结合凋亡信号的起始因子胱冬酶原(pro-caspase-8)。被激活的caspase-8启动了非线粒体依赖途径和线粒体依赖的两种细胞凋亡途径。非线粒体凋亡途径通过激活的csapase8直接激活下游的效应胱天蛋白酶分子caspase3、caspase7而启动级联反应，不断地传递和放大凋亡信号，从而引发对TRAIL敏感的细胞发生大量、快速的凋亡；线粒体依赖途径通过激活的caspase8作用于Bid(Bcl-2inhibitory BH3-domain-containing protein)形成有活性的tBid(truncated BID)，促使包括cytochrome C在内的线粒体蛋白的释放。被释放的cytochrome C再与apaf-1，pro-caspase9和dATP形成一种被称之为apoptosome的复合体。这种复合体二聚化以后再激活caspase9，进而通过caspase3、caspase7诱导肿瘤细胞的凋亡。

目前，国内外公司对TRAIL的相关临床研究处在临床II期。研究结果表明TRAIL对非小细胞肺癌、胃癌、肝癌、黑色素瘤以及非霍奇金淋巴瘤均有一定的疗效并具有良好的安全性。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白已经实现原核系统大肠杆菌、真核系统酵母和哺乳动物细胞表达。真核系统表达的样品二聚体含量远远高于原核表达，所以一般用原核系统表达。现有文献和专利中TRAIL蛋白的纯化大多采用镍金属螯合层析、离子交换层析以及结晶的方法来纯化，但镍金属螯合层析会有镍离子的残留问题；TRAIL蛋白在低盐溶液中溶解度低，且不稳定，使用离子交换层析降低样品盐浓度的同时需要稀释以降低TRAIL蛋白的浓度，这样会导致样品体积大、上样时间延长和样品不稳定等问题；结晶的方法是利用了TRAIL蛋白溶解度会随温度降低而减小的特点，但结晶耗时太长，也不适合工业化生产。

为了得到生物学活性良好的重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体，并且使之各项指标符合作为生物药物开发的要求，本发明尝试一套重组人TRAIL的纯化工艺，避免使用镍离子螯合、离子交换和低温结晶等费时费力的方法。新工艺主要包括锌离子螯合层析和两步疏水层析。整个工艺安排合理，不需要超滤操作。工艺可以有效去除宿主残留蛋白、宿主残留DNA以及内毒素，生产的样品能满足新版药典对生物制品的要求。

本发明中提到的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体TRAIL是利用大肠杆菌表达的重组蛋白产品，与全长的人TRAIL蛋白比较缺少N端113个氨基酸，只保留有天然蛋白C端的114-281位氨基酸，分子量19.6KD。

发明内容

本发明公开了重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的纯化新工艺。

本发明所述的重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的新型纯化工艺，包括锌离子螯合层析与两步疏水层析。该纯化方法包括以下步骤：

1)锌离子螯合层析：发酵菌体均质后离心处理，将所得上清液上样于锌离子螯合层析柱，用洗脱液洗脱层析柱，收集含目的蛋白洗脱组份。

螯合层析采用的金属离子螯合层析的介质包括：GE公司的chelating sepharoseFF，IMAC sepharose 6FF，IMAC sepharose high performance，以及西安吉诺泰生物科技有限公司金属螯合琼脂糖凝胶等介质。

2)第一步疏水层析：将上步所得样品加入0.3～0.6M硫酸铵后上样于层析柱，收集含目的蛋白的流穿组份。

3)第二步疏水层析：向收集所得流穿组分中增加硫酸铵浓度至1.0～1.8M后，上样于层析柱，用洗脱液洗脱层析柱，收集含目的蛋白的洗脱组份。

本发明所述的疏水层析选用填料为带有苯基官能团的介质。此种类型的介质包括：GE公司的phenyl sepharosephenyl sepharose big beads，phenyl sepharose 6FF(high sub)，phenyl sepharose 6FF(low sub)，phenyl sepharose hight performance，capto phenyl(HS)以及东曹的TOYOPEARL Phenyl-650S，TOYOPEARL Phenyl-650M，TOYOPEARL Phenyl-650C，TOYOPEARL Phenyl-600M等系列填料。

本发明所述的重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的纯化新工艺，详细步骤为：

1)锌离子螯合层析：发酵菌体经高压均质离心后的上清液上样于锌离子螯合层析柱，平衡液平衡后用洗脱液洗脱，收集含目的蛋白洗脱组份。

2)第一步疏水层析：将上步获得的样品中加入0.3-0.6M的硫酸铵后上样于层析柱，收集含目的蛋白的流穿组份。有文献报道在高盐情况下让目的蛋白结合在疏水填料上用于纯化TRAIL蛋白的方法，但在样品纯度较低的情况下加入高浓度(如大于1.0M的硫酸铵)的盐会导致样品中的某些杂质沉淀，部分目的蛋白也会被共沉淀，导致层析柱堵塞和目的蛋白损失。但在样品中加入低浓度(如小于0.6M的硫酸铵)的盐样品会保持澄清，通过疏水层析柱时大部分杂质和色素被吸附在柱上，而目的蛋白会流穿下来，纯度可达98％。

3)第二步疏水层析(吸附)：平衡层析柱，向上步获得的样品中继续增加硫酸铵浓度，增加硫酸铵浓度至1.0～1.8M，将所得产物上样于层析柱，再用平衡液平衡至紫外吸收值稳定后用洗脱液洗脱层析柱，收集含目的蛋白的洗脱组份。样品经过上步纯化后纯度已经可达98％，而经过此步纯化后纯度可进一步提高到99％以上。

4)样品脱盐：使用分子筛G-25层析或者超滤的方式把样品中的盐成份置换为0.1-0.4M硫酸钠，0.02M Tris，0.3mM硫酸锌即可。

由于文献报道的镍离子螯合层析方法，最终产品会残留镍离子，因此存在一定的安全隐患，而本发明所采用的锌离子螯合层析就能避免该风险；同时锌离子螯合层析获得的样品纯度明显高于镍离子螯合层析。

本发明所述的重组人TRAIL的纯化新工艺，简便易行，省略了超滤置换的步骤。经验证该方法可以方便地应用于TRAIL的规模化生产。

本发明所述的重组人TRAIL的纯化新工艺，经过对重组人TRAIL纯度验证与活性验证，并显示了良好的实际效果。本发明制备重组人TRAIL蛋白经检测各项指标均满足新版药典对生物制品的要求，用于动物实验也表现良好的有效性和安全性。

附图说明

图1重组人TRAIL锌螯合层析图，其中图A为chelating sepharose FF填料，图B为IMAC sepharose FF填料。其中纵坐标mAU表示A₂₈₀紫外吸收值，横坐标为体积。

图2金属螯合层析chelating sepharose FF填料挂镍和挂锌(实例2与实例3)两种情况下的电泳结果。1为蛋白marker；2为上样前样品；3为挂镍情况下的流穿；4为挂镍情况下的洗脱；5为挂锌情况下的流穿；6为挂锌情况下的洗脱。

图3phenyl sepharose 6FF填料吸附层析，不同硫酸铵浓度下上样的层析图谱。

其中图A为硫酸铵浓度为1.0M时的层析图谱；图B为硫酸铵浓度为1.3M时的层析图谱；图C为硫酸铵浓度为1.8M时的层析图谱(实例2)。其中纵坐标mAU表示A₂₈₀紫外吸收值，横坐标为体积。

图4chelating sepharose FF镍螯合层析-phenyl sepharose 6FF(low sub)疏水层析(流穿)-phenyl sepharose 6FF(low sub)疏水层析(吸附)(实例2)后的rhTRAILDESEC-HPLC图谱。其中，纵坐标mAU表示A₂₈₀紫外吸收值，横坐标为时间，目的蛋白于13.1min出峰。

图5chelating sepharose FF锌螯合层析-phenyl sepharose 6FF(high sub)疏水层析(流穿)(实例3)后的rhTRAILDE SEC-HPLC图谱。其中，纵坐标mAU表示A₂₈₀紫外吸收值，横坐标为时间，目的蛋白于13.1min出峰。图6IMAC sepharose 6F.F.锌螯合层析-phenyl sepharose 6FF疏水层析(流穿)(实例4)后的rhTRAILDE SEC-HPLC图谱。其中，纵坐标mAU表示A₂₈₀紫外吸收值，横坐标为时间，目的蛋白于13.1min出峰。

图7IMAC sepharose 6F.F.锌螯合层析-phenyl sepharose 6FF疏水层析(流穿)-phenyl sepharose 6FF(high sub)疏水层析(吸附)(实例5)后的rhTRAILDE SEC-HPLC图谱。其中，纵坐标mAU表示A₂₈₀紫外吸收值，横坐标为时间，目的蛋白于13.1min出峰。

图8经实例2-5方法纯化后的rhTRAIL蛋白液相纯度比较。1为实例2纯化的rhTRAIL液相纯度；2为实例3纯化的rhTRAIL液相纯度；3为实例4纯化的rhTRAIL液相纯度；4为实例5纯化的rhTRAIL液相纯度。

图9经实例2-5方法纯化后的rhTRAIL蛋白SDS-PAGE电泳图谱。1为蛋白分子量marker；2为实例2纯化的rhTRAIL；3为实例3纯化的rhTRAIL；4为实例4纯化的rhTRAIL；5为实例5纯化的rhTRAIL。

图10实例5各步纯化样品电泳图谱，其中：1为蛋白质Marker；2为IMACsepharoseFF锌螯合层析上样样品；3为IMAC sepharose FF锌螯合层析上样流穿；4为IMAC sepharoseFF锌螯合层析洗脱样品；5为phenyl sepharose6FF(high sub)疏水层析(流穿)流穿样品；6为phenyl sepharose 6FF(high sub)疏水层析(吸附)洗脱样品。

图11供试品与参考品活性比较，把供试品和参考品稀释到相同浓度用于体外活性测定，供试品活性与参考品相当。

具体实施方式

实施例1重组人TRAIL在大肠杆菌中的表达

1)菌株的构建

在pBR322载体EcoR I和HindIII的酶切位点之间插入依次排列的色氨酸启动子，多酶切位点和T0终止子的序列，构建成功表达载体pHS。

设计引物(Sequence NO：1与Sequence NO：2)，从人胰腺cDNA样品中扩增出TRAIL基因编码114-281位氨基酸的DNA序列(Sequence NO：3)，其对应的氨基酸序列为SequenceNO：4，再把这段序列插入到载体pHS上的XbaI/XhoI酶切位点之间，构建得到重组质粒pHS-TRAIL。重组质粒pHS-TRAIL转化宿主菌，然后经摇瓶筛选得到高效表达的菌株pHS-TRAIL/W3110-2。

2)重组人TRAIL菌株的培养

采取批培养的方式。发酵过程分为两个阶段：第一个阶段是扩陪阶段，此阶段菌体利用基础培养基快速生长，此过程大约5小时，菌体OD₆₀₀可以达到10左右；第二阶段是诱导表达阶段，此阶段开始补加色氨酸含量低的氮源和糖，菌体在低色氨酸情况下开始表达目的蛋白，同时菌体密度继续升高，此阶段持续11-13小时，菌体OD₆₀₀可达50左右，表达量可达3克/升以上。

实施例2重组人TRAIL蛋白的纯化方案A

本实例中优选以GE公司的chelating sepharose FF填料挂上镍离子，用于样品的第一步纯化。chelating sepharose FF填料的优点是反压小，流速高。样品经过锌离子螯合层析后再经过两步疏水层析，第一步疏水层析目的蛋白流穿，大部分杂质和色素吸附在柱上，样品纯度可达90％，第二步疏水层析目的蛋白吸附于柱上，经洗脱后样品纯度大于98％。

材料与仪器

chelating sepharose FF填料(GE healthcare公司产品)，phenyl sepharose6FF(low sub)(GE healthcare公司产品)，AKTA Purifier层析系统(GEhealthcare公司产品)。

实验方法

1)chelating sepharose FF填料层析

清洁chelating sepharose FF层析系统，并作去热原处理，依次进行以下操作：用0.2mol/L硫酸镍水溶液流过柱床；用水冲洗柱床；用(0.1mol/L磷酸二氢钠+0.35mol/L氯化钠+0.01mol/L咪唑)缓冲液(pH7.2)平衡层析柱；样品为菌体破碎离心后上清，上样后用(0.1mol/L磷酸二氢钠+0.35mol/L氯化钠+0.01mol/L咪唑)缓冲液(pH7.2)平衡层析柱，直到紫外吸收值稳定；用(0.1mol/L磷酸二氢钠+0.35mol/L氯化钠+0.05mol/L咪唑)缓冲液(pH7.2)洗脱层析柱，收集洗脱峰。

2)phenyl sepharose 6FF(low sub)填料层析流穿

清洁phenyl sepharose 6FF(low sub)层析系统，并作去热原处理，依次进行以下操作：用(0.1mol/L磷酸二氢钠+0.35mol/L氯化钠+0.6mol/L硫酸铵)缓冲液(pH7.2)平衡层析柱；上步样品中加入0.6M硫酸铵后上样，待流穿液紫外吸收值升高开始被收集；上完样后用(0.1mol/L磷酸二氢钠+0.35mol/L氯化钠+0.3～0.6mol/L硫酸铵)缓冲液(pH7.2)冲洗柱子，直到紫外吸收降下来停止收集。

3)phenyl sepharose 6FF(low sub)填料吸附

试验中对硫酸铵浓度进行调整，分为I，II，III三套方案。清洁phenylsepharose6FF(low sub)层析系统，并作去热原处理，分别进行以下操作：用(0.1mol/L磷酸二氢钠+0.35mol/L氯化钠+I：1.0mol/L，II：1.3mol/L或III：1.8mol/L硫酸铵)缓冲液(pH7.2)平衡层析柱；上步样品中加入I：0.4mol/L，II：0.7mol/L或III：1.2mol/L硫酸铵后上样；上完样后用(0.1mol/L磷酸二氢钠+0.35mol/L氯化钠+I：1.0mol/L，II：1.3mol/L或III：1.8mol/L硫酸铵)缓冲液(pH7.2)冲洗柱子，直到紫外吸收稳定；用缓冲液(0.1mol/L磷酸二氢钠+0.35mol/L氯化钠+0.6mol/L硫酸铵)缓冲液(pH7.2)洗脱，收集洗脱峰(图3)。

实施例3重组人TRAIL纯化的纯化方案B

本实施例中金属螯合层析用锌离子螯合填料，同时疏水填料用phenyl sepharose6FF(high sub)，疏水只做一步(流穿)，此方案总共两步层析。材料与仪器

chelating sepharose FF填料(GE healthcare公司产品)，phenyl sepharose6FF(high sub)(GE healthcare公司产品)，AKTA Purifier层析系统(GEhealthcare公司产品)。

实验方法

1)chelating sepharose FF填料层析

清洁chelating sepharose FF层析系统，并作去热原处理，依次进行以下操作：用0.2mol/L硫酸锌水溶液流过柱床；用水冲洗柱床；用(0.1mol/L磷酸二氢钠+0.35mol/L氯化钠+0.03mol/L咪唑)缓冲液(pH7.2)平衡层析柱；样品为菌体破碎后离心上清，上样后用(0.1mol/L磷酸二氢钠+0.35mol/L氯化钠+0.03mol/L咪唑)缓冲液(pH7.2)平衡层析柱，直到紫外吸收值稳定；用(0.1mol/L磷酸二氢钠+0.35mol/L氯化钠+0.15mol/L咪唑)缓冲液(pH7.2)洗脱层析柱，收集洗脱峰。

2)phenyl sepharose 6FF(high sub)填料流穿

清洁phenyl sepharose 6FF(high sub)层析系统，并作去热原处理，依次进行以下操作：用(0.1mol/L磷酸二氢钠+0.35mol/L氯化钠+0.4mol/L硫酸铵)缓冲液(pH7.2)平衡层析柱；上步样品中加入0.4M硫酸铵后上样，待流穿液紫外吸收值升高开始被收集；上完样后用(0.1mol/L磷酸二氢钠+0.35mol/L氯化钠+0.4mol/L硫酸铵)缓冲液(pH7.2)冲洗柱子，直到紫外吸收降下来停止收集。

实施例4重组人TRAIL纯化的纯化方案C

本实施例优选IMAC sepharose FF填料(挂锌)代替chelating sepharoseFF填料，疏水填料与方案B一致，且疏水只做一步(流穿)

材料与仪器

IMAC sepharose F.F.填料(GE healthcare公司产品)，phenyl sepharose6FF(high sub)(GE healthcare公司产品)，AKTA Purifier层析系统(GEhealthcare公司产品)。

实验方法

1)IMAC sepharose FF填料层析

清洁IMAC sepharose FF层析系统，并作去热原处理，依次进行以下操作：用0.2mol/L硫酸锌水溶液流过柱床；用水冲洗柱床；用(0.1mol/L磷酸二氢钠+0.35mol/L氯化钠+0.03mol/L咪唑)缓冲液(pH7.2)平衡层析柱；样品为菌体破碎后离心上清，上样后用(0.1mol/L磷酸二氢钠+0.35mol/L氯化钠+0.03mol/L咪唑)缓冲液(pH7.2)平衡层析柱，直到紫外吸收值稳定；用(0.1mol/L磷酸二氢钠+0.35mol/L氯化钠+0.20mol/L咪唑)缓冲液(pH7.2)洗脱层析柱，收集洗脱峰。

2)phenyl sepharose 6FF(high sub)填料流穿

实施例5重组人TRAIL纯化的纯化方案D

本实施例选择IMAC sepharose FF填料(挂锌离子)作为第一步层析填料，随后用phenyl sepharose 6FF(high sub)填料进行两步疏水层析，一步为目的蛋白流穿，一步为目的蛋白吸附。

材料与仪器

IMAC sepharose FF填料(GE healthcare公司产品)，phenyl sepharose 6FF(high sub)(GE healthcare公司产品)，AKTA Purifier层析系统(GEhealthcare公司产品)。

实验方法

1)IMAC sepharose FF填料(挂锌)层析

清洁IMAC sepharose FF层析系统，并作去热原处理，依次进行以下操作：用0.2mol/L硫酸锌水溶液流过柱床；用水冲洗柱床；用(0.1mol/L磷酸二氢钠+0.35mol/L氯化钠+0.03mol/L咪唑)缓冲液(pH7.2)平衡层析柱；样品为菌体破碎后离心上清，上样后用(0.1mol/L磷酸二氢钠+0.35mol/L氯化钠+0.03mol/L咪唑)缓冲液(pH7.2)平衡层析柱，直到紫外吸收值稳定；用(0.1mol/L磷酸二氢钠+0.35mol/L氯化钠+0.15mol/L咪唑)缓冲液(pH7.2)洗脱层析柱，收集洗脱峰。

2)phenyl sepharose 6FF(high sub)填料流穿(同实例4)

3)phenyl sepharose 6FF(high sub)填料吸附

清洁phenyl sepharose 6FF(high sub)层析系统，并作去热原处理，依次进行以下操作：用(0.1mol/L磷酸二氢钠+0.35mol/L氯化钠+1.3mol/L硫酸铵)缓冲液(pH7.2)平衡层析柱；上步样品中加入0.9M硫酸铵后上样；上完样后用(0.1mol/L磷酸二氢钠+0.35mol/L氯化钠+1.3mol/L硫酸铵)缓冲液(pH7.2)冲洗柱子，直到紫外吸收稳定；用缓冲液(0.1mol/L磷酸二氢钠+0.35mol/L氯化钠+0.6mol/L硫酸铵)缓冲液(pH7.2)洗脱，收集洗脱峰。

实施例6重组人TRAIL蛋白的检测

1)SDS-PAGE检测

将分离纯化的蛋白样品进行SDS-PAGE分析，通过实施例2-5目标蛋白以及蛋白质Marker的检测结果如图6所示，目标蛋白与理论分子量一致约19.6kD。

2)SEC-HPLC法

使用材料为G2000柱子，4.6mm×25mm(TOSOH公司产品)；流动相为20mmol/L PBS，0.2mol/L NaCl，pH6.8；检测波长为280nm；流动相流速：0.5ml/min。通过实施例2-5所获得目标蛋白检测结果分别如图2-5所示，目标蛋白于13.1min出峰。

实验表明，采用锌离子螯合层析效果明显优于镍离子螯合层析，镍离子螯合一步层析纯度只能达到70％，锌可以达到85％以上(图2)，且不必要担心镍离子残留。填料IMACsepharose F.F.要优于chelating sepharose FF(图7)使用IMAC sepharose F.F.的实施例5纯度要高于使用chelating sepharose FF实施例4，此步收率可以达到80％左右。疏水层析填料选择phenyl sepharose 6FF(low sub)或者phenyl sepharose 6FF(high sub)纯化效果差别不大，但从载量上考虑high sub型要优于low sub，此步层析收率90％左右，目的蛋白纯度可达95％以上。是否需要第三步疏水层析(吸附)要视具体要求而定，第三步层析可使目的蛋白纯度由98％提高到99.5％(液相纯度，图7)，收率80％左右。

经高密度发酵培养后，目的蛋白粗提收率为40％左右，层析纯化收率可达50％以上，总收率为20％左右。纯化工艺完全能满足大规模工业化生产的要求。

本纯化工艺采用的金属螯合层析和疏水层析。已有的文献纯化TRAIL蛋白也用金属螯合层析，但是用镍离子，我们用锌离子螯合层析相对于镍离子，样品纯度有明显的提高(由70％提高到85％)，且避免了镍离子残留的问题；也有人将疏水层析应用于TRAIL蛋白纯化，但都是采取高盐吸附的方式，而在样品还纯度不高的情况下加入很高浓度的盐会使得样品里面的某些杂质沉淀，进而导致部分目的蛋白被共沉淀，导致柱子堵塞和目的蛋白损失。我们采取样品流穿的方式，在样品中加入较低浓度的盐，此时样品澄清，通过疏水层析柱时大部分杂质和色素被吸附在柱上，而目的蛋白会流穿下来，纯度可达95-98％的高纯度，且色素能被除尽。接下来可以再用一步疏水吸附层析进一步提高蛋白纯度。使用一步或者两步疏水层析代替离子交换层析可以避免rhTRAIL蛋白在低盐下不稳定的问题，同时可以省去超滤步骤，很大程度上节约生产时间和成本。与低温结晶工艺比较本工艺可以节约大量的时间，且过程更为可控。

综上所述，重组人TRAIL的本纯化工艺过程便捷，填料成本低，目的蛋白活性高，适合应用工业生产规模。

Claims

1.一种重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的新型纯化工艺，其特征在于，所述的纯化工艺依次包括：

①锌离子螯合层析

②第一步疏水层析

③第二步疏水层析，

所述步骤②第一步疏水层析包括将上步所得样品加入0.3～0.6M硫酸铵后上样于疏水层析柱，收集含目的蛋白的流穿组分。

2.根据权利要求1所述的锌离子螯合层析与两步疏水层析，其特征在于，所述层析采用的介质为sepharose。

3.根据权利要求1所述的重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的新型纯化工艺，其特征在于包括以下步骤：

1)锌离子螯合层析：发酵菌体均质后离心处理，将离心所得上清液上样于锌离子螯合层析柱，用洗脱液洗脱层析柱，收集含目的蛋白洗脱组分。

2)第一步疏水层析：将上步所得样品加入0.3～0.6M硫酸铵后上样于疏水层析柱，收集含目的蛋白的流穿组分。

3)第二步疏水层析：向上步收集所得的流穿组分样品中增加硫酸铵浓度至1.0～1.8M后，上样于层析柱，用洗脱液洗脱层析柱，收集含目的蛋白的洗脱组分。

4.根据权利要求1或3所述的纯化方法，其特征在于，所述疏水层析选用带有苯基官能团的填料。