ES2322945T3 - Metodos para la purificacion de proteina. - Google Patents
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Abstract
Un método para purificar una proteína de una muestra que incluye a la proteína y al menos una proteína contaminante que comprende someter la muestra a cromatografía sobre hidroxiapatita, por medio de la cual se separa la proteína de al menos una proteína contaminante, en donde la mayoría de las moléculas de la proteína se recuperan en el flujo y lavado, en donde la proteína ha sido previamente purificada por medio de cromatografía de afinidad utilizando una segunda proteína fijada a un soporte sólido como adsorbente, en donde las segunda proteína se enlaza específicamente a un dominio constante del anticuerpo inmunoglobulina, y en donde la proteína incluye un dominio constante del anticuerpo inmunoglobulina.
Description
Métodos para la purificación de proteína.
Esta solicitud reivindica el beneficio de tres
solicitudes provisionales, la solicitud estadounidense No.
60/343.363, presentada el 21 de diciembre de 2001, la solicitud
estadounidense No. 60/347.189, presentada el 8 de enero de 2002 y la
solicitud estadounidense No. 60/364.272, presentada el 12 de marzo
de 2002.
La invención se relaciona con la purificación de
proteína, en particular, con la purificación utilizando
cromatografía sobre hidroxiapatita.
Se emplean a menudo las Proteínas A y G para
purificar anticuerpos por medio de cromatografía de afinidad. Ver,
por ejemplo R. Vola y colaboradores (1994), Cell Biophys.
24-25: 27-36; Aybay e Imir (2000),
J. Immunol. Methods 233 (1-2):
77-81; Ford y colaboradores (2001), J. Chromatogr. B
754: 427-435; DE 42 05 938. Estas proteínas son
útiles debido a que se enlazan a una porción constante (F_{C}) de
muchos anticuerpos diferentes. Las proteínas recombinantes de fusión
que incluyen una porción F_{C} de un anticuerpo IgG se pueden
purificar utilizando métodos similares.
Cuando se produce una proteína para uso
farmacológico, es importante remover contaminantes tóxicos o
inmunogénicos, tal como otras proteínas. Específicamente, la
Proteína A es inmunogénica y, en grandes cantidades, potencialmente
tóxica. Alguna Proteína A puede filtrarse dentro de una muestra
durante cromatografía de afinidad cuando se utiliza como absorbente
la Proteína A fijada a un soporte sólido. Ver, por ejemplo,
Bensinger y colaboradores (1984), J. Biol. Response Modif. 3:
347-351; Ventura y colaboradores (1987), Cancer
Treat. Rep. 71 (4): 411-413.
Se han separado los anticuerpos monoclonales
biespecíficos de otros anticuerpos enlazándolos y eluyéndolos de
hidroxiapatita posteriormente a una purificación previa por medio de
cromatografía de afinidad utilizando Proteína A fijada a un soporte
sólido como adsorbente. Tarditi y colaboradores (1992), J.
Chromatography 599: 13-20; Ford y colaboradores
(2001), J. Chromatography B 754: 427-435. También
se han enlazado y eluido anticuerpos monoclonales de hidroxiapatita.
Ahmad (1999), Ceramic Hydroxyapatite as a Polishing Step for
Monoclonal Antibody Purification, Resumen de la Recovery of
Biological Products Meeting #9 en Whistler, British Columbia.
La presente invención proporciona un proceso
simplificado y de amplia aplicación para utilizar cromatografía
sobre hidroxiapatita para la purificación de anticuerpos y de otras
proteínas.
La cromatografía de afinidad es una poderosa
herramienta para purificación de proteínas tal como anticuerpos y
proteínas de fusión F_{C}. Sin embargo, si se fabrican las
proteínas para uso terapéutico, la presencia de otras proteínas,
incluida una proteína usada como parte de un absorbente de afinidad,
que puede filtrarse dentro de una muestra durante la cromatografía
de afinidad, es motivo de preocupación. Además, pueden estar
presentes otros contaminantes de proteína en una muestra, tales
como, por ejemplo, proteínas derivadas de células huésped que
producen la proteína que está siendo purificada. La invención
proporciona, entre otras cosas, una técnica de alto rendimiento para
resolver estos problemas a través de cromatografía sobre
hidroxiapatita en un modo de flujo que involucra un procesamiento
mínimo.
Por lo tanto, la invención proporciona, en un
aspecto, un método para separar una proteína de una segunda proteína
que comprende someter la proteína a cromatografía sobre
hidroxiapatita cuando (1) la proteína ha sido previamente purificada
por medio de cromatografía de afinidad utilizando la segunda
proteína fijada a un soporte sólido como absorbente, (2) la segunda
proteína puede enlazarse a un dominio constante del anticuerpo
inmunoglobulina, y (3) la proteína no se enlaza a hidroxiapatita
bajo las condiciones utilizadas. La proteína puede incluir una
porción F_{C} de un anticuerpo. Opcionalmente, la proteína puede
ser TNFR:F_{C}. La segunda proteína puede ser Proteína A o
Proteína G.
La invención proporciona además un método para
purificar una proteína de una muestra que incluye a la proteína y al
menos una proteína contaminante que comprende someter a la muestra a
cromatografía sobre hidroxiapatita, en donde la proteína es separada
de al menos una proteína contaminante por medio de cromatografía
sobre hidroxiapatita en una solución en la cual se lleva a cabo la
cromatografía sobre hidroxiapatita, en donde la mayor parte de las
moléculas de la proteína son recuperadas en el flujo y el lavado, en
donde la proteína ha sido previamente purificada por cromatografía
de afinidad utilizando una segunda proteína fijada a un soporte
sólido como un absorbente, y en donde la segunda proteína se enlaza
a un dominio constante del anticuerpo inmunoglobulina. La segunda
proteína puede o no estar presente en un nivel detectable en la
muestra, y la proteína se puede separar de la segunda proteína por
medio de cromatografía sobre hidroxiapatita en la solución
utilizada. La proteína y al menos una proteína contaminante pueden
haber sido secretadas en un medio de cultivo por células animales
cultivadas, tales como las células CHO. La proteína puede incluir
una porción F_{C} de un anticuerpo y puede, por ejemplo, ser TNFR:
F_{C} o un anticuerpo. La segunda proteína puede ser Proteína A y
Proteína G. La solución en la cual se realiza la cromatografía sobre
hidroxiapatita puede incluir un amortiguador de fosfato de sodio en
una concentración aproximadamente entre 5 milimolar y
aproximadamente 50 milimolar, opcionalmente aproximadamente entre 15
milimolar y aproximadamente 35 milimolar, y puede tener un pH entre
aproximadamente 6,0 y aproximadamente 8,6.
La invención proporciona además, en otro
aspecto, un método para separar una proteína recombinante de fusión
de una segunda proteína que comprende someter a la proteína
recombinante de fusión a cromatografía sobre hidroxiapatita cuando
(1) la proteína recombinante de fusión ha sido previamente
purificada por medio de cromatografía de afinidad utilizando la
segunda proteína fijada a un soporte sólido como un absorbente y (2)
la proteína recombinante de fusión incluye una porción F_{C} de un
anticuerpo y parte o todo de una proteína que no es un anticuerpo.
En una modalidad, la proteína recombinante de fusión puede ser TNFR:
F_{C}.
En aún otro aspecto, la invención abarca además
un método para separar una proteína recombinante de fusión de una
segunda proteína que comprende someter a la proteína recombinante de
fusión a cromatografía sobre hidroxiapatita cuando (1) la proteína
recombinante de fusión no se enlaza a la hidroxiapatita y la segunda
proteína se enlaza a hidroxiapatita bajo las condiciones utilizadas,
(2) la proteína recombinante de fusión ha sido previamente
purificada por medio de cromatografía de afinidad utilizando a la
segunda proteína fijada a un soporte sólido como un absorbente, y
(3) la proteína recombinante de fusión incluye a la región F_{C}
de un anticuerpo.
En otra modalidad, la invención proporciona un
método para purificar una proteína recombinante de fusión de una
muestra que contiene a la proteína recombinante de fusión y al menos
una proteína contaminante que comprende someter a la muestra a
cromatografía sobre hidroxiapatita, en donde la proteína
recombinante de fusión incluye una porción F_{C} de un anticuerpo
y parte o todo de una proteína que no es un anticuerpo, y en donde
la proteína recombinante de fusión ha sido previamente purificada
por medio de cromatografía de afinidad utilizando una segunda
proteína fijada a un soporte sólido como adsorbente. La mayoría de
las moléculas de la proteína recombinante de fusión se pueden
recuperar en el flujo y el lavado. La proteína recombinante de
fusión puede ser TNFR:F_{C} y la segunda proteína puede ser
Proteína A o Proteína G. La cromatografía sobre hidroxiapatita se
puede llevar a cabo en una solución que incluye un amortiguador de
fosfato de sodio, opcionalmente en una concentración entre 5
milimolar y aproximadamente 50 milimolar o aproximadamente entre 15
milimolar y aproximadamente 35 milimolar y opcionalmente a un pH
entre aproximadamente 6,0 y aproximadamente 8,6. La proteína
recombinante de fusión y/o al menos una proteína contaminante pueden
ser secretadas dentro de un medio de cultivo por células animales
cultivadas, opcionalmente células CHO. En aún otro aspecto de la
invención, se proporciona un método para separar TNFR:F_{C} de
Proteína A que comprende someter a TNFR:F_{C} a cromatografía
sobre hidroxiapatita después de la purificación de TNFR:F_{C} por
medio de cromatografía de afinidad utilizando Proteína A fijada a un
soporte sólido como adsorbente.
En una modalidad adicional, la invención
proporciona un método para purificar TNFR:F_{C} que comprende
someter una muestra que contiene TNFR:F_{C} y al menos una
proteína contaminante a cromatografía sobre hidroxiapatita bajo
condiciones en donde la mayor parte de las moléculas de TNFR:F_{C}
son recuperadas en el flujo y lavado.
Una modalidad adicional proporciona un método
para purificar TNFR:F_{C} que comprende someter TNFR:F_{C} a
cromatografía sobre hidroxiapatita bajo condiciones donde
TNFR:F_{C} no se enlaza a la hidroxiapatita, por lo cual
TNFR:F_{C} se separa de al menos una proteína contaminante.
La invención proporciona además, en aún otro
aspecto, un método para separar una proteína recombinante de fusión
de proteínas de la célula huésped, que comprende cargar una muestra
que contiene la proteína recombinante de fusión sobre
hidroxiapatita, sometiendo a la proteína recombinante de fusión a
cromatografía sobre hidroxiapatita bajo condiciones donde la
proteína recombinante de fusión no se enlaza a la hidroxiapatita, y
recuperando una muestra que contiene a la proteína recombinante de
fusión en el flujo y lavado combinados.
En aún otro aspecto, se proporciona un método
para separar una proteína de proteínas de la célula huésped que
comprende someter una muestra que contiene a la proteína y al menos
a una proteína de la célula huésped a cromatografía sobre
hidroxiapatita, por lo cual se separa la proteína de la menos una
proteína de la célula huésped, en donde la proteína incluye un
dominio constante del anticuerpo inmunoglobulina, en donde se
recuperan la mayoría de las moléculas de la proteína en el flujo y
lavado, y en donde tanto la proteína como la proteína de la célula
huésped han sido secretadas en un medio de cultivo por parte de
células animales cultivadas, tales como, por ejemplo células CHO. La
concentración de las proteínas de la célula huésped puede ser menor
aproximadamente a 100 partes por millón, y la proteína puede ser
TNFR:F_{C}.
También se describe la preparación purificada de
TNFR:F_{C} en donde la preparación incluye menos de 3 partes por
millón de Proteína A y menos de 100 partes por millón de proteínas
de la células animal huésped, opcionalmente menos de 2 partes por
millón de Proteína A y/o menos de 75 partes por millón de proteínas
de la célula huésped.
La Figura 1 muestra el perfil de elusión de la
corrida en una columna de hidroxiapatita en fosfato de sodio 25
milimolar, pH 6,8 sobre la cual se cargó una muestra que contiene
TNFR:F_{C} como especie principal, como se describe en el Ejemplo
2.
Adsorbente: Un adsorbente es al menos una
molécula fijada a un soporte sólido o al menos una molécula que es,
por sí misma, un sólido, que se utiliza para llevar a cabo la
cromatografía.
Cromatografía de afinidad: La
cromatografía de afinidad es cromatografía que utiliza las
interacciones específicas reversibles entre biomoléculas, por
ejemplo, la habilidad de la Proteína A para enlazarse a una porción
F_{C} de un anticuerpo IgG, en vez de las propiedades generales de
una molécula, tales como el punto isoeléctrico, la hidrofobicidad, o
el tamaño, para efectuar la separación cromatográfica. En la
práctica, la cromatografía de afinidad involucra el uso de un
adsorbente, tal como Proteína A fijada a un soporte sólido, para
separar cromatográficamente moléculas que se enlazan más o menos
firmemente al adsorbente. Ver, Ostrove (1990) en Guide to Protein
Purification, Methods in Enzymology 182:
357-379.
Anticuerpo: Un anticuerpo es una proteína
o complejo de proteínas, cada una de las cuales incluye al menos un
dominio variable del anticuerpo inmunoglobulina y al menos un
dominio constante del anticuerpo inmunoglobulina, los anticuerpos
pueden ser anticuerpos de cadena única, anticuerpos diméricos, o
algunos complejos de orden superior de proteínas que incluyen, pero
no se limitan a, anticuerpos heterodiméricos.
Cromatografía: Cromatografía es la
separación de moléculas químicamente diferentes en una mezcla por
medio de percolación de la mezcla a través de un adsorbente, que
adsorbe o retiene diferentes moléculas más o menos fuertemente. Las
moléculas que son menos fuertemente adsorbidas o retenidas por el
adsorbente son liberadas del adsorbente bajo condiciones donde
aquellas más fuertemente adsorbidas o retenidas no lo son.
Dominio constante del anticuerpo
inmunoglobulina: Un dominio constante del anticuerpo
inmunoglobulina es un dominio de inmunoglobulina que es idéntico o
sustancialmente similar a un dominio C_{L}, C_{H}1, C_{H}2,
C_{H}3 o C_{H}4 de origen humano o animal. Ver, por ejemplo,
Charles A Hasemann y J. Donald Capra, Immunoglobulins: Structure and
Function, en William E. Paul, ed., Fundamental Immunology, Second
Edition, 209, 210-218 (1989).
Contaminante: Un contaminante es
cualquier molécula foránea o indeseada, particularmente una
macromolécula biológica tal como un ADN, un ARN, o una proteína,
diferente a la proteína que está siendo purificada que está presente
en una muestra de una proteína que está siendo purificada. Los
contaminantes incluyen, por ejemplo, otras proteínas de las células
que secretan a la proteína que está siendo purificada y proteínas,
tales como la Proteína A, que son parte de un adsorbente utilizado
para cromatografía de afinidad que puede lixiviarse dentro de una
muestra durante la cromatografía de afinidad.
Porción F_{C} de un anticuerpo: La
porción F_{C} de un anticuerpo incluye a los dominios de
inmunoglobulina humana o animal C_{H}2 y C_{H}3 o a los dominios
de inmunoglobulina sustancialmente similares a aquellos. Para los
propósitos de la invención, la actividad biológica de una porción de
F_{C} de un anticuerpo para el propósito de determinar la
similitud sustancial es la habilidad para ser enlazada por una
segunda proteína que se enlaza a las porciones de F_{C} de
ocurrencia natural de anticuerpos, tales como la Proteína A o la
Proteína G. Para discusión, ver Hasemann y Capra, ver más arriba, en
las páginas 212-213.
Proteínas de la célula huésped: Las
proteínas de la célula huésped son proteínas codificadas por el
genoma de ocurrencia natural de una célula huésped dentro de la cual
se introduce el ADN que codifica a una proteína que va a ser
purificada. Las proteínas de la célula huésped pueden ser
contaminantes de la proteína que va a ser purificada, cuyos niveles
se pueden reducir por medio de purificación. Las proteínas de la
célula huésped se pueden analizar por medio de cualquier método
apropiado incluyendo electroforesis en gel y coloración y/o el
ensayo de ELISA, entre otros.
Cromatografía sobre hidroxiapatita: La
cromatografía sobre hidroxiapatita es cromatografía que utiliza
hidroxiapatita cerámica como adsorbente. Ver, por ejemplo, Marina J.
Gorbunoff (1990), Protein Chromatography on Hydroxyapatite Columns,
en Guide to Protein Purification, Murray P. Deutscher, ed., Methods
in Enzymology 182: 329-339.
Anticuerpo IgG: Para los propósitos de la
invención, un anticuerpo IgG es un anticuerpo que incluye al menos
un dominio constante de inmunoglobulina tipo \gamma. Para
discusión, ver Hasemann y Capra, ver más arriba, en la página
226.
Polipéptido: Para los propósitos de la
invención, se utiliza en forma intercambiable "polipéptido" con
"proteína".
Proteína A: La Proteína A es una proteína
originalmente descubierta en la pared celular de Estafilococo que se
enlaza específicamente a una porción de F_{C} de anticuerpo IgG.
Para los propósitos de la invención, "Proteína A" es cualquier
proteína idéntica o sustancialmente similar a la Proteína A de
Estafilococo, incluyendo las formas comercialmente disponibles y/o
recombinantes de la Proteína A. Para los propósitos de la invención,
la actividad biológica de la Proteína A con el objeto de determinar
la similitud sustancial es la capacidad de enlazarse a una porción
de F_{C} del anticuerpo IgG.
Proteína G: La Proteína G es una proteína
originalmente descubierta en la pared celular de Estreptococo que se
enlaza específicamente a una porción de F_{C} de un anticuerpo
IgG. Para los propósitos de la invención, "Proteína G" es
cualquier proteína idéntica o sustancialmente similar a la Proteína
G de Estreptococo, incluyendo las formas comercialmente disponibles
y/o recombinantes de la Proteína G. Para los propósitos de la
invención, la actividad biológica de la Proteína G con el objeto de
determinar la similitud sustancial es la capacidad de enlazarse a
una porción de F_{C} del anticuerpo IgG.
Proteína LG: La Proteína LG es una
proteína recombinante de fusión que se enlaza a los anticuerpos IgG
que incluyen porciones tanto de Proteína G (ver la definición
anterior) como de Proteína L. La Proteína L fue originalmente
aislada de la pared celular de Peptoestreptococos. La Proteína LG
fue originalmente aislada de la pared celular de Peptoestreptococos.
La Proteína LG incluye dominios de enlazamiento de IgG tanto de
Proteína L como G. Vola y colaboradores (1994) Cell. Biophys.
24-25: 27-36. Para los propósitos de
la invención, "Proteína LG" es cualquier proteína idéntica o
sustancialmente similar a la Proteína LG, incluyendo las formas
comercialmente disponibles y/o recombinantes de la Proteína LG. Para
los propósitos de la invención, la actividad biológica de la
Proteína LG con el objeto de determinar la similitud sustancial es
la capacidad para enlazarse a un anticuerpo IgG.
Purificación: Purificar una proteína
significa reducir las cantidades de elementos foráneos o indeseados,
especialmente macromoléculas biológicas tales como proteínas o ADN,
que pueden estar presentes en una muestra de la proteína. La
presencia de proteínas foráneas se puede analizar por medio de
cualquier método apropiado que incluye electroforesis en gel y
coloración y/o ensayo de ELISA. La presencia de ADN se puede
analizar por medio de cualquier método apropiado que incluye
electroforesis en gel y coloración y/o ensayos que emplean la
reacción en cadena de la polimerasa.
Proteína recombinante de fusión: Una
proteína recombinante de fusión es cualquier proteína que incluya
parte o todo de dos o más proteínas que no están fusionadas en su
estado natural. Los ejemplos de tales proteínas incluyen, pero no se
limitan al activador del receptor humano de NF-KapaB
fusionado a una porción de F_{C} de un anticuerpo
(TEKdelta:F_{C}), y el receptor del factor de necrosis tumoral
fusionado a una porción de F_{C} de un anticuerpo
(TNFR:F_{C}).
Separación: Una proteína es separada de
una segunda proteína en una mezcla que incluye a ambas proteínas en
una mezcla cuando la mezcla es sometida a un proceso de tal manera
que al menos la mayoría de las moléculas de la proteína sean
removidas de esa porción de la mezcla que incluye al menos la
mayoría de las moléculas de la segunda proteína.
Sustancialmente similar: Para los
propósitos de la invención, las proteínas son sustancialmente
similares si ellas son al menos 80%, preferiblemente al menos 90%
idénticas entre sí en la secuencia de aminoácidos y mantienen o
alteran en una forma deseable la actividad biológica de la proteína
inalterada. Incluidos entre los aminoácidos considerados idénticos
para el propósito de determinar si las proteínas son sustancialmente
similares están los aminoácidos que son sustituciones conservadoras,
que es muy poco probable que afecten la actividad biológica,
incluidos los siguientes: Ala por Ser Val por Ile, Asp por Glu, Thr
por Ser, Ala por Gly, Ala por Thr, Ser por Asn, Ala por Val, Ser por
Gly, Tyr por Phe, Ala por Pro, Lys por Arg, Asp por Asn, Leu por
Ile, Leu por Val, Ala por Glu, Asp por Gly, y estos cambios a la
inversa. Ver, por ejemplo, Neurath y colaboradores, The Proteins,
Academic Press, New York (1979). El porcentaje de identidad de dos
secuencias de aminoácidos se puede determinar por medio de
inspección visual y de cálculos matemáticos, o más preferiblemente,
se hace la comparación comparando la información de la secuencia
utilizando un programa de computador tal como el programa versión
10.0 del paquete Wisconsin del Genetics Computer Group (GCG,
Madison, WI), "GAP" (Devereux y colaboradores, 1984, Nucl.
Acids Res. 12: 387) u otros programas de computador comparables. Los
parámetros preferidos predeterminados para el programa "GAP"
incluyen: (1) la matriz ponderada de comparación de aminoácidos de
Gribskov y Burgess ((1986), Nucl. Acids Res. 14: 6745), como lo
describen Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Polypeptide Sequence
and Structure, National Biomedical Research Foundation, páginas
353-358 (1979), u otras matrices de comparación
comparables; (2) una penalización de 30 por cada vacío y una
penalización de 1 por cada símbolo en cada vacío para las secuencias
de aminoácidos; (3) no penalización para los vacíos en los extremos;
y (4) no penalización máxima para vacíos largos. También se puede
hacer uso de otros programas utilizados por aquellos capacitados en
el arte de la comparación de secuencias.
TNFR: "TNFR" se refiere a proteínas
compuestas de secuencias de aminoácidos que son idénticas o
sustancialmente similares a la secuencia de un receptor nativo del
factor de necrosis tumoral de mamífero (TNFR). La actividad
biológica para el propósito de determinar similitud sustancial
significa la capacidad para enlazar al factor de necrosis tumoral
(TNF), para transducir una señal biológica iniciada por el
enlazamiento de TNF a una célula, o para reaccionar en forma cruzada
con anticuerpos anti-TNR surgidos contra TNFR de
fuentes naturales (esto es, no recombinantes). Un TNFR puede ser
cualquier TNFR de mamífero, incluidos los TNFR de humano o de
múrido. Tales TNFR son descritos en la patente estadounidense No.
5.395.760, y en la patente estadounidense No. 5.610.279. Un TNFR
particularmente preferido es aquel descrito en la patente
estadounidense No. 5.395.760, que tiene un peso molecular aparente
medido por SDS-PAGE de aproximadamente 80
kilodaltons en su forma glicosilada.
TNFR:F_{C}: TNFR:F_{C} es una
proteína recombinante de fusión que incluye todo o parte de un
domino extracelular de un TNFR fusionado a una región F_{C} de un
anticuerpo. Tal dominio extracelular incluye, pero no se limita a,
secuencias de aminoácidos sustancialmente similares a los
aminoácidos 1-163, 1-185, ó
1-235 de la Figura 2A de la patente estadounidense
No. 5.395.760. Los usos posibles de TNFR:F_{C} purificado por
medio de métodos convencionales se discuten en Srivastava (2001)
Research Communications in Molecular Pathology and Pharmacology 109
(1 & 2): 125-141; Strand (1999) Clinical
Cornerstones Office Rheumatology 2 (2): 38-50; Hodge
y colaboradores (1998) Immunology Letters 63:
49-51.
Dominio variable del anticuerpo
inmunoglobulina: Un dominio variable del anticuerpo
inmunoglobulina es un dominio de inmunoglobulina que es idéntico o
sustancialmente similar a un dominio V_{L} o a un dominio V_{H}
de origen humano o animal. Para los propósitos de la invención, la
actividad biológica de un dominio variable del anticuerpo
inmunoglobulina con el objeto de determinar una similitud sustancial
es enlazamiento de antígeno.
El proceso de purificación de una proteína a
menudo involucra numerosas etapas. La presente invención abarca un
proceso para reducir la cantidad de una segunda proteína en una
mezcla que incluye una proteína que está siendo purificada y una
segunda proteína, en donde la segunda proteína es introducida
durante una etapa de cromatografía de afinidad en la cual la segunda
proteína es parte del adsorbente. La remoción de tal segunda
proteína puede ser desafiante cuando los puntos isoeléctricos de la
proteína que está siendo purificada y un complejo de la segunda
proteína con la proteína que está siendo purificada son cercanos
debido a que la cromatografía de intercambio iónico es poco probable
que afecte una separación de tales proteínas. El uso de
hidroxiapatita hace que la separación sea tanto posible como simple.
Los métodos de la invención también tienen la ventaja adicional de
remover otras materias indeseables de la proteína. Además, la
invención incluye un método para purificar una proteína que
comprende una región F_{C} de un anticuerpo utilizando
cromatografía sobre hidroxiapatita bajo condiciones en las cuales la
proteína es recuperada en el flujo y lavado y al menos una proteína
contaminante es retenida sobre la hidroxiapatita.
En un aspecto, los métodos de la invención
pueden reducir la cantidad de una segunda proteína, y/o un complejo
de la segunda proteína con la proteína que está siendo purificada,
que es introducida durante la cromatografía de afinidad, en una
muestra que contiene la proteína que está siendo purificada. En este
aspecto, la cromatografía sobre hidroxiapatita se lleva a cabo bajo
condiciones tales que la proteína que está siendo purificada no se
enlace a la hidroxiapatita, pero la segunda proteína, y/o un
complejo de la segunda proteína con la proteína que está siendo
purificada, se enlacen.
El proceso de la invención puede, en algunas
modalidades, involucrar también al menos dos etapas. Primero, la
proteína sufre una etapa previa de purificación por cromatografía de
afinidad utilizando la segunda proteína fijada a un soporte sólido
como absorbente. Segundo, la cromatografía sobre hidroxiapatita se
lleva a cabo bajo condiciones tales que la proteína no se enlace a
la hidroxiapatita, pero la segunda proteína, y/o un complejo de la
segunda proteína con la proteína que está siendo purificada, lo
hagan. El proceso completo de purificación de la proteína puede
incluir otras etapas antes y/o después de cada una de estas
etapas.
Antes del equilibrio y de la cromatografía, se
puede equilibrar previamente el medio para la cromatografía sobre
hidroxiapatita en una solución escogida, por ejemplo, una sal y/o
una solución amortiguadora. La etapa de equilibrio previo sirve para
desplazar una solución utilizada para regeneración y/o
almacenamiento del medio de cromatografía. Alguien capacitado en el
arte se dará cuenta que la composición de la solución de equilibrio
previo depende de la composición de la solución de almacenamiento y
de la solución que va a ser utilizada para la cromatografía
posterior. De este modo, las soluciones apropiadas para equilibrio
previo pueden incluir al mismo amortiguador o sal utilizados para
llevar a cabo la cromatografía, opcionalmente, con una concentración
mayor de la que es utilizada para llevar a cabo la cromatografía.
Los amortiguadores y las sales que pueden ser utilizados para la
cromatografía se discuten más adelante. Por ejemplo, cuando la
solución utilizada para llevar a cabo la cromatografía incluye
fosfato de sodio en una concentración dada, la etapa de equilibrio
previo puede tener lugar en una solución que contiene fosfato de
sodio a una concentración mayor. Como ilustración de esto, si la
solución utilizada para llevar a cabo la cromatografía incluye
fosfato de sodio aproximadamente entre 0,5 milimolar y
aproximadamente 50 milimolar, la etapa de equilibrio previo puede
presentarse en una solución que contiene fosfato de sodio en
concentraciones aproximadamente entre 0,2 molar y aproximadamente
0,5 molar, más preferiblemente en concentraciones de fosfato de
sodio aproximadamente entre 0,3 molar y aproximadamente 0,4 molar,
inclusive.
Antes de aplicar la muestra a la columna, se
puede equilibrar el medio para la cromatografía sobre hidroxiapatita
en el amortiguador o la sal que serán utilizados para la
cromatografía de la proteína. Como se discute más adelante, se puede
llevara a cabo la cromatografía (y la carga de la proteína que va a
ser purificada) en una variedad de amortiguadores o de sales que
incluyen sales de sodio, potasio, amonio, magnesio, calcio, cloruro,
fluoruro, acetato, fosfato, y/o citrato y/o amortiguador Tris. Tales
amortiguadores o sales pueden tener un pH de al menos
aproximadamente 5,5. En algunas modalidades, el equilibrio puede
tener lugar en una solución que contiene un amortiguador Tris o de
fosfato de sodio. Opcionalmente, el amortiguador de fosfato de sodio
está en una concentración aproximadamente entre 0,5 milimolar y
aproximadamente 50 milimolar, más preferiblemente en una
concentración aproximadamente entre 15 milimolar y 35 milimolar.
Preferiblemente, el equilibrio tiene lugar a un pH aproximadamente
de al menos 5,5. El equilibrio tiene lugar a unos pH aproximadamente
entre 6,0 y aproximadamente 8,6, preferiblemente a unos pH
aproximadamente entre 6,5 y 7,5. Más preferiblemente, la solución
incluye un amortiguador de fosfato de sodio en una concentración de
aproximadamente 25 milimolar y a un pH de aproximadamente 6,8.
Cualquiera o todas las etapas cromatográficas de
la invención se pueden llevar a cabo a través de cualquier medio
mecánico. La cromatografía se puede realizar en una columna. La
columna puede ser corrida con o sin presión y desde la parte
superior hasta la inferior o desde la parte inferior hasta la
superior. La dirección de flujo del fluido en la columna se puede
invertir durante el proceso cromatográfico. La cromatografía también
se puede llevar a cabo utilizando un proceso por tandas en el cual
se separa el soporte sólido del líquido utilizado para cargar,
lavar, y eluir la muestra por medio de cualquier medio adecuado,
incluida la gravedad, centrifugación, o filtración. La cromatografía
también se puede llevar a cabo poniendo en contacto a la muestra con
un filtro que adsorba o retenga algunas moléculas en la muestra más
fuertemente que a otras.
La proteína puede ser producida por células
huésped vivas que han sido genéticamente modificadas para producir
la proteína. Los métodos para modificar genéticamente las células
para producir proteínas son bien conocidos en el arte. Ver, por
ejemplo, Ausabel y colaboradores, eds. (1990), Current Protocols in
Molecular Biology (Wiley, New York). Tales métodos incluyen
introducir ácidos nucleicos que codifican y permiten la expresión de
la proteína dentro de células huésped vivas. Estas células huésped
pueden ser células bacterianas, células de hongos, o,
preferiblemente, células animales desarrolladas en cultivo. Las
células huésped bacterianas incluyen, pero no se limitan a, células
de Escherichia coli. Ejemplos de cepas adecuadas de E.
coli incluyen: HB101, DH5\alpha, GM2929, JM109, KW251, NM538,
NM539, y cualquier cepa de E. coli que falle en escindir ADN
foráneo. Las células huésped de hongos que pueden ser utilizadas
incluyen, pero no se limitan a, células de Saccharomyces
cerevisiae, Pichia pastoris y Aspergillus. Unos
pocos ejemplos de líneas de células animales que pueden ser
utilizadas son CHO, VERO, BHK, HeLa, Cos, MDCK, 293, 3T3, y WI38. Se
pueden establecer nuevas líneas de células animales utilizando
métodos conocidos por aquellos capacitados en el arte (por ejemplo,
por medio de transformación, de infección viral, y/o de selección).
Opcionalmente, la proteína puede ser secretada por las células
huésped dentro del medio.
La concentración de proteína de una muestra en
cualquier etapa de purificación se puede determinar por medio de
cualquier método adecuado. Tales métodos son bien conocidos en el
arte e incluyen: 1) métodos colorimétricos tales como el ensayo de
Lowry, el ensayo de Bradford, el ensayo de Smith, y el ensayo de oro
coloidal; 2) métodos que utilizan las propiedades de absorción de
radiación UV de las proteínas; y 3) estimación visual con base en
las bandas coloreadas de proteína sobre geles que dependen de la
comparación con estándares de proteína de cantidad conocida sobre el
mismo gel. Ver, por ejemplo, Stoschek (1990), Quantitation of
Protein, en Guide to Protein Purification, Methods in Enzymol. 182:
50-68.
La proteína que experimenta purificación como se
contempla por parte de la invención incluye uno o más dominios
constantes del anticuerpo inmunoglobulina y puede, pero no
necesariamente, incluir un dominio único o dominios múltiples
variables del anticuerpo inmunoglobulina. Puede ser una proteína de
ocurrencia natural o una proteína recombinante de fusión. Puede
incluir una porción de F_{C} de un anticuerpo. Puede también
incluir una proteína que no es un anticuerpo.
Algunas proteínas contempladas específicamente
para uso con la invención incluyen proteínas recombinantes de fusión
que incluyen uno o más dominios constantes del anticuerpo
inmunoglobulina, opcionalmente una porción de F_{C} de un
anticuerpo, y una proteína idéntica o sustancialmente similar a una
de las siguientes proteínas: un ligando flt3 (como se describe en la
solicitud internacional No. WO 94/28391), un ligando CD40 (como se
describe en la patente estadounidense No. 6.087.329),
eritropoyetina, trombopoyetina, calcitonina, ligando Fas, ligando
para el activador del receptor de NF-Kapa B (RANKL),
ligando que induce apoptosis relacionada con el factor de necrosis
tumoral (TNF) (TRAIL, como se describe en la solicitud internacional
No. WO 97/01633), linfopoyetina derivada del estroma tímico, factor
estimulador de colonias de granulocitos, factor estimulador de
colonias de granulocitos-macrófagos
(GM-CSF, como se describe en la patente australiana
No. 588819), factor de crecimiento de mastocitos, factor de
crecimiento de células madre, factor de crecimiento epidérmico,
RANTES, hormona de crecimiento, insulina, insulinotropina, factores
de crecimiento tipo insulina, hormona paratiroidea, interferones,
factores de crecimiento neural, glucagón, interleuquinas 1 a 18,
factores de estimulación de colonias, linfotoxina \beta, factor de
necrosis tumoral (TNF), factor inhibidor de la leucemia, oncostatina
M, y diferentes ligandos paras las moléculas de la superficie de la
célula ELK y Hek (tal como los ligandos para las quinasas
relacionadas con eph o LERKS). Las descripciones de las proteínas
que se pueden purificar de acuerdo con los métodos de la invención
se pueden encontrar, por ejemplo, en Human Cytokines: Handbook for
Basic and Clinical Research, Vol. II (Aggarwal and Gutterman, eds.
Blackwell Sciences, Cambridge, MA, 1998); Growth Factors: A
Practical Approach (McKay and Leigh, eds., Oxford University Press
Inc., New York, 1993); y The Cytokine Handbook (A.W. Thompson, ed.,
Academic Press, San Diego, CA, 1991).
Las proteínas contempladas por la invención
también incluyen proteínas recombinantes de fusión que incluyen uno
o más dominios constantes del anticuerpo inmunoglobulina,
opcionalmente una porción de F_{C} de un anticuerpo, más un
receptor para cualquiera de las proteínas anteriormente mencionadas
o proteínas sustancialmente similares a tales receptores. Estos
receptores incluyen: ambas formas de TNFR (denominadas como p55 y
p75), los receptores tipo I y II de la Interleuquina 1 (como se
describe en la patente EP No. 0 460 846, la patente estadounidense
No. 4.968.607, y la patente estadounidense No. 5.767.064), el
receptor de Interleuquina 2, el receptor de Interleuquina 4 (como se
describe en la patente EP No. 0 367 566 y la patente estadounidense
No. 5.856.296), el receptor de Interleuquina 15, el receptor de
Interleuquina 17, el receptor de Interleuquina 18, el receptor del
factor estimulador de colonias de
granulocitos-macrófagos, los receptores para
oncostatina M y el factor inhibidor de leucemia, el activador del
receptor de NF-Kapa B (RANK, como se describe en la
patente estadounidense No. 6.271.349), los receptores para TRAIL
(incluidos los receptores para TRAIL 1, 2, 3 y 4), y receptores que
incluyen dominios de muerte, tales como Fas o el Receptor que Induce
Apoptosis (AIR).
Otras proteínas que pueden ser purificadas
utilizando el proceso e la invención incluyen antígenos de
diferenciación (denominados como proteínas CD) o sus ligandos o
proteínas sustancialmente similares a cualquiera de éstas que están
fusionadas al menos a un dominio constante del anticuerpo
inmunoglobulina, opcionalmente a una porción de F_{C} de un
anticuerpo. Tales antígenos están divulgados en Leukocyte Typing VI
(Proceedings of the VIth International Workshop and Conference,
Kishimoto, Kikutani y colaboradores, eds., Kobe, Japan, 1996). Se
describen proteínas CD similares en trabajos posteriores. Los
ejemplos de tales antígenos incluyen CD27, CD30, CD39, CD40, y los
ligandos de los mismos (ligando CD27, ligando CD30, etc.). Varios de
los antígenos CD son miembros de la familia del receptor TNF, que
también incluye al ligando 41BB y OX40. Los ligandos son a menudo
miembros de la familia del TNF, como lo son el ligando 41BB y el
ligando OX40. Por lo tanto, los miembros de las familias del TNF y
del TNFR pueden ser purificados también utilizando la presente
invención.
Las proteínas enzimáticamente activas o sus
ligandos también pueden ser purificados de acuerdo con la invención.
Los ejemplos incluyen proteínas recombinantes de fusión que incluyen
al menos un dominio constante del anticuerpo inmunoglobulina más
todo o parte de una de las siguientes proteínas o sus ligandos o una
proteína sustancialmente similar a una de estas: miembros de la
familia de la metaloproteinasa con actividad de desintegrina,
diferentes quinasas, glucocerebrosidasa, superóxido dismutasa,
activador del plasminógeno tisular, Factor VIII, Factor IX,
apolipoproteína E, apolipoproteína A-I, globinas, un
antagonista de IL-2, alfa-1
antitripsina, Enzima Convertidora de TNF-alfa,
ligandos para cualquiera de las enzimas anteriormente mencionadas, y
numerosas otras enzimas y sus ligandos.
El método de la invención también puede ser
utilizado para purificar anticuerpos o porciones de los mismos y
anticuerpos quiméricos, esto es, anticuerpos que tienen dominios
constantes del anticuerpo inmunoglobulina humana acoplados a uno o
más dominios variables del anticuerpo inmunoglobulina de múrido, o
fragmentos de los mismos. El método de la invención también puede
ser utilizado para purificar conjugados que incluyen un anticuerpo y
una sustancia citotóxica o luminiscente. Tales sustancias incluyen:
derivados de la maitansina (tales como DM1); enterotoxinas (tales
como una enterotoxina de Estafilococo); isótopos de yodo (tales como
el yodo 125); isótopos de tecnecio (tales como
Tc-99m); fluorocromos de cianina (tales como
Cy5.5.18); y proteínas inactivadoras del ribosoma (tales como
buganina, gelonina, o saporina-S6). Los ejemplos de
anticuerpos o de conjugados de anticuerpo/citotoxina o
anticuerpo/luminóforo contemplados por la invención incluyen a
aquellos que reconocen a cualquiera o a una combinación de las
proteínas anteriormente descritas y/o los siguientes antígenos: CD2,
CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33,
CD40, CD44, CD52, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD147,
IL-1\alpha, IL-1\beta,
IL-4, IL-5, IL-8,
IL-10, IL-2, subunidades de receptor
de IL-4, del receptor de IL-6, del
receptor de IL-13, del receptor de
IL-18, PDGF-\beta, VEGF, TGF,
TGF-\beta2, TGF-\beta1, receptor
de EGF, receptor de VEGF, complemento de C5, IgE, antígeno tumoral
CA125, antígeno tumoral MUC1, antígeno PEM, LCG (que es un producto
génico que se expresa en asocio con cáncer de pulmón),
HER-2, una glicoproteína asociada con el tumor
TAG-72, el antígeno SK-1, los
epítopos asociados con el tumor que están presentes en niveles
elevados en los sueros de pacientes con cáncer de colon y/o
pancreático, epítopos asociados con el cáncer o proteínas expresadas
sobre células cancerosas de seno, de colon, células escamosas,
células cancerosas de próstata, de pulmón y/o de riñón y/o sobre
células de melanoma, de glioma, o de neuroblastoma, el núcleo
necrótico de un tumor, integrina alfa 4 beta 7, la integrina
VLA-4, las integrinas B2, los receptores de TRAIL 1,
2, 3 y 4, RANK, el ligando RANK, TNF-\alpha, la
molécula de adhesión VAP-1, la molécula de adhesión
de la célula epitelial (EpCAM), la molécula-3 de
adhesión intercelular (ICAM-3), adesina
leucointegrina, la glicoproteína plaquetaria gp IIb/IIIa, cadena
pesada de miosina cardíaca, hormona paratiroidea, rNAPc2 (que es un
inhibidor del factor tisular VIIa), MHC I, antígeno
carcinoembrionario (CEA), fetoproteína alfa (AFP), factor de
necrosis tumoral (TNF), CTLA-4 (que es un antígeno
asociado con el linfocito T citotóxico), el receptor de
Fc-\gamma-1,
HLA-DR 10 beta, antígeno HLA-DR,
L-selectina, IFN-\gamma, Virus
Sincitial Respiratorio, virus de inmunodeficiencia humana (VIH),
virus de la hepatitis B (HBV), mutantes de Estreptococo, y
Staphyloccocus aureus.
La invención puede ser utilizada también para
purificar anticuerpos anti-idiotípicos, o proteínas
sustancialmente similares, incluyendo, pero sin limitarse a
anticuerpos anti-idiotípicos contra: un anticuerpo
dirigido al antígeno tumoral gp 72; un anticuerpo contra el
gangliósido GD3; o un anticuerpo contra el gangliósido GD2.
En cromatografía de afinidad, un adsorbente
puede incluir un soporte sólido adecuado con una segunda proteína
fijada a él. Una muestra de proteína que contiene la proteína que va
a ser purificada puede ser aplicada a este absorbente. El adsorbente
puede ser posteriormente lavado en una solución que no interfiera
con el enlazamiento de la segunda proteína al dominio constante del
anticuerpo inmunoglobulina de la proteína. La proteína por lo tanto
puede ser eluida del adsorbente con una solución que interfiere con
el enlazamiento del dominio constante del anticuerpo inmunoglobulina
por medio de la segunda proteína.
La segunda proteína es cualquier proteína que
puede enlazarse a un dominio constante del anticuerpo
inmunoglobulina, que puede, pero no necesariamente, ser una proteína
recombinante de fusión. Opcionalmente, la segunda proteína puede ser
Proteína G, Proteína LG o Proteína A. la segunda proteína puede
estar fijada a cualquier soporte sólido adecuado incluyendo:
agarosa, sefarosa, sílice, carbón vegetal de colodión, arena, y
cualquier otro material adecuado. Tales materiales son bien
conocidos en el arte. Se puede utilizar cualquier método adecuado
para fijar la segunda proteína al soporte sólido. Los métodos para
fijar proteínas a soportes sólidos adecuados son bien conocidos en
el arte. Ver, por ejemplo, Ostrove (1990) en Guide to Protein
Purification, Methods in Enzymology 182: 357-371.
Además, tales soportes sólidos que ya tienen la segunda proteína
fijada se encuentran comercialmente disponibles por parte de muchos
fabricantes incluidos BioRad, Merck, Amersham Pharmacia Biotech, y
Millipore Corporation.
En una etapa opcional, se carga una muestra de
proteína que incluye a la muestra que va a ser purificada más los
contaminantes sobre el adsorbente, que incluye a la segunda proteína
fijada a un soporte sólido, en una solución que contiene un
amortiguador y/o una sal. Los amortiguadores adecuados incluyen,
pero no se limitan a, amortiguadores de fosfato, amortiguadores
Tris, amortiguadores de acetato, y/o amortiguadores de citrato. Las
sales adecuadas incluyen, pero no se limitan a, cloruro de sodio,
cloruro de potasio, cloruro de amonio, acetato de sodio, acetato de
potasio, acetato de amonio, sales de calcio, y/o sales de magnesio.
Por ejemplo, la solución puede incluir Tris en concentraciones
aproximadamente entre 5 milimolar y 100 milimolar y cloruro de
sodio en concentraciones aproximadamente entre 50 milimolar y 250
milimolar. Sin embargo, se pueden utilizar otros amortiguadores y
sales. Después de la carga, se puede lavar el adsorbente con más de
la misma solución. La proteína puede ser eluida utilizando una
solución que interfiere con el enlazamiento de la segunda proteína
al dominio constante del anticuerpo inmunoglobulina. Esta solución
puede incluir un agente caotrópico, tal como guanidinio, un agente
que puede o bien incrementar o disminuir el pH, y/o una sal. Esta
solución puede incluir ácido acético, glicina, o ácido cítrico. La
elución se puede efectuar disminuyendo el pH. Por ejemplo, el pH se
puede disminuir aproximadamente hasta 4,5 o menos, típicamente
aproximadamente entre 3,3 y aproximadamente 4,0, utilizando una
solución que contiene citrato o acetato, entre otras posibilidades.
Alternativamente, el pH se puede incrementar, típicamente
aproximadamente hasta 8,5. Las soluciones apropiadas para efectuar
tales eluciones pueden incluir Tris o carbonato de sodio, entre
otras posibilidades. También se encuentran disponibles otros métodos
de elución. Los protocolos para tal cromatografía de afinidad son
bien conocidos en el arte. Ver, por ejemplo, Miller y Stone (1978),
J. Immunol. Methods 24 (1-2):
111-125. Las condiciones para enlazamiento y elución
las pueden optimizar fácilmente aquellos capacitados en el arte.
En los métodos de la invención, la proteína es
sometida a cromatografía sobre hidroxiapatita bajo condiciones en
las cuales la proteína no se enlaza a la hidroxiapatita, pero lo
hace la segunda proteína, y/o un complejo de la segunda proteína con
la proteína, que puede estar presente después de la cromatografía de
afinidad. La muestra es cargada sobre hidroxiapatita y se realiza la
cromatografía en una solución que contiene un amortiguador y/o una
sal a un pH aproximadamente superior a 5,5. Preferiblemente, puede
efectuarse la cromatografía en una solución que es igual o similar a
aquella en la cual se carga la proteína sobre el medio de
cromatografía. La cromatografía sobre hidroxiapatita puede llevarse
a cabo bajo condiciones en las cuales la proteína y la segunda
proteína se enlazan entre sí para formar un complejo o bajo
condiciones en las cuales no lo hacen. De este modo, en el primer
caso, la separación de la proteína de la segunda proteína puede
implicar la separación de la proteína de un complejo de la segunda
proteína con la proteína. En el segundo caso, la separación de la
proteína de la segunda proteína puede implicar precisamente eso. La
cromatografía y la carga pueden realizarse en una variedad de
amortiguadores y/o de sales incluidos amortiguadores de sodio, de
potasio, de amonio, de magnesio, de calcio, de cloruro, de fluoruro,
de acetato, de fosfato, de citrato y/o de Tris. Los ejemplos
específicos de tales amortiguadores y sales son: Tris, fosfato de
sodio, fosfato de potasio, fosfato de amonio, cloruro de sodio,
cloruro de potasio, cloruro de amonio, cloruro de magnesio, cloruro
de calcio, fluoruro de sodio, fluoruro de potasio, fluoruro de
amonio, fluoruro de calcio, fluoruro de magnesio, citrato de sodio,
citrato de potasio, citrato de amonio, acetato de magnesio, acetato
de calcio, acetato de sodio, acetato de potasio, o acetato de
amonio. El rango de pH se escoge para optimizar las condiciones de
la cromatografía y para retener las características deseadas de la
proteína de interés. Para la mayoría de las proteínas de interés,
que pueden estar en el rango aproximadamente entre 6,0 y
aproximadamente 8,6, preferiblemente aproximadamente entre 6,5 y
aproximadamente 7,5. Sin embargo, se sabe que ciertas proteínas son
resistentes a unos pH extremos, y puede ser posible un rango más
amplio. En una modalidad, la solución de carga/cromatografía incluye
un amortiguador de fosfato de sodio en una concentración
aproximadamente entre 0,5 milimolar y aproximadamente 50 milimolar,
más preferiblemente en una concentración aproximadamente entre 15
milimolar y 35 milimolar de fosfato de sodio. Opcionalmente, la
solución incluye un amortiguador de fosfato de sodio en una
concentración aproximadamente de 25 milimolar y un pH
aproximadamente de 6,8. En otra modalidad, la solución de carga
incluye Tris a un pH aproximadamente entre 6,0 y aproximadamente
9,0, preferiblemente aproximadamente entre 6,5 y aproximadamente
8,0.
Se recolecta el líquido del fluido, que incluye
a la proteína que está siendo purificada. El amortiguador
seleccionado y/o la sal a la concentración seleccionada permiten que
la segunda proteína se enlace a la hidroxiapatita, mientras que la
proteína que está siendo purificada no lo hace. Una persona
capacitada en el arte se guiará por el conocimiento del estado del
arte para determinar qué amortiguador o qué sal es apropiada para la
proteína particular que está siendo purificada. Ver, por ejemplo,
Gorbunoff (1990), Protein Chromatography on Hydroxyapatite Columns,
en Guide to Protein Purification, Methods in Enzymology 182:
329-339; Scopes, Protein Purification: Principles
and Practice, Third Edition, pp. 173-75, Springer,
1994. Además, alguien capacitado en el arte puede determinar
fácilmente la concentración óptima del amortiguador o la sal
seleccionados a utilizar, por ejemplo, corriendo a un gradiente del
amortiguador o de la sal seleccionados a través de la columna de
hidroxiapatita a la cual se aplica una muestra que incluye a la
proteína que va a ser purificada y la segunda proteína. Las
fracciones del efluente de la columna se pueden recolectar y
analizar para determinar la concentración de amortiguador o de sal a
la cual eluyen la proteína y la segunda proteína. Los análisis
adecuados incluyen, por ejemplo, una medición de la conductancia
eléctrica con un medidor de conductividad (para determinar la
concentración de sal en la muestra) más electroforesis en gel o un
ensayo de ELISA (para determinar la identidad de las proteínas en la
muestra). Opcionalmente, se puede lavar la hidroxiapatita con más de
la misma solución en la cual se cargó la muestra de proteína, y se
puede recolectar también esta solución de lavado y combinarla con el
líquido del fluido.
Después de la recolección del fluido y,
opcionalmente, del lavado, que incluyen a la proteína que está
siendo purificada, se pueden liberar las proteínas que pueden
permanecer enlazada a la hidroxiapatita despojando al medio de
cromatografía utilizando una solución que contiene al amortiguador o
a la sal utilizados para la cromatografía, pero con una molaridad
más alta. Luego, se puede regenerar la columna utilizando una
solución que tendrá el efecto de liberar la mayor parte o todas las
proteínas del medio cromatográfico y reduciendo o eliminando
cualquier contaminación microbiana que pueda estar presente en el
medio cromatográfico. En una modalidad, tal solución puede incluir
hidróxido de sodio. Se puede utilizar también otros reactivos.
Posteriormente, se puede enjuagar la columna y almacenarla en una
solución que pueda desestimular el crecimiento microbiano. Tal
solución puede contener hidróxido de sodio, pero también pueden ser
apropiados otros reactivos.
La segunda proteína, un complejo de la proteína
y la segunda proteína, y/o otras proteínas que pueden estar
presentes en una muestra de la proteína que está siendo purificada,
pueden ser monitoreados por medio de cualquier medio apropiado.
Preferiblemente, la técnica debe ser lo suficientemente sensible
para detectar contaminantes en el rango aproximadamente entre 2
partes por millón (ppm) (calculado como nanogramos por miligramo de
la proteína que está siendo purificada) y 500 ppm. Por ejemplo, el
ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), un método bien
conocido en el arte, puede ser utilizado para detectar contaminación
de la proteína por la segunda proteína. Ver, por ejemplo, Reen
(1994), Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA),
en Basic Protein and Peptide Protocols, Methods Mol. Biol. 32:
461-466. En un aspecto, puede que la cromatografía
sobre hidroxiapatita no reduzca la contaminación en forma detectable
por parte de una segunda proteína, especialmente si el material
cargado sobre la hidroxiapatita tiene niveles de la segunda proteína
que son cercanos o están por debajo de los niveles detectables.
Alternativamente, la cromatografía sobre hidroxiapatita puede
reducir la contaminación por parte de una segunda proteína
aproximadamente al menos dos veces, preferiblemente aproximadamente
al menos tres veces, más preferiblemente aproximadamente al menos
cinco veces, aún más preferiblemente aproximadamente al menos diez
veces, incluso más preferiblemente aproximadamente al menos quince
veces, lo más preferible aproximadamente al menos veinte veces.
Preferiblemente, la contaminación de la proteína por parte de la
segunda proteína después de la cromatografía sobre hidroxiapatita no
es aproximadamente mayor a 400 ppm, más preferiblemente no es
aproximadamente mayor a 360 ppm, más preferiblemente no es
aproximadamente mayor a 320 ppm, más preferiblemente no es
aproximadamente mayor a 280 ppm, más preferiblemente no es
aproximadamente mayor a 240 ppm, más preferiblemente no es
aproximadamente mayor a 200 ppm, más preferiblemente no es
aproximadamente mayor a 160 ppm, más preferiblemente no es
aproximadamente mayor a 140 ppm, más preferiblemente no es
aproximadamente mayor a 120 ppm, más preferiblemente no es
aproximadamente mayor a 100 ppm, más preferiblemente no es
aproximadamente mayor a 80 ppm, más preferiblemente no es
aproximadamente mayor a 60 ppm, más preferiblemente no es
aproximadamente mayor a 40 ppm, más preferiblemente no es
aproximadamente mayor a 20 ppm, más preferiblemente no es
aproximadamente mayor a 10 ppm, más preferiblemente no es
aproximadamente mayor a 5 ppm, más preferiblemente no es
aproximadamente mayor a 1 ppm y lo más preferible no es
aproximadamente mayor a 0,5 ppm. La contaminación por parte de dicha
segunda proteína puede estar en el rango desde niveles indetectables
hasta aproximadamente 5 ppm o aproximadamente desde 5 ppm hasta
aproximadamente 400 ppm. Si se está purificando una proteína para
uso farmacológico, alguien capacitado en el arte se dará cuenta de
que el nivel preferido de la segunda proteína puede depender de la
dosis semanal de la proteína que se va a administrar por paciente,
con el objetivo de que el paciente no reciba más allá de una cierta
cantidad de una proteína contaminante por semana. De este modo, si
se disminuye la dosis semanal requerida de la proteína, se puede
incrementar posiblemente en nivel de contaminación por parte de una
segunda proteína.
En forma similar, otras proteínas contaminantes,
incluidas las proteínas de la célula huésped, que pueden estar
presentes en una muestra de la proteína que está siendo purificada,
pueden ser monitoreadas por cualquier medio apropiado, incluyendo el
ensayo de ELISA. En un aspecto, la contaminación de la proteína por
parte de esas otras proteínas se puede reducir después de la
cromatografía sobre hidroxiapatita, preferiblemente aproximadamente
al menos dos veces, más preferiblemente aproximadamente al menos
tres veces, más preferiblemente aproximadamente al menos cinco
veces, más preferiblemente aproximadamente al menos diez veces, más
preferiblemente aproximadamente al menos veinte veces, más
preferiblemente aproximadamente al menos treinta veces, más
preferiblemente aproximadamente al menos cuarenta veces, más
preferiblemente aproximadamente al menos cincuenta veces, más
preferiblemente aproximadamente al menos sesenta veces, más
preferiblemente aproximadamente al menos setenta veces, más
preferiblemente aproximadamente al menos 80 veces, más
preferiblemente aproximadamente al menos 90 veces, y lo más
preferible aproximadamente al menos 100 veces. En otro aspecto, la
contaminación de la proteína por parte de esas otras proteínas
después de cromatografía sobre hidroxiapatita no es aproximadamente
superior a 10.000 ppm, preferiblemente no aproximadamente superior a
2.500 ppm, más preferiblemente no aproximadamente superior a 400
ppm, más preferiblemente no aproximadamente superior a 360 ppm, más
preferiblemente no aproximadamente superior a 320 ppm, más
preferiblemente no aproximadamente superior a 280 ppm, más
preferiblemente no aproximadamente superior a 200 ppm, más
preferiblemente no aproximadamente superior a 160 ppm, más
preferiblemente no aproximadamente superior a 140 ppm, más
preferiblemente no aproximadamente superior a 120 ppm, más
preferiblemente no aproximadamente superior a 100 ppm, más
preferiblemente no aproximadamente superior a 80 ppm, más
preferiblemente no aproximadamente superior a 60 ppm, más
preferiblemente no aproximadamente superior a 40 ppm, más
preferiblemente no aproximadamente superior a 30 ppm, más
preferiblemente no aproximadamente superior a 20 ppm, más
preferiblemente no aproximadamente superior a 10 ppm, más
preferiblemente no aproximadamente superior a 5 ppm. Tal
contaminación puede estar en el rango desde niveles no detectables
hasta aproximadamente 10 ppm o aproximadamente desde 10 ppm hasta
aproximadamente 10.000 ppm. Si se está purificando una proteína para
uso farmacológico, alguien capacitado en el arte se dará cuenta de
que el nivel aceptable de otras proteínas contaminantes puede
depender de la dosis semanal de la proteína que se va a administrar
por paciente, como se explicó anteriormente.
La cantidad de ADN que puede estar presente en
una muestra de la proteína que está siendo purificada se puede
determinar por medio de cualquier método adecuado. Por ejemplo, se
puede utilizar un ensayo que utilice reacción en cadena de la
polimerasa. Opcionalmente, la técnica puede detectar contaminación
con ADN en niveles de 10 picogramos por miligramo de proteína y
superiores. Los niveles de ADN se pueden reducir por medio de
cromatografía sobre hidroxiapatita, opcionalmente aproximadamente
dos veces, preferiblemente aproximadamente cinco veces, más
preferiblemente aproximadamente diez veces, más preferiblemente
aproximadamente quince veces, lo más preferible aproximadamente 20
veces. Opcionalmente, los niveles de ADN después de la cromatografía
sobre hidroxiapatita son aproximadamente menores a 20 picogramos por
miligramo de proteína, preferiblemente menores a 15 picogramos por
miligramo de proteína, más preferiblemente menores a 10 picogramos
por miligramo de proteína, los más preferible menos de 5 picogramos
por miligramo de proteína.
Se ofrecen los siguientes ejemplos a manera de
ilustración y no como una limitante.
Ejemplo
1
Este experimento demuestra que la cromatografía
sobre hidroxiapatita puede reducir los niveles de proteína A
residual en una muestra de proteína que incluye TNFR: F_{C} que
contiene una cantidad definida de proteína A, que puede formar un
complejo con TNFR: F_{C}.
Se equilibró previamente una columna de
hidroxiapatita cerámica (Tipo II, BioRad, 80 \mu) de 18
centímetros de alto y 1,6 centímetros de diámetro interno con dos
volúmenes de columna de fosfato de sodio 0,4 molar, pH 6,8 y
equilibrada con cuarto volúmenes de columna de fosfato de sodio 25
milimolar, pH 6,8, que tiene una conductividad de 2,8 miliSiemens
(mS). Se cargó una muestra de proteína (5,11 miligramos/mililitro)
en 668 mililitros de fosfato de sodio 25 mM, pH 6,8 que contiene
TNFR: F_{C} y proteína A (209 ppm) sobre la columna. Se determinó
la cantidad de proteína A en la muestra utilizando un ensayo de
ELISA. Se recolectó el líquido del fluido, que contenía TNFR:
F_{C}. Se lavó la columna con tres volúmenes de columna de fosfato
de sodio 25 milimolar, pH 6,8, y se recolectó el lavado y se lo
combino con el flujo. La proteína recolecta en el flujo y en lavado
se esterilizó por medio de filtración y se almacenó a
2-8ºC hasta que se llevó a cabo la siguiente etapa
de purificación. La mayor parte del TNFR: F_{C} cargado se
recupera (97%) en el líquido de fluido más el de lavado. Se midió la
cantidad de proteína A en el fluido más en el lavado, y era de 11
ppm. Después de eso, se despojo la columna utilizando tres volúmenes
de columna de fosfato de sodio 0,4 molar, pH 6,8, se la regeneró
utilizando dos volúmenes de columna de hidróxido de sodio 1 molar, y
se enjuagó con tres volúmenes de columna de hidróxido de sodio 0,1
molar, fosfato de sodio 10 milimolar, y se almacenó en la misma
solución, en cuya condición quedó lista para ser reutilizada.
Ejemplo
2
Este experimento demuestra que los niveles de
proteínas de la célula huésped en una muestra que contiene TNFR:
F_{C} se puede reducir por medio de cromatografía sobre
hidroxiapatita.
Se equilibró previamente una columna de
hidroxiapatita cerámica (Tipo II, BioRad, 80 \mu) de 10
centímetros de alto y 1,1 centímetros de diámetro interno con dos
volúmenes de columna de fosfato de sodio 0,3 molar, pH 6,8 y
equilibrada con tres volúmenes de columna de fosfato de sodio 25
milimolar, pH 6,8, que tiene una conductividad de 2,8 mS. Se
cargaron aproximadamente 1,9 gramos de proteína en un volumen de 382
mililitros de fosfato de sodio 25 mM, pH 6,8 sobre la columna. La
muestra incluía TNFR: F_{C} que contenía la gran mayoría de la
muestra, y las proteínas de la célula huésped (545 ppm). Se
determinó la cantidad de proteínas de la célula huésped en la
muestra utilizando ensayos de ELISA. Se recolectó el líquido del
fluido, que contenía TNFR: F_{C}. Se lavó la columna con tres
volúmenes de columna de fosfato de sodio 25 milimolar, pH 6,8, y se
recolectó el lavado y se lo combino con el flujo. La mayor parte del
TNFR: F_{C} cargado se recuperó (92%) en el líquido de fluido más
el de lavado. Se esterilizó el TNFR: F_{C} recolectado por medio
de filtración. La cantidad de proteínas de la célula huésped se
disminuyó aproximadamente al menos setenta veces (desde 545 ppm
hasta 7 ppm) cuando se la compara con el material cargado sobre la
columna de hidroxiapatita. Después de eso, se despojo la columna
utilizando tres volúmenes de columna de fosfato de sodio 0,3 molar,
pH 6,8, se enjuagó con medio volumen de columna de fosfato de sodio
25 milimolar, pH 6,8 regenerada utilizando dos volúmenes de columna
de hidróxido de sodio 1 molar, enjuagada con tres volúmenes de
columna de hidróxido de sodio 0,1 molar, fosfato de sodio 10
milimolar, y se almacenó en la misma solución, en cuya condición
quedó lista para ser reutilizada.
La Figura 1 muestra los perfiles de absorbancia
y de conductividad de la columna. La mayor parte de la proteína en
la muestra fluye a través de la columna antes del incremento de la
conductividad (aproximadamente hasta 20 mS) provocado por la adición
de fosfato de sodio 0,3 molar, aproximadamente entre 55 y 59
volúmenes de columna. El gran incremento en la conductancia
(aproximadamente hasta 200 mS) después de eso corresponde a la
adición de hidróxido de sodio 1,0 molar para regenerar la columna
como se explicó anteriormente. Ya que el TNFR: F_{C} constituye la
especie mayoritaria en la muestra de proteína cargada sobre la
columna, este perfil indica que TNFR: F_{C} fluye a través de una
columna de hidroxiapatita que corre en fosfato de sodio 25
milimolar, pH 6,8.
\newpage
Ejemplo
3
El siguiente experimento muestra que los niveles
de proteína A y de otras proteínas contaminantes pueden ser
reducidos simultáneamente utilizando cromatografía sobre
hidroxiapatita.
Se equilibró previamente una columna de
hidroxiapatita cerámica (Tipo II, BioRad, 80 \mu) de 18
centímetros de alto y 1,6 centímetros de diámetro interno con dos
volúmenes de columna de fosfato de sodio 0,4 molar, pH 6,8 y
equilibrada con tres volúmenes de columna de fosfato de sodio 25
milimolar, pH 6,8. Se cargaron aproximadamente 3,2 gramos de
proteína con una concentración aproximada de 5 mg/ml en fosfato de
sodio 25 milimolar, que contiene TNFR: F_{C}, Proteína A, que
forma un complejo con TNFR: F_{C} bajo estas condiciones,
(aproximadamente entre 97 ppm y aproximadamente 106 ppm), y otras
impurezas relacionadas con el proceso (PRI; aproximadamente entre 59
ppm y aproximadamente 67 ppm) sobre la columna. Se determinaron las
cantidades de Proteína A y de PRI en la muestra utilizando ensayos
de ELISA. Se recolectó el líquido del fluido, que contenía TNFR:
F_{C}. Se lavó la columna con tres volúmenes de columna de fosfato
de sodio 25 milimolar, pH 6,8, y luego se recolectó el lavado. Casi
todo el TNFR: F_{C} cargado (99-100%) fue
recuperado en el líquido del fluido más el de lavado. Se redujo la
cantidad de Proteína A y de PRI en la muestra en
5,3-5,4 veces y 2,8-3,7 veces,
respectivamente, cuando se la compara con el material cargad sobre
la columna de hidroxiapatita. Después de eso, se despojó la columna
utilizando cinco volúmenes de columna de fosfato de sodio 0,4 molar,
pH 6,8, regenerada utilizando dos volúmenes de columna de hidróxido
de sodio 1 M, enjuagada en tres volúmenes de columna de fosfato de
sodio 10 milimolar, pH 6,8, hidróxido de sodio 0,1 M, y almacenada
en la misma solución en cuya condición está lista para ser
reutilizada.
La presente invención no está limitada en su
alcance por las modalidades específicas descritas aquí, que se
utilizan como simples ilustraciones de aspectos individuales de la
invención, y los métodos funcionalmente equivalentes y los
componentes están dentro del alcance de la invención. En realidad,
serán evidentes diferentes modificaciones de la invención además de
aquellas descritas aquí, para aquellos capacitados en el arte
relacionada con la descripción anterior y los dibujos acompañantes.
Se pretende que tales modificaciones caigan dentro el alcance de las
reivindicaciones anexas.
\vskip1.000000\baselineskip
Este listado de referencias citado por el
solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma
parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran
cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las
omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.
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Claims (21)
1. Un método para purificar una proteína de una
muestra que incluye a la proteína y al menos una proteína
contaminante que comprende someter la muestra a cromatografía sobre
hidroxiapatita, por medio de la cual se separa la proteína de al
menos una proteína contaminante, en donde la mayoría de las
moléculas de la proteína se recuperan en el flujo y lavado, en donde
la proteína ha sido previamente purificada por medio de
cromatografía de afinidad utilizando una segunda proteína fijada a
un soporte sólido como adsorbente, en donde las segunda proteína se
enlaza específicamente a un dominio constante del anticuerpo
inmunoglobulina, y en donde la proteína incluye un dominio constante
del anticuerpo inmunoglobulina.
2. Un método para purificar una proteína que
comprende:
- (a)
- someter la proteína y al menos una proteína contaminante a cromatografía de afinidad utilizando una segunda proteína fijada a un soporte sólido como adsorbente, en donde la segunda proteína se enlaza específicamente a un dominio constante del anticuerpo inmunoglobulina y en donde la proteína incluye un dominio constante del anticuerpo inmunoglobulina al cual se enlaza específicamente la segunda proteína; y
- (b)
- someter luego la proteína y al menos una proteína contaminante a cromatografía sobre hidroxiapatita en donde la mayoría de las moléculas de la proteína se recupera en el flujo y lavado, por medio de lo cual se separa la proteína de al menos una proteína contaminante.
3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en
donde la segunda proteína está presente en un nivel detectable en la
muestra y en donde la proteína se separa de la segunda proteína por
medio de la cromatografía sobre hidroxiapatita.
4. El método de la reivindicación 1, 2 ó 3, en
donde la proteína ha sido secretada dentro de un medio de cultivo
por células animales cultivadas.
5. El método de la reivindicación 4, en donde
las células animales son células CHO.
6. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 5, en donde la proteína incluye una porción de
F_{C} de un anticuerpo.
7. El método de la reivindicación 6, en donde la
proteína es TNFR: F_{C} o un anticuerpo.
8. El método de la reivindicación 1 ó 2, en
donde la segunda proteína es seleccionada del grupo que consiste de
Proteína A y Proteína G.
9. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en donde la cromatografía sobre
hidroxiapatita se lleva a cabo en una solución que contiene fosfato
de sodio en una concentración aproximadamente entre 5 milimolar y
aproximadamente 50 milimolar y que tiene un pH aproximadamente entre
6,0 y aproximadamente 8,6.
10. Un método para purificar una proteína
recombinante de fusión a partir de una muestra que contiene a la
proteína recombinante de fusión y al menos una proteína contaminante
que comprende someter a la muestra a cromatografía sobre
hidroxiapatita, en donde la proteína recombinante de fusión incluye
una porción de F_{C} de un anticuerpo y una proteína que no es de
un anticuerpo, en donde la proteína recombinante de fusión ha sido
previamente purificada por medio de cromatografía de afinidad
utilizando una segunda proteína fijada a un soporte sólido como
adsorbente, y en donde la mayoría de las moléculas de la proteína
recombinante de fusión se recuperan en el flujo y lavado.
11. Un método para purificar una proteína
recombinante de fusión que comprende someter a la proteína
recombinante de fusión y al menos una proteína contaminante a
cromatografía de afinidad utilizando una segunda proteína fijada a
un soporte sólido como adsorbente antes de someter a la proteína
recombinante de fusión y al menos una proteína contaminante a
cromatografía sobre hidroxiapatita, en donde la mayoría de las
moléculas de la proteína recombinante de fusión se recuperan en el
flujo y lavado y en donde la proteína recombinante de fusión incluye
una porción de F_{C} de un anticuerpo y una proteína que no es de
un anticuerpo.
12. El método de la reivindicación 10 u 11, en
donde la mayoría de las moléculas de la proteína recombinante de
fusión se recuperan de la hidroxiapatita en el flujo y lavado.
13. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 12, en donde la proteína recombinante de
fusión es TNFR: F_{C}.
14. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 13, en donde la segunda proteína es
seleccionada del grupo que consiste de Proteína A y de Proteína
G.
15. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 14, en donde la cromatografía sobre
hidroxiapatita se lleva a cabo en una solución que contiene fosfato
de sodio en una concentración aproximadamente entre 5 milimolar y
aproximadamente 50 milimolar y que tiene un pH aproximadamente entre
6,0 y aproximadamente 8,6.
16. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 15, en donde la proteína recombinante de
fusión ha sido secretada dentro de un medio de cultivo por medio de
células animales cultivadas.
17. El método de la reivindicación 16, en donde
las células animales son células CHO.
18. Un método para purificar TNFR: F_{C} que
comprende someter una muestra que contiene TNFR: F_{C} y al menos
una proteína contaminante a cromatografía sobre hidroxiapatita bajo
ciertas condiciones en donde la mayoría de las moléculas de TNFR:
F_{C} son recuperadas en el flujo y lavado, en donde al menos una
proteína contaminante es separada de TNFR: F_{C}.
19. Un método para separar una proteína de las
proteínas de la célula huésped que comprende someter a una muestra
que contiene a la proteína y al menos una proteína de la célula
huésped a cromatografía sobre hidroxiapatita, en donde al menos una
proteína de la célula huésped es separada de la proteína, en donde
la proteína incluye un dominio constante del anticuerpo
inmunoglobulina, en donde la mayoría de las moléculas de la proteína
son recuperadas en el flujo y lavado, y en donde tanto la proteína
como la proteína de la célula huésped han sido secretadas dentro de
un medio de cultivo por medio de las células animales
cultivadas.
20. El método de la reivindicación 19, en donde
la concentración de las proteínas de la célula huésped con relación
a la proteína en el flujo y lavado es aproximadamente menor a 100
partes por millón.
21. El método de la reivindicación 19 ó 20, en
donde la proteína es TNFR: F_{C}.
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