JPH03291300A - ポリクローナル抗体の分離方法 - Google Patents
ポリクローナル抗体の分離方法Info
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- JPH03291300A JPH03291300A JP1338209A JP33820989A JPH03291300A JP H03291300 A JPH03291300 A JP H03291300A JP 1338209 A JP1338209 A JP 1338209A JP 33820989 A JP33820989 A JP 33820989A JP H03291300 A JPH03291300 A JP H03291300A
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Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明はヒドロキシアパタイトを用いたポリクローナル
抗体の新規な分離方法に関するものである。ポリクロー
ナル抗体は血液等の体液に含まれ免疫反応を司る成分て
、近年医薬品、診断薬等での利用価値が高まっている。
抗体の新規な分離方法に関するものである。ポリクロー
ナル抗体は血液等の体液に含まれ免疫反応を司る成分て
、近年医薬品、診断薬等での利用価値が高まっている。
〔従来の技術）
体液中に含まれるポリクローナル抗体は塩析等の前処理
後、イオン交換クロマトグラフィーやゲル濾過法等多種
、多段階のクロマトグラフィーによってクラス別、すな
わちＩｇＡ 、 ＴｇＧ 、 ＩｇＰ等二二分離・精製
されてきた。しかしながら分離・精製方法がクラス毎に
よって異なっており煩雑で時間を要するものであった。
後、イオン交換クロマトグラフィーやゲル濾過法等多種
、多段階のクロマトグラフィーによってクラス別、すな
わちＩｇＡ 、 ＴｇＧ 、 ＩｇＰ等二二分離・精製
されてきた。しかしながら分離・精製方法がクラス毎に
よって異なっており煩雑で時間を要するものであった。
また、ヒドロキシアパタイトは従来から抗体物質の有用
な分離・精製手段であり、他の分離手段と比べても優れ
た性質を有することが知られており、特にモノクローナ
ル抗体の分！Ｉｌ！こは有効である。ところがヒドロキ
シアパタイトにＩｇＡ 、 ＩｇＧ、Ｉｇ？Ｉ等の各ク
ラスが混在したポリクローナル抗体を吸着させ、ヒドロ
キンアパタイトクロマトグラフィーに一般的に用いられ
る、リン酸緩衝液の濃度を変化させる方法で溶出させる
と、各クラスはオーバーラツプして溶出され、完全分離
することは不可能であった。
な分離・精製手段であり、他の分離手段と比べても優れ
た性質を有することが知られており、特にモノクローナ
ル抗体の分！Ｉｌ！こは有効である。ところがヒドロキ
シアパタイトにＩｇＡ 、 ＩｇＧ、Ｉｇ？Ｉ等の各ク
ラスが混在したポリクローナル抗体を吸着させ、ヒドロ
キンアパタイトクロマトグラフィーに一般的に用いられ
る、リン酸緩衝液の濃度を変化させる方法で溶出させる
と、各クラスはオーバーラツプして溶出され、完全分離
することは不可能であった。
〔発明が解決しようとする１題〕
本発明者らはヒドロキシアパタイトの優れた分離能力に
注目し新規な溶出条件にてクラス別に溶出する方法を鋭
意検討し、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを
用いてポリクローナル抗体を簡易に各種クラス毎に分離
する方法を見出し発明を完成するに至った。
注目し新規な溶出条件にてクラス別に溶出する方法を鋭
意検討し、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを
用いてポリクローナル抗体を簡易に各種クラス毎に分離
する方法を見出し発明を完成するに至った。
発明者らは従来ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ
ー用として使用されている展開液のリンＭ緩衝液に無機
クロル塩（以下無機塩と略記する）を添加し、さらに開
始及び最終展開液のｐＨを変えることで、分離対象サン
プル間の選択性が大きく変化することを見出した。
ー用として使用されている展開液のリンＭ緩衝液に無機
クロル塩（以下無機塩と略記する）を添加し、さらに開
始及び最終展開液のｐＨを変えることで、分離対象サン
プル間の選択性が大きく変化することを見出した。
これにより溶出ピークの形状及び選択性が著しく改善さ
れ、従来多段階のクロマトグラフィーにより分離・精製
されていたＩｇＡ 、 ＩｇＧ 、ＩｇＭ等のポリクロ
ーナル抗体をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー
１段で同時にしかも簡便に得ることを可能にした。
れ、従来多段階のクロマトグラフィーにより分離・精製
されていたＩｇＡ 、 ＩｇＧ 、ＩｇＭ等のポリクロ
ーナル抗体をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー
１段で同時にしかも簡便に得ることを可能にした。
以下本発明の詳細な説明する。
本発明者らはヒドロキシアパタイトとポリクローナル抗
体ｒｇｔ 、 ＩｇＧ及びＩｇＭ等との吸着に影響を及
ぼす展開液のｍ戒を検討した結果、クラス別に溶出する
ことに成功したものである。
体ｒｇｔ 、 ＩｇＧ及びＩｇＭ等との吸着に影響を及
ぼす展開液のｍ戒を検討した結果、クラス別に溶出する
ことに成功したものである。
ポリクローナル抗体はヒドロキシアパタイトに効率よく
吸着するが、通常のリン酸濃度勾配法によって溶出され
た場合は、モノクローナル抗体の場合と比較して溶出パ
ターンがブロードとなる。
吸着するが、通常のリン酸濃度勾配法によって溶出され
た場合は、モノクローナル抗体の場合と比較して溶出パ
ターンがブロードとなる。
ポリクローナル抗体は各クラス毎に吸着挙動が異なるが
、それぞれピーク幅が広いがため各クラスがオーバーラ
ンプして溶出し、これはステップワイズ法を用いて溶出
しても分離は不可能である。
、それぞれピーク幅が広いがため各クラスがオーバーラ
ンプして溶出し、これはステップワイズ法を用いて溶出
しても分離は不可能である。
本発明者らは、（１）１０〜５００ｍＭの無機塩を展開
液に添加することにより各ポリクローナル抗体のピーク
がシャープになることを見出した。〔第１図）しかもこ
の無機塩の効果的濃度はポリクローナル抗体のクラスに
よって異なる６例えばＩｇＡやＩｇＧはＯ〜１００ｍＭ
無機塩で良好な結果が得られ、２５０ｍＭ以上の無機塩
ではヒドロキシアパタイトへの吸着が弱くなる。しかし
ＩＢＭでは３００〜５００１無機塩で良好な結果を得た
。
液に添加することにより各ポリクローナル抗体のピーク
がシャープになることを見出した。〔第１図）しかもこ
の無機塩の効果的濃度はポリクローナル抗体のクラスに
よって異なる６例えばＩｇＡやＩｇＧはＯ〜１００ｍＭ
無機塩で良好な結果が得られ、２５０ｍＭ以上の無機塩
ではヒドロキシアパタイトへの吸着が弱くなる。しかし
ＩＢＭでは３００〜５００１無機塩で良好な結果を得た
。
このことを応用して３００〜５００ｍＭ 無機塩存在下
でｒｇＭを特異的に精製可能であることを見出し、また
開始液の低濃度側リン酸緩衝液に低濃度（０〜１０ｍＭ
）の無機塩を加え、最終溶液となる高濃度（３００〜５
００−Ｍ ）のリン酸緩衝液に高濃度（３００〜５００
ｍＭ ）の無機塩を加え、リン酸緩衝液の濃度勾配と無
機塩の濃度勾配の併用により各クラスをヒドロキシアパ
タイトに効率よく吸着しシャープに溶出させることを可
能にした。
でｒｇＭを特異的に精製可能であることを見出し、また
開始液の低濃度側リン酸緩衝液に低濃度（０〜１０ｍＭ
）の無機塩を加え、最終溶液となる高濃度（３００〜５
００−Ｍ ）のリン酸緩衝液に高濃度（３００〜５００
ｍＭ ）の無機塩を加え、リン酸緩衝液の濃度勾配と無
機塩の濃度勾配の併用により各クラスをヒドロキシアパ
タイトに効率よく吸着しシャープに溶出させることを可
能にした。
更に本発明者らは、（２）上記の方法ではポリクローナ
ル抗体のＩｇＡとＩｇＧは未だ精製不十分であったため
、これを改善すべく溶離液のＰＨに工夫を重ねた。ヒド
ロキシアパタイトとタンパク質との吸着に展開液のｐＨ
が大きく影響することは周知の事実であり、低いｐｉｆ
の保持力は強く、高いｐＨの保持力が弱いため、低いｐ
Ｈから高いｐＨへのｐＨ勾配によるタンパクの溶出例は
ある１本発明者らはこれとは異なり、低濃度の開始緩衝
液のｐｉｆを上げ（ｐＨ７，０以上）高濃度の最終緩衝
液のｐＨを下げ（ｐＨ６，０以下）たグラジェントによ
り、二液の混合開始時に著しいｐＨ変曲点が生しるのを
利用した。
ル抗体のＩｇＡとＩｇＧは未だ精製不十分であったため
、これを改善すべく溶離液のＰＨに工夫を重ねた。ヒド
ロキシアパタイトとタンパク質との吸着に展開液のｐＨ
が大きく影響することは周知の事実であり、低いｐｉｆ
の保持力は強く、高いｐＨの保持力が弱いため、低いｐ
Ｈから高いｐＨへのｐＨ勾配によるタンパクの溶出例は
ある１本発明者らはこれとは異なり、低濃度の開始緩衝
液のｐｉｆを上げ（ｐＨ７，０以上）高濃度の最終緩衝
液のｐＨを下げ（ｐＨ６，０以下）たグラジェントによ
り、二液の混合開始時に著しいｐＨ変曲点が生しるのを
利用した。
高いｐＨでのポリクローナルＩｇＡのヒドロキシアパタ
イトへの吸着は弱く大部分は未吸着画分に溶出する。モ
して二液の混合開始時に生しるｐＨ変曲点でＩｇＡとＩ
ｇＧの混合ピークが生し、その後のグラジェントでＩｇ
Ｇが７容出する。
イトへの吸着は弱く大部分は未吸着画分に溶出する。モ
して二液の混合開始時に生しるｐＨ変曲点でＩｇＡとＩ
ｇＧの混合ピークが生し、その後のグラジェントでＩｇ
Ｇが７容出する。
以上の方法（］）と方法（２）の併用した系でステンプ
ワイズを行うことでポリクローナル抗体を８０％以上の
純度でクラス別に分離することが可能となった。
ワイズを行うことでポリクローナル抗体を８０％以上の
純度でクラス別に分離することが可能となった。
〔実施例］
以下実施例により本発明をさらに明確に説明する。
実施例１
ヒト血清由来ポリクローナルＩｇＡ 、 ＩｇＧ及びＩ
ｇｌ’ｌの分離例。
ｇｌ’ｌの分離例。
実施例では高速液体クロマトグラフィー装置（ＨＰＬＣ
）島津ＬＣ−６＾及びＩｆＰＬＣ用ヒドロキシアパタイ
トカラム（三井東圧化学■製ＨＣＡ−Ｃｏｌｕｍｎ Ａ
−７６１０／Ｐ−４００１＞を用いた。
）島津ＬＣ−６＾及びＩｆＰＬＣ用ヒドロキシアパタイ
トカラム（三井東圧化学■製ＨＣＡ−Ｃｏｌｕｍｎ Ａ
−７６１０／Ｐ−４００１＞を用いた。
サンプルはヒト血清由来ポリクローナルＩｇＡ、ＩｇＧ
及びＩｇＭ （ミドリ十字社）を用い、それぞれ０．
５ｒｍｇ 、計１．５ｔａｇをＨＣＡ−Ｃｏｌｕｔｎに
注入した。展開条件は以下の通りである。すなわち、開
始液に（Ａ）１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（以下Ｋ
ＰＢと略す）をｐＨ７，５に調製したもを用い、最終液
には（Ｂ） ５００５ＭのＫＰＢをｐｎｓ、８に調製し
、さらに５００５Ｍの塩化カリウムを添加したものを用
いた。これら２液（Ａ） 、（Ｂ）の混合割合を以下の
如く変化させた。
及びＩｇＭ （ミドリ十字社）を用い、それぞれ０．
５ｒｍｇ 、計１．５ｔａｇをＨＣＡ−Ｃｏｌｕｔｎに
注入した。展開条件は以下の通りである。すなわち、開
始液に（Ａ）１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（以下Ｋ
ＰＢと略す）をｐＨ７，５に調製したもを用い、最終液
には（Ｂ） ５００５ＭのＫＰＢをｐｎｓ、８に調製し
、さらに５００５Ｍの塩化カリウムを添加したものを用
いた。これら２液（Ａ） 、（Ｂ）の混合割合を以下の
如く変化させた。
即ち、
ステンプワイズ ０〜５ｍ１ｎ Ｏ％Ｂ５〜１０１
１ｉｎ１５％Ｂ １（１−２０ｍｉｎ ２７％Ｂ ２０−２３＋ｍｉｎ １００％Ｂ 混合威分は第２図（イ）に示すように分離された。単成
分での展開（それぞれ０．５ｍ）ではＩｇＡは第２図−
（ロ）、ＩｇＧは第２図−（ハ）、及び１ｇ列は第２図
−（ニ）のようなりロマトパターンとなり、また混合成
分の分離の時得られた分画のＥＬＩＳ＾ （抗１ｇＡ
、抗ＩｇＧ 、抗１ｇＭ抗体による）法による各ピーク
の確認の結果もこれと同様であった。さらにＩｇＡは収
率８０％、純度９５％（うち５％はＩｇＧ ）で得られ
、ＩｇＧは収率８０％、純度８５％（うち１５％はＩｇ
Ａ ）で得られ、ＩｇＭは収率９９％、純度１００％で
得られることを確認した。
１ｉｎ１５％Ｂ １（１−２０ｍｉｎ ２７％Ｂ ２０−２３＋ｍｉｎ １００％Ｂ 混合威分は第２図（イ）に示すように分離された。単成
分での展開（それぞれ０．５ｍ）ではＩｇＡは第２図−
（ロ）、ＩｇＧは第２図−（ハ）、及び１ｇ列は第２図
−（ニ）のようなりロマトパターンとなり、また混合成
分の分離の時得られた分画のＥＬＩＳ＾ （抗１ｇＡ
、抗ＩｇＧ 、抗１ｇＭ抗体による）法による各ピーク
の確認の結果もこれと同様であった。さらにＩｇＡは収
率８０％、純度９５％（うち５％はＩｇＧ ）で得られ
、ＩｇＧは収率８０％、純度８５％（うち１５％はＩｇ
Ａ ）で得られ、ＩｇＭは収率９９％、純度１００％で
得られることを確認した。
実施例２
母乳より分泌型１ｇＡの分離
ヒト母乳を以下に示すスキームに従い前処理し、Ｈｌ：
、ｆｉ−Ｃｏｌｕｍｎ精製を行った。
、ｆｉ−Ｃｏｌｕｍｎ精製を行った。
脱脂した人乳（２５ｃｃ）
沈殿
上澄
１−０．４５μフイルターで濾過
粗精製サンプル（１０ｃｃ）
＋（ＰＬＣ及び展開液（Ａ） 、（Ｂ）は実施例１と同
じものを用いた。目的成分は展開液（Ａ）で平衡化した
カラム内を素通りし、未吸着画分として得られる。
じものを用いた。目的成分は展開液（Ａ）で平衡化した
カラム内を素通りし、未吸着画分として得られる。
更に高純度品が必要な場合は、上述未吸着画分をｐＨ６
，８に調製後、以下の展開条件で精製する。
，８に調製後、以下の展開条件で精製する。
即ち、開始液に（Ｃ）１０ｍＭＫＰＲ（ｐＨ６，８）、
最終液に（ｄ）３５０＃Ｍ ＫＰＢ （ｐ＋１６．８）
を用い、（Ｃ）から（ｄ）ヘノ直接濃度勾配を２０分間
で実施する。
最終液に（ｄ）３５０＃Ｍ ＫＰＢ （ｐ＋１６．８）
を用い、（Ｃ）から（ｄ）ヘノ直接濃度勾配を２０分間
で実施する。
精製された分泌１ｇＡの収率は４０〜５０％、純度は９
０％以上であることを確認した（免疫電気泳動法、３％
アクリルアミドゲル電気泳動）。
０％以上であることを確認した（免疫電気泳動法、３％
アクリルアミドゲル電気泳動）。
本発明の技術により、これまで困難であったポリクロー
ナル抗体のクラス別分離がヒドロキシアパタイトクロマ
トグラフィーを用いて簡易な操作で可能となった。また
この方法は他の分離困難なタンパク質の混合成分の分離
・精製にも応用可能であり、産業上の価値は大きい。
ナル抗体のクラス別分離がヒドロキシアパタイトクロマ
トグラフィーを用いて簡易な操作で可能となった。また
この方法は他の分離困難なタンパク質の混合成分の分離
・精製にも応用可能であり、産業上の価値は大きい。
第１図は、添加無機塩濃度と各ポリクローナル抗体のカ
ラム溶出挙動を示す。図中利／２は溶出ピークの半値幅
、ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅはカラムに保持される
時間、１グラフはカラムに保持されない成分の割合をそ
れぞれ示す。 第２図（イ）はポリクローナルＩｇＡ 、 ｒｇｃ；
、及びＴｇＭの混合成分のクロマトパターンを示す、第
２図（ロ）はＩｇＡ 、第２図（ハ）はＩｇＧ 、第２
図（ハ）はＩｇＭのそれぞれの単成分でのクロマトノく
ターンを示す。
ラム溶出挙動を示す。図中利／２は溶出ピークの半値幅
、ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅはカラムに保持される
時間、１グラフはカラムに保持されない成分の割合をそ
れぞれ示す。 第２図（イ）はポリクローナルＩｇＡ 、 ｒｇｃ；
、及びＴｇＭの混合成分のクロマトパターンを示す、第
２図（ロ）はＩｇＡ 、第２図（ハ）はＩｇＧ 、第２
図（ハ）はＩｇＭのそれぞれの単成分でのクロマトノく
ターンを示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによりポ
リクローナル抗体を分離する方法において、展開液にリ
ン酸緩衝液を用い、該緩衝液に塩化カリウムまたは／及
び塩化ナトリウムを添加することを特徴とするポリクロ
ーナル抗体の分離方法。 ２）展開液中のリン酸濃度がＰＯ＿４＾３＾−として０
ｍＭ〜５００ｍＭの範囲であって、塩化物の濃度がＣｌ
＾−として０ｍＭ〜５００ｍＭであり、さらにｐＨが５
．０〜８．０の範囲内でポリクローナル抗体を分離する
特許請求の範囲第１項記載の分離方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1338209A JPH03291300A (ja) | 1989-12-28 | 1989-12-28 | ポリクローナル抗体の分離方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1338209A JPH03291300A (ja) | 1989-12-28 | 1989-12-28 | ポリクローナル抗体の分離方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03291300A true JPH03291300A (ja) | 1991-12-20 |
Family
ID=18315953
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1338209A Pending JPH03291300A (ja) | 1989-12-28 | 1989-12-28 | ポリクローナル抗体の分離方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03291300A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0873362B1 (de) * | 1996-01-12 | 2002-06-12 | Baxter Aktiengesellschaft | VERFAHREN ZUR TRENNUNG VON IgG und IgA |
| US7122641B2 (en) | 2001-12-21 | 2006-10-17 | Immunex Corporation | Methods for purifying protein |
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| WO2022008658A1 (en) * | 2020-07-10 | 2022-01-13 | Grifols Worldwide Operations Limited | Method for obtaining a composition comprising human plasma-derived immunoglobulin m |
-
1989
- 1989-12-28 JP JP1338209A patent/JPH03291300A/ja active Pending
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