JP3435265B2 - 等電点３．３以下の蛋白質の分離方法 - Google Patents
等電点３．３以下の蛋白質の分離方法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、試料液中の等電点
３．３以下の蛋白質の分離方法に関し、さらに詳しくは
体液中の等電点３．３以下の蛋白質を１分離工程で分離
しうる方法に関する。
３．３以下の蛋白質の分離方法に関し、さらに詳しくは
体液中の等電点３．３以下の蛋白質を１分離工程で分離
しうる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、成人病の死亡原因としては癌が大
きな割合を占めている。癌の早期発見、早期治療は重要
であるが、それと同時に癌治療後の経過診断も重要な意
義を持つ。血清、血漿、腹水等の体液中におけるα1 −
酸性糖蛋白質をはじめとする等電点３．３以下の酸性糖
蛋白質（以下、ＡＧＰと略記することがある。）の濃度
は、一般に癌患者で高く、健常者で低いことは、既に報
告されており、この点に着目して、体液中のＡＧＰの濃
度を測定することで癌の診断あるいは癌治療後の経過診
断を行おうとする取り組みも多い。
きな割合を占めている。癌の早期発見、早期治療は重要
であるが、それと同時に癌治療後の経過診断も重要な意
義を持つ。血清、血漿、腹水等の体液中におけるα1 −
酸性糖蛋白質をはじめとする等電点３．３以下の酸性糖
蛋白質（以下、ＡＧＰと略記することがある。）の濃度
は、一般に癌患者で高く、健常者で低いことは、既に報
告されており、この点に着目して、体液中のＡＧＰの濃
度を測定することで癌の診断あるいは癌治療後の経過診
断を行おうとする取り組みも多い。
【０００３】例えば、プレパラティブ・バイオケミスト
リィー（PREPARATIVE BIOCHEMISTRY）、４（２）、１１
５〜１２６（１９７４）「ヒト血清α−１酸性糖蛋白質
の単離精製（ISOLATION AND PURIFICATION OF HUMAN SE
RUM ALPHA-1 ACIDGLYCOPROTEIN)」には、ジエチルアミ
ノエチル（ＤＥＡＥ）セルロースカラムを用いたクロマ
トグラフィーによりＡＧＰを分離しうることが記載され
ている。しかしながら、この方法では、ＤＥＡＥセルロ
ースカラムに種々の蛋白質を吸着させ、ＡＧＰ以外の蛋
白質をカラムから溶出させた後、目的とするＡＧＰを溶
出させなければならない。したがって、臨床検査機関な
どにおける体液中のＡＧＰの濃度を測定するための手段
としては、煩雑で、効率が悪い。
リィー（PREPARATIVE BIOCHEMISTRY）、４（２）、１１
５〜１２６（１９７４）「ヒト血清α−１酸性糖蛋白質
の単離精製（ISOLATION AND PURIFICATION OF HUMAN SE
RUM ALPHA-1 ACIDGLYCOPROTEIN)」には、ジエチルアミ
ノエチル（ＤＥＡＥ）セルロースカラムを用いたクロマ
トグラフィーによりＡＧＰを分離しうることが記載され
ている。しかしながら、この方法では、ＤＥＡＥセルロ
ースカラムに種々の蛋白質を吸着させ、ＡＧＰ以外の蛋
白質をカラムから溶出させた後、目的とするＡＧＰを溶
出させなければならない。したがって、臨床検査機関な
どにおける体液中のＡＧＰの濃度を測定するための手段
としては、煩雑で、効率が悪い。
【０００４】一般に、静電的な親和力により蛋白質を液
相中で固相表面に吸着させる場合には、蛋白質溶液のｐ
Ｈを蛋白質の等電点に近づけることで、最大の吸着効果
を得ることができる。したがって、ＡＧＰをハイドロキ
シアパタイトに吸着させるためにｐＨ４．０の緩衝液を
用いている。しかしながらｐＨ４．０において血清をハ
イドロキシアパタイトに対して作用させた場合、免疫グ
ロブリンなど等電点の高い蛋白質のハイドロキシアパタ
イトに対する吸着作用が弱くなり、ハイドロキシアパタ
イトクロマトグラフィーによる１段階のＡＧＰ分離は困
難である。
相中で固相表面に吸着させる場合には、蛋白質溶液のｐ
Ｈを蛋白質の等電点に近づけることで、最大の吸着効果
を得ることができる。したがって、ＡＧＰをハイドロキ
シアパタイトに吸着させるためにｐＨ４．０の緩衝液を
用いている。しかしながらｐＨ４．０において血清をハ
イドロキシアパタイトに対して作用させた場合、免疫グ
ロブリンなど等電点の高い蛋白質のハイドロキシアパタ
イトに対する吸着作用が弱くなり、ハイドロキシアパタ
イトクロマトグラフィーによる１段階のＡＧＰ分離は困
難である。
【０００５】また、ジャーナル・オブ・クロマトグラフ
ィー（Journal of Chromatography)、５８２（１９９
２）２４６〜２４８頁、柿木シゲルら著「液体カラムク
ロマトグラフィーによる血清中のα1 −酸性糖蛋白質の
迅速かつ簡単な測定法（Rapidand simple method for t
he determination of α1 −acid glycoprotein inser
um by colum liquid chromatography) 」には、血清を
ＤＥＡＥＭアニオン交換樹脂カラムに通して血清中のＡ
ＧＰを吸着させ、これをクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ
４．０）で溶離させ（ＡＧＰの粗分離）、この溶離液を
ハイドロキシアパタイトカラムに通し、線形勾配のリン
酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．２）を用いて所望のＡＧＰ
を分離する方法が記載されている。この方法において
も、ＤＥＡＥカラムを用いるクロマトグラフィーは、血
清の前処理、すなわち、ＡＧＰの粗分離を目的とするも
のであり、その溶離液をハイドロキシアパタイトカラム
に流して高速液体クロマトグラフィーによって精製ＡＧ
Ｐを得るものである。したがって、２段階の分離操作を
必要とし、それに付随する操作も煩雑になる。ハイドロ
キシアパタイトが蛋白質吸着能を有することは、公知で
あり、従来一般に５００℃以上の温度で熱処理されたリ
ン酸カルシウム系化合物が用いられている。
ィー（Journal of Chromatography)、５８２（１９９
２）２４６〜２４８頁、柿木シゲルら著「液体カラムク
ロマトグラフィーによる血清中のα1 −酸性糖蛋白質の
迅速かつ簡単な測定法（Rapidand simple method for t
he determination of α1 −acid glycoprotein inser
um by colum liquid chromatography) 」には、血清を
ＤＥＡＥＭアニオン交換樹脂カラムに通して血清中のＡ
ＧＰを吸着させ、これをクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ
４．０）で溶離させ（ＡＧＰの粗分離）、この溶離液を
ハイドロキシアパタイトカラムに通し、線形勾配のリン
酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．２）を用いて所望のＡＧＰ
を分離する方法が記載されている。この方法において
も、ＤＥＡＥカラムを用いるクロマトグラフィーは、血
清の前処理、すなわち、ＡＧＰの粗分離を目的とするも
のであり、その溶離液をハイドロキシアパタイトカラム
に流して高速液体クロマトグラフィーによって精製ＡＧ
Ｐを得るものである。したがって、２段階の分離操作を
必要とし、それに付随する操作も煩雑になる。ハイドロ
キシアパタイトが蛋白質吸着能を有することは、公知で
あり、従来一般に５００℃以上の温度で熱処理されたリ
ン酸カルシウム系化合物が用いられている。
【０００６】また、抗原抗体反応を利用したＡＧＰ濃度
測定法の一つである酵素免疫法は、測定手順が多く煩雑
であり、また、同じく抗原抗体反応を利用した免疫拡散
法の操作は簡便ではあるが、反応が完結し、結果を得る
までに数十時間を要するという問題があり、いずれも臨
床検査機関などにおける体液中のＡＧＰを測定する手段
としては効率の悪いものであった。
測定法の一つである酵素免疫法は、測定手順が多く煩雑
であり、また、同じく抗原抗体反応を利用した免疫拡散
法の操作は簡便ではあるが、反応が完結し、結果を得る
までに数十時間を要するという問題があり、いずれも臨
床検査機関などにおける体液中のＡＧＰを測定する手段
としては効率の悪いものであった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、１段階の分
離操作で効率よく血清などの体液中のＡＧＰを分離する
ことができ、その定量に供することができる等電点３．
３以下の蛋白質の分離方法を開発することを目的とす
る。
離操作で効率よく血清などの体液中のＡＧＰを分離する
ことができ、その定量に供することができる等電点３．
３以下の蛋白質の分離方法を開発することを目的とす
る。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、未熱処理又は
低温熱処理リン酸カルシウム系化合物粉体粒子を用いて
緩衝液の濃度及びｐＨを適切に選定してクロマトグラフ
ィーを行うことによって１段階でＡＧＰの分離を行いう
ることを見出し、この知見に基づいて完成したものであ
る。すなわち、本発明は、試料液中の等電点３．３以下
の蛋白質を分離するため、試料液をＣａ／Ｐ比が１．０
〜２．０のリン酸カルシウム系化合物の粉体微粒子と接
触させ、次いで、濃度が８０〜１５０ｍＭで、ｐＨが
５．５〜５．７のリン酸緩衝液を加え、上記粉体微粒子
に試料液中の等電点３．３を超える蛋白質を吸着させて
除去することを特徴とする等電点３．３以下の蛋白質の
分離方法に関する。
低温熱処理リン酸カルシウム系化合物粉体粒子を用いて
緩衝液の濃度及びｐＨを適切に選定してクロマトグラフ
ィーを行うことによって１段階でＡＧＰの分離を行いう
ることを見出し、この知見に基づいて完成したものであ
る。すなわち、本発明は、試料液中の等電点３．３以下
の蛋白質を分離するため、試料液をＣａ／Ｐ比が１．０
〜２．０のリン酸カルシウム系化合物の粉体微粒子と接
触させ、次いで、濃度が８０〜１５０ｍＭで、ｐＨが
５．５〜５．７のリン酸緩衝液を加え、上記粉体微粒子
に試料液中の等電点３．３を超える蛋白質を吸着させて
除去することを特徴とする等電点３．３以下の蛋白質の
分離方法に関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明においては、Ｃａ／Ｐ比が
１．０〜２．０のリン酸カルシウム系化合物を試料中の
等電点３．３を超える蛋白質の吸着に用いる。リン酸カ
ルシウム系化合物の蛋白質吸着能は、低温焼成のものの
方が高く、従来の高温焼成のものでは等電点３．３を超
える蛋白質を完全に吸着することはできない。等電点
３．３以下の蛋白質を吸着せず、等電点３．３を超える
蛋白質を吸着させる本発明の目的において、リン酸カル
シウム系化合物は、未熱処理であるか又は４００℃以下
の温度で熱処理されたものが好ましい。
１．０〜２．０のリン酸カルシウム系化合物を試料中の
等電点３．３を超える蛋白質の吸着に用いる。リン酸カ
ルシウム系化合物の蛋白質吸着能は、低温焼成のものの
方が高く、従来の高温焼成のものでは等電点３．３を超
える蛋白質を完全に吸着することはできない。等電点
３．３以下の蛋白質を吸着せず、等電点３．３を超える
蛋白質を吸着させる本発明の目的において、リン酸カル
シウム系化合物は、未熱処理であるか又は４００℃以下
の温度で熱処理されたものが好ましい。
【００１０】リン酸カルシウム系化合物としては、Ｃａ
／Ｐ比が１．０〜２．０のものであれば、特に制限はな
く、例えば、Ｃａ10（ＰＯ4)6 （ＯＨ)2、Ｃａ10（ＰＯ
4)6Ｆ2 、Ｃａ10（ＰＯ4)6 Ｃl2、Ｃａ3(ＰＯ4)2 、Ｃ
ａ2 Ｐ2 Ｏ7 、Ｃａ（ＰＯ3)2 のうちから選ばれた１種
又は２種以上を使用することができる。これらのうちハ
イドロキシアパタイトを主成分とするものが最も好まし
い。フッ素アパタイトを用いる場合、全リン酸カルシウ
ム系化合物中のフッ素含有率が５重量％以下であるのが
好ましい。フッ素含有率が５重量％を超えると、フッ素
の溶出が起こり好ましくない。これらのリン酸カルシウ
ム系化合物は、公知の湿式合成法、乾式合成法などによ
って合成することができる。本発明においては、平均粒
径２〜１００μｍの粉体微粒子を用いるのが好ましい。
平均粒径が２μｍ未満では、微粒子がカラム出口に詰ま
る、カラム全体の通液抵抗が増大するといった障害が起
こり、蛋白質の分離効率は低下する。また、１００μｍ
を超えると、カラム内の粒子充填状態が疎になり自然拡
散による蛋白質バンドの広がりのため、分離効率は低下
する。また、これらの粉体微粒子は、１０〜１００ｍ2
／ｇの比表面積を有するのが吸着能の点から好ましい。
／Ｐ比が１．０〜２．０のものであれば、特に制限はな
く、例えば、Ｃａ10（ＰＯ4)6 （ＯＨ)2、Ｃａ10（ＰＯ
4)6Ｆ2 、Ｃａ10（ＰＯ4)6 Ｃl2、Ｃａ3(ＰＯ4)2 、Ｃ
ａ2 Ｐ2 Ｏ7 、Ｃａ（ＰＯ3)2 のうちから選ばれた１種
又は２種以上を使用することができる。これらのうちハ
イドロキシアパタイトを主成分とするものが最も好まし
い。フッ素アパタイトを用いる場合、全リン酸カルシウ
ム系化合物中のフッ素含有率が５重量％以下であるのが
好ましい。フッ素含有率が５重量％を超えると、フッ素
の溶出が起こり好ましくない。これらのリン酸カルシウ
ム系化合物は、公知の湿式合成法、乾式合成法などによ
って合成することができる。本発明においては、平均粒
径２〜１００μｍの粉体微粒子を用いるのが好ましい。
平均粒径が２μｍ未満では、微粒子がカラム出口に詰ま
る、カラム全体の通液抵抗が増大するといった障害が起
こり、蛋白質の分離効率は低下する。また、１００μｍ
を超えると、カラム内の粒子充填状態が疎になり自然拡
散による蛋白質バンドの広がりのため、分離効率は低下
する。また、これらの粉体微粒子は、１０〜１００ｍ2
／ｇの比表面積を有するのが吸着能の点から好ましい。
【００１１】本発明において、試料液とは、等電点３．
３以下の蛋白質を含む任意の液体であってよく、例え
ば、血清、血漿、腹水などの体液が挙げられる。
３以下の蛋白質を含む任意の液体であってよく、例え
ば、血清、血漿、腹水などの体液が挙げられる。
【００１２】本発明の方法を実施する場合には、試料液
を採取し、上記のようなリン酸カルシウム系化合物の粉
体微粒子と接触させるが、試料の量が５０μｌ未満の場
合は操作上不都合であるため、試料体積を５０μｌ程度
に希釈する必要がある。したがって、試料量が５０μｌ
未満の場合は溶離液と同じ組成のリン酸緩衝液で希釈し
て試料体積を５０μｌにする。試料液とリン酸カルシウ
ム系化合物の粉体微粒子との接触は、これらを混合し、
その後固相と液相とを分離する方法でもよいが、一般に
は、リン酸カルシウム系化合物の粉体微粒子をカラムに
充填し、カラムクロマトグラフィーによって行うのが好
ましい。カラムクロマトグラフィーを行う場合には、充
填剤であるリン酸カルシウム系化合物の粉体微粒子を予
め溶離液として用いるリン酸緩衝液で湿らせておき、次
いで試料液を流すのが好ましい。送液方法は、定量ポン
プあるいは重力を用いる方法であってよい。
を採取し、上記のようなリン酸カルシウム系化合物の粉
体微粒子と接触させるが、試料の量が５０μｌ未満の場
合は操作上不都合であるため、試料体積を５０μｌ程度
に希釈する必要がある。したがって、試料量が５０μｌ
未満の場合は溶離液と同じ組成のリン酸緩衝液で希釈し
て試料体積を５０μｌにする。試料液とリン酸カルシウ
ム系化合物の粉体微粒子との接触は、これらを混合し、
その後固相と液相とを分離する方法でもよいが、一般に
は、リン酸カルシウム系化合物の粉体微粒子をカラムに
充填し、カラムクロマトグラフィーによって行うのが好
ましい。カラムクロマトグラフィーを行う場合には、充
填剤であるリン酸カルシウム系化合物の粉体微粒子を予
め溶離液として用いるリン酸緩衝液で湿らせておき、次
いで試料液を流すのが好ましい。送液方法は、定量ポン
プあるいは重力を用いる方法であってよい。
【００１３】リン酸緩衝液は、ｐＨ５．５〜５．７であ
ることを必要とする。リン酸緩衝液のｐＨが５．５より
低いと、リン酸カルシウム系化合物が溶解してしまい、
液相あるいは流出液中にリン酸カルシウム系化合物が溶
出していると、その後に液相あるいは流出液中のＡＧＰ
を色素結合法で定量できなくなる。また、緩衝液のｐＨ
が５．７を超えると、等電点が３．３を超える蛋白質も
リン酸カルシウム系化合物微粒子に吸着されずに、液相
あるいは流出液中に溶出してしまい、１段階でＡＧＰを
分離できなくなる。また、リン酸緩衝液の濃度は、８０
〜１５０ｍＭであるのが好ましい。この濃度が８０ｍＭ
未満であると、ＡＧＰも溶出せず、１５０ｍＭを超える
とＡＧＰ以外の蛋白質の溶出が起こる。
ることを必要とする。リン酸緩衝液のｐＨが５．５より
低いと、リン酸カルシウム系化合物が溶解してしまい、
液相あるいは流出液中にリン酸カルシウム系化合物が溶
出していると、その後に液相あるいは流出液中のＡＧＰ
を色素結合法で定量できなくなる。また、緩衝液のｐＨ
が５．７を超えると、等電点が３．３を超える蛋白質も
リン酸カルシウム系化合物微粒子に吸着されずに、液相
あるいは流出液中に溶出してしまい、１段階でＡＧＰを
分離できなくなる。また、リン酸緩衝液の濃度は、８０
〜１５０ｍＭであるのが好ましい。この濃度が８０ｍＭ
未満であると、ＡＧＰも溶出せず、１５０ｍＭを超える
とＡＧＰ以外の蛋白質の溶出が起こる。
【００１４】こうして得られた液相あるいは流出液中の
ＡＧＰ濃度は、クマシーブリリアントブルーＧ−２５０
蛋白質定量試薬（ＰＩＥＲＣＥ社製）などを使用する色
素結合法あるいは電気泳動分析により測定することがで
きる。従来使用された波長２８０ｎｍの吸光度測定は、
回収した液相又は流出液中に波長２８０ｎｍに吸収帯を
持つ非蛋白質成分が存在するため使用できない。しか
し、クマシーブリリアントブルーＧ−２５０蛋白質定量
試薬は、この非蛋白質成分と反応しない。
ＡＧＰ濃度は、クマシーブリリアントブルーＧ−２５０
蛋白質定量試薬（ＰＩＥＲＣＥ社製）などを使用する色
素結合法あるいは電気泳動分析により測定することがで
きる。従来使用された波長２８０ｎｍの吸光度測定は、
回収した液相又は流出液中に波長２８０ｎｍに吸収帯を
持つ非蛋白質成分が存在するため使用できない。しか
し、クマシーブリリアントブルーＧ−２５０蛋白質定量
試薬は、この非蛋白質成分と反応しない。
【００１５】
【実施例】次に、実施例に基づいて本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明はこれによって制限されるもの
ではない。
的に説明するが、本発明はこれによって制限されるもの
ではない。
【００１６】実施例１
図１に示すクロマトグラフィー装置を用いて市販のＡＧ
Ｐ（ＳＩＧＭＡ社製）を分離した。その際リン酸緩衝液
のｐＨを５．７〜５．４まで変化させてＡＧＰの溶出挙
動を調べた。図１において、リン酸緩衝液容器１から定
量ポンプ２によりリン酸緩衝液を吸引し、試料注入部３
より試料を注入し、必要に応じてリン酸緩衝液で希釈さ
れた試料を、リン酸カルシウム系化合物の粉体微粒子を
充填したカラム４に流入させた。溶離液の初濃度を１０
ｍＭとし、試料注入後（分析開始後）３分後に溶離液濃
度を勾配２０ｍＭ／分として４００ｍＭまで上昇させ、
カラム４からの流出液を吸光度計５によってモニターリ
ングし、流出口６から流出させる。なお、吸光度計５で
測定された吸光度は、記録計７に記録される。
Ｐ（ＳＩＧＭＡ社製）を分離した。その際リン酸緩衝液
のｐＨを５．７〜５．４まで変化させてＡＧＰの溶出挙
動を調べた。図１において、リン酸緩衝液容器１から定
量ポンプ２によりリン酸緩衝液を吸引し、試料注入部３
より試料を注入し、必要に応じてリン酸緩衝液で希釈さ
れた試料を、リン酸カルシウム系化合物の粉体微粒子を
充填したカラム４に流入させた。溶離液の初濃度を１０
ｍＭとし、試料注入後（分析開始後）３分後に溶離液濃
度を勾配２０ｍＭ／分として４００ｍＭまで上昇させ、
カラム４からの流出液を吸光度計５によってモニターリ
ングし、流出口６から流出させる。なお、吸光度計５で
測定された吸光度は、記録計７に記録される。
【００１７】分離条件は、下記のとおりとした。
リン酸緩衝液：ｐＨ５．７、５．５及び５．４のリン酸
ナトリウム緩衝液 カラム形状 ：直径７ｍｍ、長さ５０ｍｍのカラム 充填剤 ：粒径２０μｍ、比表面積５０ｍ2 ／ｇ程
度の熱処理を施していないハイドロキシアパタイト 流速 ：２ｍｌ／分 試料 ：市販のＡＧＰ（ＳＩＧＭＡ社製）２０μ
ｇ水溶液（試料濃度１ｍｇ／ｍｌ）
ナトリウム緩衝液 カラム形状 ：直径７ｍｍ、長さ５０ｍｍのカラム 充填剤 ：粒径２０μｍ、比表面積５０ｍ2 ／ｇ程
度の熱処理を施していないハイドロキシアパタイト 流速 ：２ｍｌ／分 試料 ：市販のＡＧＰ（ＳＩＧＭＡ社製）２０μ
ｇ水溶液（試料濃度１ｍｇ／ｍｌ）
【００１８】上記の条件で得られた溶出挙動を波長２８
０ｎｍで測定し、結果を図２に示す。図２において、曲
線イはｐＨ５．７のリン酸ナトリウム緩衝液を用いた場
合、曲線ロはｐＨ５．５のリン酸ナトリウム緩衝液を用
いた場合、曲線ハはｐＨ５．４のリン酸ナトリウム緩衝
液を用いた場合を示す。吸着ＡＧＰの溶出ピーク位置の
シフトから、ＡＧＰは溶離液ｐＨを酸性とするにしたが
ってカラムに強く保持される傾向が認められた。また、
溶離液ｐＨが酸性となるにしたがってピーク形状はブロ
ード状になり、良好な分離が達成されていないことが分
かる。以上の結果からＡＧＰ分離におけるリン酸緩衝液
ｐＨの下限は５．５程度であることが示された。
０ｎｍで測定し、結果を図２に示す。図２において、曲
線イはｐＨ５．７のリン酸ナトリウム緩衝液を用いた場
合、曲線ロはｐＨ５．５のリン酸ナトリウム緩衝液を用
いた場合、曲線ハはｐＨ５．４のリン酸ナトリウム緩衝
液を用いた場合を示す。吸着ＡＧＰの溶出ピーク位置の
シフトから、ＡＧＰは溶離液ｐＨを酸性とするにしたが
ってカラムに強く保持される傾向が認められた。また、
溶離液ｐＨが酸性となるにしたがってピーク形状はブロ
ード状になり、良好な分離が達成されていないことが分
かる。以上の結果からＡＧＰ分離におけるリン酸緩衝液
ｐＨの下限は５．５程度であることが示された。
【００１９】実施例２
図１の装置を用いてヒト血清中のＡＧＰを分離した。分
離条件は、下記のとおりとした。 リン酸緩衝液：濃度１００ｍＭ、ｐＨ５．７のリン酸ナ
トリウム緩衝液 カラム形状 ：直径７ｍｍ、長さ５０ｍｍのカラム 充填剤 ：粒径２０μｍ、比表面積５０ｍ2 ／ｇ程
度の熱処理を施していないハイドロキシアパタイト 流速 ：１ｍｌ／分 試料 ：未処理のヒト血清１０μｌ これに上記リン酸緩衝液を加えて５０μｌの試料とし
た。
離条件は、下記のとおりとした。 リン酸緩衝液：濃度１００ｍＭ、ｐＨ５．７のリン酸ナ
トリウム緩衝液 カラム形状 ：直径７ｍｍ、長さ５０ｍｍのカラム 充填剤 ：粒径２０μｍ、比表面積５０ｍ2 ／ｇ程
度の熱処理を施していないハイドロキシアパタイト 流速 ：１ｍｌ／分 試料 ：未処理のヒト血清１０μｌ これに上記リン酸緩衝液を加えて５０μｌの試料とし
た。
【００２０】上記の条件下でカラムに試料を注入する
と、２分程度でＡＧＰを含む液体が流出してきた。この
流出液を回収し、脱塩、濃縮処理した後に電気泳動分析
を行った。得られた電気泳動パターンを図３に示す。市
販のＡＧＰ（ＳＩＧＭＡ社製）をリン酸カルシウム（ハ
イドロキシアパタイト）カラムに通した後、それを回収
して電気泳動分析した。その結果、等電点３．３〜４．
５の位置に蛋白質バンドを認めた。したがって、ＡＧＰ
は本発明による分離の過程で等電点位置を変化させるこ
とが分かる。
と、２分程度でＡＧＰを含む液体が流出してきた。この
流出液を回収し、脱塩、濃縮処理した後に電気泳動分析
を行った。得られた電気泳動パターンを図３に示す。市
販のＡＧＰ（ＳＩＧＭＡ社製）をリン酸カルシウム（ハ
イドロキシアパタイト）カラムに通した後、それを回収
して電気泳動分析した。その結果、等電点３．３〜４．
５の位置に蛋白質バンドを認めた。したがって、ＡＧＰ
は本発明による分離の過程で等電点位置を変化させるこ
とが分かる。
【００２１】前記の方法でヒト血清中のＡＧＰを分離
し、回収したＡＧＰ溶液を分画分子量５０００の限外ろ
過膜（日本ミリポア社製）を１００倍に濃縮した後、Ａ
ＧＰ抗体を用いた一元免疫拡散プレート（細菌化学研究
所製）に添加した。３７℃で４８時間インキュベーショ
ンした結果、本発明により分離したＡＧＰの抗体結合活
性を示す沈降リングの形成を認めた。
し、回収したＡＧＰ溶液を分画分子量５０００の限外ろ
過膜（日本ミリポア社製）を１００倍に濃縮した後、Ａ
ＧＰ抗体を用いた一元免疫拡散プレート（細菌化学研究
所製）に添加した。３７℃で４８時間インキュベーショ
ンした結果、本発明により分離したＡＧＰの抗体結合活
性を示す沈降リングの形成を認めた。
【００２２】実施例３
実施例２で用いた未焼成ハイドロキシアパタイトの代わ
りに４００℃で熱処理したハイドロキシアパタイトを用
いた以外は、実施例２と同様に操作したところ実施例２
で得られたのと実質的に同じ電気泳動パターンが得られ
た。
りに４００℃で熱処理したハイドロキシアパタイトを用
いた以外は、実施例２と同様に操作したところ実施例２
で得られたのと実質的に同じ電気泳動パターンが得られ
た。
【００２３】実施例４
１４個の血清試料を用いて実施例２と同じ条件でクロマ
トグラフィーを行い、得られた流出液にクマシーブリリ
アントブルーＧ−２５０蛋白質定量試薬（ＰＩＥＲＣＥ
社製）を加えた後、波長５９５ｎｍの吸光度から流出液
中の総蛋白質濃度を測定し、これをＡＧＰ濃度とした。
また、各試料のＡＧＰ濃度を一元免疫拡散法により測定
し、先の測定結果と比較した。すなわち、図４におい
て、縦軸には本発明により分離されたＡＧＰを上記の色
素結合法で測定した結果をプロットし、横軸に各試料の
ＡＧＰ濃度を市販の免疫拡散プレートで測定した結果を
プロットした。図４によれば、両者はほぼ比例してお
り、本実施例は、免疫拡散法によるＡＧＰ測定結果（１
検体当り４８時間程度要した）と同程度の精度の結果を
極めて短時間で得た（１検体当り５分程度）ことを示
す。
トグラフィーを行い、得られた流出液にクマシーブリリ
アントブルーＧ−２５０蛋白質定量試薬（ＰＩＥＲＣＥ
社製）を加えた後、波長５９５ｎｍの吸光度から流出液
中の総蛋白質濃度を測定し、これをＡＧＰ濃度とした。
また、各試料のＡＧＰ濃度を一元免疫拡散法により測定
し、先の測定結果と比較した。すなわち、図４におい
て、縦軸には本発明により分離されたＡＧＰを上記の色
素結合法で測定した結果をプロットし、横軸に各試料の
ＡＧＰ濃度を市販の免疫拡散プレートで測定した結果を
プロットした。図４によれば、両者はほぼ比例してお
り、本実施例は、免疫拡散法によるＡＧＰ測定結果（１
検体当り４８時間程度要した）と同程度の精度の結果を
極めて短時間で得た（１検体当り５分程度）ことを示
す。
【００２４】なお、クマシーブリリアントブルーＧ−２
５０は、等電点３．３以下の蛋白質の他に溶解したリン
酸カルシウム（ハイドロキシアパタイト）でも吸収波長
５９５ｎｍで発色する。そこで、ｐＨ５．７、５．５及
び５．４を有する濃度１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液を図１に示した液体クロマトグラフィー装置（充填剤
は実施例１に記載したものと同じ、未使用）に流し、流
出液１ｍｌを回収し、これにクマシーブリリアンドブル
ーＧ−２５０蛋白質定量試薬（ＰＩＥＲＣＥ社製）を１
ｍｌ添加し、波長５９５ｎｍの吸光度を測定した。別
に、カラムを通過していないリン酸緩衝液についても、
その１ｍｌに同じ蛋白質定量試薬１ｍｌを添加し、波長
５９５ｎｍの吸光度を測定した。前者と後者の差を溶解
したリン酸カルシウムの量として求めた。結果は、下記
のとおりであった。 溶離液ｐＨ リン酸カルシウム溶解量（吸光度の差） ５．７ ０．０１ ５．５ ０．０１ ５．４ ０．０４５ 以上の結果から、本発明におけるリン酸緩衝液の最低ｐ
Ｈは、ｐＨ５．５であることが分かる。
５０は、等電点３．３以下の蛋白質の他に溶解したリン
酸カルシウム（ハイドロキシアパタイト）でも吸収波長
５９５ｎｍで発色する。そこで、ｐＨ５．７、５．５及
び５．４を有する濃度１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液を図１に示した液体クロマトグラフィー装置（充填剤
は実施例１に記載したものと同じ、未使用）に流し、流
出液１ｍｌを回収し、これにクマシーブリリアンドブル
ーＧ−２５０蛋白質定量試薬（ＰＩＥＲＣＥ社製）を１
ｍｌ添加し、波長５９５ｎｍの吸光度を測定した。別
に、カラムを通過していないリン酸緩衝液についても、
その１ｍｌに同じ蛋白質定量試薬１ｍｌを添加し、波長
５９５ｎｍの吸光度を測定した。前者と後者の差を溶解
したリン酸カルシウムの量として求めた。結果は、下記
のとおりであった。 溶離液ｐＨ リン酸カルシウム溶解量（吸光度の差） ５．７ ０．０１ ５．５ ０．０１ ５．４ ０．０４５ 以上の結果から、本発明におけるリン酸緩衝液の最低ｐ
Ｈは、ｐＨ５．５であることが分かる。
【００２５】実施例５
図５に示すように、プラスチックシリンジ８の底部に東
洋ろ紙グラスファイバーフィルター９を置き、その上に
充填剤１０を１ｇ充填し、さらに東洋濾紙グラスファイ
バーフィルター９を載せて重力による送液方式のカラム
を作製した。このカラムを用いて下記の分離条件でヒト
血清試料を分離した。 溶離液 ：濃度１００ｍＭ、ｐＨ５．７のリン酸ナ
トリウム緩衝液 カラム形状 ：内径１０ｍｍ、長さ５５ｍｍのプラスチ
ックシリンジ 充填剤 ：粒径４０μｍの熱処理を施していないハ
イドロキシアパタイト 流速 ：１ｍｌ／分 試料 ：６種類の未処理のヒト血清各１５μｌ これを上記溶離液で希釈して５０μｌの試料とした。
洋ろ紙グラスファイバーフィルター９を置き、その上に
充填剤１０を１ｇ充填し、さらに東洋濾紙グラスファイ
バーフィルター９を載せて重力による送液方式のカラム
を作製した。このカラムを用いて下記の分離条件でヒト
血清試料を分離した。 溶離液 ：濃度１００ｍＭ、ｐＨ５．７のリン酸ナ
トリウム緩衝液 カラム形状 ：内径１０ｍｍ、長さ５５ｍｍのプラスチ
ックシリンジ 充填剤 ：粒径４０μｍの熱処理を施していないハ
イドロキシアパタイト 流速 ：１ｍｌ／分 試料 ：６種類の未処理のヒト血清各１５μｌ これを上記溶離液で希釈して５０μｌの試料とした。
【００２６】６種類のヒト血清試料を溶離液で５０μｌ
に希釈した後、これを溶離液５ｍｌで予め洗浄済みのカ
ラム上部から添加し、１分後に溶離液２ｍｌを添加し、
２分後にさらに溶離液２ｍｌを添加し、同時に溶出液を
回収し、回収溶液にクマシーブリリアントブルーＧ−２
５０蛋白質定量試薬１ｍｌを添加して波長５９５ｎｍの
吸光度を測定し、結果を図６に示す。図６において、縦
軸には本発明により分離されたＡＧＰを上記の色素結合
法で測定した結果をプロットし、横軸に各試料のＡＧＰ
濃度を市販の免疫拡散プレートで測定した結果をプロッ
トした。図６によれば、両者はほぼ比例しており、本実
施例は、免疫拡散法によるＡＧＰ測定結果（１検体当り
４８時間程度要した）と同程度の精度の結果を極めて短
時間で得た（１検体当り５分程度）ことが分かる。
に希釈した後、これを溶離液５ｍｌで予め洗浄済みのカ
ラム上部から添加し、１分後に溶離液２ｍｌを添加し、
２分後にさらに溶離液２ｍｌを添加し、同時に溶出液を
回収し、回収溶液にクマシーブリリアントブルーＧ−２
５０蛋白質定量試薬１ｍｌを添加して波長５９５ｎｍの
吸光度を測定し、結果を図６に示す。図６において、縦
軸には本発明により分離されたＡＧＰを上記の色素結合
法で測定した結果をプロットし、横軸に各試料のＡＧＰ
濃度を市販の免疫拡散プレートで測定した結果をプロッ
トした。図６によれば、両者はほぼ比例しており、本実
施例は、免疫拡散法によるＡＧＰ測定結果（１検体当り
４８時間程度要した）と同程度の精度の結果を極めて短
時間で得た（１検体当り５分程度）ことが分かる。
【００２７】さらに、上記の溶出液の電気泳動パターン
を図７に示す。このパターンにおいて等電点３．３〜
４．５の位置にある横長の蛋白質スポットは、ＡＧＰの
等電点が変化したものである。市販のＡＧＰ（ＳＩＧＭ
Ａ社製）をリン酸カルシウム（ハイドロキシアパタイ
ト）カラムに通した後、それを回収して電気泳動分析し
た。その結果、等電点３．３〜４．５の位置に蛋白質バ
ンドを認めた。したがって、ＡＧＰは本発明による分離
の過程で等電点位置を変化させることが分かる。
を図７に示す。このパターンにおいて等電点３．３〜
４．５の位置にある横長の蛋白質スポットは、ＡＧＰの
等電点が変化したものである。市販のＡＧＰ（ＳＩＧＭ
Ａ社製）をリン酸カルシウム（ハイドロキシアパタイ
ト）カラムに通した後、それを回収して電気泳動分析し
た。その結果、等電点３．３〜４．５の位置に蛋白質バ
ンドを認めた。したがって、ＡＧＰは本発明による分離
の過程で等電点位置を変化させることが分かる。
【００２８】実施例６
Ｃａ／Ｐ比１．０のリン酸カルシウム系化合物粉体をカ
ラム充填剤として用いた以外は、実施例２と同様に操作
し、回収された溶出液の２次元電気泳動分析を行ったと
ころ、図８に示す電気泳動パターンが得られ、血清中の
ＡＧＰが良好に分離された。
ラム充填剤として用いた以外は、実施例２と同様に操作
し、回収された溶出液の２次元電気泳動分析を行ったと
ころ、図８に示す電気泳動パターンが得られ、血清中の
ＡＧＰが良好に分離された。
【００２９】実施例７
Ｃａ／Ｐ比２．０のリン酸カルシウム系化合物粉体をカ
ラム充填剤として用いた以外は、実施例２と同様に操作
し、回収された溶出液の２次元電気泳動分析を行ったと
ころ、図９に示す電気泳動パターンが得られ、血清中の
ＡＧＰが良好に分離された。
ラム充填剤として用いた以外は、実施例２と同様に操作
し、回収された溶出液の２次元電気泳動分析を行ったと
ころ、図９に示す電気泳動パターンが得られ、血清中の
ＡＧＰが良好に分離された。
【００３０】比較例１
未処理のヒト血清の２次元電気泳動分析を行い、図１０
に示す電気泳動パターンを得た。図１０において、ａは
ＡＧＰ、ｂ及びｃはアルブミン、ｄはプレアルブミン、
ｅ、ｆ及びｇはトランスフェリン、ｈは免疫グロブリン
Ｇ、ｉはハプトグロビン、ｊは免疫グロブリンＡ、ｋは
免疫グロブリンＭを示す。
に示す電気泳動パターンを得た。図１０において、ａは
ＡＧＰ、ｂ及びｃはアルブミン、ｄはプレアルブミン、
ｅ、ｆ及びｇはトランスフェリン、ｈは免疫グロブリン
Ｇ、ｉはハプトグロビン、ｊは免疫グロブリンＡ、ｋは
免疫グロブリンＭを示す。
【００３１】比較例２
濃度１００ｍＭ、ｐＨ５．８のリン酸ナトリウム緩衝液
を用いた以外は、実施例２と同様に操作してヒト血清中
のＡＧＰの分離を試みた。得られた流出液の蛋白質組成
の２次元電気泳動分析を行ったところ、流出液はＡＧＰ
とともに、それ以外の蛋白質成分であるトランスフェリ
ンなどの血清蛋白質を含んでいた。したがって、上記の
緩衝液条件ではＡＧＰを完全に分離できない。上記の２
次元電気泳動分析で得られたパターンを図１１に示す。
図１１において、ＡはＡＧＰ、Ｂ及びＣはトランスフェ
リンを示す。
を用いた以外は、実施例２と同様に操作してヒト血清中
のＡＧＰの分離を試みた。得られた流出液の蛋白質組成
の２次元電気泳動分析を行ったところ、流出液はＡＧＰ
とともに、それ以外の蛋白質成分であるトランスフェリ
ンなどの血清蛋白質を含んでいた。したがって、上記の
緩衝液条件ではＡＧＰを完全に分離できない。上記の２
次元電気泳動分析で得られたパターンを図１１に示す。
図１１において、ＡはＡＧＰ、Ｂ及びＣはトランスフェ
リンを示す。
【００３２】
【発明の効果】本発明の方法によれば、特定濃度範囲及
び特定ｐＨのリン酸緩衝液で希釈した試料をリン酸カル
シウム系化合物の粉体微粒子と接触させ、固相と液相と
分離するという１回の分離操作で短時間で高精度で効率
よくＡＧＰを分離することができる。したがって、本発
明の方法は、血清、血漿、腹水などの体液中のＡＧＰを
臨床検査機関などで測定するのに極めて有効である。
び特定ｐＨのリン酸緩衝液で希釈した試料をリン酸カル
シウム系化合物の粉体微粒子と接触させ、固相と液相と
分離するという１回の分離操作で短時間で高精度で効率
よくＡＧＰを分離することができる。したがって、本発
明の方法は、血清、血漿、腹水などの体液中のＡＧＰを
臨床検査機関などで測定するのに極めて有効である。
【図１】実施例及び比較例において使用したクロマトグ
ラフィー装置の系統図である。
ラフィー装置の系統図である。
【図２】実施例１で得られたクロマトグラムを示す図で
ある。
ある。
【図３】実施例２で得られた電気泳動パターンを示す図
である。
である。
【図４】実施例４で得られた本発明の方法と免疫拡散法
による血清中のＡＧＰ濃度の相関図である。
による血清中のＡＧＰ濃度の相関図である。
【図５】実施例５で用いたカラムの断面図である。
【図６】実施例５で得られた本発明の方法と免疫拡散法
による血清中のＡＧＰ濃度の相関図である。
による血清中のＡＧＰ濃度の相関図である。
【図７】実施例５で得られた電気泳動パターンを示す図
である。
である。
【図８】実施例６で得られた電気泳動パターンを示す図
である。
である。
【図９】実施例７で得られた電気泳動パターンを示す図
である。
である。
【図１０】比較例１で得られた電気泳動パターンを示す
図である。
図である。
【図１１】比較例２で得られた電気泳動パターンを示す
図である。
図である。
１ リン酸緩衝液容器
２ 定量ポンプ
３ 試料注入部
４ カラム
５ 吸光度計
６ 流出口
７ 記録計
８ プラスチックシリンジ
９ 東洋ろ紙グラスファイバーフィルター
１０ 充填剤
ａ ＡＧＰ
ｂ アルブミン
ｃ アルブミン
ｄ プレアルブミン
ｅ トランスフェリン
ｆ トランスフェリン
ｇ トランスフェリン
ｈ 免疫グロブリンＧ
ｉ ハプトグロブリン
ｊ 免疫グロブリンＡ
ｋ 免疫グロブリンＭ
Ａ ＡＧＰ
Ｂ ＡＧＰ
Ｃ トランスフェリン
Ｄ トランスフェリン
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 特開 平７−289886（ＪＰ，Ａ)
特開 平５−310780（ＪＰ，Ａ)
特開 平３−291300（ＪＰ，Ａ)
特開 平７−301626（ＪＰ，Ａ)
特開 平７−88361（ＪＰ，Ａ)
特開 平７−146281（ＪＰ，Ａ)
特開 平８−136520（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 30/00 - 30/96
G01N 33/68
Claims (5)
- 【請求項１】 試料液中の等電点３．３以下の蛋白質を
分離するため、試料液をＣａ／Ｐ比が１．０〜２．０の
リン酸カルシウム系化合物の粉体微粒子と接触させ、次
いで、濃度が８０〜１５０ｍＭで、ｐＨが５．５〜５．
７のリン酸緩衝液を加え、上記粉体微粒子に試料液中の
等電点３．３を超える蛋白質を吸着させて除去すること
を特徴とする等電点３．３以下の蛋白質の分離方法。 - 【請求項２】 リン酸カルシウム系化合物の粉体が未熱
処理粉体である請求項１記載の等電点３．３以下の蛋白
質の分離方法。 - 【請求項３】 リン酸カルシウム系化合物の粉体が４０
０℃以下の温度で熱処理した粉体である請求項１記載の
等電点３．３以下の蛋白質の分離方法。 - 【請求項４】 リン酸カルシウム系化合物がハイドロキ
シアパタイトである請求項１〜３のいずれか１項記載の
等電点３．３以下の蛋白質の分離方法。 - 【請求項５】 試料液が体液である請求項１記載の等電
点３．３以下の蛋白質の分離方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28571395A JP3435265B2 (ja) | 1994-11-14 | 1995-11-02 | 等電点３．３以下の蛋白質の分離方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6-279285 | 1994-11-14 | ||
| JP27928594 | 1994-11-14 | ||
| JP28571395A JP3435265B2 (ja) | 1994-11-14 | 1995-11-02 | 等電点３．３以下の蛋白質の分離方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08211041A JPH08211041A (ja) | 1996-08-20 |
| JP3435265B2 true JP3435265B2 (ja) | 2003-08-11 |
Family
ID=26553255
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28571395A Expired - Fee Related JP3435265B2 (ja) | 1994-11-14 | 1995-11-02 | 等電点３．３以下の蛋白質の分離方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3435265B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009025154A (ja) * | 2007-07-19 | 2009-02-05 | Hoya Corp | ヘムタンパク質分離法およびヘムタンパク質吸着剤 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4617175B2 (ja) | 2005-03-07 | 2011-01-19 | Ｈｏｙａ株式会社 | 吸着剤および吸着装置 |
-
1995
- 1995-11-02 JP JP28571395A patent/JP3435265B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009025154A (ja) * | 2007-07-19 | 2009-02-05 | Hoya Corp | ヘムタンパク質分離法およびヘムタンパク質吸着剤 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08211041A (ja) | 1996-08-20 |
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