JPH0477500A

JPH0477500A - グリコヘモグロビンの分離方法および分離装置並びに分離カラム

Info

Publication number: JPH0477500A
Application number: JP2192423A
Authority: JP
Inventors: Masako Mizuno; 水野　昌子; Kenji Tochigi; 栃木　憲治; Yutaka Misawa; 三沢　豊
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1990-07-20
Filing date: 1990-07-20
Publication date: 1992-03-11
Anticipated expiration: 2013-07-30
Also published as: US5348649A; JP2782470B2; DE4124058A1; DE4124058C2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、血液中から安定型グリコヘモグロビンを分離
する分離方法および分離装置に関する。

〔従来の技術〕

グリコヘモグロビンは、血液中の糖がその濃度に応じて
赤血球中に入った後に、ヘモグロビンと結合して生成さ
れるものである。グリコヘモグロビンのうち、安定型Ａ
１ｃ　（ｓｔａｂｌｅ　−Ａ□ｃ　；　ｓ　−Ａ、ｃ）
の濃度は過去１〜３ケ月の平均的な血糖値を反映すると
いわれている。ｓ　　Ａｌ（の値は、尿糖値や血糖値と
ともに糖尿病の診断や糖尿病患者の経過観察の指標とし
て用いられている。尿糖値や血糖値は生理的要因により
変動するが、ｓ　−Ａ、Ｃは生理的要因に左右されにく
いという特長を有する。

ヘモグロビンはヘム（色素）とグロビン（タンパク）が
結合した分子置駒６４，５００の複合タンパクであり、
動物の体内での酸素の運搬体として重要な役割を果して
いる。

健常成人のヘモグロビン（Ｈｂ）はＨｂＡｏ。

ＨｂＡ、、ＨｂＦからなっている。ＨｂＡｏに糖が結合
したものがグリコヘモグロビン（ＧＨｂ）であり、Ｈｂ
Ａ□とも呼ばれる。ＧＨｂ　（ＨｂＡ、）はＨｂのアミ
ノ酸構造やＨｂに結合する糖の種類の違いが異なるＡ工
ａ、　Ａｌｂ、　Ａｒｃなどで構成されている。これら
のＧＨｂの中で量的に一番多い成分がＡ　ｌｃであり、
健常工人の場合４〜６％を占めている。

Ａ　１　ｃは安定型Ａ　１　ｃ　（ｓ　　Ａ　１ｃ　）
と不安定型Ａ　１　ｃ（ｌａｂｘｌｅ　　Ａｌｃ　；　
Ｑ−Ａ、ｃ）とからなる。このうち、１〜３ケ月前の血
糖値とよい相関を示すのはｓ−Ａ工Ｃである。Ｑ−Ａ工
Ｃは健常成人で空腹時の全Ａ　１ｃ　中１０〜１５％程
度であるといわれている。

このＱ　　Ａ、ｃはヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端とグルコ
ースの還元性末端とが可逆的にシッフ塩基結合したもの
であり、比較的短時間のうちに生成分解する。従って、
糖尿病患者は健常人よりもＱ−Ａｌｃの量が多く、全Ａ
、ｃに対し１０〜２０％にも及ぶことがある。また、空
腹時よりも食後の方が多くなり、採血時の状態に大きく
影響される。

一方、５−ＡｌＣはＱ　　Ａｘｅから徐々に持続的かつ
不可逆的に生成され、過去１〜３ケ月の血糖値レベルを
良く反映するといわれている。

従って、ｓ−Ａ工Ｃのみを分離して測定することが望ま
しいが、両者は構造的に極めて類似しており、液体クロ
マトグラフィでの分離はかなり難しい。

ｓ　　Ａｚｃのみを測定する方法として、（１）分離カ
ラムでｓ−Ａ工ＣとＱ−ＡｌＣとをクロマト的に分離・
定量する方法、（２）あらかじめ前処理によりΩ−Ａ工
Ｃを除去する方法の２通りがある。

分離カラムでＱ−ＡｌＣとｓ　　Ａ１（とを分離する方
法としては、長さの長い高分離能の分離カラムを用いて
、分離性能を向上させることが行われている。この方法
は前処理により除去する方法に比べてヘモグロビンが変
性しにくいという特長を有する。

一方、あらかじめ前処理により１２−Ａｌｃを化学的に
除去する方法としては、赤血球を生理食塩水あるいはセ
ミカルバジドとアニリンを含む緩衝液でふ置する方法（
スペセン他；ダイアベトロシア。

Ｐ、Ａ、　５ｖｅｎｄｓｅｎ、　ｅｔ、　ａｌ、　Ｄｉ
ａｂｅｔｏｌｏｇｉａ。

１９．１３０　（１９８０）と、ナタン他；クリニカル
ケミケトリ、　Ｄ、Ｍ、Ｎａｔｈａｎ、　ｅｔ、　ａｌ
、、Ｃ１１ｍ。

Ｃｈｅｍ、、２８，５１２　（１９８２））がある、こ
れらの方法は、（１−Ａｌｃが一時的に結合（シッフ塩
基結合）しているため、分解しやすいことに着目したも
のである。

また、市販のＱ　　Ａ１ｃ除去試薬を血液に加えてから
５０℃位で１〜２分間加熱してＱ　　ＡｌＣを除去する
方法が提案されている（例えば、特開昭６３−７５５５
８号公報、特開昭６３−３６１４３号公報、特開平１−
９７８５７号公報）９〔発明が解決しようとする課題〕しかしながら、上記従来技術のうち、分離カラムでρ−
Ａ　１ｃとｓ　　Ａ　１ｃとを分離する方法では、Ｑ　
　Ａｘｅとｓ　　Ａ　１（とを完全に分離するには１検
体あたり約１０〜６０分もの長い分析時間を要する。そ
のために多くの検体を処理することは不可能に近い。ま
た、カラムが長いので多くの充填剤を要するのでカラム
の価格が高くなるとともに、装置が大型化する欠点があ
る。

また、前処理によりＱ　　Ａ、ｃを除去する方法では、
前処理が煩雑であったり、前処理に３０分〜４時間を要
し、この場合も多くの検体を処理するには問題がある。

さらに、加熱処理を行う方法では、血液中のタンパクが
変性して、沈殿が生じて配管やフィルタなどが詰まった
場合に分析不可能になるという問題がある。

本発明の目的は、安定型Ａｒｃ　（ｓ　−Ａｒｃ）を他
のＨｂ酸成分ら短時間で分離することができるとともに
、配管やフィルタなどの詰まりを防止することができる
グリコヘモグロビンの分離方法および分離装置を提供す
ることである。

〔課題を解決するための手段〕

上記目的を達成するために、本発明の分離方法は、高速
液体クロマトグラフィにより、グリコヘモグロビンを各
成分に分離する場合に、試料中のグリコヘモグロビン、
ヘモグロビン、ヘモグロビン誘導体を分離する操作と、
前記試料中の不安定型ヘモグロビン成分を除去する操作
を並行して行うことである。

また、本発明の分離方法は、高速液体クロマトグラフィ
により、グリコヘモグロビンを各成分に分離する場合に
、少なくともグリコヘモグロビン、ヘモグロビン、ヘモ
グロビン誘導体を含む試料が分離カラムを通過する間に
、前記試料中の不安定型ヘモグロビンをグルコースとヘ
モグロビンとに分解させることにより、不安定型ヘモグ
ロビンを除去することである。

また、本発明の分離方法は、高速液体クロマトグラフィ
により、グリコヘモグロビンを各成分に分離する場合に
、カルボキシアルキル基を有する無機多孔性物質または
有機多孔性物質からなる充填剤とジヒドロキシボロニル
基を有する無機多孔性物質または有機多孔性物質からな
る充填剤とを混合した充填剤に前記溶離液を流通させる
ことにより、試料中の不安定型ヘモグロビンを分解して
除去するとともに、前記試料中のグリコヘモグロビン、
ヘモグロビン、ヘモグロビン誘導体を分離することであ
る。

また、本発明の分離方法は、高速液体クロマトグラフィ
により、グリコヘモグロビンを各成分に分離する場合に
、カルボキシアルキル基を有する無機多孔性物質または
有機多孔性物質からなる充填剤に溶離液を流通させ、引
き続きジヒドロキシボロニル基を有する無機多孔性物質
または有機多孔性物質からなる充填剤に前記溶離液を流
通させること、あるいは、これとは逆にジヒドロキシボ
ロニル基を有する無機多孔性物質または有機多孔性物質
からなる充填剤に溶離液を流通させ、引き続きカルボキ
シアルキル基を有する無機多孔性物質または有機多孔性
物質からなる充填剤に溶離液を流通させることにより、
前記試料中のグリコヘモグロビン、ヘモグロビン、ヘモ
グロビン誘導体を分離することである。

さらに、本発明は、分離カラムと、該分離カラムに試料
を注入する手段と、前記分離カラムに溶離液を流通させ
る手段と、前記分離カラムからの溶出液を検出する手段
とを備え、高速液体クロマトグラフィにより、グリコヘ
モグロビンを各成分に分離する分離装置において、前記
分離カラムに、試料中のグリコヘモグロビン、ヘモグロ
ビン、ヘモグロビン誘導体の分離と、前記試料中の不安
定型ヘモグロビンの除去とを並行して行う機能を持たせ
たものである。

また、本発明は、分離カラムと、該分離カラムに試料を
注入する手段と、前記分離カラムに溶離液を流通させる
手段と、前記分離カラムからの溶出液を検出する手段と
を備え、高速液体クロマトグラフィにより、グリコヘモ
グロビンを各成分に分離する分離装置において、前記分
離カラムに、カルボキシアルキル基を有する無機多孔性
物質または有機多孔性物質からなる充填剤と、ジヒドロ
キシボロニル基を有する無機多孔性物質または有機多孔
性物質からなる充填剤とを混合した充填剤を充填したも
のである。

また、本発明は、分離カラムと、該分離カラムに試料を
注入する手段と、前記分離カラムに溶離液を流通させる
手段と、前記分離カラムからの溶出液を検出する手段と
を備え、高速液体クロマトグラフィにより、グリコヘモ
グロビンを各成分に分離する分離装置において、前記分
離カラムに、カルボキシアルキル基を有する無機多孔性
物質または有機多孔性物質からなる充填剤と、ジヒドロ
キシボロニル基を有する無機多孔性物質または有機多孔
性物質からなる充填剤とを、溶離液の流れ方向に対して
二層に分けて充填したものである。

また、本発明は、分離カラムと、該分離カラムに試料を
注入する手段と、前記分離カラムに溶離液を流通させる
手段と、前記分離カラムからの溶出液を検出する手段と
を備え、高速液体クロマトグラフィにより、グリコヘモ
グロビンを各成分に分離する分離装置において、前記分
離カラムを溶離液の流れ方向に沿って２つに分け、一方
の分離カラムには、カルボキシアルキル基を有する無機
多孔性物質または有機多孔性物質からなる充填剤を充填
し、他方の分離カラムには、ジヒドロキシボロニル基を
有する無機多孔性物質または有機多孔性物質からなる充
填剤を充填したものである。

また、本発明の分離カラムは、カルボキシアルキル基を
有する無機多孔性物質または有機多孔性物質からなる充
填剤と、ジヒドロキシボロニル基を有する無機多孔性物
質または有機多孔性物質からなる充填剤とを混合した充
填剤を充填したものである。

また、本発明の分離カラムは、カルボキシアルキル基を
有する無機多孔性物質または有機多孔性物質からなる充
填剤と、ジヒドロキシボロニル基を有する無機多孔性物
質または有機多孔性物質からなる充填剤とを、溶離液の
流れ方向に対して二層に分けて充填したものである６また、本発明の分離カラムは、カルボキシアルキル基を
有する無機多孔性物質または有機多孔性物質からなる充
填剤を充填したものである。

また、本発明の分離カラムは、ジヒドロキシボロニル基
を有する無機多孔性物質または有機多孔性物質からなる
充填剤を充填したものである。

〔作用〕グリコヘモグロビン分析用分離カラムとして、カルボキ
シアルキル基及びジヒドロキシボロニル基を有する充填
剤を充填した分離カラムを用いることにより、Ω−Ａ□
Ｃ分解とＨｂの各成分への分離を同時に行うことができ
る。

ＧＨｂを高速液体クロマトグラフィ　（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）
にて分離する場合、充填剤として、シリカゲル、メタク
リレート系ゲル、ビニルアルコール系ゲルなどの親水性
の基材に、カルボキシメチル基などを導入した弱酸性陽
イオン交換樹脂が用いられる。

このイオン交換クロマトグラフィでは、等電点の差を利
用して、）（ｂを各成分に分離することができる。

一方、ジヒドロキシボロニル基を有する充填剤はアフィ
ニティクロマトグラフィに用いられている。ジヒドロキ
シボロニル基を有する充填剤を充填したカラムに溶離液
を流通させると、Ｑ　　ＡｘｅはＨｂＡ、とグルコース
とに分解される一ＱＡ１ｃは式（１）に示すようにＨｂ
のβ鎖Ｎ末端とグルコースの還元性末端とが可逆的に結
合したものであり、非常に不安定である。そこで、平衡
が右方向に進み、Ｑ　　Ａ、ｃは分解し、ＨｂＡ、とな
る。

通常、アフィニティクロマトグラフィでは、式（２）に
示すように、固定相に導入されたジヒドロキシボロニル
基と１．２−シスジオール基との特異的反応を利用して
、Ｈｂにグルコースなどの糖が結合したグリコヘモグロ
ビンとノングリコヘモグロビン（Ｈｂ）を分離する。な
お、この反応はｐＨ８以上で進行する。

Ｈここではジヒドロキシボロニル基を有する充填剤をグリ
コヘモグロビンとノングリコヘモグロビンとに分離する
ためではなく、Ｑ　　Ａ　１ｃをグルコースとＨｂとに
分解して除去する目的で使用しているため、ｐＨを８以
下、好ましくは７以下にすることが望ましい。

なお、ｐＨ８以上ではグリコヘモグロビンが特異的にジ
ヒドロキシボロニル基と結合し、充填剤に吸着される。

Ｈｂ＋ＧＨｂの等電点は６．９０から６．９５である。

（カルボキシアルキル基を導入した）弱酸性陽イオン交
換樹脂を用いたイオン交換クロマトグラフィによりＨｂ
やＧＨｂを分離する場合、溶離液としてはＨｂやＧＨｂ
の等電点よりも低いｐＨのものを用いなければならない
。従って、グリコヘモグロビンがジヒドロキシボロニル
基と結合することはない。

このようにカルボキシアルキル基とジヒドロキシボロニ
ル基とを有する充填剤を用いることにより、生理的要因
、食事等により変動しゃすいＱ−Ａ　ｚ　ｃの影響を受
けることなく、ｓ　−Ａｌｃを分離定量することができ
る。

分離カラムとしては、カルボキシアルキル基とジヒドロ
キシボロニル基との両方の官能基を有する充填剤を充填
したカラムを用いることができる。

また、ジヒドロキシボロニル基を有する充填剤を充填し
たカラムでΩ−Ａ　１　ｃを除去した後、カルボキシア
ルキル基を有する充填剤を充填した分離カラムでＨｂを
各成分に分離することもできる。

逆に、カルボキシアルキル基を有する充填剤を充填した
カラムでＨｂを各成分に分離した後、ジヒドロキシボロ
ニル基を有する充填剤を充填したカラムでｕ−Ａｌｃを
除去することもできる。

さらに、ジヒドロキシボロニル基を有する充填剤とカル
ボキシアルキル基を有する充填剤を混合して、あるいは
段階的に（重ねて）充填した分離カラムを用いてもよい
。

水沫では従来イオン交換クロマトグラフィで用いていた
溶離液をそのまま用いることができる。

従って、溶離条件の検討は特に必要がない。

また、前処理によりＱ　　Ａｘｃを除去する必要がない
ので、分析操作が容易であり、かつ分析時間も前処理時
間が必要ない分短くてすむ。また、Ｑ−Ａ１ｃ以外のＨ
ｂやＧＨｂの分解や変性も起こらない。

従って、このような分離カラムを用いた本発明のグリコ
へモーグロビンの分離方法では、血液中の安定型Ａｚｃ
　（ｓ　　Ａｔｅ）を生理的要因により値の変動する不
安定型Ａ１ｃ　（Ｑ　　ＡＸｃ）の影響をうけることな
く、迅速、安定（再現性良く）かつ容易に分析できる。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例を図面を用いて説明する。

本発明の充填剤としては、１つの粒子に官能基としてカ
ルボキシアルキル基とジヒドロキシボロニル基が導入さ
れているものを使用できる。また、カルボキシアルキル
基が導入された充填剤とジヒドロキシボロニル基が導入
された充填剤を同一のカラムに充填した分離カラムを用
いてもよい。またさらに、カルボキシアルキル基が導入
された充填剤とジヒドロキシボロニル基が導入された充
填剤を各々の別のカラムに充填したカラムを用いてもよ
い。

カルボキシアルキル基及び／またはジヒドロキシボロニ
ル基を導入する母材（基体）としては、従来から液体ク
ロマトグラフィに用いられている母材を用いることがで
きるが、機械的強度が強い、タンパク質の非特異的吸着
が少ない（疎水性が強くない）、化学的に安定であるも
のが望ましい。

このような条件をみたす母材として、メタクリレ−ト系
ゲル、ビニルアルコール系ゲルなどの親水性の有機多孔
性物質（架橋重合体）を用いることができる。また、溶
離液としてｐＨ７以下の緩衝液を使用するので、シリカ
ゲルなどの無機多孔性物質を用いることもできる。

上述したような母材にジヒドロキシボロニル基を導入す
る方法としては、次の方法をあげることができる。上記
の母材とエピハロヒドリン、ビスエポキシド等を反応さ
せ、次いで、メタアミノフェニルボロン酸を反応させる
ことにより得ることができる。また、母材の水酸基に公
知の方法でカルボキシアルキル基を導入し、次いで、該
カルボキシアルキル基をアザイドに変換した後、メタア
ミノフェニルボロン酸と反応させることによっても得る
ことができる。さらにまた、母材の水酸基にブロムシア
ンを反応させ、次いで、オリゴペプチドを反応させ、さ
らにカルボジイミド存在下に、メタアミノフェニルボロ
ン酸を反応させることによっても得ることができる。

カルボキシアルキル基を導入する方法としては、例えば
、モノクロロ酢酸やモノブロモ酢酸等のハロゲン化酢酸
を上記母材の水酸基に反応させる方法をあげることがで
きる。

カルボキシアルキル基の導入量は充填剤の乾燥重量１ｇ
あたり０．１〜１　ｍｅｑが望ましい。また。

ジヒドロキシボロニル基の導入量は充填剤の乾燥重量１
ｇあたり０．１〜１　ｍｅｑが望ましい。

ジヒドロキシボロニル基の定量は、例えば、ジヒドロキ
シボロニル基を有する充填剤とソルビトールを水溶液中
に共存させ、アルカリによる滴定で求めることができる
（新実験化学講座、分析化学１．Ｐ、７７、丸首）。ま
た、ジヒドロキシボロニル基を有する充填剤を過酸化水
素で処理し、遊離するホウ酸の量を前述の滴定により求
めることができる。さらにまた、ホウ酸の量を原子吸光
や発光法などにより求めてもよい。カルボキシアルキル
基は通常行われている従来公知のカルボキシル基の交換
容量の測定法により求めることができる。

カルボキシアルキル基を有する充填剤としてはカルボキ
シメチル基、カルボキシエチル基など種々の充填剤を用
いることができるが、さらに好ましくはカルボキシメチ
ル基を有する充填剤を用いることができる。

本発明において用いられる充填剤の形状として、球状、
破砕状など種々あげることができるが、高分能を得るに
は球状の方が望ましい。充填剤の粒径は１〜２００μｍ
、好ましくは１〜２０μｍ。

さらに好ましくは１〜ｌＯμｍとするのがよい。

本発明のカラムとしては、内径１〜１０醜、長さ２０ａ
ａ以下、好ましくは内径１〜６ｍ、長さ２〜１０ａ１の
円筒形のものが望ましい。

カラムへ充填剤を充填する方法は、均一な状態に充填で
き、充填率を制御できる方法であれば従来公知の方法で
よい、充填率は充填時の圧力、充填時間を調整すること
により制御できる。

溶離液としては、ｐＨ５，０〜７．０の緩衝液であれば
通常グリコヘモグロビンを液体クロマトグラフィで分析
するときに用いられる溶離液でよい。

例えば、酢酸ナトリウム系、リン酸ナトリウム系、リン
酸カリウム系のような緩衝液、あるいは塩化ナトリウム
や硫酸ナトリウムのような塩を含む溶液が用いられる。

なお、尿素やグアニジンを添加してもよい。また、アセ
トニトリル、エタノール、メタノール、メルカプトエタ
ノール等の有機溶媒を混合してもよい。

溶離液の組成、例えば緩衝剤、塩、尿素、有機溶媒等の
濃度やｐＨは、液体クロマトグラフィにより、ヘモグロ
ビン、グリコヘモグロビン、ヘモグロビン誘導体を分析
する際、必ずしも一定である必要はない。例えば、連続
的勾配方式あるいは段階的勾配方式よって変化させるこ
ともできる。

また、溶離液の送液流量も一定である必要はなく、時間
経過に従って連続的あるいは段階的に変化させることが
できる。

本発明の分離カラムにより分離された溶出液中のグリコ
ヘモグロビン、ヘモグロビン及びヘモグロビン誘導体は
波長４１５−の可視光を測定することにより検出できる
。また、溶離液のｐＨや濃度を変化させる場合、屈折率
の変化によって吸収が起こるので、リファレンスとして
グリコヘモグロビン、ヘモグロビン等の吸収のない波長
（６９０ｍ＋）の可視光を測定してもよい。

次に、本発明を実施例を用いて、さらに詳細に説明する
。

（実施例１）充填剤としては、メタクリレート系ポリマを母材とし、
これに官能基としてカルボキシメチル基とジヒドロキシ
ボロニル基を導入した充填剤を使用した。

第１表は実施例１とその比較例１について、充填剤の物
性値及び圧力損失を測定した結果を示している。実施例
１の充填剤は比較例１のカルボキシメチル基を有する充
填剤に、さらにジヒドロキシボロニル基を導入したもの
である。実施例１と比較例１では粒径、比表面積やカル
ボキシメチル基の量などはほぼ等しい。すなわち、ジヒ
ドロキシボロニル基を導入しても、粒径、比表面積、カ
ルボキシメチル基の量はあまり変化していない。

これら２種の充填剤を各々カラム（内径４．６ｍ、長さ
８０ｍｍ、ステンレスＩＢ）に充填し、分離カラムとし
て用いた。充填はいずれもスラリー法に依った。スラリ
ー溶媒及び充填溶媒としては、８０ｍＭリン酸カリウム
（ＰＨ６，２０）を使用し、充填圧力１５０ｋｇｆ／ｃ
ｄにて充填溶媒を１時間送液した。

（以下余白）試料としては抗凝固剤としてエチレンジアミン四酢酸ナ
トリウム液を添加して採血した健常成人の新鮮血を用い
た。この新鮮血に市販の溶血剤を加えて２００倍に希釈
し、この溶血液を試料として用いた。

溶離液としては、リン酸−カリウム（ＫＨ。

ｐｏ、）及びリン酸二カリウム（Ｋ２ＨＰ　Ｏ４）を下
記濃度になるように脱液水に溶解したものを使用した。

Ａ液；　　３３ｍＭ　　　ＫＨ，ＰＯ４７ｍＭ　　　Ｋ
、ＨＰＯ。

ｐＨ６，２Ｂ液；　　６６ｍＭ　　　ＫＨ２Ｐ０゜１４ｍＭ　　　
Ｋ、ＨＰＯ４ｐＨ６，２Ｃ液；　１６０　ｎｉ　Ｍ　　　Ｋ　Ｈｙ＝　Ｐ　Ｏ−
４０ｍＭ　　　Ｋ、ＨＰＯ４ｐＨ６，１実験装置としては、ポンプは日立製Ｌ−６２００形イン
テリジェントポンプを、インジェクタは容量１０μＱの
ものを、検出器は日立製Ｌ−４２００形ＵＶ−ＶＩＳ検
出器を、データ処理装置は日立製Ｄ−２５００形データ
処理装置をそれぞれ使用した。

カラム温度は２５℃、検出波長４１５ｎｍにて測定を行
った。各成分の分離は下に示すようなステップワイズグ
ラジェント法に依った。

第１液：Ａ液　　　　　　　　　　Ｏ〜０．４分第２液
：Ａ液／Ｂ液＝５０１５０　０．５〜３．０分第３液：
Ｃ液　　　　　　　　　３．１〜３．８分第１液：Ａ液
　　　　　　　　　３．９〜７．０分溶離液流量：１．
２ｍ１２／ｍｉｎ試料の注入量＝１０μα 上記分析条件で、実施例１の分離カラムにより得られた
クロマトグラムを第１図に、比較例１の分離カラムによ
り得られたクロマトグラムを第２図に示す。

第１図及び第２図において、ピーク１はＡ　１　ａ、ピ
ーク２はＡｉｂ、ピーク３はＨｂＦ、ピーク４は安定型
Ａ　、　ｃ　（ｓ　　Ａ　、ｃ　）、ピーク５はＨｂＡ
ｃ、ピーク６は不安定型Ａｚｃ　（Ｑ　　Ａ工Ｃ）をそ
れぞれ示している。

各ピークの同定は以下のように行った、血液と糖誘導体
とをふＷ（インキュベート）することにより、種々のグ
リコヘモグロビンを生成させることができるが、このと
き増大するピークを確認することにより、各ピークの同
定が可能である。

フルクトース−１，６−ニリン酸、グルコース−６−リ
ン酸の添加によりピーク１　（Ａ、＆）が確認され、ピ
ルビン酸の添加によりピーク２　（Ａｉｂ）が確認され
た。また、血液にグルコースを添加してインキュベート
した後に試料を調製して測定したところピーク６が顕著
に増大したこと、またグルコースを添加してインキュベ
ートした血液をさらに生理食塩水中で４５℃で４ｈｒイ
ンキユベート後、試料を調製して測定したところピーク
６が減少したことから、ピーク６はＱ−Ａ工。であると
考えられる。なお、ピーク４は上記したようなグルコー
スの添加、生理食塩水中のインキュベートにより、増減
がみられなかったことから、ｓ　−Ａ　１ｃであると考
えられる。また、ピーク３はさい帯血の主成分と同じ挙
動を示すことからＨｂＦであると考えられる。

第２図の比較例１の場合ではＱ　　Ａｌｃのピーク６が
出現している。一方、第１図では、実施例１の分離カラ
ムを用いた場合、完全にＱ　　Ａｘｅが除去されている
。なお、実施例１と比較例１の分離カラムで、Ａ４ａｌ
　Ａ１ｂ＋　Ｈｂ　Ｆ　、　ｓ　　Ａ４ｃ及びＨｂＡｏ
の各成分の保持時間はほぼ等しい。カラムの圧力損失（
溶離液流量：　１．２ｍＡ／ｍｉ　ｎ）は実施例１の場
合９８ｋｇｆ／ａ＆、比較例１の場合９５ｋｇｆ／ｊで
ありほぼ等しかった。

このように本実施例によれば、Ｑ　　Ａｌｅの除去（分
解）とＨｂの各成分への分離を同時に行うことができる
ので、従来長い時間（１５分〜４時間）を要していたＱ
　　Ａ、ｃの除去処理の時間を短縮することが可能であ
る。また、システム内で連続的にＱ　　Ａｌｃを除去で
きるので、従来のような煩雑な操作が不要となる。さら
に、Ω−Ａ　ｉｃの分解に要する時間が短いので、Ｑ　
　Ａｘｅの除去処理に伴って、ＧＨｂやＨｂが変性した
り、分解したりすることがなく、正確な測定値（ｓ　　
Ａｒｃの値）を得ることができる。

また、本実施例によれば、第１図より実施例１の分離カ
ラムでＨｂの各成分が充分に分離されていることが判る
。その結果、さらに短いカラムを用いたり、溶離液の流
量を大きくしたりすることにより、分析時間を一層短縮
することができる。

（実施例２）第２表は実施例２とその比較例２について、充填剤の物
性値及び圧力損失の値を示している。実施例２及び比較
例２の分離カラムは、各々前述した実施例１及び比較例
１の充填剤を短いカラム（φ４．６Ｘ３５ｍ＋）に充填
したものである。充填法は実施例１と同様の方法で行っ
た。

実施例、２及び比較例２の分離カラムを用いて、グリコ
ヘモグロビン、ヘモグロビンを測定した。

装置は実施例１と同じものを用いた。また、試料も実施
例１と同じものを使用した。各成分の分離は以下に示す
ようなステップワイズグラジェント法に依った。使用す
る溶離液Ａ液、Ｂ液、Ｃ液の組成は実施例１と同じであ
るが、グラジェントのプログラム、溶離液の流量が実施
例１と異なる。

第１液：Ａ液　　　Ｏ〜０．２分第２液：Ｂ液　　　０．３〜１．５分第３液：Ｃ液　　　　１．６〜１．９分第４液：Ａ液　
　　　２．０〜３．５分溶離液流量：１．４ｍ＋２／ｍ
１ｎ（以下余白）上記分析条件により、実施例２のカラムで得られたクロ
マトグラムを第３図に、比較例２のカラムで得られたク
ロマトグラムを第４図にそれぞれ示す、実施例２及び比
較例２のカラムの圧力損失（溶離液流量：　１，４ｍ１
２／ｍｉ　ｎ）は各々４８ｋｇｆ／ａＪ、４７ｋｇｆ／
ｆｆｌであった。

第３図において、ピーク１がＡ１□、ピーク２がＡ　１
　ｂ　ｇ　ピーク３がＨｂＦ、ピーク４がＳ　　Ａｚｃ
。

ピーク５がＨ・ｂＡ、を示す。また、第４図において、
ピーク１がＡ１＆、ピーク２がＡ１５．ピーク３はＨｂ
Ｆ、ピーク７が（Ｑ　−Ａ、ｃ　十ｓ　−Ａ、ｃ）　？
ピーク５がＨｂＡ、を示す。

第３図と第４図で各成分の保持時間はほぼ等しい、また
、第３図のピーク４　（Ｓ　　ＡＩＣ）と第４図のピー
ク７　（Ｑ　−Ａ１ｃ＋　５−Ａｉｃ）の保持時間も等
しい、ピーク面積はピーク７の方がピーク４に比べて１
０％程度大きい、第４図のピーク７の保持時間は第３図
のピーク４の保持時間と等しいが、ピーク７には７１　
　Ａ、ｃも含まれているので、その分ピーク面積が大き
くなったものと考えられる。

６ｏ検体の試料について、実施例２及び比較例２の方法
でクロマトグラムを測定し、ピーク４（ｓ−Ａ、ｃ）と
ピーク７　（Ｑ　　ＡＩＣ＋　ｓ　　Ａ、ｃ）の面積を
比較したところ、平均で６．８％（範囲：３〜１２％）
だけピーク７の面積の方が大きかった。ここでは空腹時
のグリコヘモグロビンの値を測定したが、食事をした直
後はさらにＱ　　Ａｉｃの割合が大きくなることが考え
られる。

実施例２（第３図）では、Ｑ　　Ａ、ｃを分離カラム内
で分解しているので３．５分でＡ　１ａ　Ｔ　Ａ　１ｂ
　ｙＨｂ　Ｆ　、　ｓ　　Ａｘｃ、Ｈｂ　Ａｏの５成分
を分離でき、ｓ−Ａ、Ｃの量を測定できる。一方、比較
例１（第２図）のようにｎ　　ＡＩＣとｓ　　Ａｒｃを
クロマト的に分離する場合は、同じ充填剤を用いた場合
、実施例２に比べて長いカラムを用いる必要があり、そ
の分、分析時間が長くなる。第２図より、比較例１の場
合に１検体の測定に要する時間は７分であり、実施例２
（第３図）の２倍の時間を要する。

以上のように、本実施例によれば、Ｑ　　Ａｌｃとｓ　
　Ａｌｃをクロマト的に分離する方法に比べて、短い時
間でｓ−Ａ、ｃの定量を行うことができる。

また、カラム長さが短い分、充填されている充填剤の量
が少ないので、カラムの価格が安くなる。

さらにまた、１検体あたり使用する溶離液の量が少なく
てすみ、ランニングコストの低減を図ることもできる。

ここで、実施例２の分析方法での測定値と比較例１の分
析方法での測定値の比較を行った。

試料としては健常成人及び糖尿病患者の抗凝固剤の入っ
た新鮮血を溶血剤で希釈したものを用いた。６０例につ
いて測定した結果を第５図に示す。

図の横軸は実施例２の方法により測定したＳ−Ａ　１　
ｃの濃度（％）、縦軸は比較例１の方法により測定した
５−Ａｌｃの濃度（％）を示す。

実施例２の方法と比較例１の方法の相関係数γは０．９
９２であった。また、相関式は実施例２の方法で得られ
たｓ　　Ａｒｃの濃度をＸ、比較例１の方法で得られた
ｓ　　Ａｒｃの濃度をＹとした場合、Ｙ＝１．０３Ｘ−
０，３１で示され、２つの方法の間で非常に良い相関が
得られた。

以上のように実施例２の方法は、血液中の安定型Ａ、ｃ
　（ｓ　　Ａｌｃ）を迅速に、かつ精度良く分析できる
方法であると考えられる。

（実施例３）第６図は本発明のグリコヘモグロビンの分離装置の一例
を示している。

試料としては抗凝固剤としてエチレンジアミン四酢酸ナ
トリウム塩を添加して採血した新鮮血を用いた。この血
液を市販の溶血剤で２００倍に希釈し、これをオートサ
ンプラ２０のサンプルテーブル１９にセットした。

分離カラム２３としては比較例２で用いたものと同じも
のを使用した。カラムサイズは内径４．６ｍ、長さ３５
ｍｍである。充填剤はメタクリレート系ゲルにカルボキ
シメチル基を導入したものを用いた（粒径４．５μｍ）
。また、前処理カラム２２（Ｑ　Ａ１ｃ除去カラム）と
してはメタクリレート系ゲルにジヒドロキシボロニル基
を導入した充填剤（粒径８μｍ）を用いた。前処理カラ
ムのサイズは内径４．６＋ｍ＋、長さ１０圃である。

実施例２で用いたカラム（メタクリレート系ゲルにカル
ボキシメチル基とジヒドロキシボロニル基を導入したも
の、粒径４．５μｍ）を使用する場合は、このカラム１
本でΩ−Ａ　ｉｃの除去とＨｂの各成分への分離を行う
ので、前処理カラム２２は必要ない。カラム恒温槽２４
の温″度は３０℃に設定した。溶離液としては実施例２
で示した１液８．２液９．３液１ｏを使用した。

第６図中、実線の矢印は試料あるいは溶離液等の液体の
流れを示す。一方、鎖線の矢印は信号の流れを示す。

各成分の分離は以下に示すようなステップワイズグラジ
ェント法に依った。

１液：Ａ液　　　Ｏ〜０．２分２液：　ＢＭ　　　　Ｏ，３〜１．５分３液：Ｃ液　　
　１．６〜１．９分１液：Ａ液　　　２．０〜３．５分溶離液流量：１．４ｍＱ／ｍｉｎサンプルテーブル１９にセットされた試料は、吸引ノズ
ル１８と試料輸送管２７を介して、シリンジ１４によっ
てサンプルループ１６に入り、計量される。洗浄液１１
は３方バルブ１５を介して供給される。６方バルブ１７
を切替ることによって、サンプルループ１６にて計量さ
れた試料はフィルタ２１を通って、前処理カラム２２に
送られ、引き続き分離カラム２３に入る。

溶離液第１液８、第２液９、第３液１０は３方電磁弁１
２を介して送液ポンプ１３によって、フィルタ２１を通
って、前処理カラム２２に送られた後、分離カラム２３
に供給される。分離カラム２３からの溶出液をＵＶ−Ｖ
Ｉ　Ｓ検出器２５で波長４１５ｎｍ及び６９０ｎｍ　（
リファレンス測定用）における吸光度を測定した。

このグラジェント条件では、第３図に示したようなりロ
マトグラムを得ることができる。すなわち、第３図のよ
うにヘモグロビンを１サイクル３．５分でＡｘａ＝　Ａ
−ｂ、Ｈｂ　Ｆ　、ｓ　　Ａｘｃ及びＨｂ　Ａｏに分離
できる。クロマトグラムよりデータプロセッサ（データ
処理装置）２６にて、ト一タルのＨｂに対するｓ　　Ａ
　１ｃの割合（百分率）を求めた。

このように本発明は、Ｑ　　Ａ、ｃの除去をシステム内
にて連続的に行うことができるので、自動化が容易であ
る。また、自動的にΩ−ＡＩＣを除去できるので、測定
精度がよい（測定値の再現性がよい）。また、操作が簡
単である。

第７図に本発明の装置の主なシステム構成を、第８図に
比較例３の装置のシステム構成の一様態例を示す。第８
図に示すように、比較例３ではオートサンプラのサンプ
ルテーブル１９にセットされた試料は試料輸送管２７を
介してサンプルループ１６にて計量された後、６方バル
ブ１７を切替ることにより、試料はＱ−Ａよ。除去部２
８に導入される。そしてＱ　　Ａ１ｃ除去部２８にて加
熱処理などをすることにより、血液中のΩ−Ａ　１ｃが
除去あるいは低減される。ρ−Ａ　１（が除去された試
料は分離カラム２３に入る。一方、溶離液８〜９は３方
電磁弁１２を介し送液ポンプ１３によって分離カラム２
３に供給される。分離カラム２３からの溶出液をＵＶ−
ＶＩＳ検出器２５にて検出する。

このように、比較例３の分離カラムに充填されている充
填剤は例えばシリカゲルやメタクリレート系ゲルにカル
ボキシル基を導入したイオン交換樹脂であり、Ｑ　　Ａ
、ｃの除去作用を有さないので、カラムに注入する前に
ａ　−Ａｌｃの除去部を設けなければならない。これに
対して１本発明の分離カラムはヘモグロビンやグリコヘ
モグロビンの分離とＲ−Ａｘｃの除去と２つの作用を有
するので、第７図に示すように、Ω−Ａ　１　ｃの除去
機構を設ける必要がない。従って、本発明の装置の方が
装置構成が単純であり、装置を小型化できる。

〔発明の効果〕

本発明によれば、Ｑ　　Ａｌｃの除去とＨｂの各成分へ
の分離を同一の分離カラムにて、あるいはシステム内で
連続的に行うことができるので、従来長い時間（１５分
〜４時間）を要していたｎ−Ａ　１　ｃの分解に要する
時間を短縮することができる。

また、Ｑ　　Ａｌｃを除去するための煩雑な処理を行う
必要がないので、操作が非常に簡単になる。

さらに、ρ−Ａ　１ｃの分解とともに他のＧＨｂやＨｂ
が変性することがないので、正確な測定値（ｓ　　Ａｌ
ｃの値）を得ることができる。

さらにまた、Ｑ−Ａ工Ｃの除去をシステム内にて連続的
に行うことができるので、自動化が容易となりこれによ
り、測定精度や測定値の再現性が向上する。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で得られたクロマトグラム、第２図は
比較例１で得られたクロマトグラム、第３図は実施例２
で得られたクロマトグラム、第４図は比較例２で得られ
たクロマトグラム、第５図は実施例２の方法で測定した
安定型Ａ１ｃ（ｓ−Ａ、Ｃ）の値と比較例１の方法で測
定した５−Ａｚｃの値の相関関係を示す図であり、第６
図は本発明の分析装置の一様態例であり、第７図は本発
明の分離装置の要部構成図、第８図は比較例３の分離装
置の要部構成図である。１・・・Ａｌａ、２・４１ｔ、、３　・Ｈｂ　Ｆ、４・
・・安定型Ａ、ｃ　（ｓ　−Ａｌｃ）　、　５−　Ｈｂ
　Ａ、、６・・・不安定型Ａｘｃ　（（ｌ　　　Ａｘｅ
）−７・・・　（１２Ａｚｃ＋　５−Ａｌｃ）−８・・
・溶離液１．９・・・溶離液２．１０・・・溶離液３．
１１・・・洗浄液、１２・・・三方電磁弁、１３・・・
送液ポンプ、１４・・・シリンジ、１５・・・３方バル
ブ、１６・・・サンプルループ、１７・・・６方バルブ
、１８・・・吸引ノズル、１９・・・サンプルテーブル
、２０・・・オートサンプラ、２１・・・フィルタ、２
２・・・前処理カラム（Ｑ　　Ａ１ｃ除去カラム）２３
・・・分離カラム、２４−・・恒温槽、２５・ＵＶ−Ｖ
ＩＳ検出器、２６・・・データプロセッサ、２７・・・
試料輸送管、２８・・・Ｑ　　Ａ、ｃ除去反応部。

Claims

【特許請求の範囲】１、高速液体クロマトグラフィにより、グリコヘモグロ
ビンを各成分に分離する場合に、試料中のグリコヘモグ
ロビン、ヘモグロビン、ヘモグロビン誘導体を分離する
操作と、前記試料中の不安定型ヘモグロビン成分を除去
する操作を並行して行うグリコヘモグロビンの分離方法
。２、高速液体クロマトグラフィにより、グリコヘモグロ
ビンを各成分に分離する場合に、少なくともグリコヘモ
グロビン、ヘモグロビン、ヘモグロビン誘導体を含む試
料が分離カラムを通過する間に、前記試料中の不安定型
ヘモグロビンをグルコースとヘモグロビンとに分解させ
ることにより、不安定型ヘモグロビンを除去するグリコ
ヘモグロビンの分離方法。３、高速液体クロマトグラフィにより、グリコヘモグロ
ビンを各成分に分離する場合に、カルボキシアルキル基
を有する無機多孔性物質または有機多孔性物質からなる
充填剤とジヒドロキシボロニル基を有する無機多孔性物
質または有機多孔性物質からなる充填剤とを混合した充
填剤に溶離液を流通させることにより、試料中の不安定
型ヘモグロビンを分解して除去するとともに、前記試料
中のグリコヘモグロビン、ヘモグロビン、ヘモグロビン
誘導体を分離するグリコヘモグロビンの分離方法。４、高速液体クロマトグラフィにより、グリコヘモグロ
ビンを各成分に分離する場合に、カルボキシアルキル基
を有する無機多孔性物質または有機多孔性物質からなる
充填剤に溶離液を流通させ、引き続きジヒドロキシボロ
ニル基を有する無機多孔性物質または有機多孔性物質か
らなる充填剤に前記溶離液を流通させることにより、前
記試料中のグリコヘモグロビン、ヘモグロビン、ヘモグ
ロビン誘導体を分離するグリコヘモグロビンの分離方法
。５、高速液体クロマトグラフィにより、グリコヘモグロ
ビンを各成分に分離する場合に、ジヒドロキシボロニル
基を有する無機多孔性物質または有機多孔性物質からな
る充填剤に溶離液を流通させ、引き続きカルボキシアル
キル基を有する無機多孔性物質または有機多孔性物質か
らなる充填剤に前記溶離液を流通させることにより、前
記試料中のグリコヘモグロビン、ヘモグロビン、ヘモグ
ロビン誘導体を分離するグリコヘモグロビンの分離方法
。６、請求項３、４又は５記載のグリコヘモグロビンの分
離方法において、前記溶離液は、ｐＨ５〜７の緩衝液で
あることを特徴とするグリコヘモグロビンの分離方法。７、分離カラムと、該分離カラムに試料を注入する手段
と、前記分離カラムに溶離液を流通させる手段と、前記
分離カラムからの溶出液を検出する手段とを備え、高速
液体クロマトグラフィにより、グリコヘモグロビンを各
成分に分離する分離装置において、前記分離カラムに、
試料中のグリコヘモグロビン、ヘモグロビン、ヘモグロ
ビン誘導体の分離と、前記試料中の不安定型ヘモグロビ
ンの除去とを並行して行う機能を持たせたことを特徴と
するグリコヘモグロビンの分離装置。８、分離カラムと、該分離カラムに試料を注入する手段
と、前記分離カラムに溶離液を流通させる手段と、前記
分離カラムからの溶出液を検出する手段とを備え、高速
液体クロマトグラフィにより、グリコヘモグロビンを各
成分に分離する分離装置において、前記分離カラムに、
カルボキシアルキル基を有する無機多孔性物質または有
機多孔性物質からなる充填剤と、ジヒドロキシボロニル
基を有する無機多孔性物質または有機多孔性物質からな
る充填剤とを混合した充填剤を充填したことを特徴とす
るグリコヘモグロビンの分離装置。９、分離カラムと、該分離カラムに試料を注入する手段
と、前記分離カラムに溶離液を流通させる手段と、前記
分離カラムからの溶出液を検出する手段とを備え、高速
液体クロマトグラフィにより、グリコヘモグロビンを各
成分に分離する分離装置において、前記分離カラムに、
カルボキシアルキル基を有する無機多孔性物質または有
機多孔性物質からなる充填剤と、ジヒドロキシボロニル
基を有する無機多孔性物質または有機多孔性物質からな
る充填剤とを、溶離液の流れ方向に対して二層に分けて
充填したことを特徴とするグリコヘモグロビンの分離装
置。１０、分離カラムと、該分離カラムに試料を注入する手
段と、前記分離カラムに溶離液を流通させる手段と、前
記分離カラムからの溶出液を検出する手段とを備え、高
速液体クロマトグラフィにより、グリコヘモグロビンを
各成分に分離する分離装置において、前記分離カラムを
溶離液の流れ方向に沿って２つに分け、一方の分離カラ
ムには、カルボキシアルキル基を有する無機多孔性物質
または有機多孔性物質からなる充填剤を充填し、他方の
分離カラムには、ジヒドロキシボロニル基を有する無機
多孔性物質または有機多孔性物質からなる充填剤を充填
したことを特徴とするグリコヘモグロビンの分離装置。１１、カルボキシアルキル基を有する無機多孔性物質ま
たは有機多孔性物質からなる充填剤と、ジヒドロキシボ
ロニル基を有する無機多孔性物質または有機多孔性物質
からなる充填剤とを混合した充填剤を充填した分離カラ
ム。１２、カルボキシアルキル基を有する無機多孔性物質ま
たは有機多孔性物質からなる充填剤と、ジヒドロキシボ
ロニル基を有する無機多孔性物質または有機多孔性物質
からなる充填剤とを、溶離液の流れ方向に対して二層に
分けて充填した分離カラム。１３、カルボキシアルキル基を有する無機多孔性物質ま
たは有機多孔性物質からなる充填剤を充填した分離カラ
ム。１４、ジヒドロキシボロニル基を有する無機多孔性物質
または有機多孔性物質からなる充填剤を充填した分離カ
ラム。１５、請求項１１又は１２記載の分離カラムにおいて、
前記充填剤は、乾燥状態での比表面積が５〜２００ｍ＾
２／ｇ、乾燥重量１ｇあたりのカルボキシアルキル基の
量が０．１〜１ｍｅｑ、ジヒドロキシボロニル基の量が
０．１〜１ｍｅｑであることを特徴とする分離カラム。１６、請求項１３記載の分離カラムにおいて、前記充填
剤は、乾燥状態での比表面積が５〜２００ｍ＾２／ｇ、
乾燥重量１ｇあたりのカルボキシアルキル基の量が０．
１〜１ｍｅｑであることを特徴とする分離カラム。１７、請求項１４記載の分離カラムにおいて、前記充填
剤は、乾燥状態での比表面積が５〜２００ｍ＾２／ｇ、
乾燥重量１ｇあたりのジヒドロキシボロニル基の量が０
．１〜１ｍｅｑであることを特徴とする分離カラム。