JPH1010113A - カルバミル化ヘモグロビンと糖化ヘモグロビンの同時定量方法及びカルバミル化ヘモグロビンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 カルバミル化ヘモグロビン（ＣＨｂ）の影響
を受けずに糖化ヘモグロビンを測定できると共に、ＣＨ
ｂをも同時に定量的に測定できるＣＨｂと糖化ヘモグロ
ビンの同時定量方法を提供すること、及び上記測定法に
おいて管理用標準物質として用い得る、変性の少ないＣ
Ｈｂの製造方法を提供する。 【解決手段】 カチオン交換クロマトグラフィーを用い
ることを特徴とするカルバミル化ヘモグロビンと糖化ヘ
モグロビンの同時定量方法、及び血液とシアン酸塩の生
理的食塩水溶液とを混合し、血液中のヘモグロビンとシ
アン酸塩とを反応させることを特徴とするカルバミル化
ヘモグロビンの製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】請求項１記載の発明は、液体
クロマトグラフィーによるカルバミル化ヘモグロビンと
糖化ヘモグロビンの同時定量方法に関する。請求項２記
載の発明は、カルバミル化ヘモグロビンの製造方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】糖化ヘモグロビンは血液中の糖がその濃
度に比例して赤血球に入った後に、ヘモグロビンと結合
して生成したものであり、その濃度は過去１〜２カ月間
の血液中の平均的な糖濃度を反映すると言われている。
そして血糖値や尿糖値に比べ生理的要因に左右されにく
いので、血液中の糖化ヘモグロビンの濃度は、糖尿病の
診断又は糖尿病患者の経過観察の最適な指標として使用
されている。このため、臨床検査分野において液体クロ
マトグラフィーによる糖化ヘモグロビンの測定が広く行
われている。

【０００３】上記糖化ヘモグロビンの測定は、血液を溶
血して赤血球中の糖化ヘモグロビンを赤血球から取り出
した溶血液試料を用い、カチオン交換樹脂が充填された
分離カラムを使用した液体クロマトグラフィーにより測
定されている（特開平２−３０９２５３号公報）。

【０００４】カルバミル化ヘモグロビン（以下、ＣＨｂ
という）は、血漿中の尿素由来のシアン酸イオンから生
じたイソシアン酸がヘモグロビンのＮ末端に反応して生
成される。血液透析によって尿素窒素を除去する際に、
尿素窒素のモニターの代わりにＣＨｂをモニターするこ
との有意性が報告されている。これは、尿素窒素の測定
法がバラツキの大きい測定法なので、バラツキの少ない
測定法が開発されているＣＨｂをモニターする方がより
有効であるためである。

【０００５】ＣＨｂの測定方法としては、Clinical Che
mistry,Vol.39,No.12,2514-2518(1993) にカチオン交換
液体クロマトグラフィーによる方法が記載され、これに
よるとＣＨｂが糖化ヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ
１ｃという）近辺に溶出されることが記載されている
が、ＣＨｂと糖化ヘモグロビンの両方を同時に定量的に
測定する方法については記載されていない。なお、ＣＨ
ｂと糖化ヘモグロビンの両方を同時に定量的に測定する
ことには、以下の点に有用性がある。すなわち、腎臓障
害は、糖尿病の重要な合併症の一つであり、腎疾患治療
に不可欠な透析時に、糖化ヘモグロビンをも測定できる
ことは、患者の状態に関してより多くの情報が得られる
こと、一度の検査で両方の測定値がわかることなどにお
いて有用である。

【０００６】カチオン交換液体クロマトグラフィーによ
るＨｂＡ１ｃの測定方法において、ＣＨｂが含まれる試
料を測定した場合、ＨｂＡ１ｃの測定値がその影響を受
ける。このため、ＣＨｂの影響を回避できるような分離
性能を実現した、カチオン交換液体クロマトグラフィー
によるＨｂＡ１ｃの測定方法はあるが〔（Clinical Che
mistry,Vol.39,No.12,2514-2518(1993) 〕、同時にＣＨ
ｂの定量もできる方法はない。

【０００７】また、ＣＨｂの測定に標準物質として使用
するＣＨｂの製造方法としては、尿素をヒト血液に添加
して加温する方法が一般的であり、加温条件としては、
上記文献に３７℃、２４時間の条件が、Metabolism,Vo
l.33,No.11,999-1002(1984)に１００℃、５分の条件が
記載されている。

【０００８】しかしながら、上記の製造方法により得ら
れるＣＨｂは、カルバミル化反応の際の条件により変性
し易く、ＣＨｂの測定のための管理用標準物質とするに
は不十分である。すなわち、大きな変性を生じ易いの
で、これを管理用標準物質とするとＣＨｂ測定値のバラ
ツキの要因となり易い。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記問題点に
鑑みてなされたものであり、請求項１記載の発明（以
下、請求項１記載の発明を本発明１という）の目的は、
ＣＨｂの影響を受けずに糖化ヘモグロビンを測定できる
と共に、ＣＨｂをも同時に定量的に測定できるカルバミ
ル化ヘモグロビンと糖化ヘモグロビンの同時定量方法を
提供することにある。請求項２記載の発明（以下、請求
項２記載の発明を本発明２という）の目的は、上記測定
法において管理用標準物質として用い得る、変性の少な
いＣＨｂの製造方法を提供することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明１のカルバミル化
ヘモグロビンと糖化ヘモグロビンの同時定量方法は、カ
チオン交換クロマトグラフィーを用いることを特徴とす
る。

【００１１】本発明２のカルバミル化ヘモグロビンの製
造方法は、血液とシアン酸塩の生理的食塩水溶液とを混
合し、血液中のヘモグロビンとシアン酸塩とを反応させ
ることを特徴とする。

【００１２】以下、本発明１について説明する。本発明
１で用いられる充填剤としては、公知のカチオン交換液
体クロマトグラフィー用充填剤が用いられ得、官能基と
して、カルボキシル基、スルホン酸基などのカチオン交
換基を有するものが、素材としては、シリカ系、ポリマ
ー系などのものが、形状としては、平均粒径１〜１０μ
ｍのものが好ましい。充填剤としては、多孔性のもので
も非多孔性のものでもよい。

【００１３】本発明１で用いられる溶離液としては、糖
化ヘモグロビンの分析に一般に用いられる公知の溶離液
が好ましく、充填剤によって異なる。一般に、ｐＨ４〜
７、濃度５０〜１０００ｍＭの、無機酸塩又は有機酸塩
からなる緩衝液が好ましく、例えば、リン酸緩衝液が好
ましい。グラジエント溶出法にて溶出するのが好ましい
ので、溶離液としては、一般に２種以上の異なる組成の
溶離液が使用される。上記溶離液のうち１種類はヘモグ
ロビンＡ０（ＨｂＡ０）成分を溶出するために、溶出力
の相対的に強い液が好ましい。

【００１４】本発明１で用いられる測定試料は、血液を
溶血した溶血液試料が好ましい。血液を溶血するには、
例えば、界面活性剤を含む溶血剤を血液に添加する方法
が挙げられる。

【００１５】また、試料から、必要に応じて不安定型糖
化ヘモグロビンを除去することができる。不安定型糖化
ヘモグロビンを除去すると、ＣＨｂが不安定型糖化ヘモ
グロビンの溶出位置に溶出しても測定できることにな
る。不安定型糖化ヘモグロビンを除去するには、公知の
方法が用いられ、例えば、試料溶液を生理食塩水で洗浄
する方法；特開昭６３−２９８０６４号公報に記載され
ているような、リン酸縮合体及び／又はリン酸縮合体の
塩からなる不安定型糖化ヘモグロビン除去試薬を試料溶
液に添加する方法などが挙げられる。また、不安定型糖
化ヘモグロビン除去試薬を上記溶血剤に添加することに
より、溶血と不安定型糖化ヘモグロビン除去を同時に行
ってもよい。

【００１６】本発明１で用いられるカチオン交換液体ク
ロマトグラフィーの条件としては、、流速０．５〜３ｍ
ｌ／分が好ましい。糖化ヘモグロビン及びＣＨｂの検出
は、吸光度によるのが簡便であり、測定波長としては、
例えば、４１５ｎｍが挙げられる。糖化ヘモグロビン及
びＣＨｂ測定値は、通常、溶出された全ピーク面積を１
００％とした場合の、各ピークの割合（％）で表示す
る。

【００１７】本発明１で用いられる溶出条件としては、
ＣＨｂの溶出位置を最適化する条件とされる。ＣＨｂは
ＨｂＡ１ｃ近辺に溶出される場合、その溶出位置が重要
となる。現在までに、各糖化ヘモグロビンのピークを完
全に分離した例は報告されておらず、一般に、溶血液試
料がカチオン交換液体クロマトグラフィーにより分離さ
れると、糖化ヘモグロビンは、糖化ヘモグロビンＡ１ａ
（ＨｂＡ１ａ）、糖化ヘモグロビンＡ１ｂ（ＨｂＡ１
ｂ）、胎児性ヘモグロビン（ＨｂＦ）、不安定型糖化ヘ
モグロビンＡ１ｃ（不安定型ＨｂＡ１ｃ）、安定型糖化
ヘモグロビンＡ１ｃ（安定型ＨｂＡ１ｃ）、非糖化ヘモ
グロビン（ＨｂＡ０）の順に溶出される。ＨｂＡ１ａ〜
ＨｂＡ１ｃまではピークが連続しており、ＣＨｂを溶出
させる余裕に乏しい。本発明１の測定方法では、ＣＨｂ
の溶出位置としては、不安定型糖化ヘモグロビンを除去
した後のその位置、又はＨｂＡ１ｃとＨｂＡ０の間が最
も好ましく、そのための溶離液条件（イオン強度やｐ
Ｈ）、流速などを調節する。

【００１８】本発明１で用いられる、液体クロマトグラ
フのシステムは、通常、図１のように構成される。溶離
液１が切り替え機構（図示せず。例えば電磁弁からな
り、溶離液１ａ、１ｂ、１ｃなどの切り替えを行う機
構）を通り、送液ポンプ２により試料導入装置３を経由
して、試料の注入を行うためのインジェクションバルブ
４を通り、充填剤が充填された分離カラム５に入り、こ
の分離カラム５により試料中の各成分が分離される。分
離された各成分は検出器６によって、例えば、吸光度を
測定する等によって検出され、その結果が記録計７に記
録され、検出後の溶離液１は廃液溜め８に溜められる。

【００１９】以下、本発明２のカルバミル化ヘモグロビ
ンの製造方法について説明する。本発明２のＣＨｂの製
造方法は、血液とシアン酸塩の生理的食塩水溶液とを混
合し、血液中のヘモグロビンとシアン酸塩とを反応させ
ることを特徴とする。

【００２０】上記シアン酸塩としては、シアン酸のアル
カリ金属塩などが挙げられ、例えば、シアン酸ナトリウ
ム、シアン酸カリウムなどが挙げられる。シアン酸塩の
生理的食塩水溶液中の濃度は、生成させるＣＨｂ量や反
応条件によって異なるが、通常０．０５〜１ｍｇ／ｄｌ
が好ましい。

【００２１】上記生理的食塩水とは、０．９重量％塩化
ナトリウム水溶液のことである。

【００２２】シアン酸塩の生理的食塩水溶液の使用量
は、製造しようとするＣＨｂの濃度によって変わるが、
好ましくは、血液と該生理的食塩水溶液との混合物中
の、１０〜８０容量％である。

【００２３】上記血液としては、取扱上健常人血液が好
ましい。

【００２４】上記反応の条件は、温度２０〜４５℃で１
〜６時間が好ましく、温度３５〜４０℃で２〜５時間が
より好ましい。なお、反応温度を高めるほど反応時間は
短縮できるが、血液の変性の点から６０℃以下が好まし
い。

【００２５】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施例及び比較例
を挙げることにより、本発明を詳細に説明するが、本発
明はこれに限定されるものではない。

【００２６】（実施例１）液体クロマトグラフのシステ
ムとして、図１のように構成されたシステムを用い、以
下のようにしてＣＨｂとＨｂＡ１ｃを測定した。装置及
び測定方法は、以下の通りである。 送液ポンプ：島津製作所社製、ＬＣ−９Ａ 試料導入装置：積水化学工業社製、ＡＳＵ−４２０ 検出器：紫外可視吸光度計、島津製作所社製、ＳＰＤ６
−ＡＶ 検出は、波長４１５ｎｍによる吸光度を測定した。溶離
液としては、リン酸緩衝液（Ａ）（０．１Ｍ、ｐＨ６）
とリン酸緩衝液（Ｂ）（０．３Ｍ、ｐＨ７．２）を用
い、リン酸緩衝液（Ａ）を送液した後、リン酸緩衝液
（Ｂ）を送液した。分離カラムとしては、カチオン交換
体が充填されたカラムである、積水化学工業社製、商品
名「Ｍｉｃｒｏｎｅｘ Ａ１ｃ ＨＳ−II」を用いた。

【００２７】溶血液試料としては、健常人新鮮血液を以
下の方法でカルバミル化したものを用いた。健常人新鮮
血液５００μｌに、等量のシアン酸塩の生理的食塩水溶
液〔シアン酸ナトリウム（和光純薬社製）の濃度が０．
２ｍｇ／ｄｌになるように溶解された、０．９重量％塩
化ナトリウム水溶液〕を添加し、３７℃の恒温水槽に入
れ加温した。５時間加温した後、一定量サンプリング
し、積水化学工業社製、溶血液２１Ｈ（不安定型糖化ヘ
モグロビン除去試薬入り溶血液）にて７５倍に溶血、希
釈した。

【００２８】上記溶血液試料を用い、上記の測定方法で
測定した。この際、溶離液（上記のリン酸緩衝液（Ａ）
及びリン酸緩衝液（Ｂ））の送液量など溶出条件を変え
て、ＨｂＡ１ｃピークとＣＨｂピークが重ならないよう
にした。

【００２９】測定結果 （１）クロマトグラム 溶離液としてリン酸緩衝液（Ａ）を６分、リン酸緩衝液
（Ｂ）を０．５分、リン酸緩衝液（Ａ）を３．５分送液
する３液ステップグラジエント法で測定し、得られたク
ロマトグラムを図２に示した。また、溶血液試料とし
て、健常人新鮮血液を上記のカルバミル化しなかったも
のも用意〔この溶血液試料の調製方法は、上記のカルバ
ミル化した溶血液試料の調製における、シアン酸ナトリ
ウム（和光純薬社製）の濃度が０．２ｍｇ／ｄｌになる
ように溶解された、０．９重量％塩化ナトリウム水溶液
の代わりに、０．９重量％塩化ナトリウム水溶液単独を
用いたことの他は、上記方法と同様に操作することによ
り調製した〕し、上記と同様の測定条件にて測定し、得
られたクロマトグラムを図３に示した。図２と図３のク
ロマトグラムの比較から、図２と図３における各ピーク
は、ピーク１１ＨｂＡ１ａ＋ｂ、１２ＨｂＦ、１３安定
型ＨｂＡ１ｃ、１４ＨｂＡ０、１５ＣＨｂ１、１６ＣＨ
ｂ２であることが分かった。

【００３０】（２）測定再現性の試験 上記のカルバミル化血液及び健常人血液について、同一
検体を繰り返し３０回測定した際の再現性をみた。ＣＨ
ｂと安定型糖化ヘモグロビンＡ１ｃの濃度は、得られた
クロマトグラムの各ピーク面積から以下の式によって算
出した。 ＣＨｂ１（％）＝〔ＣＨｂ１ピーク面積／（ヘモグロビ
ンの全ピーク面積の総和）〕×１００ ＣＨｂ２（％）＝〔ＣＨｂ２ピーク面積／（ヘモグロビ
ンの全ピーク面積の総和）〕×１００ 安定型糖化ヘモグロビンＡ１ｃ（％）＝〔安定型糖化ヘ
モグロビンＡ１ｃピーク面積／（ヘモグロビンの全ピー
ク面積の総和）〕×１００ 上記式における「ヘモグロビンの全ピーク面積」のヘモ
グロビンとは、具体的には、ＨｂＡ１ａ＋ｂ、ＨｂＦ、
安定型ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、ＣＨｂ１及びＣＨｂ２の
ことを指す。得られたＣＨｂ１、ＣＨｂ２、安定型Ｈｂ
Ａ１ｃの測定値、その標準偏差及び変動係数を表１に示
した。

【００３１】

【表１】

【００３２】表１より、再現性は良好であり、本発明方
法により、ＣＨｂとＨｂＡ１ｃは良好に測定できること
が分かった。

【００３３】（３）ＨｂＡ１ｃについての相関 健常人及び糖尿病患者より採血した血液検体１４検体
と、該血液検体を前記のカルバミル化した溶血液試料を
得たときと同一の条件（３７℃、５時間）でカルバミル
化して得たカルバミル化検体１４検体について、それぞ
れ溶血液２１Ｈにて７５倍に溶血、希釈した。得られた
非カルバミル化溶血液試料１４試料、及びカルバミル化
溶血液試料１４試料について、前記と同様にして液体ク
ロマトグラフィーを行って、それぞれのＨｂＡ１ｃ濃度
（％）を測定した。得られた結果から、各血液検体につ
いて、非カルバミル化試料とカルバミル化試料のＨｂＡ
１ｃ濃度（％）についての相関を調べ、その相関図を図
４に示した。図４より両者の相関は良好であり、ＨｂＡ
１ｃの測定にＣＨｂが悪影響を与えないことが分かっ
た。なお、相関式は、 （カルバミル化試料のＨｂＡ１ｃ濃度）＝０．９４９×
（非カルバミル化試料のＨｂＡ１ｃ濃度）＋０．２８０ 相関係数は、０．９９６であった。

【００３４】実施例２ （１）ＣＨｂ製造の反応曲線の作成 実施例１で用いたものと同様に配合されたシアン酸ナト
リウムの生理的食塩水溶液０．５ｍｌを健常人血液０．
５ｍｌに添加し、３７℃の恒温槽にて加温時間を変えて
加温し、加温後冷却して反応を止め、実施例１と同様に
して溶血液２１Ｈにて溶血、希釈した。得られた溶血希
釈液を試料として、実施例１と同様にして液体クロマト
グラフィー法でＣＨｂ１とＣＨｂ２の濃度を測定した。
この測定結果を図５に示した。この結果、ＣＨｂ１及び
ＣＨｂ２共に、加温時間が１５０分以上では、カルバミ
ル化が飽和することが分かる。

【００３５】（２）シアン酸ナトリウム濃度の影響 健常人血液との反応時に使用したシアン酸ナトリウム濃
度を０．２ｍｇ／ｄｌとしたことの代わりに、図６に示
したようにシアン酸ナトリウム濃度が０〜１ｍｇ／ｄｌ
になるように生理的食塩水に溶解したものを用い、健常
人血液に等量添加し、３７℃、５時間加温反応させた。
加温後冷却して反応を止め、実施例１と同様にして溶血
液２１Ｈにて溶血、希釈した。得られた溶血希釈液を試
料として、実施例１と同様にして液体クロマトグラフィ
ー法でＣＨｂ１とＣＨｂ２の濃度を測定した。結果を図
６に示した。図６より、シアン酸ナトリウム（図６で
は、ＮａＣＮＯと記した）濃度を高めると、カルバミル
化の程度が高まることが分かる。

【００３６】（比較例１）健常人血液に尿素（和光純薬
社製）を２００ｍＭとなるように添加し、３７℃で２４
時間加温した。得られた反応液を、実施例１と同様にし
て溶血液２１Ｈにて溶血、希釈した。得られた溶血希釈
液を試料として、実施例１と同様に操作して液体クロマ
トグラフィーを行い、そのクロマトグラムを図７に示し
た。図７より、ピーク１１ＨｂＡ１ａ＋ｂが増大し、糖
化ヘモグロビンの変性が起こったことが分かる。

【００３７】

【発明の効果】本発明１のカルバミル化ヘモグロビンと
糖化ヘモグロビンの同時定量方法の構成は上記の通りで
あり、本発明１を用いると、カチオン交換液体クロマト
グラフィーを用いて、ＣＨｂを精度よく短時間で測定で
きる。また、従来通り、ＨｂＡ１ｃも同時に精度よく測
定できる。従って、透析患者の血中ＣＨｂ濃度のモニタ
ーに利用できると共に、患者のＨｂＡ１ｃ濃度もわか
り、より有効な治療のための情報を提供する。本発明２
のカルバミル化ヘモグロビンの製造方法の構成は上記の
通りであり、本発明２を用いると、本発明１の測定時の
管理用検体となるカルバミル化ヘモグロビン標準物質を
安定に製造できる。また、血液のカルバミル化によって
該血液中のＨｂＡ１ｃの濃度は殆ど影響を受けないの
で、ＨｂＡ１ｃ測定の標準物質をも兼ねることができ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明で用いられる液体クロマトグラフのシス
テムの構成の一例を示す図である。

【図２】実施例１で得られた、カルバミル化した試料の
クロマトグラムである。

【図３】健常人血液を試料としたときのクロマトグラム
である。

【図４】健常人及び糖尿病患者より採血した血液検体１
４検体と、該血液検体をカルバミル化して得たカルバミ
ル化検体１４検体と、から得られた溶血液試料につい
て、それぞれのＨｂＡ１ｃ濃度を測定したものの、各血
液検体についての、非カルバミル化試料とカルバミル化
試料のＨｂＡ１ｃ濃度の相関図である。

【図５】ＣＨｂ製造時の反応時間と、得られたカルバミ
ル化した試料中のＣＨｂ濃度との関係を示すグラフであ
る。

【図６】ＣＨｂ製造時のＮａＣＮＯ濃度と、得られたカ
ルバミル化した試料中のＣＨｂ濃度との関係を示すグラ
フである。

【図７】比較例１で得られたクロマトグラムである。

【符号の説明】

１ 溶離液 ２ 送液ポンプ ３ 試料導入装置 ４ インジェクションバルブ ５ 分離カラム ６ 検出器 ７ 記録計 ８ 廃液溜め

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 カチオン交換クロマトグラフィーを用い
   ることを特徴とするカルバミル化ヘモグロビンと糖化ヘ
   モグロビンの同時定量方法。
2. 【請求項２】 血液とシアン酸塩の生理的食塩水溶液と
   を混合し、血液中のヘモグロビンとシアン酸塩とを反応
   させることを特徴とするカルバミル化ヘモグロビンの製
   造方法。