JP4144117B2

JP4144117B2 - グルコースの測定方法及び測定装置

Info

Publication number: JP4144117B2
Application number: JP15765499A
Authority: JP
Inventors: 和秀吉川; 義之新藤; 淳内田
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1999-06-04
Filing date: 1999-06-04
Publication date: 2008-09-03
Anticipated expiration: 2019-06-04
Also published as: JP2000346848A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液試料中のグルコース濃度を測定する方法及びグルコース濃度を測定する装置に関するものであり、他の血中物質、特に安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定と同時にグルコースを測定するのに好適な測定方法及び測定装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
血液試料中のグルコース濃度は、種々の疾患に関連して変動するため、臨床診断の分野で頻繁に利用されている。なかでも、糖尿病の早期発見、治療経過観察において、重要な指標の一つとして広く利用されている。
【０００３】
従来、血液試料中のグルコース濃度は、グルコースとグルコースオキシダーゼとの反応により生成した過酸化水素を、ペルオキシダーゼ等の酵素とその酵素基質を用いて比色定量する方法や、グルコースとヘキソキナーゼの反応によりＡＴＰ存在下で生成するグルコース−６−リン酸を、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼと反応させることで生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈを比色定量する方法により、測定されている。また、このような生化学的測定以外にも、グルコースオキシダーゼ固定化半透膜を用い、該膜がグルコース存在下で生成する過酸化水素又は酸素を電気化学的に測定する方法も利用されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記したように、血液試料中のグルコース濃度の測定は、臨床的に重要な意義を有しているが、グルコース濃度を測定するためには、酵素や色素等の試薬を種々使用し、更には時間を費やして複雑な反応を行うか、又は、専用装置を用いて、電気化学的に測定するしかなかった。
【０００５】
また、例えば糖尿病は、患者数も多く合併症による医療費負担の増加のため、早期の発見と治療が重要である。現在のところ、糖尿病の早期発見・経過観察を目的とするグルコース濃度の測定は必須であるが、その際に、併せて安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定を同時に行えれば、さらに有効な臨床的知見を得ることが可能になる（ＴｈｅＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ３２９，９７７−９８６（１９９３年））。ヘモグロビンＡ１ｃは、赤血球中のヘモグロビンにグルコースが非酵素的に結合して生成するが、その反応過程では、非常に短時間で可逆的に生成する不安定型ヘモグロビンＡ１ｃを経て、非可逆的に安定型ヘモグロビンＡ１ｃが生成するため、過去１〜３月間の血中グルコース濃度が、安定型ヘモグロビン濃度に平均的に反映されるからである。
【０００６】
しかしながら、従来は、グルコースと安定型ヘモグロビンＡ１ｃの濃度を、同一血液試料について同時かつ高精度で測定する方法がなかったため、グルコース濃度は生化学測定又は電気化学的な測定方法により、そして安定型ヘモグロビンＡ１ｃ濃度は液体クロマトグラフィーにより測定するのが一般的であった。このため、比較的多量の血液試料が必要であったばかりでなく、血液試料を異なる装置毎に分注する手間や結果を得るまで時間がかかる、という課題があった。
【０００７】
本発明は、上記課題に鑑み、１台の装置により、グルコースと安定型ヘモグロビンＡ１ｃの濃度を、同一血液試料について同時かつ高精度で測定し得る方法及び装置を提供するものである。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、血液試料中の全ヘモグロビン含量、即ち不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ含量、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ含量そしてその他のヘモグロビン含量の和、に対する不安定型ヘモグロビンＡ１ｃの割合と、当該試料中のグルコース濃度が一次式で表される相関関係を有するという、従来知られていなかった新たな知見を得、それに基づき、完成されたものである。
【０００９】
即ち請求項１に記載した発明は、グルコースの測定方法に関するものであり、試料中の全ヘモグロビン含量及び不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ含量を測定し、全ヘモグロビン含量に対する不安定型ヘモグロビンＡ１ｃの割合から当該試料中のグルコース濃度を算出するものである。また請求項２に記載した発明は、請求項１に記載した発明に係り、試料中の全ヘモグロビン含量及び不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ含量の測定を、液体クロマトグラフィーにより行うことを特徴とする。
【００１０】
また請求項３に記載した発明は、グルコースの測定装置に関するものであり、試料中の全ヘモグロビン含量及び不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ含量を測定するための測定手段と、全ヘモグロビン含量に対する不安定型ヘモグロビンＡ１ｃの割合を算出し、そして算出結果から当該試料中のグルコース濃度を算出するための演算手段とを有するものである。そして請求項４に記載した発明は、請求項３に記載した発明に係り、測定手段が液体クロマトグラフィーにより試料中の全ヘモグロビン含量及び不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ含量を測定する手段であることを特徴とする。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
本発明における試料は、必要に応じて、例えば蒸留水や、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００等の界面活性剤を含有する溶血試薬等の希釈液で希釈された血液である。本発明では、まず、試料を適当な測定に供し、試料中の全ヘモグロビン含量と不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ含量を測定する。全ヘモグロビン含量と不安定型Ａ１ｃ量の測定は、例えば液体クロマトグラフィーにより測定できるが、より短時間で操作を終了でき、しかも不安定型ヘモグロビンＡ１ｃを他のヘモグロビンと十分に分離して測定し得る、高速液体クロマトグラフィーにより測定することが好ましい。不安定型ヘモグロビンＡ１ｃを、他のヘモグロビンと十分に分離して含量を測定することにより、算出されるグルコース濃度の正確性を高めることができる。
【００１２】
液体クロマトグラフィーに用いる分析カラムや、分析液等に関する分離条件は、不安定型ヘモグロビンＡ１ｃを他のヘモグロビンから分離し得れば特に制限されないが、陽イオン交換基を有する充填剤を充填した分析カラムを用いるイオン交換クロマトグラフィーは、特に好適な例である。そして、カラムにより分離された不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ及びその他のヘモグロビンを検出するための検出器は、ヘモグロビンの吸収極大波長である４１５ｎｍ付近の吸収を連続的に測定できる、フローセルタイプの可視検出器を用いることが好ましい。
【００１３】
液体クロマトグラフィーに試料を供して得られるクロマトグラムから、不安定型ヘモグロビンＡ１ｃに由来するピークとそれ以外のヘモグロビンに由来するピークを同定後、不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ由来のピーク面積をＬＡＲＥＡ、それ以外のヘモグロビン由来のピーク面積をＨＡＲＥＡ１とすると、安定型ヘモグロビンの割合（ＳＡ１Ｃ（％））が得られる。
【００１４】
ＬＡ１Ｃ（％）＝ＬＡＲＥＡ／（ＬＡＲＥＡ＋ＨＡＲＥＡ１）×１００
ここで、ＬＡ１Ｃ（％）は当該血液試料中のグルコース濃度と一次の相関関係を有していることから、血液試料中のグルコース濃度ＢＧ（ｍｇ／ｄｌ）は、以下の通りとなる。
【００１５】
ＢＧ（ｍｇ／ｄｌ）＝Ｆ１×ＬＡ１Ｃ（％）＋Ｆ２
上記において、Ｆ１及びＦ２は定数である。係数Ｆ１及びＦ２は、既知のグルコース濃度の血液試料を、例えば同一条件下での液体クロマトグラフィーに供し、得られたクロマトグラムに基づき、不安定型ヘモグロビンＡ１ｃの、その他のヘモグロビンに対する割合から算出されるもので、分析カラム７の種類（例えばイオン交換基の種類等）やカラムのサイズ、分析に使用する溶離液の組成等の条件によって異なるが、分析条件が一定であれば固定できる係数であり、血液試料を提供する被検者や、糖尿病を患っているか否か等の被検者の状態によってはあまり変動しない。このため、本発明では、上記のようにして、グルコース濃度（ｍｇ／ｄｌ）を知ることができるのである。
【００１６】
本発明は、血液試料中の全ヘモグロビン含量に対する不安定型ヘモグロビンＡ１ｃの割合から、当該血液試料中のグルコース濃度を算出するものであるが、安定型ヘモグロビンのピーク面積等を知ることができれば、その割合（％）も同時に得ることが可能である。即ち、まず、例えば上記液体クロマトグラフィーのクロマトグラムにおいて、不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ、そしてその他のヘモグロビンの各ピークを同定後、各ピークのピーク面積を算出する。不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ由来のピーク面積をＬＡＲＥＡ、安定型ヘモグロビン由来のピーク面積をＳＡＲＥＡ、その他のヘモグロビン由来のピーク面積をＨＡＲＥＡ２とすると、安定型ヘモグロビンの割合（ＳＡ１Ｃ（％））が得られる。
【００１７】
ＳＡ１Ｃ（％）＝ＳＡＲＥＡ／（ＬＡＲＥＡ＋ＳＡＲＥＡ＋ＨＡＲＥＡ２）×１００
上記において、不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ又は安定型ヘモグロビンＡ１ｃ以外のヘモグロビンとしては、例えばヘモグロビンＡ１ａ、ヘモグロビンＡ１ｂ、ヘモグロビンＡ０等のヘモグロビンＡ群や、ヘモグロビンＦがある。上記のように本発明は不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ又は安定型ヘモグロビンＡ１ｃの、全ヘモグロビン含量に対する割合を求めることを含むが、ここで、ヘモグロビンＡ群に属するヘモグロビンの総量は、真の全ヘモグロビン含量の大部分（約９５％以上）を占めることから、該Ａ群に属するヘモグロビン総量を全ヘモグロビン含量として本発明を実施することもできる。
【００１８】
以上のように、本発明では、液体クロマトグラフィーによる分析を１回行うのみで、グルコース濃度（ｍｇ／ｄｌ）、そして更には安定型ヘモグロビンＡ１ｃの割合（％）をも得ることができる。
【００１９】
本発明を用いてグルコース濃度を算出しようとする場合には、不安定型ヘモグロビンを他のヘモグロビンと分離可能な手段を用いれば良いが、グルコース濃度に加えて安定型ヘモグロビンの割合をも算出しようとする場合には、不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ、そしてその他のヘモグロビンの３成分を分離できる手段を用いる。例えば前記した液体クロマトグラフィーは、この３成分をも分離し得る好適な分離手段として例示可能であるが、中でも、ヘモグロビンＡ１ｃ分析に常用されている、陽イオン交換基を有する充填剤を充填した分析カラムを用いるイオン交換クロマトグラフィーを、好適な手段として例示できる。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、実施例等により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２１】
図１、本発明の分析装置を説明するための、概略図である。この装置は、分析液を切り替えるための切り替えバルブ４、分析液を送液するための送液ポンプ５、試料を注入するための試料注入バルブ６、分析カラム７、検出器８から構成されている。そして、検出器８は、プリンタ８に検出結果であるクロマトグラムを出力するに止まらず、不図示のクロマトグラム解析装置に対しても検出結果を出力する。解析装置は、入力したクロマトグラムを記憶し、各種ヘモグロビンのピーク同定、各ピークの面積の算出、後述する不安定型ヘモグロビンＡ１ｃの割合の算出、そしてグルコース濃度（ｍｇ／ｄｌ）の算出更には安定型ヘモグロビンＡ１ｃの割合（％）の算出と出力を行う。
【００２２】
溶離液１〜３としては、分析カラム７に陽イオン交換カラムを用いるのであれば、例えば、異なる３種類の濃度の硫酸ナトリウムを含む、２０ｍＭＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）等を使用することができる。
【００２３】
次に、この装置を用いて本発明を実施する場合について、説明する。まず、測定に先立ち分析カラム７を、３種の溶離液のうち、硫酸ナトリウム濃度がもっとも低いもので平衡化する。次に、血液試料（血液そのもの）を必要に応じて蒸留水やＴｒｉｔｏｎＸ−１００等の界面活性剤を含有する溶血試薬等の希釈液で希釈し、試料注入バルブから注入し、ヘモグロビンをいったんカラム７に保持させる。
【００２４】
次に、分析カラム７に供される硫酸ナトリウムの濃度が順次上昇するよう、切り替えバルブ４を切り替えて、供する溶離液を切り替える。これにより、カラム７に保持されたモグロビンは、カラムに充填された充填剤に対する保持力の弱い順に溶出する。順次カラム７から溶出するヘモグロビンは、検出器８で連続的に検出で検出され、そのクロマトグラムは、検出器８に接続したプリンター９から出力される。
【００２５】
検出は、ヘモグロビンの吸収極大波長である４１５ｎｍで行い得る。なお、ヘモグロビンの溶出順番は充填剤や溶離液の種類等、分析条件により異なるが、上記条件下では、ヘモグロビンＡ１ａ、ヘモグロビンＡ１ｂ、ヘモグロビンＦ、不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ、その他のヘモグロビン（ヘモグロビンＡ０が主成分である）の順で溶出する。
【００２６】
図２は、上記本発明の分析装置により実際に得られたクロマトグラムである。各ピークの面積（ｍＶ・ｓｅｃ）は、ピーク高さを時間方向に積分することで求めることができる。図２のクロマログラムでは、ヘモグロビンＡ１ａ（１０を付したピーク；１３．６７ｍＶ・ｓｅｃ）、ヘモグロビンＡ１ｂ（１１を付したピーク；１１．８３ｍＶ・ｓｅｃ）、ヘモグロビンＦ（１２を付したピーク；１１．０４ｍＶ・ｓｅｃ）、不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ（１３を付したピーク；５８．１６ｍＶ・ｓｅｃ）、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ（１４を付したピーク；１０１．０５ｍＶ・ｓｅｃ）、その他のヘモグロビン（ヘモグロビンＡ０が主成分である、１５を付したピーク；２２０９．９７ｍＶ・ｓｅｃ）である。
【００２７】
不安定型ヘモグロビンＡ１ｃと安定型ヘモグロビンＡ１ｃを除く、その他のヘモグロビン由来ピークの総面積（ＨＡＲＥＡ）は、上記から、２２４６．５１ｍＶ・ｓｅｃとなる。この結果、不安定型ヘモグロビンの割合（ＬＡ１Ｃ（％））は２．４１％となり、試料中のグルコース濃度は、次式により算出される。
【００２８】
ＢＧ（ｍｇ／ｄｌ）＝９８．６（Ｆ１）×２．４１−１０３．２（Ｆ２）
≒１３４ｍｇ／ｄｌ
係数Ｆ１及びＦ２は、既知のグルコース濃度の血液試料を上記の液体クロマトグラフィーに供し、得られたクロマトグラムから、不安定型ヘモグロビンＡ１ｃの、その他のヘモグロビンに対する割合から算出したものである。なお係数Ｆ１及びＦ２は上記数値に限られるものではなく、本発明を実施する条件毎決定するすべきものである。
【００２９】
一方、安定型ヘモグロビンＡ１ｃの割合（ＳＡ１Ｃ（％））は、ＳＡ１Ｃ（％）＝４．２０％となる。この結果、例えば既知濃度のヘモグロビンを含む血液試料が示すピーク面積について予め知見を得ておけば、本発明によって安定型ヘモグロビンＡ１ｃ含有量を推定することが可能となる。
【００３０】
（実施例）
８７例の血液試料を用い、市販の溶血試薬（ＨＬＣ−７２３ＧＨｂＶ用溶血洗浄液、東ソー（株）製）で希釈して溶血した後、上記装置を用いて測定を行い、血中グルコース濃度を測定した。また同一の血液試料をグルコースオキシダーゼ固定化電極を用いた市販のグルコース濃度測定装置（電極法糖分析装置ＧＡ０３、（株）エイアンドティー製）で測定し、グルコース濃度を測定した。
【００３１】
図３は、本発明により測定されたグルコース濃度と、市販の装置により測定したグルコース濃度の相関を示す図である。図３から明らかなように、本発明によって測定されたグルコース濃度は、市販の装置により測定されたグルコース濃度と良好な相関を示すことが分かる。
【００３２】
【発明の効果】
本発明により測定方法では、既存の方法と同等の測定値（グルコース濃度）が得られるが、本発明では更に、安定型ヘモグロビンＡ１ｃをも同時に測定することができる、という効果がある。
【００３３】
本発明は、従来から実施されている液体クロマトグラフィーにより、クロマトグラムを取得後、その結果を解析することでグルコース濃度等を算出しようとするものである。この結果、新たな装置や機器を必要とせず、従来から使用されている測定装置に、クロマトグラムを解析するための解析装置を付加するのみで実施することが可能である。そして本発明によれば、グルコース濃度や安定型ヘモグロビンＡ１ｃの割合を簡便かつ迅速に知ることができ、臨床検査特に糖尿病の早期発見・治療経過観察に効果的である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係わる方法を実施した液体クロマトグラフィー分析装置の概略図を示す。
【図２】実施例により得られたクロマトグラムを示す。
【図３】実施例により得られた血中グルコース濃度（Ｙ軸）と糖分析装置ＧＡ０３により得られたグルコース濃度（Ｘ軸）の相関を示す。
【符号の説明】
１，２，３：溶離液
４：溶離液切り替え弁
５：送液ポンプ
６：試料注入バルブ
７：分析カラム
８：検出器
９：プリンター
１０：ヘモグロビンＡ１ａ画分
１１：ヘモグロビンＡ１ｂ画分
１２：ヘモグロビンＦ画分
１３：不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ画分
１４：安定型ヘモグロビンＡ１ｃ画分
１５：ヘモグロビンＡ０画分

Claims

試料中の全ヘモグロビン含量及び不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ含量を測定し、全ヘモグロビン含量に対する不安定型ヘモグロビンＡ１ｃの割合から当該試料中のグルコース濃度を算出する、グルコースの測定方法。
試料中の全ヘモグロビン含量及び不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ含量の測定を、液体クロマトグラフィーにより行うことを特徴とする、請求項１の方法。
試料中の全ヘモグロビン含量及び不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ含量を測定するための測定手段と、全ヘモグロビン含量に対する不安定型ヘモグロビンＡ１ｃの割合を算出し、そして算出結果から当該試料中のグルコース濃度を算出するための演算手段とを有する、グルコースの測定装置。
前記測定手段が液体クロマトグラフィーにより試料中の全ヘモグロビン含量及び不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ含量を測定する手段であることを特徴とする、請求項３の装置。