JPH01291159A - 糖化タンパク質の分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、糖化アルブミンおよび糖化ヘモグロビンを含
む試料中の糖化アルブミンおよび糖化ヘモグロビンを、
液体クロマトグラフィーにより、１回の試料注入操作で
糖化アルブミンおよび糖化ヘモグロビンを分離する方法
に関する。

糖尿病のような長期間血糖値が高値を示す疾患では、さ
まざまな生体中のタンパク質が非酵素的に糖化反応を受
ける。血清アルブミンやヘモグロビンも゛それらに属す
るタンパク質である。

従来、糖尿病の診断には、血糖、尿糖、インスリン、グ
ルカゴンの測定、経口ブドウ糖負荷試験等が用いられて
いるが、生理条件あるいは測定方法により結果が影響さ
れ易いとか、被験者にも負担がかかる等の問題点がある
。それに対して、生体中の糖化タンパク質の濃度は、−
時的な生理条件の影響が少なく、過去数週間〜数ケ月の
血中の平均的ｙＭｎ度の指標となるため、近年注目され
°ている。

例えば糖化ヘモグロビンは、過去１〜３ケ月の血糖値の
平均的指標となり、糖尿病患者の重症度と正の相関があ
ることから、糖尿病の新たな診断法、血糖コントロール
の指標としてすでに臨床応用されている。特に、全ヘモ
グロビンに対する糖化ヘモグロビンの割合は、３ケ月前
の空腹時血糖値とよく相関すると言われている。

糖化アルブミンは、その半減期が１７日であり、糖化ヘ
モグロビンと比較すると、血糖状態に速やかに応答する
し、また、血糖値のように一時的な生理条件の影響を受
けて大きく変動することもない。糖尿病の診断では、数
週間から１ケ月程度前の血糖状態の情報が有用であるた
め、糖化アルブミンはこの要求に最も応え得る指標とし
て、最近各方面から注目を浴びている。

このように、糖化ヘモグロビンと糖化アルブミンは、臨
床的には異なる情報を与えることになる。

（従来の技術） 従来、糖化ヘモグロビンの分離方法としては、カルボキ
シメチル型イオン交換樹脂を固定相として用いるイオン
交換クロマトグラフィー〔イー・クリフォード・トーレ
ン・ジェーアール、ジャーナル・オブ・クロマトグラフ
ィー（Ｅ、　Ｃ１１ｆｆｏｒｄＴｏｒｅｎ　Ｊｒ、　ｅ
ｔ　ａｌ、＋　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔ
ｏｇｒａｐｈｙ）。

２６６　２０７、１９８３）　、アガロース等の軟質ゲ
ルにジヒドロキシボロニル基を導入し、この官能基とグ
ルコースとの相互作用を利用するアフイニテイクロマト
グラフィー〔イー・シー・アブラハム、ジェー・ラフ゛
・タリノ・メト（Ｅ、　Ｃ，八ｂｒａｈａｍ、ｅｔ　ａ
ｌ、、　Ｊ、、　Ｌａｂ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｅｄ、）、
　１０２．　Ｎｏ、２．１８７゜１９８３３等の方法が
ある。

糖化アルブミンの分離方法としては、カルボキシメチル
型セルロース等を固定相として用いるイオン交換クロマ
トグラフィー〔ジェームス・エフ・デイ、ジェー・バイ
オ・ケム（Ｊａｍｅｓ　Ｆ、　Ｄａｙ　ｅｔａｌ、、　
Ｊ、　Ｂｉｏ、　Ｃｈｅｍ、）、　２５４　、　Ｎｏ、
３，５９５．１９７９：ｌ、セルロース等の軟質ゲルに
ジヒドロキシボロニル基を導入し、この官能基とグルコ
ースとの相互作用を利用するアフィニティクロマトグラ
フィー〔エイ・ケイ・マリア、アナリイティカル・レタ
ーズ（Ａ、　　Ｋ、　　Ｍａｌｌｉａ　　ｅｔ　　ａｌ
、　　八ｎａｌｙｔｉｃａｌ　　Ｌｅｔｔｅｒｓ）。

１４（Ｂ８）、　６４９〜６６１．１９８１３等が試み
られている。

上記従来技術のうち、糖化アルブミンの分離方法に関し
ては、糖化アルブミンと非糖化アルブミンの分離は可能
であるが、それらと血清、血漿など体液中の他の成分、
例えば、免疫グロブリン類（ＩｇＧ、　ＩｇＭ等）、ハ
プトグロビン、トランスフェリン等との分離ができず、
実質的に体液中の糖化アルブミンと非糖化アルブミンを
定量することはできない。

したがって、従来は試料中からアルブミンを単離した後
、−旦クロマトグラフィーの系外に出し、濃縮後、改め
て糖化アルブミンと非糖化アルブミンを分離できるカラ
ムに導くという方法がとられζいた。すなわち、試料中
からアルブミンを分離する操作と、アルブミンを糖化ア
ルブミンと非糖化アルブミンとに分離する操作が、少な
くとも２段階の別個の操作として行われており、煩雑で
長時間を要していた。

これらのことが、迅速性、操作性、再現性および自動化
が要求される臨床検査の場で、現在、糖化アルブミンが
測定されず、また、そのための分析装置もない最大の原
因である。

ここで、これらの問題点を克服した糖化アルブミンの分
離方法として、特開昭６２−２２６９９９号公報に記載
の方法がある。すなわち、第１カラムで試料中からアル
ブミンを分離し、それをクロマトグラフィーの流路系外
に出すことなく第２カラムに導き、そこでアルブミンを
糖化アルブミンと非糖化アルブミンとに分離することを
特徴とするクロマトグラフィーによる糖化アルブミンの
分離方法である。

（発明が解決しようとする課題） 上記のように、糖化ヘモグロビンや糖化アルブミンを単
独で迅速に分離する方法は知られている。

しかし、前述のように、糖化ヘモグロビンと糖化アルブ
ミンは、臨床的には異なる情報を与えるため、同一試料
中の両方の情報を同時に得ることは、常に求められてい
る。糖化ヘモグロビンと糖化アルブミンを単独で別々に
分離定量するという従来技術は、臨床検査の場で要求さ
れる操作性、迅速性の点で問題があった。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、前記の問題点を克服するため鋭意研究の
結果、迅速性、操作性、再現性にすぐれ、しかも、自動
化の可能な糖化アルブミンと糖化ヘモグロビンを同時に
分離定量する方法を開発し、本発明を完成するに至った
。

すなわち、本発明は、糖化アルブミンおよび糖化ヘモグ
ロビンを含む試料中の糖化アルブミンおよび糖化ヘモグ
ロビンを、液体クロマトグラフィーにより分離する方法
において、流路切換手段により接続された糖化アルブミ
ン分離部分と糖化ヘモグロビン分離部分の両方を有する
分離システムに、１回の試料注入操作により、糖化アル
ブミンおよび糖化ヘモグロビンの分離結果を得ることを
特徴とする糖化タンパク質の分離方法を提供する。

本発明において、糖化アルブミンとは、グルコースと共
有結合したアルブミン、非糖化アルブミンとは、グルコ
ースと結合していないアルブミンを言う。

また、本発明で言うアルブミンとは、糖化アルブミンと
非糖化アルブミンの両方を指す。

本発明における糖化ヘモグロビンとは、グルコースと共
有結合したヘモグロビン、非糖化ヘモグロビンとは、グ
ルコースと結合していないヘモグロビンを言う。

また、−本発明で言うヘモグロビンとは、糖化ヘモグロ
ビンと非糖化ヘモグロビンの両方を指す。

本発明で言う試料とは、少なくとも糖化アルブミンと非
糖化アルブミンのどちらか、もしくはその両方、および
少なくとも糖化ヘモグロビンと非糖化ヘモグロビンのど
ちらか、もしくはその両方を含有するもので、例えば、
血清、血漿、溶血液、尿等の体液を挙げることができる
。

本発明では、１回の注入操作により、試料は液体クロマ
トグラフィーの分離システムに導入される。本発明の分
離方法の一例のフローダイアグラムを第１図に示して、
流路切換手段、糖化アルブミン分離部分および糖化ヘモ
グロビン分離部分の関係を説明する。

第１図において、第１カラムは試料中のアルブミンとヘ
モグロビンを分離するカラム、第２カラムは糖化ヘモグ
ロビンと非糖化ヘモグロビンを分離するカラム、第３カ
ラムは糖化アルブミンと非糖化アルブミンを分離するカ
ラムである。

第１図において、移動相が送液ポンプ１により送られ、
試料注入部より注入された試料は、移動相とともに第１
カラムに送入され、試料中のアルブミンとヘモグロビン
が分離され検出される。次いで、波路切換手段により、
第１カラムで分離されたヘモグロビンが第２カラムに送
入される。該ヘモグロビンが第２カラムに送入され、第
１カラムからアルブミンが溶出された後、流路切換手段
により流路が切換えられ、送液ポンプ１から送液される
移動相は流路切換手段を通って第３カラムに送入される
。この時、第２カラムには、流路切換手段を介して送液
ポンプ２により移動相が送液される。送液ポンプ１．２
ともに移動相をＡ液からＢ液に切換えることにより、第
３カラムで糖化アルブミンと非糖化アルブミンは分離さ
れ、また、第２カラムで糖化ヘモグロビンと非糖化ヘモ
グロビンは分離され、それぞれのカラムからの溶出液は
検出器に送入される。

本発明で用いる第１カラムは、アルブミンとヘモグロビ
ンを分離できるカラムであればよく、特に限定されない
。好ましい例として、アルブミンと親和性の高い色素シ
バクロン・ブルーＦ３Ｇ−Ａ等を結合させたゲルを充填
したカラム、血清中の大量成分であるＩｇＧ　　（分子
量：約１５万）とアルブミン（分子量゛：約６，６万）
とを分離できるゲル濾適用充填カラム、アミノ基を有す
るイオン交換ゲル充填カラム等が挙げられる。

ただし、シバクロン・ブルー等のアルブミンと親和性の
高い物質を導入する担体およびゲル濾適用固定相担体と
しては、機械的強度、化学的安定性にすぐれ、タンパク
質の非特異吸着が少ないという理由で、架橋共重合体重
量当たりアルコール性水酸基１．０〜１４．　０ｍｅｑ
／ｇ　、比表面積５〜１ｏｏｏボ／ｇ、保持し得る水の
量が０．５〜６゜０ｇ／ｇである硬質の親水性架橋共重
合体が好ましい。最も好ましい例として、特開昭５７−
３０９４５号公報記載のビニルアルコール単位由来のア
ルコール性水酸基を有する架橋共重合体を挙げることが
できる。あるいは特開昭５６−６４６５７号および特開
昭５９−１４５０３６号公報記載の架橋共重合体も好ま
しい。

該親水性架橋共重合体にアミノ基を導入する方法として
は、例えば、次の方法を挙げることができる。すなわち
、上記の親水性架橋共重合体とエピハロヒドリンビスエ
ボキシド等を反応させ、エポキシ基含有架橋共重合体を
得、ついで、アンモニア、エチルアミン等の一級アミン
、ジエチルアミン等の二級アミンを反応させることによ
って、得ることができる。

アミノ基としては、置換基を有しないアミノ基、エチル
アミノ基等の一置換アミノ基、ジエチルアミノ基等の二
置換アミノ基を挙げることができる。

アミノ基の量は、架橋共重合体重量当たり０．０２〜５
．Ｏｍｅｑ／ｇであり、好ましくは０．０５〜２　、　
０　ｍｅｑ／ｇであり、さらに好ましくは０．２〜１　
、　０　ｍｅｑ／ｇである。

チバクロンブルーＦ　３　Ｇ−Ａを導入する方法として
は、例えば、該親水性架橋共重合体の水酸基にブロムシ
アンを反応させ、ついで、チバクロンブルーＦ３Ｇ−Ａ
を反応させる方法を挙げることができる。

チバクロンブルーＦ　３　Ｇ−Ａの量は、架橋共重合体
重量当たり０．　００２〜１．　０ｍｅｑ／ｇであり、
好ましくは０．　００５〜０．　０５ｍｅｑ／ｇである
。

これらのゲルのうち、親水性架橋共重合体にアミノ基を
導入したゲルが特に好ましい。

本発明で用いる最も好ましい例として、特開昭６０−１
５０８３９号公報記載のビニルアルコール単位由来のア
ルコール性水酸基とジエチルアミノ基を有する架橋共重
合体を挙げることができる。

この架橋共重合体は、特願昭６０−１２２２号記載の方
法により、アルブミンとヘモグロビンを迅速に分離する
ことが可能である。

本発明で用いる第２カラムおよび第３カラムは、イオン
交換ゲルまたはジヒドロキシボロニル基を有するゲルを
充填したカラム等が挙げられるが、少なくとも第２カラ
ムでは、糖化ヘモグロビンと非糖化ヘモグロビンが分離
できればよく、また、第３カラムでは、糖化アルブミン
と非糖化アルブミンが分離できればよく、特に限定され
ない。

イオン交換ゲルを用いる場合、言うまでもなく、糖化ヘ
モグロビンと非糖化ヘモグロビン、あるいは糖化アルブ
ミン非糖化アルブミンのわずかな等電点の差を利用する
わけであるが、イオン交換基は陽イオン交換基の方が好
ましく、中でもカルボキシル基、スルホン酸基等が特に
好ましい。

また、ジヒドロキシボロニル基は、１，２−シスジオー
ルを有する化合物と特異的に結合するため、この官能基
を有するゲルを固定相としたアフィニティークロマトグ
ラフィーも、糖化ヘモグロビンと非糖化ヘモグロビン、
あるいは糖化アルブミンと非糖化アルブミンの分離に有
効である。

これらの官能基を導入する固定相担体としては、従来液
体クロマトグラフィー用固定相担体として−Ｊ’ｌＱ的
に用いられているセルロース、アガロース等の多糖類の
軟質ゲル、シリカゲル、スチレン−ジビニルベンゼン系
共重合体等が挙げられるが、機械的強度、化学的安定性
にすぐれ、タンパク質の非特異吸着が少ないという点で
、架橋共重合体重量当たりアルコール性水酸基１．０〜
１４．Ｏｍｅｑ／ｇ　、比表面積５〜１０００ボ／ｇ、
保持し得る水の量が０．５〜６．０ｇ／ｇである硬質の
親水性架橋共重合体が好ましい。最も好ましい例として
、特開昭５７−３０９４５号、特開昭５６−６４６５７
号および特開昭５４−１４５０３６号公報記載の架橋共
重合体を挙げることができる。

上記の親水性架橋共重合体にジヒドロキシボロニル基を
導入する方法としては、次の方法を挙げることができる
。すなわち、上記の親水性架橋共重合体とエビハロヒド
リン、ビスエポキシド等を反応させ、エポキシ基含有架
橋共重合体を得、ついで、メタアミノフェニルポロン酸
を反応させることによって得ることができる。

また、カルボキシル基を導入する方法としては、例えば
、モノクロロ酢酸やモノブロモ酢酸等のハロゲン化酢酸
を、該親水性架橋共重合体の水酸基と反応させる方法を
挙げることができる。

さらに、スルホン酸基を導入する方法としては、例えば
、プロパンスルトンを該親水性架橋共重合体の水酸基と
反応させる方法を挙げることができる。

ジヒドロキシボロニル基の量は、架橋共重合体重量当た
り０．０５〜５　、　０　ｍｅｑ／ｇであり、好ましく
は０．０５〜３．　０ｍｅｑ／ｇ　、さらに好ましくは
０．１〜２　、　０　ｍｅｑ／ｇである。

カルボキシル基またはスルホン酸基の量は、架橋共重合
体重量当たり０．０２〜５　、　　Ｏｍｅｑ／ｇであり
、好ましくは０．　０５〜２．　　Ｏｍｅｑ／ｇであり
、さらに好ましくは０．２〜１　、　　Ｏｍｅｑ／ｇで
ある。

これらのゲルのうち、親水性架橋共重合体にジヒドロキ
シボロニル基を導入したゲルが特に好ましい。本発明で
用いる最も好ましい例として、特開昭６２−１９２４０
５号記載のアルコール性水酸基とジヒドロキシボロニル
基を有するホウ素含有架橋共重合体を挙げることができ
る。

本発明において用いられる官能基を固定化したゲルの形
状は、球状、破砕状等種々挙げることができるが、好ま
しくは球状である。その場合、重量平均粒径は１〜５０
０μｍであり、好ましくは１〜２０μｍ、さらに好まし
くは１〜１０μｍである。

次に°、−本発明で用いる移動相について述べる。

糖化アルブミンと非糖化アルブミンを分離するため、あ
るいは糖化ヘモグロビンと非糖化ヘモグロビンを分離す
るための充填剤として、ジヒドロキシボロニル基が固定
化されたゲルを用い、アルブミンとヘモグロビンを分離
するための充填剤として、アミノ基が固定化されたゲル
をもちいる場合は、少なくとも２種類の移動相（Ａ液と
Ｂ液）を用意し、途中でＡ液からＢ液に切り換える方法
を好ましい方法として挙げることができる。Ａ液からＢ
液への切り換えは、ステップワイズに行うこともできる
し、連続的に比率を変える、いわゆるグラジェント法で
行うこともできる。

ここで言うＡ液は、１０〜５００ｍＭの緩衝用基剤を有
し、１．２−シスジオールを有する物質を含有しないｐ
Ｈ７，５〜９．５の水溶液が好ましい。緩衝用基剤とし
ては、ｐＨ７，５〜９．５において緩衝能を有する基剤
が好ましいが、特に好ましい基剤としては、酢酸アンモ
ニウム等のアンモニウム塩、モルフォリン、Ｎ−２−ヒ
ドロキシエチルピペラジンＮ’　−２−エタンスルホン
酸等を挙げることができる。これらの緩衝用基剤は、ジ
ヒドロキシボロニル基と糖化アルブミンや糖化ヘモグロ
ビンなどの糖化タンパク質の糖の部分の結合を強めるこ
とができるため、糖化アルブミンや糖化ヘモグロビンな
どの糖化タンパク質と、非糖化タンパク質を硬度に分離
するのに有効である。

ｐＨが７．５より低いと、ジヒドロキシボロニル基と糖
の結合が弱くなり好ましくない。また、ｐＩ］が９．５
より高くなると、アルブミンやヘモグロビン等のタンパ
ク質が変性し、沈澱を生ずるおそれがあり好ましくない
。また、Ａ液は緩衝用基剤以外の塩を含むことができる
。特に、二価金属イオンの塩、例えば、塩化マグネシウ
ム等を含むことにより、糖鎖とジヒドロキシボロニル基
の結合を強めることができ好ましい。二価金属イオンの
塩の濃度は、好ましくは５ｍＭ〜１００ｍＭである。

１価金属イオンの塩、例えば、塩化ナトリウム等も含む
ことができ、その濃度は、好ましくは５００ｍＭ以下で
ある。

一方゛、−Ｂ液は１０〜５００ｍＭの緩衝用基剤を有す
るｐＨ２〜６．５の水溶液が好ましく、ｐＨ７゜５以上
でも１．２−シスジオールを有する物質を含んでいれば
よい。その場合もｐｉ（９，５以下が好ましい。この条
件を用いると、ジヒドロキシボロニル基と糖鎖の結合を
弱めることができ、ジヒドロキシボロニル基に結合した
糖化アルブミンや糖化ヘモグロビン等の糖化タンパク質
を溶出させることができる。

緩衝用基剤としては、使用ｐ　Ｈにおいて緩衝能を有す
る緩衝用基剤が好ましいが、特に好ましい例として、ト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トリエタノー
ルアミン等を挙げることができる。これらの緩衝用基剤
は、ジヒドロキシホロニル基と糖鎖の結合を弱めること
ができ、ジヒドロキシボロニル基と結合した糖化タンパ
ク質の溶出を容易にする。

１．２−シスジオールを有する物質としては、例えば、
ソルビトール、マンニトール等の糖類を挙げることがで
きる。１．２−シスジオールを有する物質の濃度は、５
０〜２０００ｍＭが好ましい。

さらに、Ａ液が二価金属イオンの塩を含有する場合は、
Ｂ液にエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等の金属キ
レート剤を添加することが好ましい。その場合、金属キ
レート剤の濃度は５〜１００ｍＭが好ましい。Ａ、Ｂ両
液共に、例えば、エタノール、メタノール、アセトニト
リル、エチレングリコール等の水溶性の有機溶媒を少量
含有している方が好ましい場合がある。

本発明で用いるカラムの形状は特に限定はされないが、
好ましくは内径１０ｍｍ以下、長さ３０ｃｍ以下が好ま
しく、内径２〜８　ｍｍ、長さ１〜１０ｃｍが特に好ま
しい。移動相の流量も特に限定はないが、０．１〜１０
蔵／ｍｉｎが好ましく、特に好ましくは０．３〜５Ｉｎ
ｉ／ｌｌｌ１ｎである。

本発明における流路切換手段は、糖化アルブミン分離部
分と糖化ヘモグロビン分離部分を切り換えることができ
るものであれば、特に限定されないが、四方切換バルブ
等の流路切換手段が好ましい。

零発°明、においては、第１カラムの出口に、例えば、
紫外吸収検出器、蛍光検出器等を接続することにより、
ヘモグロビンとアルブミンの分離を検出することができ
る。

また、第２カラムの出口には、紫外吸収検出器、蛍光検
出器、可視吸収検出器等を接続することにより、糖化ヘ
モグロビンと非糖化ヘモグロビンをそれぞれ検出、定量
することができる。この時に可視吸収検出器を用いると
、他の成分が混入していても、糖化ヘモグロビンおよび
非糖化ヘモグロビンを特異的に検出、定量することがで
きる。第３カラムの出口には、紫外吸収検出器、蛍光検
出器等を接続することにより、糖化アルブミンと非糖化
アルブミンをそれぞれ検出、定量することができる。

（発明の効果） 本発明の糖化タンパク質の分離方法は、同一試料中の糖
化アルブミンと糖化ヘモグロビンを、１回の試料注入操
作のみで分離、定量することができる。

従来、糖化アルブミンと糖化ヘモグロビンは、別々の方
法で分析されてきたが、本発明の方法により、迅速、簡
便に、糖化アルブミンと糖化ヘモグロビンの分析が可能
になった。

本発明の方法は、自動化が可能であり、再現性もよいた
め、一般の臨床検査の場での分析が可能である。

（実施例） 以下に、第１図のフローダイアダラムによる本発明の一
実施例を示すが、本発明は、この実施例により限定され
るものではない。

第１カラムとしてアミノ基を有するイオン交換ゲル充填
カラム、第２カラムおよび第３カラムとしてジヒドロキ
シボロニル基を導入したゲルを充填したカラムを使用し
た例を示す。

第１カラムは、特開昭６０−１５０８３９号公報の実施
例１に記載のゲル（重量平均粒径９．０μｍ、水酸基密
度４．　９ｍｅｑ／ｇ　、保持できる水の量がｉ’、−
９ｇ／ｇ、ジエチルアミノ基が０，５ｍｅｑ／ｇ　）を
内径７．　６ｍｍ、長さ１００閣のステンレス製カラム
に充填したものを用いた。

第２カラムおよび第３カラムは、次のようにして作成し
たものを用いた。

特開昭５７−３０９４５号公報の実施例１に記載のビニ
ルアルコールポリマーゲル（Ｘ；０．３、水酸基量；　
７．　８ｍｅｑ／ｇ　、保持し得る水の量；ｌ。

７８ｇ／ｇ、比表面積；７８ボ／ｇ、粒径１９゜０μｍ
）２５ｇに、エピクロルヒドリン１１６゜８ｇ１ジメチ
ルスルフオキシド２５０成、ＩＯＮ水酸化ナトリウム水
溶液１２．５ｄを加え、３０°Ｃで２０時間反応させた
。エポキシ基の導入量は１　、　０　ｍｅｑ／ｇであっ
た。なお、エポキシ基の定量法は、特開昭５７−１９０
００３号公報に記載の方法で行った。

次に、ｍ−アミノフェニルボロン酸ヘミ硫酸塩１３ｇを
２５０　ｍｌｌの水に溶解し、ｐＨ１１としたものに先
のエポキシ基導入ポリマー２０ｇを加え、６０゛Ｃで２
００時間反応行った。次に、残存エポキシ基を保護する
ために２５ｍＭ）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ンを加え、５０″Ｃで５時間反応を行った。ボロン酸の
導入量は０．２８ｍｅｑ／ｇであった。ボロン酸の定量
は以下の方法によった。

上記のｍ−アミノフェニルボロン酸を導入したポリマー
１ｇに３０％過酸化水素水１０ｄを加え、５時間反応さ
せることによって、ホウ素〜炭素結合を切断した。次に
、ポリマーを遠沈し、その上清を採取した。これを脱炭
酸後、糖を加えることによってホウ酸エステルを形成さ
せ、強酸化し、水酸化ナトリウムで滴定することによっ
てホウ酸を定量した。

なお、この分析に用いた器具は、すべて石英製である。

ｍ−アミノフェニルボロン酸を導入した共重合体の水酸
基密度は９．　２ｍｅｑ／ｇ　　（ジヒドロキシボロニ
ル基切断後）、保持し得る水の量は１．７０ｇ／ｇであ
った。また、粒径、比表面積は導入前と同じであった。

なお、保持し得る水の量および比表面積は、特開昭５７
−３０９４５号公報に記載の方法で求めた。

上記のアミノフェニルボロン酸導入共重合体を内径４．
６［１１１１１，長さ１００ｍｍのステンレス製カラム
に充填し、第２カラムおよび第３カラムとした。

このフローダイアグラムによる分析について説明すると
、流路切換により以下に示すステップに分かれて作動す
る。

ステップ■（試料注入から、第１カラムで分離されたヘ
モグロビンの第２カラム への導入まで） 流路切換手段を実線流路にしておき、移動相Ａ液を送液
ポンプ１により送液し、試料注入部から試料を注入する
。注入された試料は、第１カラムに導入される。第１カ
ラムで分離されたヘモグロビンは、検出器１から出た後
、流路切換手段を介して第２カラムに導入される。

ステップ■（第１カラムで分離されたアルブミンの第３
カラムへの導入） 第１カラムにより分離された試料中のアルブミンが検出
器１を通過した後、流路切換手段は破線流路に切り換え
られ、その結果、検出器１からの溶出液は、流路切換手
段を介して第３カラムに送られる。

ステップ■（第２カラムによる糖化ヘモグロビンと非糖
化ヘモグロビンの分離） 流路切換手段は破線流路の状態で、送液ポンプ２が移動
相をＡ液からＢ液への直線グラジェントにより送液する
。この時、第２カラムから非糖化ヘモグロビン、糖化ヘ
モグロビンの順に溶出され、検出器２により検出される
。

ステップ■（第３カラムによる糖化アルブミンと非糖化
アルブミンの分離） 流路切換手段は破線流路の状態で、送液ポンプ１により
移動相Ａ液が第３カラムに送られて、非糖化アルブミン
が第３カラムから溶出される。次に、移動相Ｂ液が送液
ポンプｌにより送液され、糖化アルブミンが第３カラム
から溶出される。非糖化アルブミンおよび糖化アルブミ
ンは、検出器３によ゛り検出される。

なお、ステップ■とステップ■は、ステップＨの終了後
、続いて同時に行われる。

ステップＶ（カラムの再生） 送液ポンプ１および２が、それぞれ移動相Ａ液を送液し
て、第１カラム、第２カラムおよび第３カラムを再生す
る。各カラムの再生が終了すると、流路切換手段は実線
流路に切り換えられ、次の分析に備えられる。

上記の各ステップにより、糖化アルブミンおよび非糖化
アルブミン、さらに、糖化ヘモグロビンおよび非糖化ヘ
モグロビンを含む試料の分析を行った一例を示す。分析
条件は以下のとおりである。

試　料：固形分を除いた健常者溶血液（５μ℃）移動相
：　（Ａ液）　２５０ｍＭ酢酸アンモニウム、５０ｍＭ
塩化マグネシウムおよび５００ｍＭ 塩化ナトリウムを含む水溶液（ｐ ）１　ａ、５）／エタノール＝９５１５（Ｂ液）　１０
０ｍＭ　　トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、
１００ｍＭソル ビトール、５００ｍＭ塩化ナトリウ ム、および５０ｍＭ　ＥＤＴＡ　２Ｎａを含む水溶液（
ｐＨ８，５） 流　量：ｌＯｄ／分 温度：３０°Ｃ 検出器：検出器１および検出器３；蛍光検出器。

励起波長２８５　ｎｍ　、蛍光波長３４０　ｎｍ検出器
２：可視吸収検出器、波長４１５ｎｍこの結果を第２図
、第３図および第４図に示す。

第２図は第１カラムによる、ヘモグロビンを含むフラク
ションとアルブミンの分離の結果を、第３図は第２カラ
ムによる、糖化ヘモグロビンと非糖化ヘモグロビンの分
離の結果を、第４図は第３カラムによる、糖化アルブミ
ンと非糖化アルブミンの分離の結果を示すものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の糖化タンパク質の分離方法の一例のフ
ローダイアダラム、第２図、第３図および第４図は、本
発明の分離方法により試料の分析を行って得られたクロ
マトグラムである。 ほか１名 第３図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 糖化アルブミンおよび糖化ヘモグロビンを含む試料中の
   糖化アルブミンおよび糖化ヘモグロビンを、液体クロマ
   トグラフィーにより分離する方法において、流路切換手
   段により接続された糖化アルブミン分離部分と糖化ヘモ
   グロビン分離部分の両方を有する分離システムに、１回
   の試料注入操作により、糖化アルブミンおよび糖化ヘモ
   グロビンの分離結果を得ることを特徴とする糖化タンパ
   ク質の分離方法。