JPH0245759A - 糖化アルブミン分析用装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野ン 本発明は、試料中のアルブミンの分離と、糖化アルブミ
ンと非糖化アルブミンの分離を、クロマトグラフィーの
同−流路内で行う糖化アルブミンの分析装置に関する。

糖尿病のような長期間血糖値が高値を示す疾患では、さ
まざまな生体中の蛋白質が非酵素的に糖化反応を受ける
１、血清アルブミンもそれらの蛋白質の一つである。

糖化アルブミンは、その半減期が１７日であり、３ケ月
前の空腹時血糖値とよく相関する指標となると言われる
糖化ヘモグロビンと比較すると、血糖状態に速やかに応
答するし、また、血糖値のように一時的な生理条件の影
響を受けて大きく変動することもない。糖尿病の診断で
は、数週間〜１ケ月程変曲の血糖状態の情報が有用であ
るため、糖化アルブミンはこの要求に最も応え得る指標
として、最近各方面から注目を浴びている。

例えば、糖化アルプミ／は現行の、または新たに変更し
た食餌療法が、その患者に適当か否かを早期に判定する
のに有効である等、その有用性が示唆されている。〔ケ
イ・エフ・マクファーラン）ｅ・ダイアペッツ（Ｋａｙ
　Ｆ　、Ｍｃｆａｒｌａｎｄ　ａｔａｌ　、ＤＩＡ−Ｂ
ＥＴＳン、　２ｇ、　１０１１．１９７９、シー・アー
ル・ガスロウ、ブロク・ナタル・アカビ・サイ、ニー・
ｘ　ス−ｘ　−（Ｃ−Ｅａｒｌ　Ｇｕｔｈｒｏｗ　ｅｔ
ａｌ、　Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ。

Ｓｅｉ　、ＵＳＡ）　、　７６、　ｓｎ９　、４２５８
．１ｓ７９　］（従来の技術） 従来、糖化アルブミンの分離方法および検出方法として
は、カルボキシメチル型セルロース等ヲ固定相として用
いるイオン交換クロマトグラフィー（シェームス・エフ
・ティ・ジエー・バイオ・ケＡ　（Ｊａｍｅｓ　Ｆ、Ｄ
ａｙ　ｅｔａｌ　Ｊ、Ｂｌｏ、Ｃｈｅｍ、）　、　２５
４．　随３、５９５．１９７９）、セルロース等の軟質
ゲルにジとドロキシボロニル基を導入し、この官能基と
グルコースとの相互作用を利用するアフイニテイーク四
マドグラフィー〔エイ・ケイ・マリア、アナリイテイカ
ルーｖターズ（Ａ、に、Ｍａｌｌｉａ　　ｅｔａｌ、Ａ
ｎａｌｙ−ｔｉｃａｌ　Ｌｅｔｔ＠ｒｓ）、　１４　（
Ｂ８）　、　６４９〜６６１．１９８１）等が試みられ
ている。

上記従来技術は、糖化アルブミンと非糖化アルブミンの
分離は可能であるが、それらと血清、血漿など体液中の
他の成分、例えば、免疫グロブリン類（ＩｇＧ、ＩｇＭ
等）、ノ・ブトグロビン、トランスフェリン等との分離
ができず、実質的に体液中の糖化アルブミンと非糖化ア
ルブミンを定食することはできない、。

したがって、従来は試料中からアルブミンを単離した後
、−旦クロマトグラフイーの系外に出し、濃縮後、改め
て糖化アルブミンと非糖化アルブミンを分離できるカラ
ムに導くという方法がとられていた。すなわち、試料中
からアルブミンを分離する操作と、アルブミンを糖化ア
ルブミンと非糖化アルブミンとに分離する操作が、少な
くとも２段階の別個の操作として行われており、煩雑で
長時間を要していた。

これらのことが、迅速性、操作性、再現性および自動化
が要求される臨床検査の場で、現在Ａ糖化アルブミンが
測定されず、また、そのための分析装置もない最大の原
因である。

ここで、これらの問題点を克服した糖化アルブミンの分
析方法として、特開昭６２−２２６９９９号公報に記載
の方法がある。すなわち、第１カラムで試料中からアル
ブミンを分離し、それをクロマトグラフィーの流路系外
に出すことなく第２カラムに導き、そこでアルブミンを
糖化アルブミンと非糖化アルブミンとに分離すること全
特徴とするクロマトグラフィーによる糖化アルブミンの
分離方法である。

上記特開昭６２−２２６９９９号に記載の実施例によれ
ば、非糖化アルブミンと糖化アルブミンは、３０分以内
で分離される。しかし、分析が終了して、次の分析全開
始するまでに、第１カラムと第２カラム金再生するため
の時間を要するため、分析サイクルは長くなり、そのた
め、臨床検査の場で用いるには、特に迅速性の点で、ま
だ、問題が残っていた。

この問題を克服した分析装置として、Ｉｒｉ願昭６３−
８２９９７号に記載の糖化アルブミン分析装置がある。

すなわち、液体クロマトグラフィーにより、試料中の糖
化アルブミンと非糖化アルブミンを分離分析する装置に
おいて、■試料中からアルブミンを分離する第１カラム
、■該アルブミンを糖化アルブミンと非糖化アルブミン
に分離する第２カラム、■第１カラムの下流と第２カラ
ムの上流の間に存在する流路切換手段を介して、第１カ
ラムと第２カラムが連結されている第１流路、および、
■第１カラムの上流に存在する流路切換手段と、上記（
３）の流路切換手段を介して、第１流路に連結されてい
る第２流路を有すること全特徴とする糖化アルブミン分
析装置である。

上記装置により、従来は長時間ｔ−要した１回の分析時
間は大幅に短縮された。

ところで、上記装置では、第１カラムでのアルブミンの
分離の状況を確認するためには、第１カラムの出口と流
路切換手段との間にモニター用の検出器を備える、すな
わち、１つの装置に検出器を２台備える必要があり、迅
速性、操作性が要求される臨床検査用の装置では、検出
益金２台備えることによる、分析時間の増大やメンテナ
ンスの煩雑さは、無視できない問題となる場合が多い。

そこで、本発明者らは、上記の問題を解消するため鋭意
検討の結果、検出器を１台用いて、迅速性、操作性、再
現性にすぐれ、しかも、自動化された糖化アルブミンと
非糖化アルブミンの分析装置を開発し、本発明を完成す
るに至った。

すなわち、本発明は、液体クロマトグラフィーにより、
試料中の糖化アルブミンと非糖化アルブミンを分離分析
する装置において、■試料中からアルブミンを分離する
第１カラム、■該アルブミンを糖化アルブミンと非糖化
アルブミンに分離する第２カラム、■第１カラムの上流
に存在する第１の流路切換手段、■第１力２ムの下流と
第２カラムの上流の間に存在する第２０流路切換手段、
■第２カラムの下流に存在する第３の流路切換手段、■
上記（４）の第２の流路切換手段を介して、第１カラム
と第２カラムが連結されている第１流路、■上記（３）
の第１０流路切換手段と上記（４）の第２０流路切換手
段を介して第１流路に連結されている第２流路、■上記
（４）の第２０流路切換手段と上記（５）の第３の流路
切換手段を介して第１流路に連結されている第３流路、
および、■上記（５）の第３の流路切換手段の下流に連
結された検出器を有することを特徴とする糖化アルブミ
ン分析用装置である。

本発明において、糖化アルブミンとは、ダルコースと共
有結合したアルブミン、非糖化アルブミンとはダルコー
スと結合していないアルブミンを言う。

また、本発明で言うアルブミンとは、糖化アルブミンと
非糖化アルブミンの両方を指す。

本発明で言う試料とは、少なくとも糖化アルブミンと非
糖化アルブミンのどちらか、もしくはその両方を含有す
るもので、例えば、血清、崩漿、溶血液、尿等の体液を
挙げることができる。

本発明で用いる第１カラムは、アルブミンと体液中のそ
の他の成分を分離できるカラムであればよく、特に限定
されない。好ましい例として、アルブミンと親和性の高
い色素シバクロン、ブルーＦ３Ｇ−Ａ等を結合させたゲ
、Ａ／を充填したカラム、血清中の大量成分であるＩｇ
Ｇ（分子量：約１５万）とアルブミン（分子量：約６．
６万）とを分離できるゲル濾過用充填カラム、アミノ基
を有するイオン交換ゲル充填カラム等が挙げられる。

ただし、シバクロン傘ブルー等のアルブミンと親和性の
高い物質を導入する担体およびゲルテ適用固定相担体と
しては、機械的強度、化学的安定性にすぐれ、タンパク
質の非特異吸着が少ないという理由で、架橋共重合体重
量轟たりアルコール性水酸基１−０〜１４．Ｏｍｅｑ／
Ｐ、比表面積５〜１０００ｄ／　’　％　　保持し得る
水の量が０．５〜６．ｒ）ｔ／ｌである硬質の親水性架
橋共重合体が好ましい。最も好ましい例として、特開昭
５７−３０９４５号公報記載のビニルアルコール単位由
来のアルコール性水酸基を有する架橋共重合体を挙げる
ことができる。

あるいは特開昭５６−６４６５７号および＠開昭５９−
１４５０３６号公報記載の架橋共重合体も好ましい。

該親水性架橋共重合体にアミノ基を導入する方法として
拡、例えば、次の方法を挙げることができる。すなわち
、上記の親水性架橋共重合体とエピハロヒドリンビスエ
ボキシド等全反応させ、エポキシ基含有条種共重合体を
得、ついで、アンモニア、エチルアミン等の一級アミン
、ジエチルアミン等の二級アミンを反応させることＫよ
って得ることができる。

アミノ基としては、置換基を有しないアミノ基、エチル
アミノ基等の一置換アミノ基、ジエチルアミノ基等の二
置換アミノ基を挙げることができる。

アミノ基の量は、架橋共重合体重量轟たり０．０２〜５
　、０　ｍｅｑ／ｆであり、好ましくは０　、０５〜２
　、Ｏｒｘｈｅｑ／ｆであり、さらに好ましくは０．２
〜１．０ｍｅｑ／Ｐである。

チバクロンブルーＦ３Ｇ−Ａを導入する方法としては、
例えば、該親水性架橋共重合体の水酸基にプ四ムシアン
を反応させ、ついで、チバクロンブルーＦ３Ｇ−Ａを反
応させる方法を挙げることができる。

チバクロンブルーＦ３Ｇ−Ａの量は、架橋共重合体重量
当たり０．００２〜１．０　ｍｅｑ／ｆであり、好まし
くは０．００５〜０　、０５　ｍｅｑ／ｒである。

これらのゲルのうち、親水性架橋共重合体にアミノ基を
導入したゲルが特に好ましい。

本発明で用いる最も好ましい例として、特開昭６０−１
５０８３９号公報記載のビニルアルコール単位由来のア
ルコール性水酸基とジェチルアミノ基を有する架橋共重
合体を挙げることができる。この架橋共重合体は、特願
昭６０−１２２２号記載の方法により、アルブミンと体
液中の他の成分を迅速に分離することが可能である。

本発明で用いる第２カラムは、イオン交換ゲルまたはジ
ヒドロキシボロニル基を有するゲルを充填したカラ五等
が挙げられるが、少なくとも糖化アルブミンと非糖化ア
ルブミンが分離できればよく、ｔＲＫ限定されない。

イオン交換ゲ、／Ｉ／を用いる場合、言うまでもなく、
糖化アルブミンと非糖化アルブミンのわずかな等電点の
差を利用するわけであるが、イオン交換基は陽イオン交
換基の方が好ましく、中でもカルボキシル基、スルホン
酸基等が待に好ましい。

また、ジヒドロキシボロニル基は、１，２−シスジオー
ルを有する化合物と特異的に結合するため、この官能基
を有するゲルを固定相としたアフィニティークロマトグ
ラフィーも、糖化アルブミンと非糖化アルブミンの分離
に有効である。

これらの官能基を導入する固定相担体としては、従来液
体クロマトグラフィー用固定相担体として一般的に用い
られているセルロース、アガロース等の多糖類の軟質ゲ
ル、シリカゲル、スチレン−ジビニルベンゼン系共重合
体等が挙げられるが、機械的強度、化学的安定性にすぐ
れ、タンパク質の非特異吸着が少ないという点で、架橋
共重合体重量当たりアルコール性水酸基１．０〜１４．
Ｏｒｎｅｑ／１１比表面積５〜１００Ｇ＆／ｆ、保持し
得る水の量が０．５〜６．Ｑｔ／ｆである硬質の親水性
架橋共重合体が好ましい。最も好ましい例として、燭開
昭５７−３０９４５号、特開昭５６−６４６５７号およ
び特開昭５４−１４５０３６号公報記載の架橋共重合体
を挙げることができる。

上記の親水性架橋共重合体にジヒドロキシボロニル基を
導入する方法としては、次の方法を挙げることができる
４、すなわち、上記の親水性架橋共重合体とエピハロヒ
ドリン、ビスエポキシド等を反応させ、エポキシ基含有
架橋共重合体を得、ついで、メタアミノフェニルポロン
酸を反応させることによって得ることができる。

また、カルボキシル基を導入する方法としては、例えば
、モノクロロ酢酸やモノブロモ酢酸等のハロゲン化酢酸
を、該親水性架橋共重合体の水酸基と反応させる方法を
挙げることができる。

さらに、スルホン酸基を導入する方法としては、例えば
、プロパンスルトンを該親水性架橋共重合体の水酸基と
反応させる方法を挙げることができる。

ジヒドロキシボロニル基の量は、架橋共重合体重量当た
１７０　、０５〜５．０　ｍｅｑ／Ｐであり、好ましく
ｕ　０　、０５〜３．０　ｍｅｑ／ｆ　、さらに好まし
くはＯ，ｉ　〜２．０ｍｅｑ／Ｐである。

カルボキシル基また社スルホン酸基の量は、架橋共重合
体重量当たり０ｏ０２〜５．０　ｍｅｑ／ｆであり、好
ましくは０．０５〜２．０　ｍｅｑ／ｆであり、さらに
好ましくは０．２〜１．０　ｍｅｑ／ｆである。

これらのゲルのうち、親水性架橋共重合体にジヒドロキ
シボロニル基を導入したゲルが％に好ましい。本発明で
用いる最も好ましい例として、特開昭６２−１９２４０
５号公報記載のアルコール性水酸基とジヒドロキシボロ
ニル基を有するホウ素含有架橋共重合体を挙げることが
できる。

本発明において用いられる官能基を固定化したゲルの形
状は、球状、破砕状等種々挙げることができるが、好ま
しくは球状である。その場合、重量平均粒径は１〜５０
０μｍであり、好ましくは１〜２０μｍ１さらに好まし
くは１〜１０μｍである。

本発明の装置の一例のフローダイアダラムを第１図に示
して、第１力２ム、第２カラム、第１流路、第２流路お
よび第３流路の関係を説明する。

第１図において、通常の糖化アルブミン分析の場合は、
次に示すように流路が切換えられることＫなる。すなわ
ち、移動相のＡ液が送液ポンプによＬ第１の流路切換手
段を介して第１流路に送られ、試料注入部より注入され
た試料は、移動相とともに第１カラムに送入され、試料
中のアルブミンと他の成分が分離される。次いで、第２
の流路切換手段により、第１カラムで分離されたアルブ
ミンのみがｗｃ２カラムに送入される。該アルブミンが
第２カラムに送入された後、第１０流路切換手段および
第２の流路切換手段により流路が切換えられ、送液ポン
プから送液される移動相は、第２流路を通って第２の流
路切換手段を介して第２カラムに送入される。移動相を
Ａ液からＢ液に切換えること忙より、第２カラムで糖化
アルブミンと非糖化アルブミンは分離され、検出器に送
入される。その後、移動相はＢ液からＡ液に切換えられ
、第２流路を通って第２の流路切換手段を介して第２カ
ラムに送られ、第２カラムを再生する。

第２カラムの再生が終了すると、第１の流路切換手段お
よび第２の流路切換手段により流路が切換えられ、移動
相は第１流路に送られ、次の分析が可能になる。

次に、第１カラムでのアルブミンの分離の確認をする場
合には、次に示すように流路が切換えられる。すなわち
、移動相のＡ液が送液ポンプにより、第１の流路切換手
段を介して第１流路に送られ、試料注入部より注入され
た試料は、移動相とともに第１カラムに送入される。第
１カラムから出た溶出液は、第２０流路切換手段を介し
て第３流路を通り、第３の流路切換手段を介して検出器
に送入される。

なお、糖化アルブミン分析の場合に、分析全開始して第
１カラムで試料中のアルブミンを分離し、該アルブミン
を第２カラムに送入するまでの時間も、もう１台の送液
ポンプを用いて第２カラムの再生に利用することができ
る。

次に、本発明で用いる移動相について述べる。

糖化アルブミンと非糖化アルブミンを分離するための充
填剤として、ジヒドロキシボロニル基カ固定化されたゲ
ルを用い、アルブミンとその他の成分を分離するための
充填剤として、アミノ基が固定化されたゲルを用いる場
合は、少なくとも２種類の移動相（Ａ液とＢ液）を用意
し、途中でＡ液からＢ液に切り換える方法を好ましい方
法として挙げることができる。Ａ液からＢ液への切り換
えは、ステップワイズに行うこともできるし、連続的に
比率を変える、いわゆるグラジェント法で行うこともで
きる。

ここで言うＡ液は、１０〜５００　ｍＭの緩衝用基剤を
有し、１，２−シスジオールを有する物質を含有しない
ｐＨ７，５〜９．５の水溶液が好ましい。

緩衝用基剤としては、ｐＨ７，５〜９．５において緩衝
能を有する基剤が好ましいが、特に好ましい基剤として
は、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩、モルフォリ
ン、Ｎ−２−ヒドロキシェチルピはラジンＮ／　　２−
エタンスルホン酸等ヲ挙ケることができる。これらの緩
衝用基剤は、ジヒドロキシボロニル基と糖化アルブミン
などの糖化タンパク質の糖の部分の結合を強めることが
できるため、糖化アルブミンなどの糖化タンパク質と、
非糖化タンパク質を高度に分離するのに有効である。

ｐＨが７．５より低いと、ジヒドロキシボロニル基と塘
の結合が弱くなり好ましくない。また、ｐＨが９．５よ
り高くなると、アルブミン等のタンパク質が変成し、沈
澱を生ずるおそれがあり好ましくない。また、Ａ液は緩
衝用基剤以外の塩を含むことができる。判に、二価金属
イオンの塩、例えば、塩化マグネシウム等を含むことに
より、糖鎖とジヒ）”Ｅｌ”ホロニル基の結合音強める
ことができ好ましい。二価金属イオンの塩の濃度は、好
ましくは５〜１ｏｏｍＭである。１価金属イオンの塩、
例えば、塩化ナトリウム等も含むことができ、その濃度
は、好ましくは５００ｍＭ以下である。

一方、Ｂ液は１０〜５００　ｍＢ／Ｉの緩衝用基剤を有
するｐＨ２〜６．５の水溶液が好ましく　、ＰＨ７，５
以上でも１．２−シスジオールを有する物質を含んでい
ればよい。その場合もＰＨ９，５以下が好ましい。この
条件を用いると、ジヒドロキシボロニル基と糖鎖の結合
を弱めることができ、ジヒドロキシボロニル基に結合し
た糖化アルブミン等の糖化タンパク質を溶出させること
ができる。

緩衝用基剤としては、使用ｐＨにおいて緩衝能を有する
緩衝用基剤が好ましいが、特に好ましい例として、トリ
ス（ヒト９０キシメチル）アミノメタン、トリエタノー
ルアミン等を挙げることができる。これらの緩衝用基剤
は、ジヒドロキシボロニル基と糖鎖の結合を弱めること
ができ、ジヒドロキシボロニル基と結合した糖化タンパ
ク質の溶出を容易にする。

１．２−シスジオールを有する物質としては、例えば、
フルビトール、マンニトール等の糖類を挙げることがで
きる。１，２−シスジオールを有スる物質の濃度は、５
０〜２０００ｍＭが好ましい。

さらに、Ａ液が二価金属イオンの塩を含有する場合は、
Ｂ液にエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ人）等の金属キ
レート剤を添加することが好ましい。その場合、金属キ
レ−・ト剤の濃度は５〜ｉｏＯｍＭが好ましい、Ａ、Ｂ
両液共に、例えば、エタノール、メタノール、アセトニ
トリル、エチレングリコール等の水溶性の有機溶媒を少
量含有している方が好ましい場合がある。

本発明で用いるカラムの形状は豹に限定はされないが、
内径１０−以下、長さ３０６１１以下が好ましく、内径
２〜８■、長さ１〜１０１：ｍが特に好ましい。移動相
の流量も＊に限定はないが、０．１〜１０１１１／ｍｉ
ｎが好ましく、特に好ましくは０．３〜５ｍｌ／　ｍｉ
ｎ　　である。

本発明における流路切換手段は、第１流路と第２流路お
よび第１流路と第３流路を切り換えることができるもの
であれば、特に限定されないが、三方切換パルプ、四方
切換ノＺルプまたは六方切換パルプ等の流路切換手段が
好ましい。

本発明においては、第３の流路切換手段の下流に、例え
ば、紫外吸光検出器、螢光検出器等を接続することによ
り、通常の糖化アルブミン分析の場合には糖化アルブミ
ン、非循化アルブミンを、また、第１カラムでのアルブ
ミンの分ＳＯ確認の場合には、アルブミンとその他の成
分をそれぞれ検出、定量することができる。

（発明の効果） 本発明の糖化アルブミン分析用装置は、１回の試料注入
操作のみで、試料中の糖化アルブミンと非糖化アルブミ
ンを短時間で、分離、定量することができるが、糖化ア
ルブミン分析に用いたのと同じ検出器を用いて、第１カ
ラムてのアルブミンの分離を確認することができる。

また、本発明では、第１カラムには一定組成の移動相が
流れているため、また、分析後の第２カラム再生のため
の移動相は、第１カラム全経由せずに短い流路を通って
第２カラムに達するために、分析が終了して次の分析の
開始までの時間が大幅に短縮された。

さらに１本発明では、第１カラムから出た移動相が第２
カラムを経由せずに検出器に送られる流路を通ることが
できるため、糖化アルブミン分析の合間に第１カラムで
のアルブミン分離の確認を短時間で正確におこなうこと
ができる。

本発明では、１台の検出器を、流路切換により糖化アル
ブミン分析と、第１カラムでのアルブミン分離のどちら
かに用いることができるため、２台の検出器を用いて、
ｒｇ１カラムでのアルブミン分離を確認しながら糖化ア
ルブミンを分析するのに比べ、分析時間を大幅に短縮し
、装置のメンテナンスの手間を軽減した。

本発明の装置は、自動化が可能であり、その結果、迅速
、簡便に１かつ再現性よく、糖化アルブミンと非糖化ア
ルブミンの分析ができる。

（実施例） 本発明の一実施例を第２図に示す構成説明図に基づいて
説明する。

第２図において、１は移動相Ａ液相容器、２は移動相Ｂ
液用容器で、その流路は、移動相切換ノｚルプ３および
ポンプ４ｔ−介して流路切換パルプＡ５に連結し、該流
路切換パルプＡ５からの第１流路ＫＦｉ、試料注入部６
、第１カラム丁、流路切換パルプＢ８、第２カラム９、
流路切換パルプ１Ｇ。

および螢光検出器１１が連結され、流路切換／ｅルプＡ
５と流路切換パルプＢ８を介して、上記第１流路に連結
された第２Ｅ路１２がまた、流路切換バルブＢ８と流路
切換パルプＣＩＯ′ｆ！：介して、上記第１流路に連結
された第３流路１３が形成されている。１４はデータ処
理機、１５は試料冷却機、１６はカラム用恒温槽、１７
Ｖｉ自動制御システムである。

第１カラム７は、特開昭６０−１５０８３９号公報の実
施例ＩＫ記載のゲル（重量平均粒径９．０μｍ１水酸基
密Ｕ　４．９　ｍｅｑ／ｒ、保持できる水の量が１．９
ｆ／２、ジエチルアミノ基が０．５　ｍｅｑ／ｌ　）を
内径７．６１１１１１．長さ１００ｍのステンレス製カ
ラムに充填したものを用いた。

第２力２ム９は、次のようにして作成したものを用いた
。即ち、特開昭５７−３０９４５号公報の実施例１に記
載のビニルアルコールコポリマーゲル（Ｘ；０．３、水
酸基量；　７−８　ｍｅ　ｑ／ｌ　Ｎ保持し得る水の量
：　１−７８　’／’　Ｎ比表面積；７８♂／ｆ、粒径
：９．０μｍ）２５１に、エビクロルヒドリ７１１６．
８２１ジメチルスルフオキシド２ｓｏｗｔ、１ｏＮ水酸
化ナトリウム水溶液１２．５−を加え、３０℃で２００
時間反応せた。エポキシ基の導入量は１．０ｍｅｑ／ｌ
であった。なお、エポキシ基の定置法は、特開昭５７−
１９０００３号公報に記載の方法で行った。次に、ｍ−
アミノフェニルボロン酸ヘミ石１１２塩１３ｆを２５０
ｄの水に溶解し、ｐＨ１１としたものに先のエポキシ基
導入ポリマー２Ｏｆを加え、６０℃で２０時間反反応性
った。次に、残存エポキシ基全保護するために２！Ｓｍ
Ｍ）リス（ヒｒロキクメチル］アミノメタンを加え、５
０℃で５時間反応を行った。ボロン酸の導入量は０．２
８ｍｅｑ／ｆであった。ボロン酸の定量は以下の方法に
よった。

上記のｍ−アミノフェニルボロンａｔ導入したポリマー
１ｆに３０％過酸化水素水１０−を加え、５時間反応さ
せることによって、ホウ素−炭素結合を切断した。次に
、ポリマーを遠心分離により沈澱させ、その上清を採取
した。これを脱炭酸後、糖を加えることＫよってホウ酸
エステルを形成させ、強酸化し、水酸化す）　ＩＪウム
で滴定することによってホウ酸全定量した。なお、この
分析に用いた器具は、すべて石英製である。ｒｎ−アミ
ノフェニルボロン酸を導入した共重合体の水酸基密度ｉ
ｊ　９　、２　ｍｅｑ／ｆ　（ジヒドロキシボ四ニル基
切断後）、保持し得る水の量は１．７０　ｔ／ｌであっ
た。また、粒径、比表面積は導入前と同じであった。な
お、保持し得る水の量および比表面積は、特開昭５７−
３０９４５号公報に記載の方法で求めた。上記のアミノ
フェニルボロン酸導入共重合体を内径６■、長さ１０Ｇ
−のステンレス製カラムに充填し、第２カラムとした。

この分析装置の作動について説明すると、流路切換によ
り以下に示すステップに分かれて作動する。

作動１（第１カラムでのアルブミン分離の確認）まず、
カラム用恒温槽１６により、第１カラム丁および第２カ
ラム９を２０〜６０℃に保持しておく。試料は試料冷却
機１５により０〜１０℃に保持しておく。次いで、移動
相切換バルブ３、流路切換バルブＡ５および流路切換パ
ルプＢ８を実線流路にまた、流路切換パルプＣｘｏ２破
線流路にしておき、移動相Ａ液用容器１中の移動相Ａ液
を送液ポンプ４により、流路切換パルプＡｓ金経て送液
し、試料注入部６から試料を注入する。注入された試料
は、第１カラム７に導入され、分離された後に流路切換
バルブＢ８、第３流路１３および流路切換バルブＣ１ｏ
２介して螢光検出器１１に送られる。螢光検出器１１で
の検出結果は、データ処理機１４により処理される。

作動２（糖化アルブミンの分析） ステップ■（試料注入から第１カラムでのアルブミン分
離まで） 作動１と同様に、カラム用恒温槽１６により、第１カ２
ム７および第２カラム９を２０〜６０℃に保持しておく
。試料は試料冷却機１５により０〜１０℃に保持してお
く。次いで、移動相切換バルブ３、流路切換パルプＡ−
８５、流路切換パルプＢ８および流路切換）ｅルプＣＩ
Ｏを実線流路にしておき、移動相Ａ液剤容器ｌ中の移動
相Ａ液を送液ポンプ４により、流路切換パルプＡ５を経
て送液し、試料注入部６から試料を注入する。

ステラ７’ｌ［（試料中のアルブミンの第２カラムへの
導入） 第１カラム７により分離された試料中のアルブミンが第
１カラム７から溶出される時間になると流路切換パルプ
Ｂ８は破線流路に切換えられ、アルブミンは第２カラム
９に送られる１゜ステップ■　（第１カラムを経由しな
い流路への流路変更） 試料中のアルブミンが第２カラム９に導入された後、流
路切換パルプＡ５は破線流路に１また、流路切換パルプ
Ｂ８は実線流路に切換えられ、その結果、送液ポンプ４
からの送液は、流路切換パルプＡ５から第２流路１２を
経由して、流路切換パルプＢ８を介して第２カラム９に
送られる。

ステップＩＶ（ｍ化アルブミンと非糖化アルブミンの分
離のステップ） 次に、移動相切換パルプ３が破線流路に切換えられ、移
動相Ｂ液層容器２中の移動相Ｂ液が送液ポンプ４により
、上記ステップ■の流路を通って第２カラム９に送られ
る。第２力２ム９で分離された糖化アルブミンおよび非
糖化アルブミンは、螢光検出器１１に送られ、その検出
結果は、データ処理機１４により処理される。

ステップＶ（第２力２ムの再生） 移動相切換ノ；ルプ３が実線流路に切換えられ、移動相
Ａ液相容器１中の移動相Ａ液が送液ポンプ４により、上
記ステップ■の流路を通って第２カラム９に送られ、第
２カラム９を再生する。

なお、以上の作動は、自動制御システム１７で制御され
る。

上記装置！！、を用いて、糖化アルブミンおよび非糖化
アルブミンを含む試料の分析を行った一例を示す。分析
条件は以下の通りである。

試　料：健常者面清（５μｔ） 移動相：（Ａ液）２５０ｍＭ酢酸アンモニウム５０ｍＭ
塩化マグネシウムお よび２００　ｍＭ塩化ナトリウ ムを含む水溶液（ｐＨｓ、ｓン／ エタノール＝９５７５ （Ｂ液）　　１００　ｍＭ　）　Ｉ）　ス（ヒＦ”　Ｃ
Ｉ　キシメチル）アミノメタン、 １００ｍＭソルビトール、お よび５０　ｍＭ　ＥＤＴＡ　２　Ｎａ　ｆ含む水溶液（
ｐＨｓ、ｓ） 流　量：１．Ｏｄ／分 温　度＝３０℃ 検　出：励起波長：２ｓｓｎｍ、螢光波長：３４０圓こ
の結果を第３図および第４図に示す。第３図は第１カラ
ムによる試料中のアルブミンの分離の結果を、第４図は
第２力２ムによる糖化アルブミンと非糖化アルブミンの
分離の結果を示すものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の糖化アルブミン分析用装置の一例を示
すフローダイアダラム、第２図は本発明の装置の一実施
例を示す構成説明図、第３図および第４図は本発明の装
置を用いて試料の分析を行って得られたり四マドグラム
である。 １・・・移動相Ａ液用容器、２・・・移動相Ｂ液用容器
、３・・・移動相切換パルプ、４・・・送液ポンプ、５
・・・流路切換パルプＡ、６・・・試料注入部、７・・
・第１カラム、８・・・流路切換パルプＢ、９・・・第
２カラム、１０・・・流路切換パルプＣ，１１・−・螢
光検出器、１２・・・第２流路、１３・・・第３流路、
１４・・・データ処理機、１５・・・試料冷却機、１６
・・・カラム用恒温槽、１７・・・自動制御システム 特却出願人　旭化戊工業株式会社 第３ 図 第４ 図 （分］

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 液体クロマトグラフイーにより、試料中の糖化アルブミ
   ンと非糖化アルブミンを分離分析する装置において、（
   １）試料中からアルブミンを分離する第１カラム、（２
   ）該アルブミンを糖化アルブミンと非糖化アルブミンに
   分離する第２カラム、（３）第１カラムの上流に存在す
   る第１の流路切換手段、（４）第１カラムの下流と第２
   カラムの上流の間に存在する第２の流路切換手段、（５
   ）第２カラムの下流に存在する第３の流路切換手段、（
   ６）上記（４）の第２の流路切換手段を介して、第１カ
   ラムと第２カラムが連結されている第１流路、（７）上
   記（３）の第１の流路切換手段と上記（４）の第２の流
   路切換手段を介して第１流路に連結されている第２流路
   、（８）上記（４）の第２の流路切換手段と上記（５）
   の第３の流路切換手段を介して第１流路に連結されてい
   る第３流路および、（９）上記（５）の第３の流路切換
   手段の下流に連結された検出器を有することを特徴とす
   る糖化アルブミン分析用装置