JPH06511084A - 蛋白のクロマトグラフィーシステム - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 蛋白のクロマトグラフィーシステム 本発明はクロマトグラフィー法において有用なシステムに関する。

２１８引量 クロマトグラフィー技術は、当技術分野においては混合物中に存在する成分（溶 質）を分離するための手段としてよく知られている。これらの技術は、化学およ び生物工学分野においては特に有用である。適切なりロマトグラフィーは、２（ または３）相間における溶質の異なる分配にしたがい、それらの分離を行う。こ の相は固体および液体で、溶質の分配は、流動相の存在下で固体（典型的には粒 状）マトリックスを通過する溶質の異なる移動度を生じる。溶質の相の移動は、 圧力勾配（一般には゛液体クロマトグラフィー”と呼ばれる）にしたがうであろ う、典型的には、分離されるべきサンプルを、クロマトグラフィー分離媒体のペ レットまたは顆粒を充填したカラムに積み、一定の速度でカラムを通過する溶媒 流を維持する。混合物の成分は、排出物中の“ピーク”　（多かれ少なかれ太く さらに重なりあった種々のピーク）として各物質がカラムを出るまで溶媒によっ て運ばれる。

クロマトグラフィーのマトリックスは、多数の基準のいずれか（サイズ、電荷、 疎水性相互反応、および／または該マトリックスに対する特異的親和性または該 マトリックス上の結合部位を含む）によって成分を分離することができる。

混合物中の成分は該マトリックスに対する親和性が異なるので、それらがマトリ ックスを通過するにつれその分配によって、それら成分が連続的にマトリックス を流出し、時間的に、かつ空間的に広がりをもって分離されえるように成分が分 離される。

分離された種々の成分またはその連続的流れの中の問題の成分の位置決定は、− ｉに前記マトリックスを流出する液相（すなわち流出液流）を一連の分画として 集め、さらにこれらの分画をサンプリングして当技術分野において既知の手段の いずれかによってその内容物を同定することによって達成される。

混合物中の種りの成分の解析はいくつかの考慮すべき事柄（主なものは、マトリ ックスの分配能およびそのシステムの理論的プレート高およびプレート数）に左 右される。一般に、表面積／容積比が大きいことが望ましい、ｔＬ体クりマトグ ラフィーシステム用マトリックスは、典型的にはカラムとして知られている円筒 形クロマトグラフィーシステムに収められる。電気泳動システムでは、良好な解 析には、用いられる電気野によって生じる熱の効率的な除去が要求される６毛細 管電気泳動または大きな表面積／容積比を提供する他の電気泳動用モジュールは ジュール熱をよ（消失させ、著しい解析損失をもたらすことなく迅速な分析を可 能にする。

一般に陽イオン性または陰イオン性物質用カラムの親和性を強めるために、また は特定の化学基もしくは生物学的活性物質に対する可逆的結合を発生させ、それ によってこれらの基または物質を含むサンプルを遊離可能な状態でカラムに結合 させ、続いて溶出させることができるようにするためにクロマトグラフィーの媒 体を処理する技術は既知である。

特定の分離を実施するための一般的なりロマトグラフィー分離の実施には特定の 媒体または被覆媒体の限定または選択、さらに最適溶媒、溶媒流速、ｐＨ、イオ ン濃度および他の環境条件（例えば出発混合物が比較的狭い多数のハンドに分離 されるよう、さらに少なくとも問題の物質が明白な排出として通過しまたは通過 させることができるような条件）を限定または選択することが含まれる。

その化学構造および形状が未だ決定されておらず、さらにクロマトグラフィー親 和性が未知である特定の物質のための適切な分離条件の組み合わせを決定するこ とは、経験、実験作業、直観力および幸運を必要とする作業である。多種多様な 条件下での生物分子の移送および吸着メカニズムの複雑な依存性の故に、よりス ピードを上げまたはより大きなカラムを利用するために単に既知の工程をスケー ルアップすることを所望する場合ですら、通常さらに別の実験作業が必要になる 。高純度、高速および／または大容量分離という分離目的を達成するために、橿 めて多くの分離条件を実験的に分析し、適切な実施条件の１つの組み合わせを決 定しなければならない。

一般には分離カラム中の物質の移動は、クロマトグラフィー媒体の顆粒またはペ レットの間およびそれを過ぎる流れによって肉眼レベルで進行し、一方、分離の 度合いおよびカラムの許容力は、特定の成分が媒体の小孔に入りまたは出ていく 分枝した細道にそって拡散する速度、および繰り返し吸着されさらに拡散細道に そって遊離される速度によってより強く支配される。

工程産出量を高めるために流束を増加させることにより、一般に各成分の溶出ピ ークの幅は広くなり、したがって解析度および分離成分の純度は犠牲にされる； 一定の流束限界を越えると溶質の時期尚早なブレークスルーを生じるがもじれな い。

生成物の合成または精製中におけるその状態をモニターする必要があることは、 当技術分野においてよく知られている。状態モニタリングは多工程の調製用プロ トコールにおいて特に重要である。混合物中の生成物の同定および品質は各工程 で決定されねばならない。生成物モニタリングはまた工程指標をｉｌｉ節するた めにフィードバンクシステムの部分として用いることができる。一般には同定は 以前に確立した同定用基準（例えばある波長で測定される特徴的吸収）を用いて 行う０問題の生成物が蛋白の場合、同定はまた分子量、活性および／または免疫 親和性によってもよい。

本発明の目的は、すべての調製用または分析用手順の間に問題の分子の存在およ び／または位置を同定するための、迅速で融通性があり反復可能なシステムおよ び装置を提供することである。最終目標は、高速度クロマトグラフィー技術の利 点を追求することによって蛋白混合物の１つまたは２つ以上の成分を分離するこ とである０本発明の目的は、クロマトグラフィーシステムの解析能力を高めるた めの二次元分析、プロセス混合物中の溶質濃度の即時モニタリング、主要量の溶 解生成物を含む溶液中の微量の溶質夾雑物の検出、例えば調製用工程のすべての 段階のクロマトグラフィー流出液中の溶質の存在および位置の迅速な決定、与え られた溶質の構造的変種の性状および相対濃度を典型的に示す混合物のプロフィ ルの作成、並びに精製または分離プロトコールの成功度の迅速な評価を含む。

溌」先の３１ 本発明は、蛋白および他の生物学的巨大分子の迅速で効率的な分離のための装置 および方法を特徴とする。この装置はサンプル投入手段、第一の液体クロマトグ ラフィーカラム、サンプル投入手段をカラムに接続する多口注入バルブ、多口注 入バルブにつながっている第二のクロマトグラフィーカラム、第一のカラムに連 続してまたはそれと択一的に作動する第二〇カラム、多口バルブを介してカラム に圧可変溶液を配送するポンプ手段、および一連のシステム制御プログラムに特 徴を与えるプログラム手段を含む。

好ましい具体例では、該装置は、溶液配送圧を制御するために該ポンプ手段と連 絡する制御手段；複数の溶液溜め、溶液投入手段をサンプル投入手段に接続する 混合バルブ（これは溶液溜めからの溶液を混合するために作動するが、この場合 該プログラム手段はこの混合バルブによって溶液を混合するという特徴を有する ）、多口注入バルブを介するカラムへの混合溶液の配送を含む溶液投入手段；カ ラム排出を検出し記録するための検出手段；検出された排出データのパターン識 別するためのマツチング手段（液体クロマトグラフィー分離用制御プログラムを 立ち上がらせるための手段に合わせて作動するようにされているテンプレートマ ツチング手段）をさらに含む。

また別の具体例では、本発明は蛋白分離用装置の特徴を有し、これは、第一およ び第二の液体クロマトグラフィーカラム、溶液を当該第一のカラムに導入するた めの手段、第一および第二のカラムに連絡する多数の多口バルブ（これを通して 溶液が移送される）、および検出手段およびデータ収集手段から成る排出手段を 含む。

好ましくは、この具体例は、第一〇カラムに溶液を導入するためのポンプ手段； 溶媒配送圧を制御するためにポンプ手段と連絡する制御手段を含む。好ましくは 、当該多数のバルブは第一、第二および第三のバルブを含み、溶液は第一および 第二のバルブを通して第一のカラムに導入され、第二および第三のバルブを通し て第二のカラムに導入され、さらに第三のバルブを通して排出手段に導入される 。第一のバルブはまた多数の口（これは時計回りまたは反時計回り方向に隣接す る口を互いに連絡し合っている）、および隣接していない２つの口を接続するル ープを含む。溶液導入手段は、サンプル溜めを含むサンプル投入手段から成る。

サンプル投入手段はさらにサンプルポンプを含んでいてもよ（、さらに溶液導入 手段は複数の溶液溜め、溶液選択用および混合用バルブ並びに第一のカラムに溶 液を配送するためのポンプを含んでいてもよい、排出手段は、検出手段をデータ 収集手段に接続する第四の多口バルブをさらに含んでいてもよい、該検出手段は ＵＶ検出器でもよい、排出手段は、ＵＶ検出器およびデータ収集手段と第四の多 口バルブを介してつながっているｐＨ／導電率検出手段をさらに含んでいてもよ い。

好ましくは、カラムは第一および第二の末端を有し、第一および第二のカラムの 少なくとも１つは、第一の末端から第二の末端までの通過時間が５分未満となる ようにクロマトグラフィーマトリックスを充填されている。クロマトグラフィー マトリックス自体は潅流できるものであってもよい。

本発明のまた別の具体例では、前記装置は、１種または２種以上の緩衝液とサン プルを混合しサンプル混合物をつくる条目混合バルブ、複数の液体クロマトグラ フィーカラム（各カラムは第一および第二の末端を含む）、サンプル混合バルブ および各クロマトグラフィーカラムの第一の末端につながっている条目注入バル ブ、排出信号記録システムおよび排出サンプル採集システムの少なくとも１つを 含む排出システム（この場合、排出システムは各カラムの第二の末端とつながっ ている）、多口注入バルブを作動させ、混合バルブから第一および第二のカラム に混合溶液を排出システムの作動と協調させながら連続的および交互に適用し、 蛋白の調製または分析のための一連の分離を行う制御手段を含む。

好ましくは、該装置は、複数の溶液溜めおよびサンプル溜めから成るサンプル投 入システムをさらに含む。

また別の具体例では、該装置は、複数のクロマトグラフィーカラム（各カラムは 粒子状マトリックス分離媒体が充填され、蛋白のカラムの投入端から排出端まで の特異的通過時間は５分未満である）、１つのカラムにカラムの投入端で溶液を 配送するための投入バルブおよび投入バルブに供給された溶液を混合するための 多口バルブを含むサンプル投入手段、検出とそれを表示する信号を提供する手段 を含むカラム排出を検出するカラム排出手段、およびサンプル投入手段を作動さ せ、投入バルブに異なる液体混合物を連続的な分離サイクルで提供することによ り、１つのカラムにおいて一連の連続的分離を行う制御手段をさらに含む、該制 御手段は、クロマトグラフィーカラムの１つを交互に利用しその間他方を洗浄し 、したがって連続的に用いられるカラムからの排出が実質的に連続して行われる こととなる切り換え手段をさらに含んでいてもよい、該装置は、一連の分離工程 制御プログラムを作動中は連続運転とするような特徴を与えるプログラム手段を さらに含んでいてもよい、該プログラム手段は、サンプル中の蛋白を分離するた めに、第一および第二のカラムを連続的に用いるように分離プログラムに特徴を 与えることができる 好ましくは、該装置の１つのカラムはイオン交換クロマトグラフィーマトリック スを含む。また別に、またはさらに加えるに、１つのカラムは逆相クロマトグラ フィーマトリックスを含むことができる。該装置はサンプルの調製および分析の ために用いられるが、ここで第一〇カラムは調製用指標の特徴をもち、第二のカ ラムは分析用指標の特徴をもつ、したがって、該プログラムは、第一のカラムに おいて分離サンプルの実質的に連続した調製を行ない、さらに第二〇カラムを介 して第一のカラムの排出物の断続的分析を行うという特徴を有することができる 。

第一および第二〇カラムの各々は、それぞれ別個に取り除き第三および第四のカ ラムにそれぞれ置き換えることができる。

また別の具体例では、該装置は、第一および第二の多口バルブ（各々のバルブは 、限定されたサンプル量を保持し、各バルブの２つの口を接続するサンプルルー プを含む）、各バルブとつながっている液体クロマトグラフィーカラム、各バル ブとつながっているサンプル供給ライン、排出を検出するための第二のバルブと つながっている検出手段、多口バルブを作動させ、サンプル供給ライン（ここで 複数サンプルの全量が導入される）およびクロマトグラフィーカラムを含む検出 ライン（ここで１つのサンプル量が検出手段を通過し、他方はカラムおよび検出 手段を通過する）の間で切り換えを行う制御手段を含む。

好ましい具体例では、前記採集ラインはその連続順に以下のものをさらに含む： 　（ａ）第一のパルプ内で第一の口を第二の口に接続する第一のサンプルループ 、（ｂ）第一のバルブの第二の口を第二のバルブの第一の口で接続するサンプル 供給ライン、（Ｃ）第二のバルブ内で第一の口を第二の口に接続する第二のサン プルループ。検出ラインはその連続順に以下のものをさらに含むことができる＝ 　（ａ）第一のバルブ内で第一の口を第三の口に接続する第一のサンプルループ 、（ｂ）第一のバルブの第三の口を第二のバルブの第三の口で接続するクロマト グラフィーカラム、（Ｃ）第二のバルブ内で第三の口を第二の口に接続スる第二 のサンプルループ、（ｄ）第二のバルブの第二の口を検出手段に接続する分路器 、他の好ましい具体例では、さらに付加された多口バルブがあってもよい；例え ば、第一と第二のバルブの間に順序よく配置され、クロマトグラフィーカラムを これらのバルブに接続する第三の多口バルブである。

本発明の具体例では、前記装置は２つの限定された量のサンプルを保持すること ができるが、１つばカラムを迂回する吸着されないサンプルで、他はマトリック スを通過ししたがって標的溶質の殆どを欠いている吸着されたサンプルである。

吸着サンプル溶液は、マトリックスを迂回し第二のサンプルループ内に含まれて いるサンプル溶液と一列に並んでマトリックスから出ていくであろう、この２つ のサンプル溶液は検出手段を通過し、２つの明白なピークをグラフにつくる。す なわち、マトリックスを迂回する供給溶液は検出手段に到達するとき、溶出液中 のすべての溶質（すなわち標的および非標的溶質とも）の濃度を表すピークが生 じる。この後に非標的溶質のみの濃度を表す第二のピークが続く。サンプル中の 全溶質を表すピーク領域によって分けられたピーク領域の差異がサンプルの純度 の程度である。

したがって標的溶質および／または不純物濃度を算出するために必要なすべての 情報は、該サンプルがカラムマトリックスを通過したとき直ちに限定量サンプル で得られる。所望の場合は標的溶質をマトリックスから溶出でき、その濃度をす べての溶質を含む供給溶液および非標的溶質のみを含む吸着溶液の濃度からそれ ぞれ別個に決定することができる。

本発明の具体例の利点は、生成サンプル中の標的溶質の存在、量および／または 純度を調製工程中に迅速にモニターできることを含む０分析の迅速性（例えば１ ０秒で実施できる）は、調製方法モニターの分析負担および、その後の調製工程 を決定するために必要な稼働休止時間を軽減する。この迅速なモニタリングシス テムでモニターされる不純物には蛋白、核酸、エンドトキシンまたは該サンプル 中で検出できるすべての生物学的分子が含まれる。

また別の局面では、本発明はサンプルの蛋白分析の方法に特徴を有する。該方法 は以下の具体例を含む、１つの具体例は、サンプルの蛋白の分析方法で、これは 、投入端および排出端を含む第一〇カラムにサンプルを導入しくここで第一〇カ ラムはサンプルの成分を分離し、分離された成分の第一の流出液流を生じる）、 予め定めた位置で第一の流出液流を遮断し分離成分分画を採集し、該成分部分を 第二のカラムに導入しくここで第二のカラムはその分画の成分を分離し、咳分画 の分離成分を含む第二の流出液流を生しる）、第二の流出液流の成分を検出する ことを含む。

好ましくは、第一〇カラムにおける分離サンプル調製が実質的に連続的で、第二 のカラムを介する第一〇カラム排出の分析は断続的である。１つのカラムはイオ ン交換クロマトグラフィーマトリックスを含むことができ；および／または１つ のカラムは逆相クロマトグラフィーマトリックスを含むことができる。

第一のカラムの流出液は、多口バルブを介して第一〇カラムの投入端に方向転換 することができ、この流出液は実質的に純粋な生成物を含んでいるかもしれない 、第二のカラムは、第一の流出液を第一のカラムの投入端にもどす回数を決定す る排出データのパターンを提供するようにデザインすることができる。

好ましくは、一部の流出液流は、多口バルブを切り換えることによって第二〇カ ラムに誘導することができる。

また別の具体例では、本発明のこの局面は、サンプルの蛋白の分析方法に特徴を 有し、これは、投入端および排出端を含む第一のカラムにサンプルを導入しくこ こで第一〇カラムはサンプルの成分を分離し、分離された成分の第一の流出液流 を生じる）、第一の流出液流を投入端および排出端を含む第二のカラム（これは 液流からサンプルの標的成分を選択的に除去する）に方向転換させ、第一の流出 液流中の標的成分を除く実質的にすべての成分を含む第二の流出液流を生じるこ とを含む。

好ましくは、該方法は、第一および第二の流出液流の成分の検出を含むことがで きる。

また別の具体例では、本発明はサンプルの蛋白の分析方法に特徴を有し、これは 、第一のカラムにサンプルを導入しくここで、投入端および排出端を含む第一の カラムはサンプルから標的成分を選択的に除去し、サンプル中の標的成分を除く 実質的にすべての成分を含む第一の流出液流を生しる）、第一の流出液流を投入 端および排出端を含む第二のカラム（これはサンプルの成分を分離し、分離され た成分の第二の溶出液流を生じる）に方向転換させることを含む。

好ましくは、この方法は、第一および第二の流出液流の排出の検出を含む。

また別の具体例では、本発明は以下を含むサンプルの蛋白分析方法の特徴を有す る：標的蛋白および微量溶質を含むサンプルを投入端および排出端並びに標的特 異的吸着手段を含む第一〇カラムに導入しくここで、第一のカラムは選択的にサ ンプルの標的蛋白を保持し、実質的に標的蛋白を欠（第一の流出液流を生じる） 、第一の流出液流を投入端および排出端並びに微量溶質吸着手段を含む第二〇カ ラム（これは咳液流から微量溶質を選択的に吸着し、第二の流出液流を生じる） に方向転換させ、第二のカラムから微量溶質を溶出させ、該溶出微量溶質を検出 する。

好ましべは、本方法は、標的特異的アフィニティー（親和性）クロマトグラフィ ーマトリックス（これは標的蛋白特異的免疫グロブリンを含んでいてもよい）を 含む第一カラムの標的吸着手段を含む、好ましくは、微量溶質吸着手段は非特異 的に蛋白を結合する手段を含む。

好ましくは、本発明のこの局面の具体例では、第一〇カラムの投入端への当該サ ンプルの投入から第二のカラムの排出端までの通過時間は１０分未満で、最も好 ましくは７分未満である。

第−の流出液流は、多口バルブを切り換えることによって第二のカラムに誘導さ れる。各カラムは粒子マトリックス分離媒体を充填することができ、これによっ て各カラム投入端とカラム排出端との間の蛋白の特徴的通過時間は５分未満とな る。好ましくは、該マトリックスは潅流クロマトグラフィーマトリックスである 。

本発明の方法および装置は、迅速で信鯨性があり、さらに応用性があり、特に生 物学的巨大分子の調製、特に蛋白の分離および精製に有用である０本明細書に記 載したクロマトグラフィーシステムは、与えられたサンプルの成分を分離するた めに２カラムシステムまたは１カラムシステムとして用いるとき利点を有する； 例えば第一の工程からの情報を第二の工程を修正するために用いることができる 。第一および第二のカラムは、溶媒を再循環させ、与えられた工程中にシステム を繰り返し使用することを可能にすることによって容易に再生できる。さらに他 の利点は、サンプルの自動調製または分析（例えば調製用／分析用組み合わせ工 程で、この工程では、第一のカラムはサンプルの成分を分離するために用いられ 、第二のカラムはサンプルの純度を調べるために任意の時間に精製工程を中断す るために用いられ、したがって二次元クロマトグラフィー分析を提供する）；第 一のカラムで精製産物を取り除き、第二のカラムで夾雑物を１縮し溶出させるこ とによるサンプルの純度分析；生成物の濃度と純度の分析；生成物それ自体、す なわち、純粋な生成物と不純物のサンプル中の生成物ピークまたは部分を構成す る構造的変種の分析である。

図ｍコＬ咀 本発明のこれらの特性および他の特性は、以下の図面と合わせ本明細書の記載に よって当業者には理解されるところであろう： 図１は、本発明の市販用具体例を示す図である。

図２は、本発明のシステムの模式図である。

図３は、本発明の具体例を示す図である。

図４は、本発明の具体例を示す図である。

図５は、図４−６の具体例のマルチカラムの操作のための状態表である。

図６は、図４−６の具体例の代表的な操作サイクルにおけるＣＰＵオペレーショ ンの連続過程を示すフローチャートである。

図７−９．１０（ａ）および（ｂ）並びに１１（ａ）および（ｂ）は、本発明の 装置を用いたクロマトグラフィ一工程の代表的なりロマトグラムを示している。

図１２（ａ）および（ｂ）は、サンプル中の微量夾雑物を検出する本発明の装置 のフローチャートである。

図１３（ａ）および（ｂ）は、本発明にしたがってサンプルをクロマトグラフす る本発明の装置およびシステムのフローチャートである。

図１４（ａ）および（ｂ）は、飛躍的に進歩したサンプルの分析を実施する本発 明の装置のフローチャートである。

図１５（ａ）および（ｂ）は、ブレークスルー生成物の構造のプロフィルを作成 する本発明の装置のフローチャートである。

図１６（ａ）および（ｂ）は、調製／分析用工程を実施する本発明の装置のフロ ーチャートである。

い貝　の發 ■ 図１は本発明の蛋白分離装置の市販用具体例の図で、これは、実質的にはコンピ ューターキーボード、マウス、およびデータを収集し保存し、さらにプログラム 制御過程を保存し実行する端末とともにハウジング内に収められている。

回２は、本発明の実施のためのコンポーネントおよび制御コンポーネントの通常 システム１００を模式的に表しており、これは、投入部分１０（分離カラムに投 入溶液を提供する）、排出部分２０（カラムから排出情報シグナルを生しる）、 分離カラム部分３０（投入部分から受け取ったサンプルを分離する）、およびプ ロセッサー４０（排出部分からの情報を受け取り、投入部分および分離カラム部 分の作動を制御し一連の分離工程を実施する）を含む。分離条件の適切な組み合 わせが分かっているときに使用する低能力作動モードでは、全く同じ条件下で反 復分離を行ない、各工程からの分離成分を採集液溜めに送りこむことによって、 有用な量の純粋物質を調製するために該システムを作動させることができる０分 析モードでは、サンプルをオートサンプラーに置き、該システムの中を連続的に 流す０両モードにおいて、プロセッサーは予め定めた担体溶液を混合するために 投入部分を制御し、さらに、サンプル配送バルブ、カラムの投入バルブおよびカ ラムの排出バルブを適切な時に、適切な方向に操作し、所望の分離を行う。

しかしながらより一般的には、該装置は、異なる作動条件下（例えば排出データ が、異なる作動指標に対応する分離結果の行列を構成するような条件）で一連の 分離を行うために作動される。このモードでは、プロセッサーは、異なる担体溶 液シリーズの各々を混合し、各溶液を用いて連続的に分離を行なうために投入部 分を制御し、カラム結果を作表する。

図３は、本発明を実施するために現時点で好ましいシステム１０１のハードウェ アーコンポーネントを詳細に図示している。

２カラムシステムのクロマトグラフィーは、図３に示した装置にしたがって用い ることができるが、また別には該装置の他の形態も用いることができる０例えば 、第二のカラムを迂回させることによって１カラムシステム用いることができ、 また付加カラムを該装置に付け、この３つのカラムの１つまたは２つを迂回させ ることによって、３カラムシステムを用いることもできる。図３によれば、サン プル調製部分１１５および溶媒調製部分１１０は各々、分離カラムユニット１３ ０に連結された投入バルブ１５１にそれぞれの溶液を提供する。排出部分１３５ は、ユニット１３０から分離カラムの排出を受け取り、特性収、または蛍光）を 示す電気信号を生じる。プロセッサ一部分１４２は排出情報を受け取り、記録し 、さらに各分離工程を統合するために他の種々のユニットを制御する０種々の周 辺装置は、排出データの表示および巧みな操作または制御指標の取り入れを可能 にする。

サンプル投入部分１１５では、４方向混合パルプ１１６が複数の液溜め１１７ａ −ｄに接続されており、これは異なるサンプルまたは緩衝液を含むことができる ；例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、細胞培養液、基剤、または水、混合 バルブ１１６の排出はポンプによってライン１１８を通って２方向性の６０バル ブ１５１　（以下でさらに考察される）に送られるが、これはまた溶媒投入部分 １１０がらの液を受け取る。サンプルポンプ１１９（例えば、ステッパーモータ ー駆動注射筒ポンプのような注射筒ポンプ）は、ループ１５２を通してバルブ１ １６からサンプルを引き上げ、続いてライン１１Ｂを通って廃液１５４に放出す る。

溶媒投入または配送システム１１０は、６０付４方向混合バルブ１１２のそれぞ れの口に接続された複数の溶媒溜め１１１ａ−ｒを含み、その混合排出物は高圧 ポンプ（標準具体例ではこれは２０００−３０００ｐｓ　ｉで６０ｍ　１７分の 能力をもつ二重ピストンポンプである）に供給され、この高圧排出は、分離カラ ムへの供給のために１１４を通って投入バルブ１５１に配送される。適切な６０ 混合バルブはＢＩＯＣＨＥＭバート番号０８０Ｔ６１２　（ビーンタウン、ニュ ーシャーシー）から人手できる。サンプルと溶液との混合または異なる溶媒溶液 の混合は、該ポンプの再充填動作中にそれぞれのバルブを開閉することによって 達成される。溶媒を続いてポンプに引き込み、ポンプのパルスダンパーにおける と同様ポンプ内で混合する。

上記に簡単に示したように、混合バルブの操作はマルチチャンネル制御システム によって制御される。該チャンネルは６チヤンネルの具体例ではＡ、Ｂ、Ｃ，Ｄ 、ＥおよびＦと呼ばれ、液溜め１ｌｌａ−ｆ（例えば、ＭＥＳ　（２−（Ｎ−モ ルフオリノコエタン−スルフォン酸緩衝液）、トリス−塩酸およびＮａＣ１、水 、ＢＳＡなどを含む）から４種類までの異なる溶媒の選択混合物を提供する。そ のような混合物の１つの処方は、本装置の分ａ、ｔ＞よび排出部分の記載ととも に引続き詳述される前にここで詳述される。

操作の好ましい一局面にしたがえば、溶媒溜めは異なる溶媒混合物セットを受け 取るが、各々は２または３種の物質を含み、広範囲のＰＨにわたって有用である 。例えば、２種の濃縮緩衝液（例えば１００ｍＭ）を１つの濃縮ｉｇｍ液（例え ば３．０ＭのＮａＣ１）とともに提供することができ、各緩衝液は所望のｐＨ範 囲の極限値に各々調整されている０例えば、一方の緩衝液はｐＨ６，０に調整さ れ、他はｐＨ９，０に調整されている。

標的緩衝液の濃度（例えば２０ｍＭ）はそのＰＨおよび溶離液濃度（例えば０． ５ＭＮａＣ１）のように選択される。水または塩溶液のいずれも緩衝液を適切な 濃度に希釈するために用いることができる。操作に際して、これら混合物指標は 、持続的に変化する１！様で用いて、１つの分離コースにおいてｐＨ勾配または イオン濃度変化をつくることができ、また各分離の間一定とし一連の異なる実験 工程を実施することもできる。さらに下記に記載するように、変化が可能な、す なわち濃度勾配も一定の溶出ステップにおいて好ましく用いられる。

図３に戻って、高圧ポンプ１１３からの混合溶媒およびサンプル配送部分１１５ からのサンプルは、サンプル投入バルブ１５１の口（１）および（４）にそれぞ れ提供される。バルブ１５１は、２ポジシヨン３チヤンネルバルブ、すなわち他 のいずれの口も、時計回りに隣接する口または反時計回りに隣接する口と連絡す るように配置されている。したがって、その第一の状態では、口（４）のサンプ ルは口（５）につながり、口（３）に接続されている口（２）に固定管１５２を 通して切り換えられ、口（３）は順にサンプルポンプおよび廃液容器１５４に接 続されているが、これによって管１５２に投入部分１１５からのサンプルが充填 される。残りの２つの口（６）および（１）は、ポンプ１１３によって口（１） に提供される溶媒が、バルブ１３４の口（１）および（６）を介して口（６）か らの投入として分離カラム部分１３０に移される。

バルブ１５１の第二の状態では、高圧ライン１１４の溶媒は口（１）から口（２ ）に伝えられ、先に獲得された管１５２の中のサンプルを口（６）に接続された 口（５）に押し出し、その結果サンプルを分離カラム部分１３０に注入し、持続 的な溶媒の流れを提供して分離を達成する０部分１１５からのすべての流れがサ ンプルラインを廃液容器に追い出すように残りの口（４）は口（３）に接続され 、それによって、該ラインを異なるｐＨ，１度などの新しいサンプルのために備 える。

したがって、バルブ１５１は管１５２のサンプルを効果的に受け取り、続いて分 離カラムを通してサンプルを移送するために溶媒流を提供する。分離工程として 、混合バルブ１１２は、システムに入る溶媒を変える（また別の工程のためにカ ラムの洗浄、溶出、平衡化および再生という異なるステップを実施する）ために 操作することができる。

図３は、分離カラム部分１３０の中の３つのバルブ、２つのカラム装置を示して いる０図に示したように、第一〇カラム１３１および第二〇カラム１３２は、別 の６０の２ポジシヨン型バルブ１３３に連結されているが、該バルブ１３３は、 同様のバルブ１３４と共同して作動し、バルブ１５１から受け取った液を分離カ ラム１３１．１３２の１つに導き、さらに選択したカラムからの排出を排出モニ タリングシステムに導く。

状態１は、口１および２．３および４並びに５および６が互いに連結されている バルブ状態で、一方、状態２は、６および１．２および３並びに４および５が互 いに連結されているバルブ状態であって、バルブ１３３および１３４の４つの可 能な状態が作動して、カラム１３１．１３２のいずれか１つの上部に投入液を提 供し、一方、部分１３５に排出物を図５にしたがい移送する。図５に示すように 、バルブ１３３が状Ｂ１でバルブ１３４が状態１の場合、カラム１３１のみが中 央演算処理装置の制御下にあり、バルブ１３３が状態２でバルブ１３４が状態ｌ にある場合、両方のカラムは非制？Ｉ下にあり、バルブ１３３が状態１でバルブ １３４が状態２である場合、両力ラムは制御下にあり、バルブ１３３が状態２で バルブ１３４が状態２である場合は、カラム１３１のみが制御下にある。

本発明のまた別の具体例では、カラムバルブシステムに単純に付加を行うことに よってカラムは各々、前進または後進方向に作動することができ、さらにバック フラッシュを行ってもよい、慣用的な定常流ポンプ（例えば嬬動性またはピスト ンポンプ）をバルブ１３４の口４でシステムに加え、平衡緩衝液を１つのカラム （例えばカラム１３２）に送り込むことができ、一方、他のカラム（例えばカラ ム１３１）を生成物の分析および調製のために用いることができる。

したがって、サンプルは上記のようにカラム１３１に導入でき、溶出剤は検出器 １３６に直接供給でき、一方、カラム１３２はバルブ１３４の口４および口５か らカラム１３２を通ってバルブ１３３の口５および６に、さらに廃液へと直接供 給される緩衝液によって再生される。

また別に、サンプルが共に１つまたは両力ラムを迂回することができる０例えば 、バルブ１５１からのサンプルは、バルブ１３４を状態１に切り換えることによ ってカラム１３１を迂回させることができ、これはサンプルをバルブ１３４の口 （１）、（２）、（３）および（４）を通ってバルブ１３３の口（５）および（ ６）に入れ換える（状Ｂ１）、そこから、サンプルは直接カラム１３２に供給さ れる。同様に、上記のようにカラム１３１を通してサンプルを供給し、バルブ１ ３４の口（５）および（４）（状態２）、バルブ１３３の口（５）および（４） （状Ｂ２）を介してカラム１３１から排出、続いて検出器１３６に排出すること ができる。サンプルはバルブ１３４を状態ｌでバルブ１３３を状態２で操作する ことによって両力ラムを迂回させることができる。

図示したように、液体が流れる状態にあるいずれのカラムの排出もバルブ１３３ の口（４）から吸収検出器１３６を抜け、バルブ１５１．１３３および１３４と 同様、排出パルプ１３７の口（１）へと送られる。このバルブ（すなわち１３７ ）は、サンプルがｐＨおよび導電率センサーを通過することを可能にする。ｐＨ および導電率センサーを通過させるとき、このバルブの状態１は、カラム排出を 口（２）およびフラクションコレクターに接続する。この状態で口（４）で注入 されたサンプルは、口（３）を介しｐＨ／導電率センサーを通り口（６）へと送 られ、そこから口（５）さらに廃液容器にへと送られる。この流路を通って注入 されたサンプルは、センサー（例えばｐＨセンサーおよび導電率センサー）に目 盛りを付けるために用いることができる。

ｐＨ／導電率センサーを用いるとき、バルブ１３７は状態２に切り換えられ、そ の結果、口（１）に入るカラム排出は、口（６）を介しセンサー１３８へと送ら れ、その後口（３）を介し口（２）、採集システム１３９へと送られる。採集シ ステムは、連続工程から単一分画を採集する単一容器を含むか、または別々の容 器に異なる連続サンプルを受け取るための自動システムを含んでいてもよい。

本発明のまた別の具体例では、他の溶質との混合物中に少なくとも１つの標的溶 質を含む一定の制限された量の供給液が、第一および第二のサンプル支持ループ に送られる。このサンプル支持ループは互いに一列に並び、およそ等量のサンプ ルを保持する。一旦この供給溶液がこれらのループを満たすと、第一のループの 供給液は、標的溶質に特異的な結合部位（これは限定された量のサンプルに含ま れる標的溶質の分子に対して過剰に存在している）を含むマトリックス中に入り 、これを通過する。

図４はこの具体例を図示するが、これは少なくとも２つの多口バルブ、少なくと も１つのカラム、および１つの検出手段を含む、多口バルブは何個の口でも含む ことができる；図４では、バルブは６つの口を含む、各バルブは、上記のように ２つの可能な状態のうち１つで作動することができる。サンプルの採集のために は、図４（ａ）に示したように、サンプル投入１４は口１から口２を介してバル ブ１５１に、ライン４２へのバルブ１５１の口５と口６を介してサンプルループ １５２に、さらにバルブ１３３の口１と口２を介してサンプルループ１５３（こ こでバルブの切り換え中はサンプルは保持される）にサンプルを供給する。サン プル検出については、図４（ｂ）に示したようにバルブ１５１はその後状態２に 切り換えられる。ループ１５２内に含まれるサンプルは、その後バルブ１５１の 口５および口４並びにバルブ１３４の口２および口３を介してカラム１３１ヘポ ンプで送られるが、ここで分析物質または標的溶質は選択的に吸着される。サン プルはその後カラム１３１を出て、バルブ１３４の口４および５を介してバルブ １３３の口３に供給される。バルブ１３３は今や状態２に切り換えられ、それに よって口３および２は互いに連結され、カラム１３１からの吸着サンプルは、ル ープ１５３に含まれる非吸着サンプルをループ１５３並びにライン４３を介する 口５および４を通って検出器１３６に送り出される。カラム１３１からの吸着サ ンプルは、ルー　７’　１５３を通り検出器１３６へと非吸着サンプルに続く。

結果はディスプレー１４１を介して表示される。

検出器の読みの表示は、高濃度の本来の非吸着サンプルを表すピークとそれに続 く第二のピークを明らかにする。第二のピークは、カラム１３１によって除去さ れる標的溶質の量に比例して第一のピークより小さい。第二のピークは吸着後サ ンプルに残存する不純物を表している。所望の場合は、標的溶質はその後溶出さ れ、上記のように検出される。

このシステムは、ポンプおよび供給される緩衝液を用いてカラムを溶出、洗浄し て再生することができる。洗浄は、例えばバルブ１５１の口３および４（状態１ ）、バルブ１３４の口２および３（状態２）、さらにループ１５３への口３およ び４（状態１）（または口３および２）を介し、バルブ１３３の口５および４へ と行うことができる。

与えられた生成物の存在、質および純度のモニターに加え、濃度が持続的に変化 する標的溶質を含む調製工程からのプロセス液は、与えられた検出信号（例えば ベースラインを越える）がバルブスイッチを始動させ、カラムを通ってサンプル を送り出すようにモニターすることができる。または、例えばある純度の生成物 の検出が分画採集を始動させ、生成物濃度または純度の１定しヘル以下の低下の 検出をフラクションコレクターの停止の引き金にすることもできる。

図４に記載する装置は以下の方法について有用であろう、一定の制限された量の 、標的溶質を含むサンプル溶液が、該溶液中に存在する標的溶質および不純物の 迅速な濃度分析のために用いられる。１つまたは２つ以上の溶質不純物および少 なくとも１つの標的溶質を含む溶液のアッセ一方法は以下のステップを含む：サ ンプルの部分標本（すなわち既知量）を工程液からサンプル供給ラインに方向転 換させ、このサンプルの部分標本の一部分を少なくとも１つの標的溶質に対して 特異的な結合部位を有するマトリックスを通過させて流出液（実質的に標的溶質 を含まない）を生成し、サンプル流出液中の不純物の濃度を表す第一のデータポ イントおよびサンプル中の溶質の付加濃度を表す第二のデータポイントを得、さ らに第一および第二のデータポイントの差異（この差異はこのサンプルの部分標 本中の標的溶質の濃度に比例している）を決定することを含む、“データポイン ト”は与えられたピークの高さまたはその下の面積のいずれを指してもよく、“ 実質的に含まない”とは、標的溶質の少なくとも９５％を含んでいないことをい う。

第一および第二のデータポイントは、このサンプルの部分標木の実質的に同等の 部分（すなわち〉９０％）を用いて得ることができる。また該部分標本部分が同 等でない場合、既知の濃度の内部スタンダード（例えばカラムに結合しない既知 濃度の蛋白）を用いて第一および第二のデータポイントを互いに比較してもよい 。

プロセス液は、そのプロセス中の選ばれた時間に分析することができる。例えば 複数の連続サンプルをプロセス液から分けることができる。このプロセス液はい ずれの調製用精製用工程によっても得られ、これには抗体を作製することができ るすべての抗原（例えば蛋白、ステロイド、抗生物質または核酸）の精製が含ま れるが、これらに限られるものではない。本明細書に詳細に記載したように、プ ロセス液は調製用クロマトグラフィ一工程、例えば比較的大規模な標的蛋白の調 製中に得ることができる。

工１１ｊ２６５λ１町 前述の操作過程中に、中央処理ユニットまたは制御ユニット１４２は統一時間ベ ースを維持し、ライン１４４によって制御信号を異なる制御バルブおよび混合バ ルブに提供し、所望の液体構成、連続操作、溶媒流および分離条件を達成する。

プロセッサー１４２は、種々の排出検出／探知ユニット（例えばＵＶ吸収検出器 １３６、並びに排出センサー１３８内のＰＨおよび導電率センサー）からライン １４６によって電気表示を受け取る。

図１に示した本発明の好ましい具体例では、プロセッシングユニット１４２はユ ーザーインターフェースシステムに連結されているが、これはプログラム／デー タ人力のためのキーボード、ディスプレーおよびマウス並びにデータを打ち出す ためのプリンターを含む。一方他の慣用的なハードウェアー要素（例えばディス クメモリーまたはセミコンダクターＲＡＭまたはＲＯＭユニット）は示されてい ないが、以下により完全に記載するように、プロセンサーを動かすためにユニッ ト１４２に含まれている。

本発明の一局面にしたがえば、該制御システムは１つの分離工程のためのバルブ 操作を制御するだけでな（、同じ溶媒または連続する異なる溶媒を用いながら複 数の連続工程を自動的に実施するプログラムデータの入力を可能にし、所望の溶 媒混合物（一工程の溶出部分のための勾配混合物を含む）を提供する。

本発明のまた別の局面にしたがえば、制御プログラムは相互作用するフィードバ ックループを提供し、この場合、一工程またはセット工程の排出指標は保存され 、その後の工程のために環境条件を決定するために処理される。

図６は、該装置を制御するために取り入れられたプログラムステップを最もよく 図示している０図６は、単一カラムを用いる代表的なプロセスにおいてマイクロ プロセッサ−によって制御される機能の操作チャート２００を示している。この システムの特定の局面は固定することができることは理解されよう：例えば、多 口バルブ、特定の混合バルブ、溶媒ポンプおよびサンプル注入ポンプ、並びにい くつかの基本的な排出センサーの存在である。他の構成要素（例えばサンプル緩 衝液、溶媒溜め、並びにクロマトグラフィーカラムのサイズおよびタイプ）はそ れぞれの使用に際して、または同一の連続工程または工程°キャンペーン”の部 分である工程間においても変化させることができる。

第一の状態２０２では、特定のセンサー、溶媒、カラムおよび緩衝液（これらは 実施されるべき分離のため、または連続分離実験のために選ばれている）でその 制御ｎプログラムが作動するようにシステムが設定され、初期設定される。これ は包括的指標数値（例えばカラムサイズおよびタイプ、サンプルループのサイズ 、６つの混合バルブチャンネルの各々に付いている溶媒の同一性または特性、各 排出センサーの同一性など）の入力を必要とする。すなわち、器械の構成、カラ ム、溶媒およびサンプルが特定される。

さらに、制御プログラムに対して一定の不履行の指示を入力することができる０ 例えば不履行の流速、ある排出センサーを迂回させるか否か、さらに平衡化、サ ンプル添加、洗浄、溶出および再生のステップを行うか否かであるが、下記でよ り完全に記載する。

操作については、モードは２０４で、例えば分析用または調製用プロトコール（ すなわち完成プロトコール）のルーチンな実施、または方法開発工程（すなわち プロトコール開発のためのプロセス）を実施するために選択される。調製用モー ドが選択される場合、１つの特定された分離方法が繰り返し行われ、多数の同一 サンプルを分離し、排出点で採集される。このモードでは、少なくとも１つの排 出センサーが用いられ、所望の分画が排出に達したとき信号を送ることができる 。そのようにして制御装置はバルブを活性化し、排出を採集容器に送ることがで きる。さらに、排出検出手段からのデータは運転のための記録として保存される 。

採集されない。いずれのモードでも、分離指標は各工程について変化する。２０ ６．２０Ｂでは、分離方法が完全に特定され緩衝液およびサンプルの混合、溶媒 の混合、カラムの構成、サンプル管のローディングおよびサンプルの注入、並び にサンプルおよび溶媒の分離カラム中の移動を含む。２１０．２１２．２１４． ２１６および２１８で示されたこれらのステップは、模式的かつ略語表現で示さ れている；実際、ステップ２１２．２１４および２１８の異なるサブループが連 続的局面で繰り返され、完全な１工程の間、前進または逆方向でカラムが平衡化 、洗浄、溶出または再生される。

分離が行われ、ステップ２２０でデータが採集され保存された後、該プロセッシ ングはステップ２２２で分岐し、さらに進行して指示された分画を２２４で採集 し、調製用方法で実施されている場合は、特定数のサンプルが分離されるまで同 一の工程が繰り返される。

本発明の主たる局面にしたがえば、制御ソフトは方法作製ソフトを含み、これは 分離装置に実験的“キャンペーン”を実施させる。これは連続的に実施される一 連の方法で、その間１つの方法が行われている各時点で指標は変化している０例 えば、この装置は２１回の分離工程を行うことができ、ここで溶媒のｐＨはｐＨ ５，０から７．０の間で０．１づつ増加するが、または塩化ナトリウムのモル濃 度が０．１段階づつ変化する。このモードで１つの方法を行った後、そのような キャンペーンが終了したか否かの決定が為され、終了していない場合は、次の工 程のための指標は２２６にロードされ、ステップ２１０または２１２で開始する 新しい工程が行われる。

本発明のまた別の主要な局面にしたがえば、１つの工程または完全なキャンペー ンからの記録データは分析モジエール２３０に送られるや 第一水準では、このモジュールは数値分析およびスブレンドシートプロセノシン グプログラムを含み、それによってすべての記録データを処理し、さらに、当該 工程またはキャンペーン中に実行された種々の入力指標の関数として、排出特性 を表すチャートおよびグラフを打ち出しまたは表示することができる。

第二水準では、該モジュールは分離方法の開発を促進しまたは自動化すらできる 分析ソフトを含んでいる。このソフトは”エキスパートシステム”型の人工知能 をプログラムを含むことができる０例えば、分析第二水準は、特定の分離媒体に おいて圧１化またはｐＨ変化キャンペーンに附したとき、特徴的な排出動態によ って一定の種類の蛋白を識別する保存テンプレートまたは、そうでなけば可能な パターンを識別する排出テンプレートを含むことができる。そのようなプログラ ムは、好ましくはプログラム入力モジュールまたは選択ソフトに合わされている が、これはモニター１４３にプロンプト記号を表示させる。

このプロンプトは、オペレーターが、問題の物質の分離の最適化のための方法ま たは数組のステップを選択できるように導く。

したがって、例えば、およその分子量およびある種の主要な基が、特定媒体にお ける移動速度および分離ダイナミクスから同定されたとき、このプログラムは、 同定された型の蛋白の基にとって有効であると分かった、異なるカラムでｐＨを 変動させるキャンペーンを示唆できるかもしれない、したがって、この水準の分 析プログラムは、顕著な蛋白の特性を認識するためのテンプレートを含み、さら にテンプレートに合わされた表または規定メンセージを含む、初等水準では、こ の分析プログラムは一連の数種の非関連方法をまた提供することができる。これ は、適切な分離媒体を迅速に決定し、または問題の物質が他の分画の前に通過す るかどうか、または溶出によってカラム残留物として分離されるべきか、さらに そうであるとしたら、溶出ステップのためにイソクラチック（ｉｓｏｃｒａｔｉ ｃ）または勾配溶媒を用いるべきか否かを検出する。

この態様では、本装置の制御プログラムは、蛋白分離方法を開発または最適化す るために従来技術で必要とされた、多くの手動または断片的調製ステップが排除 され、さらにそのようなステップ（そのようなステップの選択に必要な思考プロ セスを含む）のために必要とされる時間が、１つのカラムで分離を行うために必 要な時間以下に短縮されることが理解されるであろう、したがって、溶媒がカラ ムを流れるときに、カラム再生、次の工程のための指標の選択、並びに次の工程 のためのサンプルおよび溶媒の混合のプロセスはすべて同時に進行する。そのよ うに作動することについてのまた別の利点は、すべての液体調製物のより高い均 一度および鮮度が得られ、これは排出センサーによって検出される排出特性との より正確な相関性につながるということである。

ロマ　′−−７１・ 本発明のクロマトグラフィーシステムでは、粒子の周囲同様粒子内に対流を導入 できるように、比較的大きな孔径を有する多孔性小粒子を含むマトリックスを用 いることによって、クロマトグラフィー処理量を高めることができる。このタイ プのクロマトグラフィーは、潅流性クロマトグラフィー（ＰｅｒｆｕｓｉｖｅＣ ｈｒｏｍａ　ｔｏｇｒａｐｈｙ　）と呼ばれ、ともに係属中の出願番号３７６８ ８５　（１９８９年７月６日出願、現在米国特許第５０１９２２０号）に記載さ れており、その開示内容は参考文献によって本明細書に含まれている。潅流性ク ロマトグラフィー技術は、高速、高能力、高解析分離を許容する。潅流性マトリ ックスは、バーセプテイブハイオシステム社（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ　Ｂｉｏｓ ｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、ケンブリンジ、マサチューセノツ）から購入すること ができる。

潅流性マトリックスは、硬質多孔性で大きな表面積を有する物質で、例えば、慣 用的なりロマトグラフィーマトリックスで用いられるものと同じ平均直径の粒子 である。潅流性マトリックスの幾何学構造は、対流液が粒子内および粒子間の両 方を移動することを許容する。典型的には、１０−２０μｍの直径の潅流性マト リックス粒子は比較的大きな平均直径（例えば６０００から８０００Ａ）の貫通 孔、および貫通孔内により小さい平均直径（５００から１５００Ａ）の内部非貫 通サブポアーによる広い表面積ネットワークを有する。相互作用する表面の構成 要素は、貫通孔およびサブポアーを含め、利用可能な全表面積において固定する ことがる。

潅流性マトリックスは、粒子間流路対粒子内貫通孔の平均直径の比が比較的小さ いという特徴を有し、したがって粒子内封流を接触可能な液の流速とすることを 可能にする。生じたネットワークは粒子内の拡散路の長さを制限し、その結果、 粒子孔内の大量移動は、範囲が広い高流速を越える拡散よりむしろ対流によって 支配される。潅流性マトリックスが充填粒子を含む場合、粒子の直径は、充填ヘ ッドの粒子間間隙の平均直径を決定する。平均粒子直径対粒子内貫通孔の平均直 径の比は、７０未満、最も好ましくは５０未満でもよい。好ましいサブポアー直 径はおよそ３００−７００人の範囲内である。さらに、その比率が低い場合〔さ らに、それに対応して粒子内ポアーサイズ（Ｓｕｂｐｏｒｅ）がより大きい場合 〕は、粒子のポアー効果が減少する。粒子間および粒子内ボアーを通り抜ける対 流速度の好ましい比は、およそｌＯ：１から１００：１の間である。

本発明の有用なりロマトグラフィーマトリックスの例は、その表面に多数の陽電 荷を有するマトリックス、例えば強力な陰イオン交換被覆ソルベント（ＵＳＳＮ 　０７１５６５６２８号（１９９０年８月１０日出願、同一の譲り受け人に譲渡 ）に開示、参考文献として本明細書に含まれている〕、マトリックスビーズの疎 水性表面に吸着被覆を有し、持続的な疎水性フィルムを生じるクロマトグラフィ ーマトリックス〔この吸着化合物は、ヒドロキシル、エポキシ、ハロゲン化物、 または他の反応性側鎖基を含んでいてもよい　［ＵＳＳＮ　０７／４６９９５６ 号（１９９０年８月１０日出願、１９９１年７月９日特許）、特許番号第５０３ ０３５２号、同一の譲り受け人に譲渡１に開示、参考文献として本明細書に含ま れている）〕、酵素を固定したマトリックス（ＵＳＳＮ　０７／４６９９５６号 （１９９０年１月２５日出願、同一の譲り受け人に譲渡）に開示、参考文献とし て本明細書に含まれている〕である。

また別に、大きな表面積を有する集札性クロマトグラフィーマトリックスも用い ることができる。無孔性粒子システムは曲がりくねった通路を含み、これは拡散 結合システムのように、粒子間間隙によって形成される。これはまたグライコチ ック社（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ　Ｉｎｃ、、ウェストへブン、コネチカソト）から 入手できる。性能が低いマトリックス、例えば慣用的なＨＰＬＣ支持体または低 圧液体クロマトグラフィー支持体もまた、本発明のある種の具体例で用いること ができる。

ロマ　グー　一 本発明のクロマトグラフィーシステムは調製用または分析用工程で用いることが でき、その場合、最終ゴールは蛋白混合物の１つまたは２つ以上の成分を分離す ることである。図７−１１は、本発明の装置を用いたクロマトグラフィ一工程で 得られた代表的なりロマトグラムを示している０例えば、クロマトグラフィ一工 程は、高速クロマトグラフィー技術の利点を追求する本発明にしたがい、以下を 可能にするために用いることができる０例えば、クロマトグラムのピークの同定 （図８）；大半が溶解生成物である溶液中の微量溶質夾雑物の検出（図７）：プ ロセス混合物中の溶質濃度の即時モニタリング（図９）；与えられた溶質の構造 的変種の性状および相対濃度を典型的に示す混合物のプロフィルの作製じフィン ガープリンビまたは“ブレークスルー”分析）（図１０）；例えば調製工程のい ずれのステップでもよいが、クロマトグラフィー流出液中の溶質の存在および位 置の迅速な決定（図１１）；および精製または分離プロトコールが成功したか否 かの迅速な評価、幾つかの代表的なりロマトグラフィ一工程が以下の実施例に記 載される。

しかし、本発明は、本明細書に詳細には記載されていない他の精製または分析ス キームも広く包含するものである。

実１．１１ 本発明のクロマトグラフィーシステムは、溶解生成物の主要量を含む溶液中の微 量７８質を検出するために用いることができる。微量溶質検出は、ＵＳＳＮ　０ ７／７２１１９２号（１９９１年６月２６日出願、同一の譲り受け人に譲渡）に 開示され、参考文献として本明細書に含まれている。この微量溶質検出工程は、 例えば、以下を含む：生成物を抽出する手段に溶液を流し、実質的に該生成物を 含まないが残余の微量溶質を含む流出液を生じ；該流出液を微量溶質吸着剤中に 通し、その中に該微量溶質を順次蓄積し；この蓄積された微量溶質を吸着剤から 溶出させ、検出可能量の微量溶質を含む溶離液分画を生じる。

この微量溶質検出方法は、以下のように本発明にしたがって実施することができ る０図３を参考にして、生成物および微量溶質不純物の混合物を含むサンプルを 、液溜め１１７ａ−ｄのいずれか１つから混合バルブ１１６およびライン１１８ を介してバルブ１５１に該バルブの口（４）から提供する。状態１のバルブ１５ １において、サンプルは口（４）を介して口（５）および管１５２にポンプで押 し出される。バルブが状態２に変更されるでいるとき、サンプルは管１５２に留 まり、さらに溶媒はライン１１４および口（１）を介してシステムにポンプで押 し出される。溶媒は口（１）から口（２）にポンプで押し出され、サンプルを管 １５２から口（５）および（６）へ押し出し、続いてバルブ１３４の口（１）お よび（６）を介して第一のカラム１３１へ押し出す、サンプルはその後カラム１ ３１（これは選択的にサンプルの生成物成分に結合することができ、したがって サンプルからそれを抽出することができる）に移送される。カラム１３１は、例 えば免疫グロブリン結合マトリックスを含むことができ、この場合、免疫グロブ リンはサンプルの主要な標的成分に特異的である。

カラム１３１の能力は、少な（ともサンプル溶液から生成物のすべてを実質的に 抽出するに足る大きさであるが、それよりはるかに大きいことが好ましい、＠量 溶質不純物を含むカラム１３１からの流出液は、バルブ１３４の口（５）および （４）を通りバルブ１３３の口（５）および（６）へ、さらに第二のカラム１３ ２（これは微量不純物を吸着し、したがってサンプル？６　？＆からそれらを抽 出できる）に送られる。比較的大容量のサンプル、したがって比較的大容量の生 成物抽出流出液が第二のカラム（これはサンプル溶液から微量溶質を典型的には 非選択的に吸着し、したがって微量溶質夾雑物を蓄積する）に渡される。第二〇 カラム１３２からの流出液は、未吸着夾雑物質を含まないことを確認するために 検出器１３６を通って流出し、続いて廃液１４０に流出する。微量溶質はその後 、第二のカラムから検出器１３６を通って同じ経路で溶出され、第二のシステム から流出する微量不純物を、例えば時間的および／または空間的に表現する排出 を生じる。微量ｔ￥７Ｉ質が蛋白である場合、第二のカラム１３２は、いずれの 蛋白結合性マトリックス（例えば、逆相、疎水性相互作用、イオン交換など）で あってもよい、さらに、検出は、慣用的な検出手段（例えば液の薄膜を通して紫 外線吸収を測定する検出手段）を介して行うことができる。蛋白以外の微量溶質 も適切な慣用的手段によって検出できる。　この装置の極めて高い感度は、以下 によって不純物を濃縮する第二のシステムの能力の結果である：　（１）比較的 大容量の生成物抽出サンプルが通過するときそれらを蓄積し、（２）比較的＠量 の溶離液中に不純物を遊離させる。したがって、例えば１０−’ｇ／ｍｌの生成 物および１０−”ｇ／ｍｌの不純物を含む１００ｍ１のサンプルが装置を通過す ることができる。

生成物（０，１ｇ）が第一のカラム１３１で抽出され、不純物（１０−”ｇ）は 第二のカラム１３２に蓄積される。次に第二〇カラム１３２の不純物は、例えば １０マイクロリツトルの溶離液で溶出され、検出可能濃度が１００−１ｏ／ｌ　 ０−’リットルまたは１０−’ｇ／Ｉである検出器１３６に送られる流出液を生 じる。その時第−〇カラムで抽出された生成物は、溶出液をバルブ１３４の口（ ６）からカラム１３１へ通過させ、さらに上記のようにカラム１３２を迂回させ た後バルブ１３４および１３３を介してシステムの外へ送り出すことによって回 収できる。

図１２は、上記の肯定を実施するために行うことができるステップのフローチャ ートである。

本発明のこの具体例では、多口バルブ１５１．１３３および１３４のうち１つ、 ２つまたは３つ全部を用いることができる。

多口バルブ１５１は、すべての必要な液流を提供するために、口（４）を通して サンプルを、口（１）を通して溶離液を、または口（１）を通して平衡化させる 緩衝液を第一のカラムに択一的に提供するために用いることができる。バルブ１ ３３および１３４は、カラム１３１を出るサンプル流出液または緩衝液をカラム １３２に流入させ、カラム１３１に溶離液を導入することができるように、さら に、カラム１３１からの溶離液を次のアノセーの準備のために廃液の方へ向け、 または生成物を採集することができるようにｙ４節することができる。バルブ１ ３４および１３３はまた、第二のシステムカラム１３２がらの流出液または？８ 離液が廃液または検出Ｘｉ　１３６へ流れることができるように構成することが できる。すべての多口バルブのバルブポジションは手動またはコンピューター制 御下のいずれがで、液配送は１つまたは２つ以上の計器付ポンプ（表示されてい ない）によって行うことができる。多口バルブは、さらに°液流分割器”　じｓ ｔｒｅａｍ　５ｐｌｉｔｔｅｒｓ”）または第一および第二のカラムへ所望の流 速のみを向け、および／または減速させる他の手段を含むことができる。

本発明のこの具体例におけるサンプル経路は以下のように考えられる。サンプル は、バルブ１５１１３４および１３３を介して第一〇カラム抽出器１３１に、例 えば計器付ポンプで添加される。サンプルがカラム１３１内を流れるとき、サン プルの生成物成分はカラム１３１に保持され、流出液はバルブ１３４を介して第 一のカラム１３１がら流出し第二のカラム１３２に流入する。流出液サンプル中 に存在する微量溶質は第二のカーフＺ、　ｌ　３２に保持される。すべての流出 液が第二のカラム１３２を通り抜けるやいなや、多口バルブ１３４は切り換えら れ、カラム１３１を迂回させた後、口（６）がらカラム１３２に注入する洗浄溶 液を介してカラム１３２の洗浄を可能にすることができる。洗浄液はバルブ１３ ３の口（１）を介してカラム１３２を出ることができる。＠量溶質は、液溜め１ ｌｌａ−ｆのうちの１つに保持されている溶出緩衝液を用いて、カラム１３２か ら溶出させることができる；溶出緩衝液はまた、バルブ１３３の口（６）を介し てカラム１３２に配送することができる。

微量溶質を含む比較的少量の流出液はバルブ１３３を介して検出器１３６に流入 する。検出はいずれの慣用的なアンセーによっても行うことができる０例えばＵ Ｖ吸収が用いられる場合、カラム１３２のクロマトグラフィ一手段によって分離 された溶出サンプル中に存在する１つまたは２つ以上の微量溶質の存在および量 を表す吸収スペクトルを作製することができる。抽出生成物が第一〇カラム１３ １から回収されることとなる場合、カラム１３１は、バルブ１３４の口（６）を 介してカラム１３１に送られる洗浄溶液を用いて洗浄され、さらに、溶離液は、 バルブ１５１の口（１）を介してカラム１３１に送ることができる。溶出生成物 サンプルは、一旦夕ロバルブが適切なポジションに切り換えられると、バルブ１ ３３および１３４、検出器１３６並びにフラクションコレクター１４９を介して カラム１３１から回収できる。上記のステップのいずれかまたはすべてをコンピ ューターの指示によって自動化することができる。

生成物の評価システムまたは生成物のモニタリングシステムの部分として、本発 明の方法および装置は、問題の生成物とともに精製されてくる微量夾雑物質の存 在を識別するために有用である０図７は、微量溶質検出工程の代表的なデータの クロマトグラムを示す、左側のクロマトグラム（Ｌ）はサンプルの主要生成物４ ４の除去前のサンプルプロフィルを示し；右側（Ｒ）は、主要生成物を除去する ためにサンプルをカラム１３１に通し、さらに微量溶質４６．４６°、４７”を 採集するためにカラム１３２に通した後のクロマトグラムである０図１２は、微 量不純物を検出するために行うことができるステップを工程順に並べた流れ図を 示す、第一のシステムは、サンプル混合物中の微量不純物の量または組成に顕著 な影響を与えることなく、実質的にすべての問題の抽出物を選択的に抽出するこ とを条件として、サンプル中の微量の不純物の存在および濃度が本発明にしたが って検出できる。

生成物および／またはプロセスモニタリングプロトコールの部分として本発明を 有用なものとする本発明の重要な特徴は、？８質微量夾雑物検出の速さ、質、お よび信幀性である。理論的には該方法および装置は、第一および第二のカラムに ついて慣用的な液体クロマトグラフィー（例えばＨＰＬＣ）を用いて実行しえる けれども、一方実際の使用に際しては、該装置の両力ラム内に迅速な液体移動が 生し、第一の流出液流と溶離液との間の解析に顕著なｔ置火が存在してはいけな い。

１施ｆ１ 本発明のクロマトグラフィーシステムおよび装置は、流出液中の予め選択された 溶質または溶質のサブセットの存在および位置を迅速に識別するために用いるこ とができる０本方法は、ＵＳＳＮ　６７２８７２号（１９９１年３月２８日出願 、同一の譲り受け人に譲渡）に開示され、参考文献として本明細書に含まれてい る０本発明の方法および装置は、調製用プロトコールにおいて吸収ピークが存在 するかおよび／または存在しないかを検出するモニタリングシステムの部分とし て特に有用である。

流出液中の問題の溶質を識別するために、混合物はまず、混合物中の成分（溶質 ）を分離することができるカラムに通し、その結果、それらは液相（流出液）と してカラムから排出されるにつれ時間的または空間的にある程度分離される。第 一〇カラムは液体クロマトグラフィーマトリックスを含んでいる。この第一の溶 質分離カラムからの流出液（ここでは“第一の流出液流”と呼ぶ）はその後検出 手段を通過し、カラムから流出する−続きの溶質を表示する第一の排出を生じる 。この−続きの溶質のうち問題の特定の溶質の識別は、液相がら問題の溶質を選 択的に抽出することができる第二〇カラムにこの第一の流出液流を通すことによ って決定される。問題の溶質を抽出する能力を除けば、この第二のカラムは実質 的に不活性であるべきで、それによって、第二のカラムを液相が通過するとき、 この−続きの溶質は、問題の成分を欠失する点を除いて本質的には変化を生しな い。好ましくは、選択的抽出は、マトリックスと問題の溶質との間のある種の特 異的結合反応によって生じる。特に有用な選択的抽出カラムは、免疫吸着および 免疫親和性マトリックスの使用を含む。

第二のカラムを出る流出液流はその後検出手段を通過し、第二のカラムから流出 する−続きの成分を表示する第二の排出を生じる。第二〇カラムは、流出液流中 の他の溶質の時間的および／または空間的配置を顕著に変化させることなく問題 の成分を選択的に抽出するので、第一と第二の排出との間の違いは、問題の生成 物の流出液流中の位置を決定するために用いることができる。その結果、問題の 成分は第二の排出では消失または激減しているかもしれない、したがって、２つ の排出の比較は第一の流出液流中の問題の溶質の位置を識別するであろう。

カラム排出を検出するために用いられる検出手段は、当分野において普通に用い られる分子検出用のいずれの手段でもよい。

現時点で好ましい検出手段は、液体のＵＶ吸収をモニターできる装置、例えば分 光光度計を含む、さらに、第一および第二の排出は両方とも単一検出手段、また 別には別々の検出手段によって生しる。同様に、第一および第二の排出は肉眼ま たは電気的に比較できる。電気的比較は、第一の排出から第二の排出を引き算し 、第一の流出液流中の問題の成分の存在および位置のみを表す第三の排出を作る ことを含む、検出手段はまた、第一の流出液流中の問題の溶質の濃度を計算し表 示するための手段を含むことができる。さらに、第二のカラムマトリックスに続 いて結合する問題の成分は、引き算によって作られたデータを確認する手段とし て、溶出し、検出し、さらに定量することができる。この方法は、本発明にした がって用いられるとき、生成物および／またはプロセスモニターとして作動する ために自動化精製システムまたは他の調製用システム、およびコンピューター制 御下に置かれた本発明の方法を実施するために必要な種々のステップに統合する ことができる。

この方法はまた、流出液流中の多数の成分を識別するために以下のように用いる ことができる：第一の流出液流の異なるサンプルを問題の異なる溶質を選択的に 抽出することができる第二〇カラムを通過させ、これらのシステムからの排出を 第一の排出と比較し；さらに、問題の溶質の純度を算定する。第二〇カラムは、 第一の流出液流からの問題の溶質を選択的に抽出するようにデザインされている ので、第一の流出液流中の問題の溶質とともに溶出するいずれの夾雑物質もその 存在が、第二の流出液流中において示されるであろう。例えば、図８では、３枚 のクロマトグラムは、（ａ）サンプルの成分を４つのピークに分離することがで きる第一のカラムを通過させた後のサンプル；　（ｂ）第一のカラムの流出液流 から溶質（ピーク１）を選択的に除去する第二〇カラムに通した後のサンプル； および（ｃ）第二〇カラムから溶出させた後の溶質（ピーク１）を表す。

この方法はまた、プロセス条件を即時評価するためにオンラインプロセスモニタ リングシステムの部分として用いることができ、生産を最適化するために必要な ように条件を変更するために得られた情報とともに用いることができる０例えば 、オンライン排出モニタリングで、重なり合ったピークによって認識される同時 に溶出する溶質は、特定のプロセス条件、例えば緩衝液ｐＨ１または溶出勾配の 指標によって分離することができる。

この方法は、図３に描かれた本発明の具体例の模式的表現を参考にして、本発明 の装置に関連して理解することができる。

分離されるべき混合物を含むサンプルを、該混合物の成分（溶質）を分配するこ とができる第一〇カラム１３１に提供する。

その時分離された溶質を含むこのカラム１３１からの流出液流をバルブ１３４の 口（５）および（４）並びにバルブ１３３の口（５）および（４）を通して直接 検出器１３６に送り、第一〇カラム１３１を流出する混合物成分の時間的、空間 的な−続きを表わす第一の排出を生じる。カラム１３１によるサンプル分離はそ の後繰り返されるが、該サンプルはカラム１３１力１ら直接カラム１３２にバル ブ１３４の口（５）および（４）並びにバルブ１３３の口（５）および（６）を 介して送られる．カラム１３２は第一の流出液流から問題の溶質を選択的に抽出 することができる．第二の流出液流中の溶質の時間的および空間的な−続きは、 実質的に第一の流出液流のそれと同一であるが、第二のカラムは幾何学的に適切 で、さらに十分に不活性でその結果問題の成分以外はすべて、顕著な相互反応ま たは遅延なしに酸カラムを通過することを条件とする。

その時第二のカラムを出る流出液流は、再び検出器１３６を通過し、流出液中に 残存する溶質の時間的、空間的連続を表す第二の排出を生じる。該検出手段はま た、第二の排出を第一の排出から引き算し、第一の流出液流中の問題の溶質の存 在および位置のみを表す第三の排出を生しることができる。検出手段は、第一の 流出液流中の問題の溶質の濃度を決定する手段、およびこれらのデータを表示す る手段を有することができる。最後に、結合溶質を引続き第二のカラムから溶出 し、検出さらに定量し、引算のデータを確認することができる．問題の溶質が蛋 白の場合、典型的な検出手段は、液体の薄膜を通してＵＶ吸収を測定する慣用的 な検出手段である．図１３は、上記の工程を実施するために用いることができる ステップのフローチャートを示す。

この方法は、分子ｔｌ１ｍシステム（自動化することができる）内のモニタリン グシステムとして用いることができる．上言己のように、多口サンプリングバル ブ１５１は第一〇カラム１３１にサンプル（同様に、必要なすべての溶媒または 緩衝液（洗浄溶媒、溶出溶媒、電気泳動システムのだめの“ランニング″緩衝液 、サンプリングの間に必要とされるシステムを再生するためのリサイクリング溶 媒を含む））を提供すること力（できる。

同様に、多口サンプリングバルブ１３３は、第一の流出Ｗ！１．流およびすべて の必要な溶媒を含む液体を第二のシステムに供給スる。両方の多口バルブのバル ブポジションは、好ましくはコンピューター制御下にあり、液配送は計器付ポン プによって行うことができる。上記に述べたように、多口バルブはさらに、。

液流分割器”または、減速させおよび／または所望の流速のみを第一および第二 〇カラムに向ける他の手段を含むことができる。第一および第二のカラムの出口 にあるバルブ１３３、１３４は、カラムを出る液をバルブ１３７を介して検出器 １３６、廃液または採集器に向かわせる。所望の場合には、手段はまた検出され たサンプルを再循環させるために提供することができる。プロセスモニタリング システムの部分として、本発明の方法は、特定の分離または精製プロトコールを 評価および／または開発するために有用であろう．例えばイオン交換クロマトグ ラフィーシステムでは、ｐＨの変動は溶質分離に顕著に影響する。本発明のクロ マトグラフィーシステムおよび装置を用し）れば、溶質分離における種りのｐＨ の影響をオンラインで迅速に評価することができ、分離を最適化するために適切 な条件に変更することができる。この評価は微量のサンプｌしを用０て迅速に実 施することができる．したがって、該方法は、サンプフレまたは時間の実質的な 損失なしにオンラインによる生産最適化を可能にする。

本発明の方法はまた、問題の溶質とともに熔出する夾雑物の存在を識別するため に有用であろう．第二のカラムカベ、サンプル混合物中に残存する溶質の量また は位置に顕著な影響を与えることなく液相から問題の溶質を本質的にすべて抽出 することを条件として、第二の排出中の溶質が問題の溶質力喝一般に専有する位 置に存在するということは、夾雑物が存在するとし１うことを示していると言え よう、さらにまた、問題の？８質を溶出し、それを定量化しさらに第一および第 二のカラムの関係を有するピークの値とこの値とを比較することによって裏付け を行うことができよう。

生成および／またはプロセスモニタリングプロトコールの部分として有用な本発 明の重要な特徴は、溶質識別の速さ、質および信転性である。これは、装置内で 両方のカラムを液体が迅速に移動し、第一と第二の流出液流との間の解析に顕著 なｔ置火がないことを必要とする 混合物中の分配された溶質の解析は、分配成分（一般にはマトリックス）に対す る種々の溶質の親和性およびシステムの理論的プレート高の関数である。カラム クロマトグラフィーにおける”プレート”は、溶出を収容できる最大均一ゾーン であると考えられる。カラムのプレート高が小さいほど、溶質はマトリックス中 を移動しながらより多くの別個のステップ（より多くのプレート数）に遭遇し、 同じような成分との間でより優れた分離を提供するであろう、一般に、マトリッ クス表面積対カラム容積の比が大きいほど、より小さなプレート高およびより大 きなプレート数が得られる。カラムデザインは一般に、問題の成分を解析するた めに十分なプレート数を提供することを可能にする最小のマトリ、クス容積をデ ザインすることに集中される。容積が小さいほど、システム内を液体が移動する 速度を増し、ゾーン分散を減少させる。好ましいマトリックスは多孔性粒子で構 成されているもので、その理由は、これらは、密な（無孔性）粒子による充填マ トリックスより実質的により大きな表面積対容積比を提供することである。

装置は、小ビーズを密に充填することによって液流に対して強い抵抗が生しるの で、高圧で働くようにデザインされており、これによって、迅速な液体の移動が 可能になる。密に充填された粒子は大きな表面積対容積比を生し、これは、小さ な分子量の？８質をよく解析する。しかしながら、慣用的なＨＰＬＣシステムは 、より大きな分子量の溶質、例えば蛋白の解析に用いる場合、実質的には成功度 は低い。蛋白のような大きな分子量の溶質が慣用的なＨＰＬＣマトリックスを通 過する速度は、主に粒子ボアー内の物質移動はボアー間の物質移動（対流的であ る）と較べて広がりやすくなるという理由から制限される。一方、高圧を低下さ せるという犠牲によって流速を高めることができるが、これは分離の質を低下さ せる。ミニスキュール力ラム（マイクロカラム）を用い、顕著な解析の損失なし にこれまで達成できなかった速度で分析を実施することができる。

潅流性マトリックスが、本発明のこの形態における第一および第二のカラムのた めに現時点では好ましい液体クロマトグラフィーマトリックスである。第一〇カ ラムに用いる潅流性マトリックス（混合物の成分を分配し解析するためにデザイ ンされている）は、当業者に既知の慣用的な方法を用いて所望するように誘導し 、特定のクロマトグラフィーシステムを作製することができる０例えば、マトリ ックスは溶質をサイズによって分配することができ、また、電荷により（例えば 、イオンまたは陰イオン交換として働り）、金属イオン親和性により、もしくは 疎水性もしくは親水性により溶質を分離するように誘導することもできる。他の 有用なマトリックスは、無機物質、例えばリン酸カルシウム（ヒドロキシアパタ イト）、ベントナイト、アルミナ、およびチタニウムまたは酸化亜鉛ゲルを含む 。

上記に記載したように、第二〇カラムは、溶液中の残存する溶質の位置および濃 度に顕著に影響を与えるべきではない。これは、システムの幾何学的構成が重要 であることを意味している。問題の？８質が実質的にすべて適切に結合する最小 容積が用いられるべきである。さらに、非特異的結合は最小限とし、誤った陰性 結果を防がなければならない、好ましくは、非特異的吸着は、およそｌｏｇ／１ ０μｍ未満であるべきである。したがって、結合表面またはマトリックスは実質 的に不活性で、流出液中に残存する溶質の解析に顕著な変化を与えることなく、 問題の？８質を選択的に（好ましくは定量的に）抽出することができなければな らない。所望の場合は、さらにサンプルを載せる前に、非特異的分子で潜在的な 非特異的結合部位をまず被覆することによって、第二のカラムにおける非特異的 結合を最小限にすることができる。当業者にとって、この°被覆”分子は溶出条 件下で十分に結合し、第二の流出液流の排出と干渉しないということは理解でき よう。

問題の溶質の選択的抽出用として現時点で好ましいマトリックスは、溶質と特異 的に結合反応を生じることができるものである。もっとも好ましくは、これらの 相互反応は可逆性で、システムは、カラムからｆＪ’ｉｊを解離させ、さらに別 のサンプルのためにシステムを準備させることができる１つまたは２つ以上のリ サイクル溶媒の手段によって再生させることができる。有用な溶質特異的部位は 、免疫吸着物質（例えば抗体）および問題の溶質と特異的に反応することができ る他の蛋白を含む０例えば、いずれかのりガント／酵素の組み合わせ（ホルモン 、毒素、レクチンおよびそれらの適切なレセプターを含む）を含む溶質および溶 質特異的結合部位を考えることができる。問題の溶質が酵素である場合、結合部 位は仮性基質またはインヒビターを含むであろう。一般に、溶質特異的結合部位 （溶質特異的親和性ソルベント）は、問題の与えられた流出液に対して生物学的 親和性を示すいずれの固定化リガンドでもよい。マトリックス表面は、溶質特異 的結合部位が不可逆的にマトリックス表面に結合されるように誘導することがで きる。結合溶質はその後溶出され、カラムは次のサンプルのために再生できる。

また別に、溶質特異的結合部位は非共有結合でマトリックス表面に付着させても よい。これによって、システムは異なる標的溶質との使用に適応させることがで きる。１つの特定の溶質特異的結合部位を、１つまたは２つ以上のリサイクル溶 媒によってシステムから除去し、第二の異なる溶質に特異的な第二の結合部位は 、その後システムに用いることができる０例えば、プロティンＡまたはプロティ ンＧはマトリックス表面に共有結合させ、多数の異なる溶質特異的抗体を順にマ トリックスに結合させることを可能にする。

裏旌貫主 本発明のクロマトグラフィーシステムはまた、治療用物質または他の物質の迅速 なアッセーおよび性状決定に有用で、これは、本明細書、ＵＳＳＮ０７１５６６ １２１号（１９９０年８月１０日出願）およびｔｌｓｓＮ０７６７６８７２号（ １９９１年３月２８日出ＩＩ）（これらは共に同−譲り受け人に培液され、“減 法クロマトグラフィー”（“５ｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ　ｃｈｒｏａ＋ａｔｏｇｒ ａｐｈｙ”として参考文献として本明細書に含まれている）に記載されたことを 基にしている０本発明にしたがえば、多数の溶質を含む溶液が、１つまたは２つ 以上の標的溶質に対して特異的な結合部位を有するマトリックスを含むカラムに 通される。ここで用いられているように、“標的？容質”とは広く定義され、い ずれの水溶性分析物も含むが、典型的には、組み換え技術によって製造される蛋 白のような蛋白質である。

カラムからの流出液流を分析することによって、標的溶質の構造的変種（すなわ ちアミノ酸配列または糖付加パターンの違いを含む同様な分子）の存在および濃 度またはそのプロフィルを決定し、それによってサンプル分画の二次元分析を提 供することができる。

したがって、他の溶質との混合物中に少なくとも１つの標的溶質（例えばポリペ プチド、蛋白、多ｗｉなどのような生物学的に活性な分子）を含む供給溶液は、 標的溶質に対して特異的な結合部位を含むカラムマトリックスに通される。該供 給溶液はこのマトリックスを通過するので、標的溶質は該結合部位に吸着され、 それによって、流出液中のいずれの濃度の標的溶質も実質的に除去される。この プロセスにおいては、限定量の非標的溶質もまた、マトリックスに非特異的に吸 着させることができる。流出液はその溶質濃度を決定するためにモニターされる 。これは流出液のＵＶ吸収（これは濃度に比例する）のモニタリングを必要とす るが、同一の効果を得るためにまた別のいずれのモニタリング方法も用いること ができることは理解されよう、流出液の溶質濃度と相関するデータを生じるいず れの方法も適切である。

流出液がカラムから流出し始めるとき、流出液中の夾雑または°非標的”溶質の 濃度は、流出液中の非標的溶質の濃度が供給液中の非標的溶質の濃度と等しい平 衡水準に達するまで増加するであろう。例えばＵＶ吸収と時間との間の関係とし てグラフに表すと、アソセ一工程におけるこの段階は、マトリックスの性状に依 存しつつ、上向きまたは垂直線を生し、これは流出供給溶液がマトリックスを通 過するとき、結合部位が利用可能な状態を維持しているかぎり、流出液中の溶質 の平衡濃度は実質的に定常となるであろう。しかしながら最後には、マトリック スの結合部位は飽和され、標的溶質は、正味の干渉なしにマトリックスを直通す るであろう。これをブレークスルーと呼ぶ。したがって、マトリックスからの標 的溶質の出現は、流出液のＵＶ吸収の検出増加をもたらすであろう、したがって 、溶質濃度がプラトー（Ｐｌａｔｅａｕ）に達するとき（これは、マトリックス 表面との？８質の正味の相互反応なしに、供給液が単純にカラムを流出している ことを示している）、流出液中の溶質濃度は供給液中の濃度と等しい。

非拡散結合クロマトグラフィーシステムが用いられるとき、または液流速度が拡 散時間に比べて遅いときは、上記で考察された現象は、２つの明確に限定された スッテブを有するグラフを生じる。すなわち、流出液中の非標的溶質の濃度を表 す平衡濃度が達成されたとき、第一の明確に限定されたプラトー（Ｐｌａｔｅａ ｕ）が生じる。これは、垂直線または垂直に近いスロープを有する線によって示 される推移時間、さらに標的および非標的溶質を合わせた濃度を表す第二のプラ トー　（Ｐｌａｔｅａｕ）を伴う。

非拡散結合クロマトグラフィーシステムが用いられるとき、または液流速度が拡 散時間に比べて遅いときは、上記で考察された現象は、２つの明確に限定された ステップを有するグラフを生じる。すなわち、流出液中の非標的溶質の濃度を表 す平衡濃度が達成されたとき、第一の明確に限定されたプラ）−（Ｐｌａｔｅａ ｕ）が生じる。これは、垂直線または垂直に近いスロープを有する線によって示 される推移時間、さらに標的および非標的溶質の濃度を共に表す第二のプラトー 　（Ｐｌａｔｅａｕ）を伴う。

平衡濃度間の違いはサンプル中の標的溶質の濃度に正比例するので、これらの平 衡濃度の違いは、サンプル中の標的？８質の濃度を算出するためにために用いる ことができる。さらに、第二のプラトー　（Ｐｌａｔｅａｕ）は供給液中のすべ ての溶質の付加濃度を示しているので、その値は、それがマトリックスに入る前 に、サンプルをモニタリングすることによって得ることができる。

したがって、標的溶質濃度を算出するために必要なすべての情報は、非標的溶質 または夾雑溶質のブレークスルーのプラトー（Ｐｌａｔｅａｕ）が達成されるや いなや人手できる。この仕掛けは、既知濃度の純粋な標的溶質を溶質検出手段に 通すことによって目盛り付けを行ない、したがって、濃度単位を、例えば吸収単 位と正比例させることができる。読み取られたプラトー（Ｐｌａｔｅａｕ）と相 関因子との間の違いの産物は標的溶質の濃度に等しい。

マトリックスは、好ましくは硬質で実質的に微細孔がなく、親水性表面を有する 粒子状物質で、好ましくは潅流性クロマトグラフィーマトリックスである。この マトリックスはまた、毛細管状の内部表面を有すると規定できる。マトリックス が、固定プロティンＡ、プロティンＧを含む表面領域を含み、さらに結合蛋白が 免疫グロブリンである場合、毎回液を通した後、マトリックスから結合部位を除 去し、新しい結合部位をマトリックスに再結合させることができる。免疫グロブ リンおよび他のタイプの蛋白結合部位は、また、疎水性ポリマーマトリックス表 面に非特異的に吸着させることができ、さらに、有機／イオン性混合解離溶液で 除去することができる。

本発明のこの具体例の適切な開発には、明確に限定されたブレークスルーを生し るクロマトグラフィー技術を用いることが必要である。これは、マトリックスを 通過する流速が遅いということを条件として、本質的にいずれのマトリックス構 造を用いても容易に達成することができる。遅い流速では、慣用的な液体クロマ トグラフィーまたは他のクロマトグラフィー媒体のポアーの内外に溶質が拡散す るために要求される時間は、流出液中の明白な濃度プラトー（Ｐｌａｔｅａｕ） の発達を破壊するためには不十分である。しかしながら、慣用的な媒体を用いる 速い流速では、流出液中の濃度ブラ）−（Ｐｌａｔｅａｕ）は典型的には識別で きない。これは、実質的には、所望の高速での実施では非拡散結合クロマトグラ フィーマトリックスを用いるべきであることを示している。

さらに、このマトリックスはできる限り小さい必要がある。

マトリックス中に存在することができるサンプルの体積は、流速と合わせて、サ ンプル導入とブレークスルーとの間の時間間隔を指令する。より速い流速および 小さいカラム容積は高速分析を促進する。このアプローチは、実質的には１分未 満、さらに容易に１０秒未満の時間で実施できるアンセーをもたらす。

すべての実際的な目的について、この短い時間枠は即時（“リアルタイム″）測 定と考えることができる。

定量的分析は流速に左右されず、さらに標的溶質およびマトリックスが平衡に達 することを必要としない、したがって、サンプルは、いずれの慣用的な方法（例 えば手動的に、例えば注射筒または電動ポンプを用いて）によってもマトリック ス中を押し進めることができる。

本発明のクロマトグラフィーシステムによる減法クロマトグラフィーは、プロセ スの正確性を損なうことなく繰り返し実施できる。マトリックスの未知サブセン トの結合部位が結合、溶出および再平衡化の反復連続で劣化するかもしれないが 、この方法は、標的および非標的溶質の濃度の違いに基づく情報を生しる。した がって、利用できる結合部位が少なくなれば、標的溶質のブレークスルーがより 短時間で生しるが、不正確な濃度が示されることはない。

本発明の装置を用いる引き算方法はまた、自己チェック能および高い融通性を有 する。検出された濃度が供給液および最終流出液のプラトー（Ｐｌａｔｅａｕ） との間で異なる場合、このシステムはおそらく不適切に操作されている可能性が ある。自己チェックはまた、最終流出液プラトー（Ｐｌａｔｅａｕ）が達成され た後マトリックスを洗浄し、続いて標的溶質を溶出させることによって実施する ことができる。溶出液中の検出パルスの統合は、結合標的溶質の量（これは前の データと相関するはずである）を°　指示するであろう。さらに、この方法は非 常に融通性がある。

例えば、高濃度の標的溶質を有するサンプルをマトリ・ンクスを通過させるとい う状況を考えてみよう、これは、はぼ直ちにマトリックスの結合部位飽和をもた らし、したがって、はぼただちにブレークスルーを生じる。上記で考察したよう なグラフでは、排出は単一の垂直線として出現し、水平プラトー（Ｐｌａｔｅａ ｕ）が続き、標的または非標的溶質の濃度についての情報は与えられない。この 状況を解消するために、サンプルは緩衝液などで希釈される必要があるだけであ る。サンプルを希釈することによって、ブレークスルーは遅延し、したがって流 出液中の非標的溶質の平衡濃度と標的および非標的溶質の平衡濃度との間に明白 な識別が可能になる。希釈液の量が分かれば、希釈は結果の正確さに悪影響を与 えない、非常に薄いサンプルのアノセーもまた日常的に実施できる。このシステ ムについてのただ１つのネガティブな影響は、結合部位を飽和させるために必要 な時間が増加するということである。これはもちろん、ｙ１′８溶質のブレーク スルー後に達成されるプラ）　−（Ｐｌａｔｅａｕ）をサンプルから直接決定す ることができるので、このプロセスの自己チェックという局面に対してのみ障害 となる。　本発明の具体例のまた別の特徴は、マトリックス上の結合部位、例え ば単クローン（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）もしくは多クローン（ｐｏｌｙｃｌｏｎ ａｌ）抗体または他の結合蛋白は、標的溶質の個性に応じて既知の方法を用いて 容易に交換できるということである。この特徴は、いずれの標的溶質についても 特別机が可能な単一マトリックスおよびアラセーブバイスの構築を可能にする。

本発明のまた別の利点は、極めて小さな規模で用いることができるということで ある。マイクロリフドルサイズのサンプルでも分析することができる。さらに、 伝統的なりロマトグラフィーカラムにマトリックスとして機能する大きな表面積 の粒子を充填するよりむしろ、毛細管の内部表面に結合蛋白を被覆することがで きる。この毛細管に溶液を通過させれば、上記で考察したのと同し結果が達成さ れる。

本明細書で述べたクロマトグラフィーシステムにした力（え４ボ減法クロマトグ ラフイーは、減法前端ブレークスル−分析（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ　ｆｒｏｎ ｔａｌ　ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ　ａｎａｌｙｓｉｓ）に基づし為で溶質の生 成をモニターする方法を提供する。この方法は、本発明の装置を用いて以下のよ うに行うことができる。

図３を参考に、バルブ１５１は、サンプル投入冊８力１らのサンプル、クロマト グラフィーマトリックスを洗浄し、再平衡化するための液溜め１ｌｌａ−ｃのい ずれか１つ力）らの緩衝溶液、またはクロマトグラフィーマトリックスの結合部 位力・ら吸着種の遊離を誘発することができる液溜め１ｌｌｅ−ｆの０ずれか１ つからの溶離液のいずれかに方向を与える。ノ＼ルフ゛１５１の排出は、より詳 しくここに述べた性状をもつクロマトグラフィーマトリックス（例えばカラム１ ３１内の）を通る選択溶液を完全に管理する。このマトリックスは表面に配置さ れ、分析物または決定のためにめられている標的溶質を選択的に吸着できる結合 部位を含む。溶質濃度は、カラム１３１の通過前または後に検出することができ る。検出器１３６４まクロマトグラフィー装置で普通に用いられるライン゛の慣 用的なデ／ｓｌイスでよいが、これは、例えばサンプル薄膜を通過するビームを 提（共するＵ■光源および、サンプル中の溶質による吸収の測定を可能にするＵ ■検出器を含む、マトリックスカラム１３１を出る液体は検出器１３６に入るが 、これはまた、溶質濃度に特徴的な指標を流出液中でこの時点で測定し、その量 を表す信号をライン１４６を通して伝える。検出器１３６からのデータむよ電気 的計算手段に入る。ここでは、例えば、オプションの検出手段と検出器１３６で 読み取られた吸収最大値との間の違０力竜算出され、さらに、その違いは、標的 溶質の濃度を決定するために変換因子との掛は算に用いられる。この濃度の値番 よまたディスプレーに配送できる。

溶質濃度がカラム１３１の通過後にのみ検出される場合【よ、検出器１３６は、 マトリックスカラム１３１を出る非標的を容質または夾雑物質の濃度を表す第一 のプラ）　−（Ｐｌａｔｅａｕ）を）炙出し、後れて、標的？８質のブレークス ル−の後、標的ン容質濃度を検出する。これらの読み取られたプラ）　−（Ｐｌ ａｔｅａｕ）を表すデータポイントは計算手段３０に送られ、上記に説明したよ うに処理される。

溶質濃度がサンプルがカラム１３１を通過する前に検出される場合、サンプルは 、カラム前結合測定のために／＜）レフ゛１５１（状ｊｉ！２Ｌバルブ１３４（ 状態口およびノイＪレフ゛１３３（状態２）を介して検出器１３６に直接切り換 えられ、さらに、マトリックスカラム１３１からの流出液は、カラム後結合測定 のために検出器１３６に直接切り換えられる。これ（よ、単一の検出手段が、カ ラム１３１にサンプルを導入する前に、サンプル中の全溶質濃度を測定し、さら にその後、標的溶質のフルレークスルーに先だって流出液中の達成プラ）−（Ｐ ｌａｔｅａｕ）　（Ｄ水Ｗ／Ｌ’ｃ測定することを可能にする．検出手段によっ て読み取られた溶質濃度を表す信号は上記のように計算手段に（五速される。

本発明の減法クロマトグラフィーは以下のように１〒われる。

分析を開始する前に、システムは、カラム１３１を平衡イヒさせ、さらに検出手 段に溶質残留物が残存して（１なし）ことを確認するために用いられる緩衝液（ 液溜めｌｌｌａ−ｃのＬつ力ｓら）で満たされる。アッセーを開始するために、 バルブ１５１を調節し、ポンプまたは注射筒で起こした圧勾配によって押し出し 、サンプルをシステムに導入させる。標的溶質はマトリックスに固定された結合 部位に結合し始めフ結合しない夾雑物はマトリックスを通過し流出液中に現れる 。流出液はカラム１３２によって直接検出器１３６へ送られ、ここで流出液中の 夾雑物質の蓄積が測定される。標的溶質がカラム１３１の結合部位を飽和させ、 流出液中にブレークスルーが始まる前に、流出液流中の非標的？８質または夾雑 物質の濃度はプラトー（Ｐｌａｔｅａｕ）に達し、プラトー　（Ｉ”１ａｔｅａ ｕ）の水準を示す信号は計算機に送られる。

この時点で標的溶質の濃度を計算するために必要な全ての情報は利用可能で、ア ソセーは完了する。しかし、チェックのために、標的溶質がカラム１３１にブレ ークスルーし、夾雑物質とともにより高いプラトー（ｐｌａｔｅａｕ）を生じる （これはマトリックスに導入される前にサンプル中で読み取られた濃度と等しい はずである）までシステムを通過する流れは継続される。

この時点で、また別の自己チェックとして、所望の場合は、緩衝液を液溜め１１ １からシステムを通過するようにバルブ１１２を切り換えることができる。それ によって、検出手段と、非特異的に吸着した夾雑物質は含まないが、マトリック スの結合部位にに非共有結合的に結合した標的溶質を含んでいるカラム１３１と を洗浄する。この洗浄ステップの後、バルブ１１２を再び切り換え液溜め１１１ から溶離液を導入しシステムを通過させる。溶出剤は標的溶質をカラム１３１か ら溶出させるために働く、溶出標的溶質は、溶質のパルスとして検出手段に検出 される。パルス曲線のインテグレーシ目ンまたは該曲線下の面積のその他の測定 により、アッセー中に結合した標的溶質の量が示され、これはまた先に得られた 濃度と相関する０図１４は上記の工程のフローチャートである。

前出のように、このシステムのすべての構成要素のデザインおよび構築は当該技 術分野の範囲内にあるということは理解されよう。実際、本発明の工程を実施で きる他の多くの構造物が考案でき、さらに所望のとおりに付加的特徴を取り入れ ることが可能である。例えばこのシステムは、交換可能なマトリックスモジュー ルであって、個々のモジュールが予め決めた標的溶質に特異的な結合部位を含む ようにデザインすることができる。

アンセーの正確さは流速に左右されないので、システムを通過する流れをどの様 に促進するかは問題ではない、したがって、例えば、ポンプは流路のどこにでも 配置することができる。また別に、注射筒に入れてもよく、また単純にシステム に詰め込んでもよい。

計算手段またはプロセッサーは種々の形態をとることができ、実際、本発明の広 い範晴では必要とされない、検出手段に付けられたプロッターは、製造または精 製システムの実施者が、標的溶質および／または不純物の濃度が時間とともに変 化しているかまたは一定であるかを複数の連続的プロットを観察しながら決定す ることを許すであろう、しかし、この計算機は、読み取られた溶質濃度比および 相関因子を示すデータポイントを表す信号を保存する手段、および標的溶質濃度 および／または夾雑溶質濃度を計算する計算モジュールを含むことができる。こ れらのデータは各アッセーの後に数字で表示できる。また別に、データは、時間 に対して標的溶１ｔｆＡ度の表を作製するために、また分析中のシステムの動態 の記録としてこのシステムの状態を示す所望の他の指示をつくるために用いるこ とができる。

クロマトグラムは、流出液中の検出溶質の濃度に比例して変化する流出液の特徴 を測定し、図に表すことによって作製される。

市販されているクロマトグラフィー装置で普通に用いられている典型的な応用で は、紫外線照射が流出液を通過し、紫外線吸収の程度が口に表される。そのよう なシステムにおけるＵ■光の吸収は、溶質がこの波長を吸収するということを条 件として、？９１に濃度に比例する。しかしながら、流出液中の分析物および不 純物の濃度を表す、流出液の特徴のいずれも本発明の目的のためにモニターでき るということは理解されるべきである。

図９（１）のクロマトグラムの横軸は時間を、縦軸は吸収または４１を示してい る。明確にするために、グラフは５つの区切り時間に区分し、Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄお よびＥと標識しである。

この区切り時間は、クロマトグラフィーローディングサイクル中の流出液中の溶 質濃度の段階を明確にし、これは、カラムに収められた慣用的なりロマトグラフ ィーマトリックスを例えば１８００ｃｍ／時間の高速でサンプルが通過するとき 遭遇するかもしれないものである。各区切り時間の間の境界は、解析の低さのた めにむしろ自由裁量で書き込まなければならない。

最初の区切り時間Ａは、流出液が完全に緩衝液から成る状態を表している。流出 液がサンプルの不純物を含み始めるとき、溶質濃度は区切り時間Ｂに示すように 上昇を始める。最後には、区切り時間Ｃに示したように平Ｉｉ濃度に達する。こ れは、不純物のマトリックスへの非特異的結合（もし存在するとしたら）が停止 し、標的溶質がマトリックスに結合することによって保持され、その結果、供給 液中の不純物の濃度が流出液中の不純物の濃度と等しくなるときに生しるであろ う。サンプルがマトリックスを通過し続けるので、標的溶質はマトリックスの結 合部位を飽和させ始める。これは、その結果、流出液中に標的溶質が徐々にその 濃度を増しながら出現するが、これは通常“ブレークスルー”と呼ばれ、区切り 時間りに示される。結合部位が完全に飽和されるとき（区切り時間Ｅ）、サンプ ルは単にマトリックスを通過し、流出液中の溶質の濃度は供給液中の溶質の濃度 と等しい。

区切り時間Ｃの“プラトー（Ｐｌａｔｅａｕ）”は、標的溶質の濃度を計算する ために必要な重要な情報であるが、プラトー（Ｐｌａｔｅａｕ）の高さおよびそ の境界は明確とは言い難いことに留意すべきである。異なる物理特性を有する多 数の溶質を含むサンプルについては、このクロマトグラムは穫めてわずかの情報 しか与えない、さらに、サンプルをマトリックスに通す速度が速いほど、一般に は、バンドの拡散によってより多くの重要なプラトー（Ｐｌａｔｅａｕ）が損な われる。

図９（２）には、サンプルを非常にゆっくりマトリックスに通したときのクロマ トグラムを示す６図９（１）と（２）のグラフ間におけるただ１つの最も重要な 違いは、後者はブレークスルーポイントおよび平衡水準をシャープに限定してい るということである０図２の区切り時間Ａ゛は図９（１）の区切り時間Ａに対応 し、緩衝液のみが流出液を構成している時間を表している０図９（２）は、マト リックスは、非特異的結合により短期間で不純物で飽和され、その結果、不純物 は、非常に限定された時間である区切り時間Ｃ゛で平衡濃度に達する。これは、 ブレークスルーポイントＢ゛とじて図に表されている。区切り時間Ｃ°の平衡濃 度は、溶液に含まれる分析物がマトリックスの結合部位に、その結合部位が飽和 されるまでロードされるので維持される。このとき、第二のブレークスルーポイ ントＤ′に達し、そこでは、流出液中の分析物の濃度が供給液中の分析物の濃度 と等しくなるであろう０分析物および不純物の濃度はともに、第二のブレークス ルーステップＤ゛に続く区切り時間Ｅ′の平衡濃度と正比例するであろう、した がって、プラトー（Ｐｌａｔｅａｕ）　Ｅ’　の高さとプラトー（Ｐｌａｔｅａ ｕ）　Ｃ’　との間の違いは、供給溶液中の分析物の４度を計算するために用い ることができる。

さらに、マトリックスの能力が既知の場合は、ブレークスルーステンプＤ°が生 しる前に通過する溶液量をモニターすることによって、溶液中の分析物の濃度を 決定することができる。

しかしながら、反復使用により結合能（マトリックスの結合部位数）が低下する ので、溶液中の分析物の濃度は、上記で考察した原則に基づいて決定される場合 が多いであろう、このように決定された濃度は、したがって、ブレークスルース テップＤ゛のタイミングと合わせて、どれだけの結合部位がマトリックス中に残 存しているかを決定するために用いられるであろう。

図９（２）の直線Ｆ°は、溶液のマトリックス通過が停止し、もう一度流出液が 緩衝液のみで構成される時点を表す、溶液中の分析物量を決定する第三の方法は 、結合部位から分析物を遊離させるために、流出液をマトリックスに通過させる ことによってマトリックスから分析物を解離させる工程にある。このプロセスは 、区切り時間Ｇ°の間のクロマトグラムの動態によって図に表されている。この 区切り時間における曲線下の面積はブレークスルーポイントＧ°について、マト リックスに結合した分析物量に正比例する。したがって、区切り時間Ｇ°の間の 曲線下の面積に基づいて行われた決定に対して、ステップＤ。

の高さに基づいて行われる標的溶質濃度の決定の正確さをチェックすることは明 らかに可能である。

反復使用とともに、クロマトグラフィーマトリックスは、その能力が低下すると いう意味で劣化する。しかし、これは、本発明の原理にしたがって作製されるデ ータの正確さに影響しない。発生しえるすべては、標的溶質がより速くブレーク スルーするので、図９（２）のプラトー（Ｐｌａｔｅａｕ）　Ｃ’　の゛長さが 短くなることである。不純物の濃度を表すブレークスルーの高さも、最大溶￥［ ′ａ度も変化せず、精度は含まれない０本明細書中に記載されたように、本発明 の好ましい局面は、高速アンセー、例えば１０秒未満であることを含む、上記で 考察した分析は、ここに記載したタイプのマトリックス媒体を含む小容積カラム 用いる場合は、実質的に１分未満、頻繁には３０秒未満、さらにしばしば１０秒 未満の短い時間で実施できる。

裏胤阻土 本発明のクロマトグラフィーシステムは、別りのサンプル中の蛋白の構造プロフ ィルにおける違いを検出するために用いることができる。ここで用いられている “構造プロフィル”または“フィンガープリント”という語句は、蛋白溶液の特 定の分子種混合物を指すが、これは、発現エラー、プロテアーゼによる切断、構 成または誘導の違いによって生じる翻訳後修飾の違いのために、バッチによりま たは時間によって変化する。したかって、サンプルを固定化結合部位（これは、 それらの結合特性およびサンプル中の構造的変種という点に関して変化する）を 含むマトリックスに通すことができる。例えば、多クローン抗体を用いることが できるが、そのクローン化された変種は、特定の蛋白変種上の特定のエピトープ に対して特異的である。

また別に、単一タイプの結合部位を用いることができるが、これは、分析される べき蛋白の変種に対して結合親和性または特異性が異なる。この工程は、少なく ともいくつかの結合部位が蛋白で飽和された後、マトリックスを出る蛋白濃度が 測定されるので、サンプル中の蛋白の構造プロフィルに特徴的なブレークスルー 関数を生しる。異なるサンプルの特徴的関数を比較することによってそれらの構 造的構成の間接的な比較が可能になる。

蛋白混合物中の分子亜種は別個の、さらに明白な構造特性を有するので、各亜種 は少な（ともいくつかの固有のエピトープを有する。マトリックスの結合部位の 各分画は、したがって、特定の分子亜種を識別（すなわち選択的に結合）し、ま たは分子亜種と優先的に結合することができる。したがって、蛋白サンプルがマ トリックスを通過するとき、その種々の亜種は平衡飽和に達し、その後流出液中 にブレークスルーする。流出液の蛋白濃度が時間とともにモニターされる場合、 流出液中の蛋白濃度がベースライン値（典型的には０）から、実質的には供給液 中の蛋白濃度と同一の値まで増加する時間間隔が存在する。

この間隔の間、蛋白濃度は、該蛋白サンプルの特定の構造プロフィルを示すＢ欅 で徐りに増加する。この関数を別々の蛋白サンプルについて比較するとき、これ らのサンプルが均一な構造を有しているかどうかを決定することができる。この 方法は、例えば、周期的に生産の流れをモニターするために、生産物が予め定め た指令の範囲内にあるということを確認する手段として用いることができる。

この工程は、カラム１３１がブレークスルーに達した後、カラム１３１からの流 出液が第二のカラム１３２を通過するという点を除いて、実質的に上記実施例３ で述べたように行うことができる。その後カラム１３２は、該ブレークスルーを 分子亜種に分離し、したがって、サンプルの標的成分の構造プロフィルを提供す る。

デバイスの目的がもっばら蛋白構造をモニターすることである場合は、計算機手 段は省力できる。この場合、ディスプレーは、流出液中の蛋白濃度を表す関数対 流出液容積を表す関数の表をディスプレーできるようにされている。したがって 、このディスプレーは、蛋白サンプルの構造プロフィルに特徴的な曲線を作製す る。この曲線は、与えられたサンプル組成を識別し、蛋白の構造プロフィルが変 化するときそれを変化させる、サンプルのフィンガープリントとして機能するこ とができる０図１５は、実施例４で述べた工程を実施するために用いられるステ ップのフローチャートを示している。

尖旌班旦 本発明のクロマトグラフィーシステムは、生成物調製中の迅速なモニタリングシ ステムとして用いることができ、サンプルの存在、濃度および純度についての情 報を迅速に提供する。このシステムは、本明細書および部分継続出１１ＵｓｓＮ Ｏ７１５６６１２１号（１９９１年１２月６日出願、同−譲り受け人に譲渡され 、参考文献として本明細書に含まれている）に記載された事柄に基づいている。

迅速モニタリング工程のこのタイプに有用な本発明の装置は、図４（ａ）および （ｂ）に示され、少なくとも２つの多口バルブ、１つのカラムおよび１つの検出 手段を含む。

持続的に？８質濃度を変化させることができる例えばプロセス流からの、限定さ れた量のサンプルが投入１４からバルブ１５１へ供給され、そこで、それは続い てサンプルループ１５２およびライン４２を通してバルブ１３３へ、その後、サ ンプルループ１５３に供給される。サンプルの一部分を採集し、バルブ１５１お よび１３３を切り換えることによってループ１５３に保持される。ループ１５２ 内に含まれるサンプルは、方向転換され（バルブ１５１を状ＬＩｉ２に切り換え ることによって）、標的溶質の吸着のためカラム１３１に通される。限定量の供 給溶液がマトリックスを通過するにつれ、標的溶質は結合部位に吸着され、その 結果、流出液中のどのような濃度の標的溶質も実質的に除去する。一旦、標的溶 質がループ１５２に保持されたサンプルから吸着されると、この吸着サンプルは カラムから流出し、ループ１５３（これもまた状Ｂ２である）に残存する非吸着 サンプルの後から一列になって供給される。非吸着サンプルもさらに吸着サンプ ルも、その後検出器１３６に供給される。

クロマトグラフィーの結果の表示は、高濃度の本来の非吸着サンプルを表す第一 のピークを明らかにする。このピークの後に第二のより小さなピークが続き、こ れは、ピークの高さが減少し、カラム１３１によって除去された標的溶質の量に 比例する面積を有し、吸着後のサンプル中に残存する不純物を表している。所望 の場合には、上記に記載したように、標的溶質はその後溶出され、検出される。

本発明の具体例では少量のサンプルのみが必要とされるので（すなわちサンプル ループ１５２および１５３を満たすために十分なサンプル）、この体積のサンプ ル中の標的溶質の量よりカラムの能力がずっと大きいかぎり、サンプルに含まれ る標的溶質の量は、好ましくは決してカラム１３１の結合部位を飽和させない。

サンプル中の標的溶質の濃度を迅速に決定する本発明を実施するために、調製用 クロマトグラフィーカラムからの流出液の持続的な流れから、図４に示した装置 を用いて１５秒という規則的な間隔でサンプリングした。細胞培養上清からのＩ ｇＧをＰＯＲＯ３Ｈ３／Ｍ　１０　Ｘ　Ｉ　ＯＯｍｍカラム（［’ｅｒＳｅｐｔ ｉｖｅ　ＢｉｏｓｙｓＬｅｓ＋ｓ、　Ｉｎｃ、、ケンブリッジ、マサチヱーセン ツ）およびＤｅｌｔａ　Ｐｒｅｐ　ＨＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ、ミルフォ ード、マサチューセッツ）を用いて精製した。ｔＰｉｌ製用クロマトグラフィー は、ＭＥＳ＄ｌ衝液（ｐＨ６，２、ＩＮのＮａＣｌ含有および非含有）を用いて 実施した。図１０（ａ）および（ｂ）では、“ＡＶおよび。

Ａ２”をトレースする調製用クロマトグラフィーが示されている。これは２つの 主要なピークを有し、ＩｇｌＯ（ａ）の広いピーク（“ＡＶ）０−５分（図１０ （ｂ）では流出番号２−１６）およびｅｌｏ（ａ）の８−１０分の間のシャープ なピーク（“Ａ２”）（図１０（ｂ）では流出番号２９−３４）である。

調製用トレーシング（“Ａ１”および”Ａ２”）は、吸収検出手段の設定を２８ ０　ｎｍに上昇させて作製した。このクロマトグラムにおけるＩｇＧの位置は、 サンプルの純度のように決定が困難である。

調製用クロマトグラフィーの間、ｉｌｌｌ剛製ラムから流れ出るプロセス流は、 ■５秒間隔で規則的に限定された部分標本を取ることによってサンプリングされ 、各サンプルはＩｇＧの純度について分析された。［１ＵｌＯ（ａ）は、分析ト レースの重ね合わせ（すなわち“　Ｂ”と呼ぶ１対のスパイクピーク）を示し、 これは、図４に示した迅速モニタリング装置を用いて得られ、各サンプルの部分 標本中のＩｇＧおよび不純物の量を決定するために必要な情報をすべて提供する 。２０μｍのサンプル部分標本をポンプでカラムに２ｍ１／分で送った。サンプ ルループ１５２．１５３はこの工程では２０μｍを保持することができる。親和 性カラム１３１は、２．ｌＸ３０ｍｍのプロティンＧカラムで、ヒトＩｇＧに対 しておよそ１．５ｍｇの結合能を有していた。検出器１３６は、高感度のために ２２０ｎｍで設定された。燐酸緩衝食塩水（ｐＨ７，０）をシステム内に通して サンプルをチェースした。

図１０（ａ）のクロマトグラムでは、各スパイクの１対（ダブレット）は、単一 サンプルの部分標本に対応し、ダブレットのうちの左側のスパイクは、調製用カ ラムの流出したときのサンプルの吸収に対応し、ダブレットのうちの右側のスパ イクは、カラムを通過した後のサンプルの吸収に対応している。ｉＪ製用カラム （？ＩＥＳ緩衝液）および迅速分析チェース緩衝液（燐酸緩衝液）の両方で用い た緩衝液のために、２２０ｎｍでバックグラウンドレベルの吸収がある。このバ ックグラウンド吸収は、８、　１分および８．４分じｂ”）の時点のダブレット のピークで明白で、この場合、調製用クロマトグラフィートレーシング（”ａ” ）のこの部分は蛋白が存在しないことを示しているが、それでも吸収信号（”　 ｂ”）は存在し続ける。蛋白が存在するクロマトグラムの領域（すなわち“Ｂ” と呼ぶ大きなピーク）では、各サンプルの部分標本におけるＩｇＧの純度は、各 ダブレットの第一および第二のピークの間のピークの高さくまたはピークの下の 面積）の違いを考えることによって決定できる。例えば、およそ９，５分で生じ るダブレットは、蛋白が存在するクロマトグラムの領域に確かに存在し、非常に 異なる高さく“ＣＩ”および”Ｃ２”）の２つのピークを含む、ピーク“０１゛ および“０２″の面積の違いは、サンプルの部分標本中のＩｇＧの量を示してお り、一方、ピーク°Ｃ２”の下の面積は、サンプル部分標本中の不純物の量と比 例している。このことは、９．０と１０．５分との間で生じるダブレットについ ても同様である。各ダブレットのピークの間の高さにおけるこの大きな違いは、 ＩｇＧがこれらのサンプル部分標本中に存在するということを示している。対照 的に、１．　５分と３分との間に生じる各ダブレット（これもまた明確に蛋白を 含んでいる）は、高さがより近いピーク（例えば“Ｄｌ”および°Ｄ２”）を含 んでおり、これは比較的少量のＩｇＧがサンプル中に存在することを示している ＠ｔＪ４製用信号（”Ａ″）および分析用ダブレットじＢ”）の間にはおよそ０ ．１３分または０．６５ｍ１と見積もられる遅延時間が存在する。

主な溶出ピーク（”　Ａ”）の全持続時間は、およそ２分、１０ｍ１または１カ ラム容積である。マイナーな溶出ピークじＥ′）（これはおそらくはウシ血清ア ルブミンである）は持続時間が０．５分である０時間１０．５分での分析は、こ のピークの最初の半分における純度を反映し、一方、１０．７５分の分析におけ るものは、最後の半分を反映する。明白に、ある程度のＩｇＧがこのピークの最 初の半分に夾雑していることが分かる。これは、ＩｇＧピークが顕著なテーリン グとともに溶出する、調製用クロマトグラムのプロフィルと一致する。

図１０（ｂ）は、図１０（ａ）に示した調製用トレーソング（Ａ１”および°Ａ ２”）の両方を、図４のカラムでサンプルから除去された標的溶質（ＩｇＧ）の 量に対応する各ピーク下の面積同様水している。後者は、図１０（ａ）のより高 いスパイクから各ダブレットのより小さいスパイクを引く（例えばピーク“ＣＩ ”から“０２″を引く）ことによって得られた。

図１０（ｂ）のサンプルは、ピーク面積からＭＥＳおよび燐酸緩衝液の吸収を引 くことによって、バックグラウンドをゼロ水準にノーマライズした０図ｔｏ（ｂ ）では、ＩｇＧピーク（”Ｆｌ”）は、明確に主要な調製ピーク（“Ａビ）と同 時に溶出し、その純度は分析ラン２８．２９および３０の間は８０％以上である ０分析ラン３１および３１は９５％以上の純度を示している。したがって、夾雑 物質がＩｇＧピークの最初の部分とともに同時溶出する一方、二番目の半分は実 質的に純粋である。迅速なモニタリング方法は、生成物の存在、質および純度に ついてオンライン分析情報を提供することができる。モニタリングに加え、この システムは、入力コマンドを受け入れ、制御コマンドを送り出すことができる。

特に、典型的にはランニングタイムが３−４時間の製造規模のクロマトグラフィ ーカラムをモニターするために用いる場合、プロセスＵＶモニターを、分析開始 の引き金とするために用いることができる。すなわち、ベースライン以上にＵｖ 信号が増加すると分析が開始する。さらに、迅速プロセスモニタリングが与えら れた純度以上の生成物を検出するとき、それは、調製用ランの分画採集を開始す るようコンタクトクロージヤー信号を送ることができる。最後に、生成物濃度ま たは純度が限定範囲レベル以下に落ちたとき、フラクションコレクターに停止の 信号が送られる。カラムが迅速循環モードで用いられる場合、この能力は装置の 運転に重要である。さらに、この減少は分析による負担であり、稼働体止翔に次 のステップを決定できるということは、バイオプロセンシングにおいて極めて有 益である。

調製用クロマトグラフィーのモニターに加え、迅速プロセスモニタリングは他の バイオブロッセシングステップにおける生成物レベルの決定、例えば他の蛋白、 ＤＮＡまたは内毒素を含む夾雑物質をモニターするための減法検出に用いること ができる。各々の場合において、カラムベースの標的蛋白サブトラクションが容 易に実施できるように、蛋白結合ベアーは存在する。

実１貫」一 本発明のクロマトグラフィーシステムおよび装置は、調製用プロセスにおいてい ずれの調製工程をモニターするためにも用いることができる０例えば、調製用ラ ンがカラム１３１で生じる場合、この調製プロセスは、その運転時間中はいつで も流出液を選択された時間に分析するために中断させることができる。

そのような分析は、どの樟に調製を続行させるかを決定するのに役立つであろう 、したがって、例えばサンプルがカラム１３１に方向転換させる必要があるかど うか、プロセスが完了したかどうか、問題の溶質が純粋であるかどうか、または このプロセスが適切に働いていないかどうかに関して、情報が利用できるように なるであろう。

この装置は、以下のように調製／分析プロセスで利用されるであろう。カラムを 平衡化した後、バルブ１５１および１３４を通してサンプルをカラム１３１（例 えばイオン交換カラム）に送る。カラム１３１からの流出液は、上記実施例で述 べたように、バルブ１３３を介してカラム１３２を迂回させることによってモニ ターできる。カラム１３１からの流出液の情報ｔよ検出手段で得ることができる 。この工程のいずれの選択された瞬間においても、カラム１３１からの流出液分 両番よ、液カベカラム１３２に供給される位置でバルブ１３３を切り換えること によって分析できる。流出液分画はそれからカラム１３２（例え番ｆ逆相クロマ トグラフィーカラム）を通過する。イオン交換カラム１３１への流れは止められ 、カラム１３２（逆相）Ｌ；！ｔ８出され、検出器１３６を介して分析される。

カラム１３２で分析力（完了した後、カラム１３１を通過する流れが再開する； 例え番ｆ秒単位で、バルブ１３３は、液がカラム１３２を迂回し、直接検出器１ ３６に供給されるポジションに切り換えられる０図１１（ａ）は、カラム１３１ からの流出液を示すクロマトグラムを示しており、図１１（ｂ）は、カラム１３ ２力・らの分析分画を示すクロマトグラムを示している０図１１（ａ）の主要な ピークは生成物ピークで、主要なピークのいずれかの側の２つの１１＼さなピー クは夾雑物のピークである。カラム１３１力１らの溶離液は、主要ピークの精製 の間の異なる時点で取られ、各溶離液分画は、マイナーピークに関しては、主要 ピークの純度の異なる組成を含むであろう、これらの分画はカラム１３２で分析 され、図１１（ｂ）に異なるタイムポイントとして示される。各タイムポイント の下に、カラムの構成、例えばカラム１（１３１）もしくは２（１３２）または 両方がオンラインの状態であるかどうかが示されている。図１５は、この工程を 実施するために取られ得るステップのフローチャートである。

上記の記載は説明のために為され、本明細書中に記載された構造および方法の範 囲内の他の形態も、本発明は含むことができるということは理解されよう、変更 および修飾は当業者によって行われるであろうが、すべてのそのような変更およ び修飾は、請求の範囲に限定されているように、本発明の部分であると考えられ る。

バ°ルブ１３３→ 図５ ＦＩＧＵＲＥ　７ ＦＩＧＵＲＥ　８ ＦＩＧυＲεＨ（ｂｌ 図１２（ａ） 図１２（ｂ） 図１３（ａ） 図１３（ｂ） 図１４（ａ） 図１４（ｂ） 図１５（ａ） 図１５（ｂ） 図１６（ａ） 図１６（ｂ） ■ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成６年３月３０日

Claims (46)

【特許請求の範囲】
1. １．以下から成るサンプルの蛋白分離用装置：サンプル投入手段； 第一の液体クロマトグラフィーカラム；該サンプル投入手段を該カラムに接続す る多口注入バルブ；該多口注入バルブとつながっている第二の液体クロマトグラ フィーカラムであって、 該第二のカラムが該第一のカラムと連続的に、および交互に作動する該第二のカ ラム； 前記多ロバルブを介して該カラムに圧可変溶液配送を提供するためのポンプ手段 ； 一連のシステム制御プログラムに特徴を与えるプログラム手段。
2. ２．前記溶液の配送圧を制御するために前記ポンプ手段とつながっている制御手 段をさらに含む請求の範囲第１項の装置。
3. ３．複数の溶液溜めを含む溶液投入手段、および該溶液投入手段を前記サンプル 投入手段に接続し、該液溜めからの溶液を混合するために作動する混合バルブを さらに含む請求の範囲第２項の装置であって、ここで、前記プログラム手段が、 該混合バルブによる溶液の混合、および前記多口注入バルブを介する前記カラム ヘの該混合溶液の配送を指定するものである装置。
4. ４．カラム排出を検出し、記録するための手段をさらに含む請求の範囲第１項の 装置。
5. ５．検出された排出データのパターンを識別するための手段であって、クロマト グラフィー分離用制御プログラムを進展させるための手段に合わせて作動するよ うにされているテンプレートマッチング手段をさらに含む請求の範囲第４項の装 置。
6. ６．以下より成る蛋白分離用装置； 第一および第二の液体クロマトグラフィーカラム；溶液を該第一のカラムに導入 するための手段；該第一および該第二のカラムとつながっていて、前記溶液がそ れを通して移送される多数の多ロバルブ；および検出手段およびデータ収集手段 を含む排出手段。
7. ７．前記溶液を前記第一のカラムに導入するためのポンプ手段をさらに含む請求 の範囲第６項の装置。
8. ８．前記溶液配送圧を制御するために前記ポンプ手段とつながっている制御手段 をさらに含む請求の範囲第７項の装置。
9. ９．前記多数のバルブが第一、第二および第三のバルブを含み、前記溶液が該第 一および第二のバルブを通して前記第一のカラムに、該第二および第三のバルブ を通して前記第二のカラムに、さらに該第三のバルブを通して前記排出手段に導 入される請求の範囲第６項の装置。
10. １０．前記第一のバルブが、時計回りまたは反時計回り方向に隣接している口と 互いにつながっている多数の口、および２つの非隣接口を接続するループを含む 請求の範囲第９項の装置。
11. １１．前記溶液導入手段が、サンプル溜めを含むサンプル投入手段を含む請求の 範囲第６項の装置。
12. １２．前記サンプル投入手段が、サンプルポンプをさらに含む請求の範囲第１１ 項の装置。
13. １３．前記溶液導入手段が、複数の溶液溜め、該溶液を選択し混合するバルブ、 および該溶液を前記第一のカラムに配送するポンプを含む請求の範囲第６項の装 置。
14. １４．前記排出手段が、前記検出手段を前記データ収集手段に接続する第四の多 ロバルブをさらに含む請求の範囲第６項の装置。
15. １５．前記検出手段がＵＶ検出器より成る請求の範囲第１４項の装置。
16. １６．前記排出手段が、前記第四の多口バルブを通して前記ＵＶ検出器および前 記データ収集手段とつながっているｐＨ／導電率検出器をさらに含む請求の範囲 第１５項の装置。
17. １７．前記カラムの各々が、第一および第二の末端を有し、該第一または第二の カラムの少なくとも１つがクロマトグラフィーマトリックスで充填され、それに よって該第一の末端から該第二の末端まで５分未満の通過時間を前記充填カラム に与える請求の範囲第６項の装置。
18. １８．前記クロマトグラフィーマトリックスが灌流性マトリックスである請求の 範囲第１７項の装置。
19. １９．以下より成るサンプル中の蛋白分離用装置：１種または２種以上の緩衝液 とサンプルを混合するための多口混合バルブ； 第一および第二の末端を含む複数の液体クロマトグラフィーカラム； 前記サンプル混合バルブと該液体クロマトグラフィーカラムの各々の前記第一の 末端とつながっている多口注入バルブ；排出信号記録システムおよび排出サンプ ル採集システムの少なくとも１つを含む排出システムであって、該排出システム が該カラムの各々の該第一の末端とつながっている、該排出システム；および 混合バルブから前記第一のカラムおよび前記第二のカラムヘ、該排出システムの 作動と協調して混合溶液を連続的にさらに交互に適用し、蛋白の調製または分析 のための一連の分離を行うために、前記多口注入バルブを操作する制御手段。
20. ２０．複数の溶液溜めおよびサンプル溜めを含むサンプル投入システムをさらに 含む請求の範囲第１９項の装置。
21. ２１．以下より成る蛋白分離用装置： 各々に特定のマトリックス分離媒体が充填され、カラム投入とカラム排出との間 に５分以下の特徴的な蛋白通過時間となっている複数の液体クロマトグラフィー カラム；該１つのカラムの該カラム投入端に溶液を配送するための投入バルブ、 および該投入バルブに提供された溶液を混合するための多口バルブを含むサンプ ル投入手段；検出を行ない、その信号表示を提供するための手段を含むカラム排 出を検出するためのカラム排出手段；および連続分離サイクルにおいて前記投入 バルブに異なる混合液を提供することによって、前記１つのカラムで一連の連続 分離を実施するために、前記サンプル投入手段を操作する制御手段。
22. ２２．前記制御手段が、前記複数の液体クロマトグラフィーカラムの１つを交互 に利用し、その間他方のカラムを洗浄し、したがって連続的に用いられるカラム からの排出が実質的に持続する連携操作を提供する切り換え手段を含む請求の範 囲第２１項の装置。
23. ２３．一連の分離プロセス制御プログラムが操作中に連続的に作動するように特 徴付けられたプログラム手段をさらに含む請求の範囲第２１項の装置。
24. ２４．前記プログラム手段が、第一および第二のカラムが前記サンプル中の蛋白 を分離するために連続的に利用される分離プログラム手段に特徴付けられる請求 の範囲第２３項の装置。
25. ２５．前記１つのカラムがイオン交換クロマトグラフィーマトリックスを含む請 求の範囲第２４項の装置。
26. ２６．前記１つのカラムが逆相クロマトグラフィーマトリックスを含む請求の範 囲第２４項の装置。
27. ２７．前記プログラムが、前記第一のカラムにおいて分離サンプルの実質的な連 続調製、および前記第二のカラムを介する該第一のカラム排出の断続的分析を特 徴付ける請求の範囲第２３項の装置。
28. ２８．前記第一および第二のカラムの各々が、それぞれ別個に取り除き可能でそ れぞれ第三および第四のカラムに置き換えることができる請求の範囲第２１項の 装置。
29. ２９．以下より成るサンプルの蛋白の分離用装置：第一および第二の多ロバルブ であって、その各々が限定量のサンプルを保持し、さらに該バルブの２つの口を 接続するサンプルループより成る該多口バルブ； 該各バルブとつながっている液体クロマトグラフィーカラム；該各バルブとつな がっているサンプル供給ライン；排出を検出するために前記第二のバルブとつな がっている検出手段；および 複数のサンプル量が導入される前記サンプル供給ラインと前記クロマトグラフィ ーカラムを含む検出ラインを含む採集ラインとの間で切り換えを行ない、そこで １つのサンプル量に該検出手段を通過させ、また別のサンプルに該カラムおよび 当該検出手段を通過させるために、前記多ロバルブを操作する制御手段。
30. ３０．前記採集ラインが以下の連続順序より成る請求の範囲第２９項の装置： （ａ）前記第一のバルブ内で第一の口を第二の口に接続する前記第一のサンプル ループ； （ｂ）該第一のバルブの第二の口を該第二のバルブの第一の口と接続する前記サ ンプル供給ライン； （ｃ）該第二のバルブ内で該第一の口を該第二の口に接続する該第二のサンプル ループ。
31. ３１．前記検出ラインが以下の連続順序より成る請求の範囲第２９項の装置： （ａ）前記第一のバルブ内で第一の口を第三の口に接続する該第一のサンプルル ープ； （ｂ）該第一のバルブの前記第三の口を前記第二のバルブの第三の口と接続する 前記クロマトグラフィーカラム；（ｃ）該第二のバルブ内で該第三の口を前記第 二の口に接続する該第二のサンプルループ； （ｄ）該第二のバルブの第二の口を前記検出手段に接続する分路器。
32. ３２．前記装置が第三の多口バルブを含み、前記クロマトグラフィーカラムが該 第三のバルブを通して前記第一および第二のバルブとつながっている請求の範囲 第２９項の装置。
33. ３３．以下の方法から成るサンプル中の蛋白の分析方法：投入端および排出端を 含む第一のカラムにサンプルを導入し、ここで、該第一のカラムは該サンプルの 成分を分離し、分離成分の第一の流出液流を生ぜしめ； 予め決定した位置で該第一の流出液流を遮断し、該分離成分の分画を採集し； 該分画を第二のカラムに導入し、ここで該第二のカラムが該分画の成分を分離し 、該分画の分離成分を含む第二の流出液流を生ぜしめ；さらに、 該第二の流出液流の該成分を検出する。
34. ３４．前記第一の流出液流の前記遮断および前記第二のカラムヘの該導入が、該 第一のカラム内での分離サンプルの実質的な連続調製、および該第二のカラムを 介する該第一のカラムの排出の断続的分析をもたらす請求の範囲第３３項の方法 。
35. ３５．前記第一のカラムがイオン交換クロマトグラフィーカラムより成り前記第 二のカラムが逆相クロマトグラフィーカラムをさらに含む請求の範囲第３４項の 方法。
36. ３６．前記第一のカラム流出液が多ロバルブを介して該第一のカラム投入端に方 向転換され得る請求の範囲第３４項の方法。
37. ３７．前記第一のカラム流出液が実質的に純粋な生成物より成る請求の範囲第３ ６項の方法。
38. ３８．前記第二のカラムは、前記第一の流出液が該第一のカラム投入端に方向転 換される回数を決定する排出データのパターンを提供する請求の範囲第３７項の 方法。
39. ３９．前記流出液流の前記部分が、多口バルブを切り換えることによって前記第 二のカラムに向けられる請求の範囲第３４項の方法。
40. ４０．以下の方法より成るサンプルの蛋白の分析方法：サンプルを第一のカラム に導入し、ここで、投入端および排出端を含む該第一のカラムが、該サンプルか ら標的成分を選択的に除去し、該標的成分を除く実質的にすべての成分を含む第 一の流出液流を生ぜしめ； 投入端および排出端を含み、該サンプルの成分を分離し、分離成分の第二の流出 液流を生じる第二のカラムに該第一の流出液流を方向転換させる。
41. ４１．前記第一および第二の流出液流の排出を検出することをさらに含む請求の 範囲第４０項の方法。
42. ４２．前記第一のカラムの前記投入端への前記サンプルの投入と前記第二のカラ ムの前記排出端との間の通過時間が１０分未満である請求の範囲第３３項または 第３４項の方法。
43. ４３．前記通過時間が７分未満である請求の範囲第４２項の方法。
44. ４４．前記第一の流出液流が、多口バルブを切り換えることによって前記第二の カラムへ向けられる請求の範囲第３３項の方法。
45. ４５．前記カラムの各投入端と前記カラムの各排出端との間の蛋白の５分以下の 特徴的な通過時間を、該カラムの各々に与える粒子マトリックス分離媒体で、該 カラムの各々が充填されている請求の範囲第３３項または４０項のいずれかの方 法。
46. ４６．前記マトリックスが灌流性クロマトグラフィーマトリックスである請求の 範囲第４５項のシステム。