JPS61120058A - 目的成分の分析方法及びその装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の利用分野］ 本発明は溶液中で蛋白質と結合している低分子量の生理
物質、薬物、その代謝物などの目的成分を蛋白質から分
離して分析する分析方法及びその分析装置に関する。

〔発明の背景〕

従来、蛋白質と結合した目的成分を分析するには、被検
溶液中に含有される蛋白質を除去せずに行う生物学的方
法と、また、蛋白質を物理的、化学的操作により除去し
た後に分析を行う物理的方法、化学的方法がある。

上記生物学的方法は目的成分と特異的に反応を行う酵素
を用いて目的成分の分析を行うものであるが、酵素の安
定性に問題があ）、分析結果の再限性、分析の操作性等
において不利となる場合が多い。

また、上記化学的分析法は、蛋白質と結合した目的成分
に塩酸を作用させて蛋白質を変性沈澱する際に目的成分
と分離してその分析を行おうとするものである。この分
析法では蛋白質が沈澱する際に、目的成分も蛋白質と一
緒に沈澱する虞れがあシ分析のデータの精度上問題があ
る。

そこで、物理的方法として蛋白質を酸または塩基で荷電
し、この荷電した蛋白質をイオン交換樹脂に通過させて
吸着する。そして吸着後ｐＨの条件を変化させて蛋白質
から目的成分のみを除去するものがある。

しかし、この物理的方法によると目的成分とともに蛋白
質が溶出する虞れがある。そこでこれらの問題点を考慮
し、特開昭５８−２２３０６１４＋、特開昭５８−２２
３０６２号に開示されているように、蛋白質をコーティ
ングした分離材が充填されたカラムを利用して、このカ
ラムに分析試料を通過させ、蛋白質と結合した目的成分
を吸着し、一方蛋白質は吸着しないで除蛋白を行う方法
もある。

しかし、上記従来例は目的成分の回収率等において優れ
ているが、除蛋白用のカラムと目的成分の分離１分析を
行う分離カラムのそれぞれに送液ポンプが必要とな夛、
装置構成か複雑なために分析の精度が低下するという問
題点があった。

すなわち、上記の種々の方法では目的成分と結合した蛋
白の除蛋白を行って目的成分の分析行うについては、有
効な除蛋白法がないために蛋白質と結合した目的成分の
分離１分析の精度が十分でなかった。

〔発明の目的〕

本発明の目的は目的成分と結合した蛋白の除蛋白を迅速
かつ十分、簡便に行い、従って、目的成分の分析を精度
よく行うことのできる目的成分の分析方法およびその分
析装置を提供することにある。

〔発明の概要〕

本発明者らは巨大網状イオン交換樹脂（スチレントジビ
ニルベンゼンの共重合体で、主に粒径が３〜１００μｍ
の微粒子ゲルにイオン交換基が結合したものとアルブミ
ン（主に血液等の生体液中の蛋白質であって、糧々の活
性物質と結合している。）との相互作用について糧々の
検討を行った結果、次のような知見を得るに致った。

すなわち、蛋白質は両性電解質であるため、このものの
総電荷はｐＨによって変化し、等電点より低いｐＨでは
正になり陽イオン交換体に吸着され、等電点より高いｐ
Ｈで負になるため陰イオン交換体に吸着される。ところ
が、このイオン交換体に巨大網状イオン交換樹脂を用い
ると％　ｐＨを調整して蛋白質が吸着し得る条件で上記
巨大網状イオン交換樹脂に吸着させると％（１）ｐＨを
変えて上記蛋白質の吸着しない条件にしても、（２）イ
オン強度を３　ｍｏｔ／　Ｌ　（Ｎａ　ＣＬ　）以上に
しても、（３）アセトントリル等の有機溶媒ｔ７ｏ１（
Ｖ／Ｖｌに上げても、もはや上記蛋白質は溶出しない現
象を見出した。蛋白質としては比較的分子量の小さいチ
トクローム（分子量約１２０００トルトン）、ミオグロ
ビン（同１７５００ドルトン）においても同様でおった
。

このように、蛋白質が巨大網状イオン交換樹脂から容易
に脱離しないのは、この樹脂内の１００人程度の分子内
穴部に蛋白質が入り込むためであると考えられる。

従って、巨大網状イオン交換樹脂を充填剤として例えば
、蛋白吸着カラムとして用いることによシ、溶離液のｐ
Ｈを調整するだけで目的成分と結合した蛋白質から目的
成分のみを分離して、その分析を行うことができる。

本発明はかかる知見に基づいてなされたものである。具
体的には本願第１の発明は目的成分と結合した蛋白質か
らなる被検物質を含有する溶液のｐＨを調節することに
よシ前記蛋白質を帯電状態にする第１工程と、巨大網状
イオン交換樹脂で前記帯電状態の蛋白質を吸着する第２
工程と、前記巨大網状イオン交換樹脂によって吸着され
た蛋白質から目的成分のみを分離する第３工程と、当該
第３工程において分離された目的成分の分析を行う第４
工程とからなることを特徴とする目的成分の分析方法で
あり、本願第２の発明は所定のｐＨを有するキャリア液
が供給されるキャリア液供給手段と、前記キャリア液に
目的成分と結合した蛋白質からなる被検物質を供給する
被検物質供給手段と、前記キャリア液中の所定のｐＨに
よって帯電した被検物質に含まれる蛋白質を吸着する巨
大網状イオン交換樹脂が充電された除蛋白カラムと、該
除蛋白カラム中に吸着された蛋白質から目的成分を溶離
する溶離液を前記除蛋白カラムに供給する溶離液供給手
段と、前記溶離液によって溶離された目的成分の分析を
行う分析手段とを備えたことを特徴とする目的成分の分
析装置である。

〔発明の実施例〕

次に本発明の好ましい実施例を添付図面に従って詳説す
る。

第１図は、本願第２の発明である目的成分の分析装置の
一実施例を示す全体構成図である。

図において、キャリア液、または溶離液を貯留する貯留
槽８Ａ、８Ｂ、８Ｃにはそれぞれ配管１１、配管１２．
配管１３が接続されている。配管１２と配管１３は流路
切刃替え弁１５で接続されており、配管１３が接続され
た配管１２は前記配管１１を流路切シ替え弁５で接続さ
れている。

この流路切シ替え弁５には配管１４が接続されており、
この配管１４は巨大網状イオン交換樹脂が充填された除
蛋白カラム３に接続されている。配管１４の途中にはポ
ンプ１、圧力計９Ａ、および試料を注入するインジェク
ション部２が設けられている。除蛋白カラム３には配管
１６が接続されておプ、この配管１６は蛋白質から分離
された目的成分の分離を行う分離カラム４が接続されて
いる。１九、配管１６には圧力計９Ｂが接続されている
。分離カラム４から出た配管１７は検出器６に接続され
ており、検出器６内には分析結果を表示する記録計７が
接続され゛ている。

次に、本実施例の動作について説明する。

先ず流路切シ替え弁の全てを閉鎖して、ポンプ１を駆動
することによりキャリア液貯留槽（図示せず）からキャ
リア液を除蛋白カラム３に導入する。次に、試料注入イ
ンジェクション部２から目的成分を結合し丸蓋白質から
なる被検物質を、キャリア液が除蛋白カラム３に行く上
流側に供給する。

キャリア液は所定のｐＨを有しており、このｐＨによシ
被検物質に含まれる蛋白質は帯電し除蛋白カラム３内の
巨大網状イオン交換樹脂に吸着される。巨大網状イオン
交換樹脂は、スチレンとジビニルベンゼンの共重合体か
らなる微粒子ゲルに、蛋白質の帯電状態に対応したイオ
ン交換基が結合し７たものである。例えば、蛋白質が正
に帯電する場合には、陽イオン交換基をスチレンとジビ
ニルベンゼンに結合する必要がある。

帯電した蛋白質が除蛋白カラム３に吸着した後には、流
路切り替え弁１５ｔ−閉鎖する一方で、流路切シ替え弁
５を開放することにより、貯留槽８入内の溶離液が除蛋
白カラム３に流入するようにする。

次に、所定時間経過後流路切シ替え弁１５の調整により
、貯留ＭｓＢ内の溶離液が貯留槽８Ａ内の溶離液式りに
流れるようにする。同様にして、貯留槽８Ｂ内の溶離液
を除蛋白カラム３に導入して所定時間経過後、貯留槽８
Ｃ内の溶離液が貯留槽８Ｂ内の溶離液の代りに分離カラ
ムに導入される。

除蛋白カラム３で吸着された蛋白質に結合された目的成
分は、このカラム３に流れてくる溶離液により蛋白質と
分離される。そして、蛋白質と分離され木目的成分は分
離カラム４に導入された後、各目的成分に応じた保持時
間が決定され分析される。保持時間は予め標準試料を用
いて決定することができる。

各１目的成分は溶離液の液性（ｐＨ）の違いによって、
各目的成分ごとに蛋白質から分離される。

上記分離カラム４は蛋白質を吸着した除蛋白カラム３が
短いために、目的成分の分離能を高める目的で使用され
るものである。従って、この分離カラム４には、６稲の
クロマトグラフィーを用いることができる。

分離カラム４で分離された各１目的成分は、検出器６に
導入され、各穐目的成分ごとに検出ピークが検出される
。この検出器６には例えば吸光度計、電位差計等が用い
ることができる。

本実施例では、溶離液を３つの流路系により分離カラム
３に導入しているが、目的成分の性質により所定の溶離
液を用い、また、所定の溶離液の流路系を採ることがで
きる。

次に上記実施例にかかる分析装置を用いた分析の実験例
について説明する。

（実験例１） 本実験例では血清中にタンパクと結合して存在するアロ
プリノールの分析を行った。

除蛋白カラム３には内径４頭、長さ１ｃｎｔのステンレ
ス鋼製クロマト管に巨大網状陰イオン交換樹脂（日立ゲ
ル◆３０１３−Ｎ）を充填し、分離カラム４には内径４
６＋ａｗ、長さ２５ｃｒｎのステンレス鋼製クロマトｆ
に蛋白吸着カラムに用いたと同じ充填剤を充填した。分
離カラム４に用いる充填剤はこの例に限られるものでは
なく分析目的物質に応じて、種々の充填剤をも用いるこ
とができる。

約１μｇのアロプリノールとヒボキサンチンを人血清２
ｒｒ１ｔに溶解したものを被検物質とし、その２０μｔ
をインジェクション２より注入し、キャリア液に混入し
たのち、アロプリノール、ヒボキサンチンと結合した血
清中の蛋白質を除蛋白カラム３に吸着させて、アロプリ
ノール等の分離・分析を行った。

検出は２５０ｎｍの波長の吸光光度法により行った。使
用した溶離液については８Ａに０．００１ｍｏｔ／　ｔ
のリン醒衝液（１）Ｈ６，Ｏｌ、８Ｂには０、０６　ｍ
ｏｌ／　を塩化アンモニウム−０，０１ｍｏｌ／ｌ−リ
ン酸２水素アンモニウム−６％ｆＶ／Ｖ）アセトニトリ
ル混合液（ｐＨ４，８）を、８Ｃには、８Ｂの溶離液の
２倍の濃度のものを用いた。溶離液の流速は０．８ｍｌ
／ｍとし、８分間８人の溶離液を流した後、次に、１０
分間８Ｂの溶離液を流し、次いで、１５分間８Ｃの溶離
液を流す。分析結果を第２図（Ｂ）に示す。尚、比較の
ためにタン・くり質を含まないヒボキサンチンとアロプ
リノールの分析結果を第２図（Ａ）に示す。第２図（Ａ
）および同（Ｂ）によれば、検出ピークに差がなく、除
タンパクの前処理が不要であることが明らかである。

なお、参考までに血清サンプルを数十回繰返して分析し
たあと除蛋白カラム３と分離カラム４の充填剤を取り出
し、血清蛋白の定量分析用キットであるフロムクレゾー
ルグリーン試薬で染色してみたところ、除蛋白カラム３
の充填剤のみが緑色に染色された。この事実から血清中
の蛋白質は除蛋白カラム３に保持され分離カラム４に到
達していないことが分った。

（実験例２） 実験例１で用いたのと同じ除蛋白カラム３に巨大網状陽
イオン交換樹脂１臼立ゲル÷３０１３−８を充填し、分
離カラム４には内径４ｗ＋＋ｍｓ長さ１５副のステンレ
ス鋼製クロマト管に陽イオン交換樹脂日立カスタムイオ
ン交換樹脂す２６１９Ｆを充填したものを用いた。肝炎
患者の分離血漿１０μｔを検体とし、上記実施例に示す
分析装置に注入し、含有アミノ酸の分析を行った。検出
はオルトフタルアルデヒド（ＯＰＡ）の発蛍光反応を利
用し、励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍとじた
溶離液は表１に示す試薬を蒸留水１ｔに溶解したものを
用いた。

表１　アミノ酸分析用溶離組成 流速はＯ，ｔｍ／／腫とし、８Ａ、８Ｂの混合割合は表
２に示すようにした。

表２　溶離液の混合割合 なお、本実験例では貯留槽８Ｃ内には除蛋白カラム３で
吸着された蛋白質の溶離を行う洗浄液が貯留されている
。この洗浄液はアセトンに濃アルカリが加えられたもの
である。低濃度あるいは中濃度アルカリでは除蛋白カラ
ム３で吸着された蛋白質の溶離を行うことができない。

上記ＯＰＡ試薬はその流速ｉ０．６ｍ／―とじ、０、３
３　ｗｓ　Ｉ　Ｄ　Ｘ　３　ｍのコイル中、３５Ｃで分
離カラム４の溶出液と反応させた。この結果を第３図に
示す。

第３図によれば各種アミノ酸が精度良く分離されている
ことができる。なお、本実験例においても実験例１と同
様に夕／バクを含まない標準試料を用いて比較試験を行
った。その比較試験の結果は第３図の結果と同様である
ので図示を省略する。

本実験例によっても、蛋白質が除蛋白カラムで完全に除
却されていることがわかる。

（実験例３） 実験例１で用いた除蛋白カラムと同様のカラムを、分離
カラムには内径４．６ｗｘ、長さ２５ｃｍのステ／レス
鋼製クロマト管に逆相・分配用シリカゲル日立ゲルφ３
０５３を充填したものを用い、痛風患者血漿成分の分析
を行った。

先ず、痛風患者血漿２０μｔを第１図で示す装置のイン
ジェクション部２に注入し、貯留槽８人に５０　ｍ　ｍ
ｏｌ／　ｌのリン醗緩衝液（りＨ６，０）を流速１．０
ｍ／−でカラム３に導入し、その他の貯留槽８Ｂ、８Ｃ
を用いない単一溶離法を採った。

検出は２５Ｑｎｍの吸光光度法によった。分析の結果を
第４図に示す。

第４図によれば、痛風患者血漿に含まれる各遣成分が精
度良く分析されていることがわかる。従って、本実験は
実験例２と同様に臨床検査部門への有用性が大きいもの
となっている。

なお、本実験例においても、蛋白質を含まない標準試料
の比較試験を行ったが、その結果はに４図に示す結果と
同様であるので図示を省略しである。

次に分析装置の他の実施例について説明する。

第５図は分析装置の他の一実施例を示す全体構成図であ
る。

本実施例において、除蛋白カラム３の圧力上昇を測定す
るために差圧計１０が設置されているほかは第１図で示
した実施例と同様である。本実施例によれば蛋白吸着カ
ラムの劣化の状態が差圧計により把掘できるという効果
がある。

第６図は第５図と同様、分析装置の他の一実施例を示す
全体構成図である。

本実施例において、上記の実施例と異なる点は、差圧＃
ＩＯの前後に多方切換弁２１Ａ、２１Ｂを設置し、２１
Ｂには実験例２で説明した洗浄液（再生液）２４を除蛋
白カラム３に送液するポンプ２２が設けられている点に
ある。

差圧計１０の表示がある所定値を示したら切換弁２１Ａ
及び２１Ｂを切換え、再生液２４をポンプ２２で蛋白吸
着カラム３に送り再生する。本実施例によれば蛋白吸着
カラム３を系からはずさないで再生できるという効果が
ある。

第７図はさらに、分析装置の他の一実施例を示す全体構
成図である。

本実施例において、第６図の実施例と異なる点は、イン
ジェクション部２と分離カラム４との間に制御装置２５
、および自動６方切換弁２３を設け、該自動６方切換弁
２３を介して除蛋白カラム３、再生液２４及び再生液送
液ポンプ２２が接続されている点でろる。通常の分析で
は、溶離液２４は自動６方切換弁２３内の破線で示した
流路７１′ｔ−通シ、除蛋白カラム３を経由して分離カ
ラム４に至るようになっている。一方、分析を繰返た制
御装（ｉｉ２５は信号Ｓｚ　’ｉ：上記自動６方切換弁
２３と再生液送液ポンプ２２に出力し、それらを駆動さ
せる。この時には、溶離液は自動６方切換弁２３内の実
線で示した流路？スΔり、除蛋白カラム３を経由しない
で分離カラム４に達する。そして、制御装置２５によ逆
作動された再生液送液ポンプ２２により再生液２４が除
蛋白カラム３に送られ、このカラム３が再生される。本
実施例によれば分析と蛋白吸着カラムの再生が自動で行
えるという効果がある。

なお、本実施例で示した除蛋白カラムの再生の制御は従
来の塊々のカラムクロマトグラフィー装置に用いること
もできる。

〔発明の効果〕

以上説明したように本発明によれば、巨大網状イオン交
換樹脂を用いているために、目的成分と結合した蛋白質
を該目的成分から除却するのを十分に、ヤ）つ迅速に行
うことができる。従って、目的成分の分析を迅速かつ十
分に行うことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明にかかる分析装置の一実施例を示す全体
構成図、第２図は本発明にかかる分析装置による分析実
験の結果を示すグラフ、第３図は肝炎患者血漿の分析実
験の結果を示すグラフ、第４図は痛風患者血漿の分析実
験の結果を示すグラフ、第５図ないし第７図は分析装置
の除蛋白カラムに差圧計１０が設けられた実施例を示す
構成図である。 ２・・・インジェクション部、３・・・除蛋白カラム、
４・・・分離カラム、６・・・分析装置、８Ａ、８Ｂ、
８Ｃ・・・溶離液貯留槽、１０・・・差圧計。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、目的成分と結合した蛋白質からなる被検物質を含有
   する溶液のｐＨを調節することにより前記蛋白質を帯電
   状態にする第１工程と、巨大網状イオン交換樹脂で前記
   帯電状態の蛋白質を吸着する第２工程と、前記巨大網状
   イオン交換樹脂によつて吸着された蛋白質から目的成分
   のみを分離する第３工程と、当該第３工程において分離
   された目的成分の分析を行う第４工程とからなることを
   特徴とする目的成分の分析方法。 ２、所定のｐＨを有するキャリア液が供給されるキャリ
   ア液供給手段と、前記キャリア液に目的成分と結合した
   蛋白質からなる被検物質を供給する被検物質供給手段と
   、前記キャリア液中の所定のｐＨによつて帯電した被検
   物質に含まれる蛋白質を吸着する巨大網状イオン交換樹
   脂が充電された除蛋白カラムと、該除蛋白カラム中に吸
   着された蛋白質から目的成分を溶離する溶離液を前記除
   蛋白カラムに供給する溶離液供給手段と、前記溶離液に
   よつて溶離された目的成分の分析を行う分析手段とを備
   えたことを特徴とする目的成分の分析装置。