JPH0228557A - 微量成分の新規測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の利用分野］ 本発明は、例えば血清、血液、血漿、尿等の生体体液、
リンパ球、血球、各種細胞類等の生体由来の試料中の微
量成分を、迅速に、容易に且つ精度良く測定する方法に
関する。

［発明の背景］ ある特定の物質同士１例えば抗原と抗体、プロテアーゼ
とその蛋白性プロテアーゼインヒビター糖鎖とレクチン
、酵素とそれに対する基質や補酵素、ホルモン等の生理
活性物質とそれに対するリセプターや輸送蛋白、２本鎖
ＤＮＡの１対のポリヌクレオチド鎖等は、互いに強い相
互作用（ａｆｆｉｎｉｔｙ　；　ｍ相方或は親和性）を
及ぼしあい、強固な複合体を形成することが知られてい
る。このような相互作用を利用して試料中の微量成分の
精製や分析を行う方法は広く行われている。

このような相互作用を利用した試料中のｔｆＬｔ成分の
測定方法としては、例えば測定対象物質と、測定対象物
質に対する結合能を有する物質（以下。

結合能物質と略記する。）との相互作用を利用し。

相互作用の結果生じるｑＬ衡状態を、標識物質を用いて
測定することによりこれを行う方法等が代表的なものと
して挙げられ、更に具体的には、例えば免疫反応を利用
した放射免疫測定法（ＲＩＡ）。

酵素免疫側定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）
等が挙げられる。

このような相互作用の結果生じる平衡状態を測定するこ
とにより行う微量成分の測定方法を更に詳しく分類すれ
ば、標識物質でｗ３１１された結合能物質（以下、Ｗ識
結合能物質と略記する。）を測定対象物質と反応させた
結果生じる、測定対象物質と結合能物質との複合物（以
下、単に複合体と略記する。）中の標識物質の量を１Ｉ
ｔＩＪ定することにより測定対象物質量を測定する。所
謂非競合反応法と呼ばれる方法と、測定対象物質に、ｍ
＊物質で標識された測定対象物質（以下、標識測定物質
と略記する。）と結合能物質とを反応させた結果生じる
標Ｒ］Ｉｔｇ定物質と結合能物質との複合物（以下、！
ｓ謝謝金合体略記する。）中のａＸ物賀の量′□を測定
することにより測定対象物質量を測定する、所謂競合反
応法と呼ばれる方法とに大別される、更に夫々が、相互
作用の結果生じる複ｎ物を遊離の（結合していない）４
！１真結合能物質（又は標識測定物質）から分離するこ
となく測定を行う、所謂ホモジニアス法と、相互作用の
結果生じる複合物を遊離の（結合していない）標識結合
能物質（又は″ＷａＳ定物質）から分離した後に測定を
行う、所謂ヘテロジニアス法とに分けることができる。

このうち、ホモジニアス法は、複合物の形成に伴ってＰ
Ｊ其物質が活性化（又は不活化）される現象を利用して
相互作用の結果生じる平衡状態を測定する方法であるた
め、測定の操作等は簡便ではあるが、使用できる標識物
質のＮ類が限られている点、及び測定対象物質が限られ
ている点等に１１題があり、広く一般に用いられるまで
には至っていない。

また、ヘテロジニアス法は、多くの種類の標識物質が使
用でき、測定対象物質と成り得るものの範囲も広いとこ
ろから、現在のところ微量成分測定方法の主流となって
いる、この方法に於いては。

当然のことながら、相互作用の結果生じる複合物（Ｂ　
ｏｕｎｄ　ｇ、）を、遊離の（結合していない）標識結
合能物質（又は標識測定物質）　　（Ｆｒｅｅ型）から
分離する操作、所謂Ｂ／Ｆ分離の操作が不可欠で、その
分離操作は、例えば、相互作用の結果生じる複合物を、
不溶性担体上に固定化された、該複合物を構成する測定
対象物質及び結合能物質の何れか一方に対する抗体に結
合させた後不溶性担体と共に分離するとか、或は該抗体
を反応液中に更に添加して該複合物との更なる複合物を
形成させてこれを沈殿物として分離する等の方法により
行われている。そのため、ヘテロジニアス法は、操作が
煩雑である点、測定までに長時間を要する点、測定の自
動化が行い難い点等に問題を有しており、改善が望まれ
ていた。

一方、上記した如きヘテロジニアス法に於ける問題点を
解決すべく、測定対象物質或は結合能物質を固定化した
担体を充填したカラムを用いる、所謂アフィニティクロ
マトグラフィの手法によりＢ　／　Ｆ分離を行う方法も
考案されている（Ｃ１ｉｎｉｅａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ、　川、　４１７〜４２０頁（１９８４）　；　Ｃ１
ｉｎｉｃＣ１１ｎｉｃａｌＣｈｅ、　３Ｊｌ、　１４９
４〜１４９８頁（１９８４）等）。

しかしながら、これらの方法に於いては、遊離の（結合
していない）標識結合能物質（又は標識測定物質）の除
去を、測定対象物（又は結合能物質）を固定化したアブ
ィニティクロマトグラフィカラムにより行うため、測定
対象物（又は結合能物質）を比較的大量に予めｍ１ｔｌ
ｃ用意）しなければならない点、アブィニティクロマト
グラフィヵラム用の充填剤の調製を行なわなければなら
ない点、測定対象物ｇ！、毎に対応するアブィニティク
ロマトグラフィカラムが必要な点、多数の試料を処理す
る際には該カラムの再生が必要となる点等に問題があり
、必ずしも充分瀦足し得る方法であるとは言えない。

［発明の目的］ 本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、沼
定対°象物質と結合能物質との相互作用を利用して生体
由来の試料中の微量成分を迅速に、容易に、■、つ精度
良く測定できる方法を提供することを目的とする。

［発明の構成］ 本発明は、測定対象物質を含有する生体由来の試料を、
標識物質で標識された或はされない、結合能物質と共に
混合して反応させた後、複合体と、遊離型の結合能物質
とを高速液体クロマトグラフィにより分離１ノ、複合体
中の標識物質の量又は結合能物質の量を測定することに
より試料中の測定対象物ａ量を測定することを特徴とす
る副定方法の発明である。

また１本発明は、測定対象物質を含有する生体由来の試
料を、標識測定物質及び結合能物質と混合して反応させ
た後、標識複合体と、遊離の標識測定物質とを高速液体
クロマトグラフィにより分離し、標識複合体中の標識物
質の量又は遊離の標識測定物質中の標識物質の量を測定
することにより試料中の測定対象物質量を測定すること
を特徴とする測定方法の発明である。

即ち５本発明者らは、測定対象物質と結合能物質の相互
作用を利用して、生体由来の試料中の微量成分を迅速に
、容易に、且つ精度良く測定する方法につき鋭意研究の
途上、該相互作用の結果生じる複合体（又はＰｌ識複合
体）　　（Ｂｏｕｎｄ型）と。

遊離の結合能物質（又は測定対象物質）　　（Ｆｒｅｅ
型）との分離、所謂Ｂ／Ｆ分離が、ある一定条件下に於
いては、高速液体クロマトグラフィ（ＩＩＰＬｃ）によ
り容易に実施できることを見出し、これを利用してＢ／
Ｆ分離を行った後、複合体中の１１［識物質の前又は結
合能物質の量、若しくはＩＩＲ複合体中の標識物質量又
は遊離の標識測定物質中の標識物質量を測定することに
より、試料中の測定対象物Ｉ！を量を迅速に、容易に、
且つ精度良（定量し得ることを見出し本発明を完成する
に至った。

本発明のｍ建方法を実施するには、例えば以下のように
して行えばよい。

即ち、所謂非競合反応の原理に基づく本発明の測定方法
を実施する場合には、先ず測定対象物質を含む生体由来
の試料と、標識された或はされない結合能物質とを、要
すれば適当な緩衝液中に添加、混合して反応させ、複合
体を形成させた後、該複合体と結合能物質とを所定の充
填剤を充填したカラムを装着したＨ　Ｐ　Ｌ　Ｃにより
分離する０次いで。

分離された複合体に含まれる標識物質の量或は結合能物
質の量を、標識物質或は結合能物質の性質に応じた測定
方法により求める。別に、測定対象物質濃度既知の試料
を用いて同様の方法により測定を行い、測定対象物質量
と複合体中のｅｓ誠物質の量或は結合能物質の量との関
係を表わす検量線を作成し、これを用いて、複合体中の
標識物質の量或は結合能物質の量に対応する測定対象物
質量を求めれば、試料中の測定対象物質量が求められる
。

また、所ａｊｉ合反応の原理による本発明の測定方法を
実施する場合には、先ず測定対象物質を含む生体由来の
試料、標識測定物質及び結合能物質を、要すれば適当な
緩賀液中に添加、混合して反応させ、？！１合体及び標
識複合体中 ａＸ複合体と、標識測定物質とを所定の充填剤を充填し
たカラムを装着した）ＩＰＬｃにより分離するや次いで
、分離された標、！１！重合体に含まれる標識物質の量
を、標識物質の性質に応じた測定方法により求める。別
に、測定対象物質濃度既知の試料を用いて同様の方法に
より測定を行い、測定対象物１を量と！５Ｊｌｌ？！１
合体中の標識物質の量との関係を表わす検量線を作成し
、これを用いて、標識複合体中の標識物質の量に対応す
る測定対象物質量を求めれば、試料中の測定対象物９を
量が求められる。

本発明の測定方法により測定可能な測定対象物質として
は、ｉ）測定対象物質と互いに強い相互作用（ａｆｆｉ
ｎｉ、ｔｙ　；　ｍ相方或は親和性）を及ぼしあい、強
固な複合体を形成し得る結合能物質が存在し、該結合能
物質がそれ自身何らかの方法により測定（検出）可能で
あるか、又は何らかの標識物質により標識可能なもの、
であるか、若しくはｉｉ）測定対象物質自体が何らかの
標識物質により１！３Ｒ可能なものであって、測定対象
物質と互いに強い相互作用（ａｆｆｉｎｉｔｙ　：　Ｉ
ｔｌ和力相方親和性）を及ぼしあい、強固なｍ真裸合体
を形成し得る結合能物質が存在するもの、であれば、特
に限定することなく挙げられるが、例えば血清、血液、
血漿、尿等の生体体液、リンパ球、血球、各種細胞類等
の生体由来の試料中に含まれる蛋白質、ペプチド、核酸
、糖鎖、脂質、ホルモン、薬物等が代表的なものとして
挙げられる。更に具体的には、例えばα−フェトプロテ
ィン（ＡＦＰ）、　ＣＡ１９−９．前立腺特異抗原（Ｐ
ＳＡ）　、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、癌細胞の産生ずる
特殊な糖鎖を有する物質等の癌マーカー例えば免疫グロ
ブリンＡ　（ＩｇＡ）、免疫グロブリンＥ（ＩにＥ）免
疫グロブリンＧ（ＩにＧ）、β２−ミクログロブリン、
アルブミン、フェリチン等の面清蛋白質、例えばＣ−ペ
プチド、アンジオテンシン　Ｉ等のペプチド、例えばア
ミラーゼ、アルカリホスファターゼ、γ−グルタミルト
ランスブエラーゼ（γ−ＧＴ［’　）等の酵素蛋白、例
えばルベラウィルス。

ヘルペスウィルス、肝炎ウィルス、ＡＴＬウィルス、Ａ
ＩＤＳウィルス等臨床的に注目されているウィルスに対
する抗ウイルス抗体、ウィルス等の病原体のデオキシリ
ポ核Ｉｌｌ　（ＤＮＡ）やリボ核ｍ（ＲＮＡ）或はこれ
ら核酸を構成する］重鎖ポリヌクレオチド、ウィルス等
の病原体に由来する抗原性物質。

例えばスギその他の草木の花粉や室内塵等のア１／ルゲ
ンに反応する抗体、例えばリボ蛋白質等の脂質１例えば
トリプシン、プラスミン、セリンプロテアーゼ等のプロ
テアーゼ、例えばインシュリン。

ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）　、サイロキシン
（Ｔ４）　、　　）−リョードサイロニン（Ｔ３）　、
プロラクチン、甲伏線刺激ホルモン（ＴＳＨ）等のホル
モン、例えばジゴキシン、フェニトイン、モルヒネ、ニ
コチン等の薬物等が挙げられる。

本発明に係るこれら測定対象物質に対する結合能物質と
しては、これら測定対象物質と互いに強い相互作用（ａ
ｆｆｉｎｉｔ、ｙ　；親和力或！ｉ親和性）を及ぼしあ
い１強固な複合体を形成する物質で、要すれば、それ自
身何らかの方法により測定（検出）可能であるか、或は
測定（検出）可能な何らかの標識物質により標識可能な
もの（測定対象物質自体が何らかの標識物質により標護
可能なものである場合にはこの限りではない。）であれ
ば特に限定することなく挙げられるが、例えば抗原性を
有する物質（ハプテンを含む、）に対する抗体、抗体に
対する抗原、特定構造のＭ頻に対して結合能を有する例
えばコンカナバリンＡ、１／ンズマメレクチン、インゲ
ンマメレクチン、ダツラレクチン。

小麦胚芽レクチン等のレクチン類、例えばトリプシンに
対するαｌアンチトリプシン、プラスミンに対するα２
マクログロブリン、七リンプロテアーゼに対するα２マ
クログロブリン等の特定の酵素に対するインヒビター類
、測定対象物質である１本ｆＩＲ〆リヌクレオチドに相
補的なポリヌクレオ千ド鎖等が挙げられる。

本発明に係る。それ自身何らかの方法により測定（検出
）可能な結合能物質の例としては１例えば酵素、蛍光性
物質、発光性物質或は紫外部に吸収を有する物質等のよ
うに、それ自身標識物質としての性質を有しているもの
が挙げられる。

また、これら測定対象物質と結合能物質との組み合わせ
をより具体的に示せば、以下の表１の如くになる。

以下余白 表１− 本発明に係る標識物質としては、例えばＥＩＡに於いて
用いられるアルカリホスファターゼ１．β−ガラクトシ
ダーゼ、パーオキシダーゼ、マイクロパーオキシダーゼ
、グルコースオキシダーゼ。

グルコース−６−リンＷＲ説水素酵素、リンゴ酸脱水素
酵素、ルシフェラーゼ等の酵素類、例えばＲＩＡで用い
らａ６９９−Ｔｅ、　”　Ｉ　ｐ　”’Ｊ　ｔ　１４Ｇ
。

３Ｈ等の放射性同位元素、例えばＦＩＡで用いられるフ
ルオレセイン、ダンシル、プルオレスカミン、クマリン
、ナフチルアミン或はこれらの誘導体等の蛍光性物質、
例えばルシフェリン、イソルミノール、ルミノール、ビ
ス（２，４，（ｆ−）リフロロフェニル）オキザレート
等の発光性物質、例えばフェノール、ナフトール、アン
トラセン或はこれらの誘導体等の紫外部に吸収を有する
物質、例えば４−アミノ−２，２，８，６−チトラメチ
ルピベリジンー１−オキシル、３−アミノ−２，２，５
，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル、２，６
−シーＬ〜ブチル−α−（３，５−ジーし一ブチルー４
−オキソー２．５−シクロヘキサジエン−１−イリデン
）−ｐ−トリルオキシル等のオキシル基を有する化合物
に代表されるスピンラベル化剤としての性質を有する物
質等が挙げられるが、これらに限定されるものではない
ことは言うまでもない。

Ｌ記した如き標識物質を結合能物質又は測定対象物質に
結合させる方法としては、自体公知のＥＩＡ、ＲＩＡ或
はＦＩＡ等Ｃご於いて一般に行われている自体公知の標
識方法（例えば、医化学実験ｍ座、ｍｓ巻、山村雄−監
修、第１版、中白書店、１９７１　；図説　蛍光抗体、
用生明著、第１版、（株）ソフトサイエンス社、１９８
３；酵素免疫測定法、石川栄治、河合忠、宮井潔編、第
２版、医学書院。

１９８２等）が何れも例外なく挙げられ、これらに準じ
て行えばよい。また、標識物質を結合能物質又は測定対
象物質に結合させる方法として、アビジン（又はストレ
プトアビジン）とビオチンの反応を利用した常法で行っ
ても良いことは言うまでもない。

本発明の測定方法に於いて、　ｉ＋＋定対象物質と標識
された或はされない結合能物質とを反応させて、複合体
を形成する際の反応条件９或は１ｌＩＱ定対象物質と標
識測定物質及び結合能Ｔｈｉ’ｔとを反応させて、６１
１３１１複合体を形成する際の反応条件としては、複合
体（又はａｇｘ複合体）が形成されるのを妨げる様な条
件でなければ特に限定されないが、常法、例えばＥＩＡ
、ＲＩＡ、Ｉ”ＩＡ、アフィニティクロマトグラフィ等
の自体公知の方法に於いて複合体等を形成させる際の反
応条件に準じて行えばよい０例えば、反応時に緩賀液を
用いる場合には、使用される緩賀剤やその他の試薬はこ
れら自体公知の方法に於いて用いられるものを適宜選択
して用いればよい。

非競合反応の原理を利用した本発明の測定方法に於いて
、複合体を形成させる際の結合能物質の使用濃度として
は、測定対象物質の検量限界をどの程度に設定するかに
よっても変動はあるが、通常は反応液中に於いて、設定
された検量限界濃度に相当する測定対象物質全てと結合
し得る濃度以上、好ましくはその２倍濃度以上、より好
ましくは５倍濃度以上が反応液中に存在していることが
望ましい。

また５Ｍ１合反応の原理を利用した本発明の測定方法に
於いて、ｗｊｌ複合体を形成させる際の結合能物質の使
用濃度及び標識測定物質の使用濃度は、測定対象物質の
検量限界や測定感度をどの程度に設定するかによって適
宜設定すればよく、特に限定されない。但し、ＢＲ測定
物質の使用濃度は、反応液中に存在する結合能物質全て
と結合し得る濃度以上に設定しておかなければならない
ことは言うまでもないゆ 本発明の測定法に於いて、反応時のｐ■■としては、複
合体（又はｔＲ識複合体）が形成されるのを妨げなし）
範囲であれば特に限定されるものではないが、通常２〜
１０．好ましくは５〜９の範囲が挙げられる。反応時の
温度も、複合体（又は標識複合体）が形成されるのを妨
げない範囲であれば特に限定されるものではないが、通
常０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃の範囲が好まし
く挙げられる。

反応時間は、複合体（又はｖｓ３１１複合体）が形成さ
れるのに要する時間が−Ｎ定対象物質と結合能物質との
性質により異なるので、各々の性質に応じて数秒間乃至
数時間適宜反応させればよい。

本発明の測定方法に於いて、Ｂ／Ｆ分離に用いられるＨ
　Ｐ　Ｌ　Ｃとしては、装置自身は通常分析の分野に於
いて用いられているもので定流速のものであれば特に問
題なく用いることができるが、分離用カラムに使用する
充填剤は、複合体（又はｅＡＲ複合体）と、遊離の結合
能物質（５？はｔ！ｌＪＲ測定物質）との間にどのよう
な性質の差があるかにより種々のものが適宜選択されて
使用されなければならないことは言うまでもない。即ち
、例えば複合体（又は標識複合体）の分子量が結合能物
質（又は標識測定物ｆｆ）の分子量の約１．２倍以上、
　ｆｌＦましくは１．５倍以上、更に好ましくは２倍以
上ある場合にはゲル濾過（ゲルクロマトグラフィ）用の
充填剤が適しており、例えば複合体（又は標、！ｉＩ！
複合体）の等電点と結合能物質（又は標識測定物質）の
等電点との差がｐＨで０゜０５以上、好ましくは０．２
以上ある場合にはイオン交換クロマトグラブイ用或は等
電点クロマトグラフィ用の充填剤が適しており１例えば
複合体（又はｍ、真複合体）と結合能物質（又は標識測
定物質）の疎水性がかなり異なっている場合には疎水ク
ロマトグラブイ用或ば逆相クロマトグラフィ川の充填剤
が適しており、：。

！■螺旋構造をとる２本鎖ＤＮＡの１対のポリヌクレオ
チド鎖の一方を結合能物質として使用して他方の検出（
定量）を行う場合には充填剤としてハイドロキシアパタ
イト又はゲルクロマ１−ゲラブイ用充填剤が用いられ、
より好ましくはハイドロキシアパタイトが用いられる。

＋１Ｐ１．ｃによりＢ／Ｆ分離を行う際に用いられる溶
Ｉｓ（溶離液）としては、形成された複合体（又は標識
複合体）が再び測定対象物質（或は標識測定物’ｒｔ＞
　と結合能物質とに分解されるようなことがなく、且つ
複合体（又は標識複合体）に含まれる標識物質のｍ糞物
質としての機能、或は結合能物質自身の標識物質として
の機能を失わしめるようなものでなければ特に限定され
ることなく挙げられるが１通常は例えばＥＩＡ、ＲＩＡ
、　Ｉ？ＩＡ。

アブイニテイクロマトグラフイ等の自体公知の方法に於
いて緩衝液として用いられているようなものであればよ
く、例えばリン１鮎酢劃Ｌクエン酸程、グツド（Ｇｏｏ
ｄ）の緩慣剤、トリス（ヒドロキシエチル）アミノメタ
ン等の緩衡剤、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、
硫酸アンモニウム等の塩類、例えばメタノール、エタノ
ール、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、テト
ラヒドロフラン等の有機溶媒類及び界面活性剤等を９複
合体（又は標ｍ複合体）と結合能物質（又は標識測定物
質）の性質に応じて適宜選択し、添加、混合して調製さ
れた、Ｐ１１２〜１０の緩衝液が好ましく用いられる。

本発明の測定方法に於いて、）ｌ　Ｐ　１．、Ｃにより
分離された複合体（又は標識複合体）中に含まれる標識
物質或は結合能物質の測定は、Ｗ＊物Ｉ！！を或、は結
合能物質の種類に応して夫々所定の方法に従って実施さ
れる１例えば、ＩＫ真物質或は結合能物質が酵素の場合
にはＥＩＡの常法、例えば［酵素免疫測定法、蛋白質核
酸酵素別冊Ｎｏ、３１、北用常廣・南原利夫・辻章夫・
石川榮治編集、５１〜６３頁２共立出版（株）　、　１
９８７年９月１０日発行」等に記載された方法に準じて
測定を行えばよく、標識物質が放射性物質の場合にはＲ
Ｉ　Ａの常法に従い、該放射性物質の出す放射線の種類
及び強さに応じ′Ｃ液浸型ＧＭカウンター、液体シンチ
レーションカウンター、井戸型シンチレーションカウン
ター）ＩＰＬｃ用カウンター等の測定機器を適宜選択し
て使用し、測定を行えばよい（例えば医化学実験講座、
第８巻、山村雄−監修、第１−版、中白書店、　１９７
１等参照、）。また、標識物質或は結合能物質が蛍光性
物質の場合には蛍光光度計等の測定機器を用いるＦ　Ｉ
　Ａの常法、例えば「図説　蛍光抗体、用生明箸、第１
版、（株）ソフトサイエンス社、　１９８３Ｊ等に記載
された方法に準じて測定を行えばよく、標識物質或は結
合能物質が発光性物質の場合にはフオ）・ンカウンター
等の測定機器を用いる常法、例えば「酵素免疫測定法、
蛋白質核酸酵素別＠Ｎｏ、３１．北川常廣・南原利夫・
辻章夫・石川榮ｉｆＥ編集、２５２−２８３頁、共立出
版（株）　、　１９８７年９月１０日発行」等に記載さ
れた方法に準じて測定を行えばよい。更に、、ｍ糞物質
或は結合能物質が紫外部に吸収を有する物質の場合には
分光光度計等の測定機器を用いる常法によって測定を行
えばよく、標識物質がスピンの性質を有する物質の場合
には電子スピン共鳴装置を用いる常法、例えばｒ酵素免
疫測定法、Ｒ白質核酸酵素別冊Ｎｏ、３１、北用常廣・
南原利夫・辻章夫・石川榮治ｍ集６２６４〜２７１頁、
共立出版（株）　、　１９８７年９月１０日発行ｊ等に
記載された方法に準じて夫々測定を行えばよい。

また、本発明に於いて、ＩＩＰしＣにより分離された複
合体（又は標Ｒ複合体）中に含ま九る標識物質或は結合
能物質の測定を行う際には、例えば［最新液体クロマト
グラフィ、原昭二・辻章夫編、第１版、９２〜１０４頁
、南山堂、１９７８年２月１日発行」等に記載されてい
るような、Ｈ［’ＬＣのカラムからの流出液をそのまま
検出部に導き、流出液中の複合体（又は標５Ｍ！複合体
）中に含まれる標識物質の量或は結合能物質の量を直接
測定する方式が、洞定か迅速に行えるのでより好ましい
、この場合に、標識物質或は結合能物質が例えば酵素で
あれば、＋１ＰＬＣのカラムと検出部との間に９＃素活
性測定用の試薬を流出液に添加して反応させる一所謂ポ
ストカラム法の反応部を設ける必要があることは言うま
でもない、Ｗ＊物貿或は結合能物質を酵素とＩまた場合
の該反応部に於いて用いられる酵素活性測定用の試薬は
、常法６例えば「酵素免疫測定法、蛋白質核酸酵素別冊
Ｎｏ、３１、北用常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編
集、５１〜６３頁、共立出版（株）　、　１９８７年９
月１０日発行」等に記載された内容に基いて＄１製した
ものを用いてもよいし、市販されている臨床検査用キッ
トの試薬を適宜選択して利用してもよい、＊た、標識物
質或は結合能物質が酵素以外の場合に於いても、検出感
度を増加させる目的で所定の試薬を添加、反応させるた
めに、ＨＰＬＣのカラムと検出部との間に適当な反応部
を設けることは任意である。

本発明の非競合反応の原理に基づく測定方法に於いて、
結合能物質として抗体を用いる場合には、目的に応じて
使用する抗体を適宜ペプシン、パパイン等の酵素を用い
て消化してＦ（ａｂ’）２、Ｆ　ａｂ’或はＦａｂとし
て使用することが望ましい、即ち、通常の抗血清中に抗
体として含まれる免疫グロブリンは通常１ｇＧクラスで
あるが、この工にＧの分子量は約１５万であり、これを
例えばパーオキシダーゼによりｍａｔしたパーオキシダ
ーゼ標識ＩにＧの分子量は約２０万程度になる。これと
測定対象物質が反応した結果得られるパーオキシダーゼ
標識複合体とパーオキシダーゼ標識■にＧとを例えばゲ
ルクロマトグラフィのＷＱでＢ／Ｆ分離を行おうとすれ
ば、測定対象物質の分子量が約５万以上なければ分離が
難しくなり、必然的に測定対象物質の種類が限られてく
る。従って、使用する抗体を酵素により消化してＦ（ａ
ｂ’）２（分子量約１０万）＋　Ｆａｂ’　（分子量約
５万）或はＦａｂ（分子量約５万）とし、これに標識物
質を結合させて標識結合能物質として用いれば、分子量
が１万程度以上のものが測定対象物質と成り得るので好
ましい。尚。

」−記した如き目的のためにＦ　ａｂ’やＦａｂを用い
る場合には使用する標識物質の分子量もなるべく小さい
方が好ましいのは言うまでもなく、例えば標識物質とし
て酵素を用いる場合には、マイクロパーオキシダーゼ（
分子量：約１８００）等の低分子量の酵素が好ましく用
いられる。また、抗体として１つの抗原認識部位のみと
結合する性質を備えたモノクローナル抗体を用いた場合
には、これを消化して得られるＦａｂ’或はＦａｂに標
識物質を結合させたものを結合能物質として用いれば、
澗定対象物貿゛１個当りに１個（測定対象物質が２量体
や３１ｔ体等になっている場合には単量体あたりに１個
）の標識物質を結合させることができるため、測定時の
検量線の直線性が良好となりより好ましい。

また、競合反応の原理に基づく測定方法に於いても、結
合能物質として抗体を用いる場合には、目的に応じて使
用する抗体を適宜ペプシン、パパイン等の酵素を用いて
消化してＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’或はＦａｂとして使
用することが望ましい。特に。

抗体として１つの抗原認識部位のみと結合する性質を備
えたモノクローナル抗体を用いた場合には、これを消化
して得られるＦａｂ’或はＦａｂを結合能物質として用
いれば、　１９定対象物質及び標識測定物質１個当りに
】４個（測定対象物質が２贋体や３量体等になっている
場合には単量体あたりに１個）の結合能物質を結合させ
ることができるため、標！Ｉｌｔ複合体の分子量、ｋ！
？電点等の性質が一定となって分離が容易となり好まし
い。

本発明の測定方法に於いては、該相互反応の結果生じる
複合体（又は標識複合体）中の標識物質の量或は結合能
物質の量を測定する以外にも、複合体の形成に関与しな
かった遊離の結合能物質中の標識物質の量或は結合能物
質の量、若しくは遊離の標識測定物作中の標識物質の量
を測定することによっても２ｗＪ定対象物質量を測定す
ることができることは言うまでもない。

本発明に於いて用いられる結合能物質としての抗体は、
常法１例えば「免疫学実験入門、第２刷。

松橋直ら、（株）学会出版センター＋　１９８１Ｊ等に
記載の方法に準じて、馬、牛、羊、兎、山羊、ラット、
マウス等の動物に測定対象物質を免疫して作製されるポ
リクローナル抗体でも、或はまた常法、即ちケラ−・と
ミルスタイン（Ｇ、にδｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｃ、Ｍｉｌ
ｓｔａｉｎ；　Ｎａｔｕｒｅ、　２５６．４９５．１９
７５）により確立された細胞融合法に従い、マウスのＵ
瘍うインからの細胞と、測定対！ａ物質で予め免疫され
たマウスのｌ＋！ｍ胞とを融合させて得られるハイブリ
ドーマが産生する単クローン性抗体でも何れにてもよく
、これらを単独で或はこれらを適宜組み合わせて用いる
等は任意である。

本発明の方法に於いて、複合体（又は標Ｘ複合体）を形
成させる際に、要すれば２種類以上の結合能物ｆｆ（具
体的には、測定対象物質上の異なる部位に各々結合する
性質を有する２種類以上の結合能物質）を用いれば、結
果的に複合体（又は標識複合体）の分子量が大きくなる
、等電点も変動する等から、複合体（又は標殿複合体）
と結合能物質（又は標識測定物質）との分離がにり容易
となり、測定精度の向上を計ることができる。更に、こ
の場合に、各々の結合能物質に標識物質を結合させて４
′ｉけば、測定感度をＪ−、昇さぜることができること
は言うまでもない。

また、非競合反応の原理に基づく測定方法に於いて、標
識結合能物質と、単なる結合能物質を併用して、測定感
度の調節を行ってもよい、即ち、このようにして反応を
行った場合には、測定対象物質は、標識結合能物質及び
単なる結合能物質の双方と反応して、ＩＪ＊物質を含む
複合体と、標識物質を含まない複合体とを形成し、これ
らが形成される比率は、反応時の標識結合能物質と帆な
る結合能物質との比率に比例する。従って、屯なる結合
能物質の比率を変化させることにより、標識物質を含む
複合体の生成比率を変化させ、且つ複合体中の標識物ｇ
Ｉｔ′ｉＩＣを測定することにより測定対象物質の測定
を行えば、測定感度の調節を行うことができる。尚、こ
の場合、標識結合能物質と単なる結合能物質は、通常同
一の結合能物質に由来するものが用いられるが、標識結
合能物質と単なる結合能物質の何れか一方が測定対象物
質と結合した場合、他方は測定対象物質に結合し得ない
様な性質を有する組み合わせとなるものであれば、結合
能物質自体の種類が異なるものでもよいことは言うまで
もない。

尚２Ｎ４定対象物質と結合能物質との組み合わせが、抗
原と抗体である場１合、従来の方法、例えばＥＩＡ法や
ＲＩＡ法により測定を行った場合には、測定結果が出る
までには少なくとも数時間、場合にＪ：りでは数日間を
要していたが。本発明の方法によれば、必要な測定時間
は通常数十分程度と非常に短くて済む。このことは、従
来考えられていた抗原抗体反応の通念を覆えす極めて意
外な事実であった。

以下に実施例を挙げて、本発明を更に１１体的に説明す
るが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではな
い。

［実施例］ 実施例１．免疫グロブリンＧ（ＩにＧ）の測定（溶離液
） リン酸１ナトリウム１３．０に、リン酸２すトリウム５
９．７ｇ、塩化ナトリウム４８．３に、アジ化ナトリウ
ム５ｇを精製水に溶解して全量５１とし、溶解液とした
。

（試料） ヒト■にＧ（シグマ社製）を生理食塩水に溶解して、ヒ
トＩｇＧ濃度０．６０．０．４８．０．３８．０．２４
゜０．１２又は０．０６ｍに／ａｌの溶液を調製し、試
料とした。

（抗体液） 抗ヒトＩｇＧ（マウス）モノクローナル抗体（和光紬薬
工業（株）製）を上紀溶ｗＩ！液に添加して、抗体蛋白
濃度１ｏ＋ｍｇ／ｍｌの溶液を調製１７．抗体液とした
。

（ＨＰＬＣの使用条件） ・カラム：１φＸ　３０　ｅ　ｍ　ｅ ・充填剤：　ＴＳＫｇｅｌ　Ｇ−３０００３Ｗ　（東ソ
ー（株）社商品名）。

・流速：　０．８＋ｍｌ／ｗｉｎ。

・検出：　２８０ｎｍの吸光度を測定した。

（測定操作） 抗体液１５０μｍと試料１００μｌとを室温下に混合し
た後、混合液の５０μｍをＨＰ　Ｉ、Ｃにより分析した
。

（結果） 得ら九だ溶出パターンを第１図に示す、ここに於いて、
八は、試料の代りに生理食塩水を用いて同様に反応させ
たものの分析結果を示し、Ｂは。

ヒトＩｇＧを０．６０Ｉｌに／ｍｌ含む試料を用いた場
合の分析結果を夫々示す。

第１図から明らかなように、抗原抗体反応により複合体
が形成されると、ａ′会合体遊離の抗体とがＨＰＩ、Ｃ
により分離されることが判る。

また、第２図に、各試料のヒトＩｇＧ濃度と、分析の結
果得られた複合体のピーク面積値との関係を表わす検量
線を示す。

第２図から明らかなように、検量線は良好な直線性を示
した。

実施例２．免疫グロブリンＥ（ＩにＥ）の測定（溶離液
） トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン６０にをイオ
ン交換水８１に溶解し、酢酸でＰＨ８，５に調整した後
、全：ｌ１１０１として溶離液とした。

（基質液） ３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）−プロピオン酸１６．
６Ｋ及び３５％過酸化水素水６３０ｍＫ（＋１２０２と
して２２０１ｇ）を上記溶離液で溶解し全！１１として
基質液とした。

（抗体液） 抗ヒトＩにＥ（マウス）モノクローナル抗体（和光紬薬
工業（株）製）を常法により処理してＦ　ａｂ’とし、
これに常法により西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ
）を標識して得たＰＯＤＩ！識抗ヒトＩｚＥ−Ｆａｂ’
を、上記溶離液中に０．５＋ｓｇ／ｍｌの蛋白濃度とな
るように添加して抗体液とした。

（試料） 市販のＩｇＥ４！ｉｌ準血清（ヘキスト社製）を生理食
塩水で希釈してＩにＥ濃度６２．１２５．２５０．５０
０又は１００００／ｍｌの溶液を調製し、試料とした。

（ＨＰＬＣの使用条件） システムの概略を第３図に示す。

・カラム：１φＸ３０ｃｍ。

・充填剤ニス−パーローズ１２（ファルマシア社商品名
）。

・流速：溶離液；　０．８ｍｌ／ｗｉｎ、、基質液；　
０．２ｍｌ／・検出：励起波長３２０ｎ＋ｍ、蛍光波長
４０４ｎｍで蛍光を測定した。

（測定操作） 抗体液１５０μｍと試料１００μｍとを室温下に混合し
た後、混合液の５μｌをＨＰＬＣにより分析した。

（結果） ＨＰＬＣによる分析の結果、ｐｏｏｍｘ抗ヒトＩにＥ−
Ｆａｂ’は１９．２分後に、ＩＫＥとＰＯＤ標識抗ヒト
ＩｇＥ−Ｆ　ａｂ’との複合体は１５．６分後に溶出し
てくることが判った。

また、第４図に、各試料のヒトＩｇＥ濃度と。

分析の結果得られた複合体のピーク面積値との関係を表
わす検量線を示す。

第４図から明らかなように、検量線は良好な直線性を示
した。

実施例３．免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の測定（溶離液
） リン１１２１カリウム２．３．、　　リン酸２ナトリウ
ム１２水塩１１．９ｇ及び塩化ナトリウム８．８Ｋをイ
オン交換水に溶解し、全ｔ　１０００耐として溶離液と
した。

（抗体液） 抗ヒトＩｇＡ（α）（ヤギ）　ＦＩＴＣＩＩ識抗体（リ
ットン社ｍ）を上記溶解液中に０．８開／耐の蛋白濃度
となるように添加して抗体液とした。

（試料） ヒトＩｇＡ（ジャクソン免疫研究所製）を生理食塩水に
溶解して、ヒトＴにＡ濃度０．０１２．０．０２４゜０
．０３ｆＪ、　０．０４８又はｏ、ｏａｏ醜ｇ／ｌｌｌ
の溶液を調製し、試料とした。

（ＩＩＰＬＣの使用条件） ・カラム：１φＸ　３０ｅ斎。

・充填剤ニス−パーローズ１２（ファルマシア社商品名
）。

・流速：　０．８１ｍ１／ｗｉｎ、。

・検出：励起波長４９５ｎ□、蛍光波長５２５ｎｍで蛍
光を測定した。

（測定操作） 抗体液５０μｌと試料５０μｍとを室温下に混合した後
、混合液の５０μｍをＨＰＬＣにより分析した。

（結果） ＨＰ　Ｌ　Ｃによる分析の結束、抗ヒトエにＡ（α）（
ヤギ）　ＦＩＴＣ標識抗体は１７８７分後に、Ｉｉ：Ａ
と抗ヒトＩｇＡ（α）（ヤギ）　Ｆ１１’Ｃ標臭抗体と
の複合体は１３．０分後に溶出してくることが判った。

また、第５図に、各試料のヒトＩｇＡ濃度と、分析の結
果得られた複合体のピーク面積値との関係を表わす検量
線を示す。

第５図から明らかなように、検量線は良好な１α線性を
示した。

実施例４、アルブミンの測定 （溶離液） リン酸〕、カリウム２３ｇ及びリン酸２すｌ−リウム１
２水＠　１１９ｇをイオン交換水に溶解Ｉへ全、ｔ　１
０１として溶離液とした。

（基質液） ２．２′−アジノービス（３−エチルベンゾチアゾリン
−６−スルホ：／Ｉ！Ｆ）　８．４３ｇ＆び３５ス過酸
化水素水２４３０ｍｇ（１１２０２としてａ５０ｍｇ）
を上記溶解液で溶解し全量１−１として基質液とした。

（抗体液） 常法にＪ：り調製した抗ヒトアルブミン抗体な産生する
マウスハイブリドーマ２クローンを夫々培養して得られ
た抗ヒトアルブミン（マウス）モノクローナル抗体Ａ及
びＢ（以下、ＡＡＭ−Ａ及びＡＡＭ−８と略記する。尚
、夫々の抗原認３１部位は互いに異なっている。）を、
常法によりＦ　ａｂ’とした。これらにＰＯＤを標識し
てｐｏｐｓ　ＸＡＡＭ−Ａ及びＰＯＤ標諏ＡＡトＢとし
、上記溶離液中に夫々の蛋白濃度が２　Ｂ／ｍ、ｌとな
るように添加して抗体液とした。

（試料） ヒトアルブミン（和光紬薬工業（株）製）を生理食塩水
に溶解して、ヒトアルブミン濃度０．００５゜ｏ、ｏｉ
、　０．０２又は０．０４１１に／１ｍｌの溶液を調製
し、試料とした。

（ＨＰＬＣの使用条件） システムの概略は第３図の通り。

・カラム：１φＸ３０ｃｍ。

・充填剤ニス−パーローズ　６　（ファルマシア社商品
名）。

・流速：溶離液；　Ｑ、Ｑ＠ｌ／＋＊ｉｎ、、基質液；
　０．１５ｍ１／＋ｍｉ、ｎ、。

・検出：　４０５ｎ＋ｎの吸光度を測定した。

（測定操作） 抗体′ａ、１００μｍと試料５０μｍとを混合し３７℃
で１０分間放置した後、混合液の５μｌをＩ（ＰＬＣに
より分析した。

（結果） ＨＰＬＣによる分析のＭ果、ＰＯＤ標黒＾ＡＭ−Ａ及び
ＰＯＤ標識Δ＾トＢは共に２５分後に＋　ＰＯＤ標識Ａ
＾トＡ及びＰＯＤ標ｌＲＡＡＭ−Ｂとヒトアルブミンと
の複合体は２２分後に溶出してくることが判った。

また、第６図に、各試料のヒトアルブミン濃度と３分析
の結果得られた複合体のピーク面積値との関係を表わす
検量線を示す。

第６図から明らかなように、検量線は良好な直線性を示
した。

尚、　ＰＯＤ標識抗体としてＰＯＤ標識＾ＡトＡ又は１
）００標諏ＡＡＭ−Ｂの何れか一方のみを用いて同様の
反応を行ったところ、　ＰＯＤ標識抗体と複合体とを七
分には分離できなかった。こればアルブミンと、　ＰＯ
Ｄ標謝ＡＡＭ−Ａ又はＰＯＤ＊ｊｌｌＡＡ阿−Ｂの何れ
か一方のみの複合体とＰＯＤ標謝＾ＡＭ−Ａ及びＰＯＤ
標臓ＡＡＭ−８とでは、その分子量の差が小さいために
十分な分離が行えなかったためと考えられる。

実施例５．ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈｃＧ）の測定 （溶離液） ソンａ１ナトリウム３．９ｇ、　　リン酸１ナトリウム
（１２水＠）８１に、塩化ナトリウム４４ｇ及び３−（
ｐ−ヒドロキシフェニル）−プロピオン酸８．３ｇをイ
オン交換水に溶解し全量５１として溶離液とした（ｐ）
Ｉ７．Ｏ）。

（基質液） ３０％過酸化水素水をイオン交換水で希釈し、＋（２０
□の２（１ｍＭ溶液を調製して基質液とした。

（抗体液１） 抗ｈＣＧ−β鎖（兎）ポリクローナル抗体（但し、抗原
としてｈＣＧ−β鎖のＣ＊端ベプタイドを使用。

和光紬薬工業（株）製）を常法により処理してＦａｂ′
とし、これに常法により西洋ワサビペルオキシダーゼ（
ＰＯＤ）を標識して得たＰＯＤ標識抗ｈＣＧ−β鎖−Ｆ
　ａｂ’を、　５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０，１
５０ｍＭ塩化ナトリウム含有）中に９５０μに／耐の清
白濃度となるように添加して抗体液ｌとした。

（抗体液２） 抗ｈＣＧ−β鎖（マウス）モノクローナル抗体（但し、
抗体液１で用いた抗体とエピトープが異なる。和光紬薬
工業（株）製）を、　５０＋ａＭリン酸緩衝液（ｐＩ（
７，０，１５０ｍＭ塩化ナトリウム含有）中に５００μ
ｇ／ｍｌの債白濃度となるように添加して抗体液２とし
た。

（試料） 市販のｈｃａ（シグマ社製）をイオン交換水に溶解して
、ｈＣＧ濃度１００．２００．３００．４００又は５０
０ｍＩＵ／ｍｌの溶液をａ製し、試料とした。

（）ＩＰＬｃの使用条件） システムの概略は第３図の通り。

・カラム及び充填剤：０，８φＸ　３Ｑｃｍ、　Ｙ　Ｍ
　Ｃ−パックＤｉｏｌ−２００（山村化学研究所（株）
社商品名）。

・流速：溶＃ｌ液；　１．Ｏｍｌ／ｍ、ｉｎ、、基質液
；　０．１ｍｌ／ｗｉｎ、。

・検出：励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４０４ｎＩｍで
蛍光を測定した。

（測定操作） 抗体液１４０μｍ、抗体液２４０μｌ及び試料５０μｌ
とを室温下に混合した後、混合液の１００μｍをＨＰＬ
Ｃにより分析した。

（結果） ＨＰＬＣによる分析の結果得られた。各試料のｈｃＧ濃
度と、複合体のピーク面積値との関係を表わす検ｆｆｉ
線を＄７図に示す。

第７図から明らかなように、検量線は良好な直線性を示
した。

尚、ＨＰＬＣＧ、：ヨ６分析（７）Ｍ果、ＰＯ［１４Ｆ
ＪＪＩ抗ｈＣＧ−β鎖−Ｆ　ａｂ’は１２．０分後に、
ＰＯＤ標識抗ｈＣＧ−β鎖−Ｆａｂ’とｈｃＧとの複合
体は９．５分後に、　ＰＯＤ標識抗ｈｃａ−β鎖−Ｆａ
ｂ’、抗ｈＣＧ−β鎖（マウス）モノクローナル抗体及
びｈＣＧとの複合体は８．２分後に溶出してくることが
判った。この結果から明らかな如く、ｈＣＧとｐｏｏｅ
＊＊抗ｈＣＧ−β鎖−Ｆａｂ’との複合体とＰＯＤ標臓
識抗ｈＣＧ−β鎖−Ｆ　ａｂ’とを分離させるよりも、
　ｈ　ＣＧ　、　ＰＯＤ標識抗ｈｃａ−β鎖Ｆａｂ’及
び抗ｈＣＧ−β鎖（マウス）モノクローナル抗体との複
合体とＰＯＤ標ＲＩＲ抗ｈ　ＣＧ−β鎖−Ｆ　ａｂ’と
を分離させる方がより確実に分離できることが判る。

実施例６．ヒト　α−フェトプロティン（ＡＦＰ）の測
定 （溶離液） リン酸１ナトリウム３．９Ｋ、リン酸２ナトリウム（］
２水塩）　８１ｇ、　Ｊ！化ナナトリウム４４ｇび３−
　（ｐ−ヒドロキシフェニル）−プロピオン酸８．３ｇ
をイオン交換水に溶解し全量５　ｌとして溶離液とした
（ｐｒ＋７．０）　。

（基質液） ３部過酸化水素水をイオン交換水で希釈し、Ｈ２０□の
２０＋ｉＭ溶液を調製して基質液とした。

（抗体液１） 抗ＡＦＰ　（マウス）モノクローナル抗体（宝酒造（株
）製）を常法により処理してＦａｂ’とし、これに常法
により西洋ワザビベルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を標識し
て得たＰＯＤ標諏抗ＡＦＰ−Ｆ　ａｂ’を、　５０ｍＭ
リン酸緩街液（ＰＨ７，０，１５０ｍＭ塩化ナトリウム
含有）中に１０μｇ／ｍｌの蛋白濃度となるように添加
して抗体液１とした。

（抗体液２） 抗体液１で用いたのと同じモノクローナル抗体を、５０
ｍＭ　ｊＪ　＞　９緩衝液（ｐＨ７，０，１５０＋ａＭ
塩化ナトリウム含有）中に５０ｎに／ｍｌの蛋白濃度と
なるように添加して抗体液２とした。

（試料） 市販のＡＦＰ（ダコ　ジャパン社製）を５０ｍＭリン酸
緩賀液（ＰＨ７，０，１５０ｍＭ塩化ナトリウム含有）
に溶解して＋　ＡＦＰＩＩ度２００．４００．８００．
８００又は１０００口に／ｍｌの溶液をｍ１ＩＩ＋、、
試料とした。

（ｔｌＰＬｃの使用条件） システムの概略は第３図の通り。

・カラム及び充填剤：０．８φＸ　３０ｅｓ、　Ｙ　Ｍ
　Ｃ−パックＤｉｏｌ−３００（山村化学研究所（株）
社商品名）。

・流速：溶離液；　１．Ｏｍｌ／ｗｉｎ、、基質液；　
０．１ｍｌ／ｍｉｎ、ｅ ・検出：励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４０４ｎｍで蛍
光を測定した。

ＣＳ定操作１−） 抗体液１−４０μｍ及び抗体液２４０μｍを室温下に混
合し、次いでこれに試料５０μｌを室温下に混合した後
、混合液の１００μｍをＨＰＬＣにより分析した。

（測定操作２） 抗体液１４０μｌ、５０ｍＭ　ｊＪ　：／　ｌ’ｌｔ　
ｎ　ｔｉｆ液（ｐＨ７，０，１５０ｍＭ塩化ナトリウム
含有）４０μｍ及び試料５０μｍとを室温下に混合した
後、混合液の１００μｍをＨＰ　ｌ、Ｃにより分析した
。

（結果） １１ＰＬｃによる分析の結果得られた。各試料のＡＰＩ
’濃度と、？ｉ［合体のピーク面積値との関係を表わす
検量線を第８図に示す、尚、第８図に於いて。

〇−は測定操作１ににり得られた結果を、−・−は測定
操作２により得られた結果を夫々示す。

第８図から明らかなように、各試料に於けるピーク面積
値、言い換えれば測定感度に違１．Ｎは見らお２るもの
の、何れの検量線も良好な直線性を示Ｉまた。

また、この結果から、抗体液２を用いることにより測定
感度の調整が可能であること　−９（、ｓ換λ−れば、
４！８１識結合能物質を調製するのに用Ｉｌ飄だ結合能
物質を標識せずに添加することにより、測定感度のｍ９
Ｉ１．が可能であることが判る、実施例７゜Ｂ型肝炎ウ
ィルス（ＨＢｓ）　Ｄ　Ｎ　Ａの測定 （溶離液１） リン酸１−すトリウム１゜６に及び３−（ｐ−ヒドロキ
シフェニル）−プロピオン酸１．ｆｌｇをイオン交換水
５００＋ｍｌに溶解した１１．ＩＮ水酸化ナトリウム溶
液でＰ、　Ｈな６．７に調整したものを、イオン交換水
で全量をｔ　　ｌとして溶離液１とした。

（溶離液２） リン酸１すトリウム７８ｇ及び３−（ｐ−ヒドロキシフ
ェニル）〜プロピオンｉｌｌ　１．ｆ３ｇをイオン交換
水５００ｍ１に溶解した後、ＩＮ水酸化ナトリウム溶液
でｐＨを６．７に！１１１！ｔ、た化のを、イオン交換
水で全量を１．１として溶離液２とした。

（基質液） ３０％　；ａ酸化水素水をイオン交換水で希釈し。

Ｈ２０２の２０１溶液を調製して基質液とした。

」１オリゴヌクレオヂドプローブ溶液）ｉ）オリゴヌク
レメ゛プローブのｍｍ ａｄｉｒ型Ｉ−（ＢｓＡｚ遺伝子をコードした塩基配列
の一部である ５’　−ＣＴＴＣＴＧＧＡＴＴＡＴＣＡＡＧＧＴＡＴＧ
Ｔ−３’（式中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシ
トシン、Ｔはチミンの各塩基残基を表わす６）の合成及
びその５′末端へのβ−リンクチオールリンカ−（Ｂｉ
ｏｓｅａｒｅｈ　Ｉｎｃ、）の付加は、β−シアノエチ
ルホスホアミダイド法により行った。また。

脱保護、ＳＨ基の活性化、精製等は常法により行った。

ｊｉ）オリゴヌクレオチドプローブのＰＯＤによる標識 スルホザクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）
シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ビアース社［
）ｉＩＩＫを３００　μｌのＰＯＤ溶液（７Ｂ／ｒｍｌ
　ｉｎ　０．１．Ｍリン酸緩衝液、ＰＨ４７，０）に加
え、３０℃で１時間反応させた。この反応液を２０ｍＭ
リン＃緩衝液（１５０ｄ塩化ナトリウム含有、　ＰＨ７
，０）で平衡化したセファデックスＧ−２５（ファルマ
シア社製）カラムで精製し、ＰＯＤを含む両分を集め、
限外濾過により濃縮した。これに、ｉで得られたオリゴ
ヌク１７オチド（ＳＨ基は活性化済み）１００μＫを加
えた後、４℃で２０時間放置した。これを、ＤＥＡＥ−
トリスアクリル（和光紬薬工業（株）製）を用いたカラ
ムクロマトにより精製し、ＰＯＤ標識オリゴヌクレオチ
ドプローブ１４０μ＆を得た。

ｉ　ｉ　ｊ、　）　ｍ　Ｉ＆オリゴヌクレオチドプロー
ブ溶液ｉｊで得られたＰＯＤ標黒オリゴヌクレオチドプ
ローブを、１．８ｍＭ　！Ｊ　ン酸ｔａ街液（ｐＨ７，
４，０，７５Ｍ塩化ナトリウム、４．５ｍＭ　ＥＤＴＡ
、　０．１％ブイコール、０．１％ポリビニルピロリド
ン、３．０％牛血清アルブミン及び０．３トリトンＸ−
１００含有、）に１１００ｎ／ｍｌとなるように溶解し
たものを標識オリゴヌクレオチドプローブ溶液とした。

（試料） ａｄ−型ＨＢ　Ｖゲノム（３，２Ｋｂ）をＰＢＲ３２２
ベクター（４，４にｂ）のＥｃｏＲＩサイトへ組み込ん
だＰＨＢＶ９３３（７，６Ｋｂ）をオノらの方法（Ｎｕ
ｅｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１１．
１７４７−１７５７頁、　１９８３）により調製した。

得られたＰＨＢ　Ｖ９３３を制限酵素Ｓａｌ　Ｋにより
切所し直線状にしたもののＩＯＢ／ｌｌｌの水溶液を試
料とした。

（ＩＩＰＬｃの使用条件） システムの概略は第３図の通り７ ・カラム及び充填剤：０．７５φＸ７．５ｃｍ。１”　
Ｓ　Ｋｇｅｌ　ＨＡｌｏｏＯ（東ソー（株）社商品名）
。

・流速：溶離液；　１．０＋ａｌ／ｍｉ旧、基質液；　
０．１ｍｌ／ｌ１ｉｎ、。

・検出：励起波長：３２０ｎｍ−蛍光波長４０４ｎｍで
蛍光を測定した、 （ｇＪ定操作） 試料１００μｍを９５℃で１０分間加熱処理した後水冷
１ノ、これに標識オリゴヌクレオチドプローブ溶液１０
０μｍを加え、３７℃で３０分間加温後、この５０１１
．１をＨＰ　Ｌ　Ｃにより分析した。

尚、　ＩＩＰＬｃによる分析に於いては、溶離液１及び
溶離液２とを用いてグラジェントを行った。即ち、分析
開始後０分から５分までは溶離液１だけで溶出を行い、
５分から３５分までは溶離液２のＯから１００％の直線
状グラジェントで溶出を行い、後は４０分まで溶離液２
だけで溶出させた。

（結果） １円４Ｃによる分析の結果、ｐｏｐｓ　真オリゴヌク１
／オチドプローブは５．０分後に、ＰＯＤ標大オリゴヌ
クレオチドプローブとＢ型肝炎ウィルスＤＮＡとの複合
体は９．８分後に溶出してくることが判った。

この結果から、本発明の方法によりＨＢｓＤＮＡの検出
が可能であることが判る。

実施例８　、　ＨＢｓＤ　Ｎ　Ａの測定−２（溶離液） リン酸１ナトリウム３．９ｇ、リン酸２カトリウム（１
２水塩）　８１ｇ−塩化ナトリウム１４７を及び３−（
Ｐ−ヒドロキシフェニル）−プロピオン酸８．３にをイ
オン交換水に溶解し全ｆｆ１５１として溶離液とした（
ｐＨ７，０）。

（基質液） ３０％過酸化水素水をイオン交換水で希釈（７、Ｈ２Ｏ
２の２０ｍＭ溶液をｔＭ製して基質液とした５（標識オ
リゴヌク１／オチドプローブ溶液）実施例７と同じもの
を使用した。

（試料） 実施例７と同じものを使用した。

（旧）１、Ｃの使用条件） システムの概略は第３図の通り。

・カラム及び充填１剤：０．８φＸ　３０ｃｍ、　Ｍ　
Ｍ　Ｃ−パックＤｉａｌ−３００（山村化学研究所（株
）社商品名）。

・流速：溶離液；　１．Ｏｍｌ／ｗｉｎ、、基質液；　
０．１ｍｌ／真１ｎ、。

・検出：励起波長３２０ｎ＋ｍ、蛍光波長４０４ｎｍで
蛍光を測定した。

（＠定操作） 試料１００μｌを９５℃で１０分間加熱処理した後水冷
し、これに標識オリゴヌクレオチドプローブ溶液１００
μｌを加え、３７℃で３０分間加温１１１５　この５０
μｍをＨＰＬＣにより分析した。

（結果） ＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃによる分析の結果、　ＰＯＤ標真標識
ゴヌク１７オチドプローブは１１．０分後に、　ＰＯＤ
標識オリゴヌクレオチドプローブと１３型肝炎ウイルス
ＤＮＡとの複合体は６６５分後に溶出してくることが判
った。

この結果から１本発明の方法によりｌ−ｌＢｓＤＮＡの
検出が可能であることが判る。

実施例９．サイロキシン（Ｔ４）の測定（溶離液） リン酸１−ナトリウム３６９に、リン酸２ナトリウム（
１２水塩）８１ｇ、塩化ナトリウム４４ｇ及び３−（ｐ
−ヒドロキシフェニル）−プロピオン酸８．３ｇをイオ
ン交換水に溶解し全量５１として溶離液とした（ｐＨ７
，０）　。

（基質液） ３０％過酸化水素水をイオン交換水で希釈し、Ｈ２Ｏ２
の２０ｍＭ溶液を調製して基質液とした。

（抗体液） 抗Ｔ４（兎）ポリクローナル抗血清（ダコ　ジャパン社
ｌ１１）を１００１１Ｍリンｍ緩債液（ｐＨ７，０，１
００ｍＭ塩化ナトリウム含有）で５００倍に希釈したも
のを抗体液とした。

（Ｋ料） Ｔ４を１１００ａリン酸緩賀液（ｐＨ７，０，１００＋
ｍＭ塩化ナトリウム含有）に溶解して、Ｔ４濃度１００
．２００又は３００μｇ／ｄｉの溶液をａ製し、試料と
した７（マイクロＰＯＤ標識Ｔ４溶液） ｉ）ＳＨ基修飾マイクロＰＯＤの調製 マイクロＰＯＤ　（以下＋　ＭＰＯＤと略記する。シグ
マ社製、Ｍ−１，１，）　４０＋ＨＨを１００＋ｍＭリ
ン酸緩暫液（ｐ　Ｈ７，５、１００ｍＭ塩化ナトリウム
含有）　４０Ｉｌｌｌに溶解後、６４ｍｚの３，３′−
ジチオビス（スルホサクシニミジル）プロピオネート（
ピアース社製）を含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ
７、５，１１００ＩＩ塩化ナトリウム含有）２嘗１を加
え、３０℃で３０分間反応させた。これに酢酸アンモニ
ウム４００■を添加溶解した後、酢酸でＰＨを４．５に
ｔｌｌ整した。次いでこれにジチオスレイトール３５０
＠にを加え、３０℃で３０分間反応後、４Ｎ水酸化ナト
リウム溶液を用いてＰＸ３を７．０に１ｔ１１整し、凍
結乾燥した。残渣をＩＮ水酸化ナトリウム溶液２臘１に
再溶解したものを、５０＋ｍＭ＃＊アンモニウム溶液で
平衡化したバイオゲルＰ−２（バイオランド社製）のカ
ラムにより精製を行い、３１鱈のＳＨ基脩飾河ＰＯＤを
得た。

ｉｉ）ＭＰＯＤ標＠Ｔ４の！ｌｌｌ製 Ｔ４１０ｍににＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド」１１及
び１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５，１００ｄ塩化
ナトリウ″ム含有）１ｍｌを加えて混合した後、Ｎ−（
γ−マレイミドブチリルオキシ）−サクシニミド１０＋
ｓにを加え、３７℃で１−時間反応させた。これに酢酸
アンモニウム５Ｉｇ、更にｉで得たＳＨ基修飾ＭＰＯＤ
　ｆｌｍｇを加えて、３７℃で２時間反応させた後、５
０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液で平衡化したバイオゲルＩ
）−２（バイオランド社製）のカラムにより蟹製を行い
、２３＋ａｚのＨＰＯＤｍ　ｍ　Ｔ　４　ヲ得た。

１ｉｉ）阿ＰＯＤ標識Ｔ４溶液の調製 ｉｉで得たＭＰＯＤ標３！ＪＴ４の２．２Ｂを１００ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０，１００ｍＭ塩化ナトリウ
ム含有）１００耐に溶解したものをＮＰＯＤ４１其Ｔ４
溶液とした。

（ＨＰＬＣの使用条件） システムの概略は第３図の通り。

・カラム及び充填剤＝０．８φＸ　３０ｃｍ、　Ｙ　Ｍ
　Ｃ−バックＤｉｏｌ−２００（山村化学研究所（株）
社商品名）。

・流速：溶離液；　１．Ｏｍｌ／ｓｕｎ、、基質液；０
．ｌ耐／ｍｚｎ、ｓ ・検出；励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４０４ｎ＊で蛍
光を測定した。

（測定操作） 、Ｘ料３０ｕｌトＭＰＯＤ４！Ｗ＊Ｔ４溶Ｍ：１Ｏｚｚ
ｌトヲ混合シた後、これに抗体液３０ｐ、ｌを室温下に
混合した。

この混合液の５０μｍを１１Ｐ］、Ｃにより分析した。

（結果） １１ＰＬＣによる分析のＭ５＃、試料中の゛ｒ４濃度の
増加に伴い、遊離のＭＰＯＤ標ＲＴ４のピーク面積の増
加及びＭＰＯＤＩＩ　臓Ｔ　４と抗Ｔ４抗体との４４Ｊ
臓複合体のピーク面積の減少がＩｌ！察された。

また、この結果得られた、各試料の１′４ｍ度と、３！
２１１１のにＰＯＤ　Ｉ！真Ｔ４のピーク面積値（盲検
値は差引済み）との関係を表わす検量線を第９図に示す
。

実施例１０．コンカナバリンＡ結合性ＰＯＤの測定（溶
離液） リン酸１ナトリウム１３．Ｏに、リンＷ１１２ナトリウ
ム５９．７に及び塩化ナトリウム４４，０にを１ｉｆ製
水に溶解して全量５１とし、溶離液とした。

（試料） ＰＯＤ　（東洋紡績（株）製）を上記の溶離液に２」／
ｍｌとなるように溶解したものを試料とした。

（コンカナバリンＡ溶液） コンカナバリンＡ（和光紬薬工業（株）！ｌ）を上記の
溶離液に３ｍに／ＩＩＩＪとなるように溶解したものを
コンカナバリンＡ溶液とした。

（ＨＰＬＣの使用柔性） ・カラム：　０．７５φＸ　３０ｅｗ＊。

・充填剤：　ＴＳＫｇｅｌ　Ｇ−３０００５ＷＸＬ　（
東ソー（株）社商品名）。

・流速：　０．７ｍｌ／ｓｕｎ。

・検出：　２８０ｎ■の吸光度を測定した。

（ｉｆ！！定操作） コンカナバリンＡ溶液６０μｌと試料１０　ｐ、　１と
を室温下に混合した後、混合液の１０μｍをＨＰ　Ｉ、
Ｃにより分析した。

（結果） ＨＰ　Ｉ、Ｃによる分析の結果、コンカナバリンＡは１
６．８分後、ＰＯＤは１４．４分後、コンカナバリンＡ
とＰＯＤとの複合体は８．４分後に溶出してくることが
判った。この結果から１本発明の方法によりコンカナバ
リンＡ結合性ＰＯＤの検出が可能であることが判る。

［発明の効果］ 以上述べた如く５本発明は、測定対象物質とこれに対す
る結合能を有する物質（結合能物質）との相互作用を利
用して試料中の微量成分を測定する方法に於いて、該相
互作用の結果生じる複合体（又は標識複合体）と遊離の
結合能物ａ（又は標Ｓ詔定＃ｊ質）との分離を高速液体
クロマトグラフィを用いて行う方法を提供するものであ
り、本発明の方法によれば、微量成分の測定を、同様に
該相互作用を利用した副定法である従来のＥＩＡ、ＲＩ
Ａ或はＦＩＡ等による測定法に比鮫して、容易に且つ短
時間で極めて精度良く測定が行える点に顕著な効果を有
する３明であり、斯業に貢献するところ大なる発明であ
る。

【図面の簡単な説明】

第１−図は、実施例１に於いて得られた高速液体クロマ
トグラフィ（ＨＰＬＣ）による試料の溶出パターンを示
し、Ａは、試料として生理食塩水を用いて反応させたも
のの分析結果を示し、Ｂは、ヒト免疫グロブリンＧ（Ｘ
ｇＧ）をＱ　、　［３Ｑｍｇ／ｍｌ含む試料を用いて反
応させたものの分析結果を夫々示す。 第２図は、実施例１に於いて得られた１にＧの検量線を
示し、横軸の各試料のヒトＩｇＧ濃度に対して得られた
複合体のピーク面積値を縦軸に沿）てプロットした点を
結んだものである。 第３図は、実施例２．４．５，６．７．８．及び９で使
用したＨＰＬＣのシステムの概略図を示したものである
。 ！！４図は、実施例２に於いて得られた免疫グロブリン
Ｅ　（ＩｇＥ）の検量線を示し、横軸の各試料のヒトＩ
ｇＥ濃度に対して得られた複合体のピーク面積値を縦軸
に沿ってプロットした点を結んだものである。 ｉＪ　５図は、実施例３に於いて得られた免疫グロブリ
ンＡ（ＩにＡ）の検量線を示し、横軸の各試料のｔニド
ＩにＡ濃度に対して得られた複合体のピーク面積値を縦
軸に沿ってプロットした点を結んだものである。 第６図は、実施例４に於いて得られたヒトアルブミンの
検量線を示し、横軸の各試料のヒトアルブミン濃度に対
して得られた複合体のピーク面積値を縦軸に沿ってプロ
ットシた点を結んだものである。 第７図は、実施例５に於いて得られたヒト絨毛性ゴナド
トロピン（ｈｃａ）の検量線を示し、横軸の各試料のｈ
ＣＧ濃度に対して得られた複合体のピーク面積値を縦軸
に沿ってプロットした点を結んだものである。 第８因は、実施例６に於いて得られたヒト　αフェトプ
ロティン（ＡＦＰ）の検量線を示し、横軸の各試料のＡ
ＦＰＩＩ１１度に対して得られた複合体のピーク面積値
を縦軸に沿ってプロットした点を結んだものである。尚
、図中、−０−は測定操作１により得られた結果を、−
・−は測定操作２により得られた結果を夫々示す。 第９図は、実施例９に於いて得られたサイロキシン（ｒ
　４）の検量線を示し、横軸の各試料のＴ４濃度に対し
て得られた遊離のマイクロペルオキシダーゼ標ＲＴ４の
ピーク面積値を縦軸に沿ってプロットした点を結んだも
のである。 特許出願人　和光純薬工業株式会社 ご一７面禮イ至 × 第 図 Ｌす［ １度 （Ｕルｌ） 第 図 ＲＡ 鷹、炙（ヲＱ） ×１０−３ 第 図 アルフ゛ミン膿−ノ（（１′シーｅ） 第 区 ＣＧ Ω゛麺 友ｍ　ＩＵ／　ｒｎｌ　） 第 図 ＦＰ １度 （ｎｇ／ｍｌ　） 第 図 Ｔφ １文 αＬｇ／　ｄｌ　）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）測定対象物質を含有する生体由来の試料を、標識
   物質で標識された或はされない、測定対象物質に対する
   結合能を有する物質（以下、結合能物質と略記する。）
   と混合して反応させた後、測定対象物質と結合能物質と
   の複合体（以下、単に複合体と略記する。）と、遊離型
   の結合能物質とを高速液体クロマトグラフィにより分離
   し、複合体中の標識物質の量又は結合能物質の量を測定
   することにより試料中の測定対象物質量を測定すること
   を特徴とする測定方法。 （２）測定対象物質が、蛋白質、ペプチド、核酸、糖鎖
   、脂質、薬物又はホルモンである請求項１に記載の測定
   方法。 （３）測定対象物質が抗原又は抗体であり、結合能物質
   が、測定対象物質に対する抗体又は抗原である請求項１
   に記載の測定方法。 （４）測定対象物質に対する抗体が、標識されたモノク
   ローナル抗体である請求項３に記載の測定法。 （５）測定対象物質に対する抗体が、標識された、モノ
   クローナル抗体由来のＦａｂ又はＦａｂ’である請求項
   ３に記載の測定法。 （６）測定対象物質が糖鎖であり、結合能物質がレクチ
   ンである請求項１に記載の測定方法。 （７）レクチンが、コンカナバリンＡ、レンズマメレク
   チン、インゲンマメレクチン、ダツラレクチン又は小麦
   胚芽レクチンである請求項６に記載の測定方法。 （８）測定対象物質がデオキシリボ核酸を構成する１本
   鎖ポリヌクレオチドであり、結合能物質が該ポリヌクレ
   オチド鎖に対して相補的なポリヌクレオチド鎖である請
   求項１に記載の測定方法。 （９）複合体と、遊離型の結合能物質との分離を、ハイ
   ドロキシアパタイトを充填したカラムを装着した高速液
   体クロマトグラフィにより行う請求項８に記載の測定方
   法。 （１０）標識物質が蛍光性物質、発光性物質、放射性物
   質、酵素、紫外部に吸収を有する物質又はスピンラベル
   化剤としての性質を有する物質である請求項１に記載の
   測定方法。（１１）標識物質で標識されない結合能物質
   が、それ自身、蛍光性物質、発光性物質、酵素又は紫外
   部に吸収を有する物質である請求項１に記載の測定方法
   。 （１２）複合体と、遊離型の結合能物質との分離を、ゲ
   ル濾過（ゲルクロマトグラフィ）用充填剤、イオン交換
   クロマトグラフィ用充填剤、疎水クロマトグラフィ用充
   填剤、等電点クロマトグラフィ用充填剤、逆相クロマト
   グラフィ用充填剤又はハイドロキシアパタイトを充填し
   たカラムを装着した高速液体クロマトグラフィにより行
   う請求項１に記載の測定方法。 （１３）測定対象物質を含有する生体由来の試料を、標
   識物質で標識された測定対象物質（以下、標識測定物質
   と略記する。）、及び結合能物質と混合して反応させた
   後、標識測定物質と結合能物質との複合体（以下、標識
   複合体と略記する。）と、遊離型の標識測定物質とを高
   速液体クロマトグラフィにより分離し、標識複合体中の
   標識物質の量又は遊離型の標識測定物質中の標識物質の
   量を測定することにより試料中の測定対象物質量を測定
   することを特徴とする測定方法。 （１４）測定対象物質が、蛋白質、ペプチド、核酸、糖
   鎖、脂質、薬物又はホルモンである請求項１３に記載の
   測定方法。 （１５）測定対象物質が抗原又は抗体であり、結合能物
   質が、測定対象物質に対する抗体又は抗原である請求項
   １３に記載の測定方法。 （１６）測定対象物質に対する抗体が、モノクローナル
   抗体である請求項１５に記載の測定法。 （１７）測定対象物質に対する抗体が、モノクローナル
   抗体由来のＦａｂ又はＦａｂ’である請求項１５に記載
   の測定法。 （１８）標識物質が蛍光性物質、発光性物質、放射性物
   質、酵素、紫外部に吸収を有する物質又はスピンラベル
   化剤としての性質を有する物質である請求項１３に記載
   の測定方法。 （１９）標識複合体と、遊離型の標識測定物質との分離
   を、ゲル濾過（ゲルクロマトグラフィ）用充填剤、イオ
   ン交換クロマトグラフィ用充填剤、疎水クロマトグラフ
   ィ用充填剤、等電点クロマトグラフィ用充填剤、逆相ク
   ロマトグラフィ用充填剤又はハイドロキシアパタイトを
   充填したカラムを装着した高速液体クロマトグラフィに
   より行う請求項１３に記載の測定方法。