JPS63222257A - 多抗原同時測定用免疫センサ− - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は多抗原同時測定用免疫センサーに関する。更に
詳しくは、少なくとも２本以上の酸素電極に、夫々抗体
を包括固定化したフィブロインフィルムを装着し、これ
らを一つの反応セル中に配置することを特徴とする多抗
原同時測定用免疫センサーに関する。

（従来の技術〕 抗原抗体反応の高い特異性を利用して検体中に含まれる
特定の抗原あるいは抗体を検出、定量し、疾病等の診断
あるいは治療に役立たせることは広く行われている。特
に、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）やエンザイムイム
ノアッセイ（ＥＩＡ）は臨床検査における微量分析手法
として、その有用性は益々高まって来ている。

ＥＩＡに於いては、一般に測定対象の抗原（あるいは抗
体）に対応する抗体（あるいは抗原）を予め適当な不溶
性担体に化学結合法、吸着法、又は包括法等によって固
定化しておき、この固定化抗体（あるいは抗原）に測定
対象の抗原（あるいは抗体）を反応させる固相法が用い
られている。

ところで最近との固相法の応用として、抗体又は抗原を
固定化した膜（フィルム）を酸素電極に装着したＥＩＡ
用の免疫センサーが、感度や取り扱いの容易さ等の点で
優れていることから注目されている。

また、例えばガン診断を始めとする成人病等の診断に於
いては、血清中の複数の微量成分の分析によって総合的
に判断して診断を下すことが好ましいが、従来の免疫セ
ンサーでは被検試料中の種々の異種成分を測定するため
には、個々の成分を夫々側々に測定しなければならず、
多数の被検試料、測定試薬を必要とし、煩雑な手間と時
間を要している。

〔発明が解決しようとする問題点〕

ＥＩＡに於いて、一つの被検試料中の複数の抗原を同時
に測定することができ、且つ測定毎に固定化抗体膜を交
換せずに繰り返し測定に使用することができる、再現性
に優れた多抗原同時測定用免疫センサーについて種々検
討を加えた。

（問題点を解決するための手段） 本発明者等は上記の点に鑑み種々検討した結果、抗体を
包括固定化したフィブロインフィルムを酸素電極に装着
した免疫センサーを少なくとも２個以上一つの反応セル
中に配置することを特徴とする多抗原同時測定用免疫セ
ンサーが上記の目的に適うことを見出して本発明を完成
した。

本発明の多抗原同時測定用免疫センサーは、抗体を包括
固定化したフィブロインフィルム（抗体固定化膜）をガ
ルバニ−型、ポーラログラフイー型等の酸素電極の酸素
透過膜の外側に装着して作成した免疫センサーを、一つ
の反応セル中に少なくとも２個以上配置して得られる（
第１図参照）。

一つの反応セル中に配置される免疫センサーの数は、個
々の電極で発生する酸素又は酸素の減少が互いに影響し
あうことがなく、且つ構造上杵される範囲内であれば良
いが、その数が増加すると反応セルの内容積を大きくし
なければならないため通常２〜６本程度が好ましく、更
に数多くの抗原を測定する場合には、その数の免疫セン
サーを配置した反応セルを直列に接続すれば良い。

また、測定の際に各電極近傍で発生する酸素の増加又は
減少が反応セル中を拡散して他の電極に影響を及ぼさな
いために、通常各免疫センサーは夫々６〜８ｍｍ程度離
して配置することが好ましい。

本発明の多抗原同時測定用免疫センサーは、例えば、免
疫反応液、酵素基質液あるいは洗浄液を順次反応セル中
に導入するフロ一式で測定に使用される（第２図参照）
。

本発明の多抗原同時測定用免疫センサーに用いられる抗
体を包括固定化したフィブロインフィルムは、特開昭６
０−１４２２５９号公報又は特開昭６０−１５５１２９
号公報に記載の方法によって製造することができる。

本発明の多抗原同時測定用免疫センサーが測定対象とす
る被検試料はＥＩＡで測定できる任意の抗原を含む試料
であり、この様な抗原としては、例えば、インシュリン
、絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）　、胎盤ラクトーゲ
ン、黄体形成ホルモン、ＩｇＧ、ＩｇＡ、　ＩｇＭ、　
ＩｇＥ、α−フェトプロティン（ＡＦＰ）、カルシノエ
ンプリオニックアンチゲン（ＣＥＡ）　、塩基性フェト
プロティン（ＲＦＰ）、Ｂ２−マイクログロブリン、向
側腎皮質ホルモン（ＡＣＴＨ）、アルカリフォスファタ
ーゼ（ＡＬＰ）、アミラーゼ等が挙げられる。

上記抗原を測定する際には、夫々に対応する抗体を包括
固定化したフィブロインフィルムが用いられる。

姑１７　　五ン談断１７訟ｂ）て１士　彷１１テｌヂＡ
ＦＩ）　ＣＩ’ＡＲＦＰ、　Ｂ、−マイクログロブリン
、ｈ（：ＧＳＡＣＴ）Ｉ、　ＡＩＰ、アミラーゼ等のガ
ンマ−カーの中からガンの種類に応じて複数個のマーカ
ーを測定することが好ましく、これらマーカーに対応す
る抗体を包括固定化したフィブロインフィルムが用いら
れる。

測定はサンドイツチ法によって行うことが好ましい。

標識酵素としては、例えば、グルコースオキシダーゼや
カタラーゼを使用することができるが、なかでも酵素活
性が高く安定な酵素であるカタラーゼが特に好ましい。

カタラーゼを標識酵素として利用するには、カタラーゼ
と抗体とを予め結合させる必要がある。

従来行われてきたグルタルアルデヒドによる架橋法は、
カタラーゼと抗体との結合が進行し過ぎ高分子量化して
生成物が沈澱する、酵素活性や抗体活性を低下させる、
あるいは低収率で再現性が悪い等の欠点を有するため、
以下の様にして製造したカタラーゼ標識抗体を使用する
ことが好ましい。

即ち、上記カタラーゼ標識抗体は、カタラーゼに一般式
（Ｉ）　　　　　　　ＮＨ Ｒ３−（ＣＨｚ）ｎ−Ｃ−ＯＲ”　　　　　　（Ｉ　）
（式中、Ｒ１は０１〜Ｃ３のアルキル基を表わし、ｎは
２〜４の整数を表わす。） で示されるメルカプトイミデート化合物を反応させ、　
　　　ＮＨ ）ｆＳ−（ＣＨｚ）ｎ−〇−（ｎは前記に同じ。）をカ
タラーゼのアミノ基に導入してチオール化カタラーゼを
得、一方、抗体に一般式（ＩＩ） （式中、Ｒ２は脂肪族炭化水素又は芳香族炭化水素の二
価残基を表わす。） で示されるスクシニルマレイミド化合物を反応させ、 アミノ基に導入したマレイミド化抗体を得、次いで、チ
オール化カタラーゼとマレイミド化抗体とを反応させ、 （ｎ、Ｒ２は前記に同じ。）でカタラーゼと抗体とを結
合させることによって製造することができる。

上記チオール化カタラーゼは、カタラーゼとメルカプト
イミデート化合物（Ｉ）とを、窒素、アルゴン等の不活
性ガス雰囲気下、又は、エチレンジアミン四酢酸又はそ
の塩の存在下に、弱アルカリ性の緩衝液、例えば、０．
０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）中でｏ’ｃ〜４０°
Ｃで０．５〜２０時間反応させることによって得られる
。

カタラーゼに導入されるチオール基は、カタラ−ゼ標識
抗体たり２〜６分子が好ましく、そのためカタラーゼに
対するメルカプトイミデート化合物（Ｉ）のモル比は、
１：１０〜１：５００が好ましく、又カタラーゼの濃度
は０．０１〜１　ｍＭが好ましい。

メルカプトイミデート化合物（Ｉ）としては、例えば、
メチル４−メルカプトブチルイミデート、メチル３−メ
ルカプトプロピオイミデート等が挙げられる。

エチレンジアミン四酢酸又はその塩の添加量は１０−’
　Ｍ〜１０−２Ｍが好ましい。エチレンジアミン四酢酸
の塩としてはその２ナトリウム塩が好ましい。

カタラーゼは動植物由来のいずれでもよいが、動物、特
にその肝臓由来のものが好ましい。

この様にして得られるチオール化カタラーゼは、透析、
ゲルクロマトグラフィー、限外濾過によって精製するこ
とができるが、特に、限外濾過が好ましい。

チオール化カタラーゼは不活性ガス雰囲気下、あるいは
エチレンジアミン四酢酸又はその塩を１０−’　Ｍ〜１
０−２Ｍ含有する中性の緩衝液中で保存することが好ま
しい。

前記マレイミド化抗体は、前記測定対象の抗原に対する
抗体とスクシニルマレイミド化合物（ＩＩ）とを、中性
の緩衝液、例えば０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０
）中で０６Ｃ〜４０°Ｃで０．５〜２０時間反応させる
ことによって得られる。

抗体に導入されるマレイミド基は、抗体１分子当たり５
〜２０分子が好ましく、そのため抗体に対するスクシニ
ルマレイミド化合物（ＩＩ）のモル比は、１：５〜１：
３００が好ましく、又抗体の濃度は０．００５〜０．１
　ｍＭが好ましい。

スクシニルマレイミド化合物（ＩＩ）としては、一般式
（ＩＩ）に於けるＲ２がプロピレン、ベンチレン等の脂
肪族炭化水素の二価残基、あるいは１，３−フェニレン
、１，４−フェニレン等の芳香族炭化水素の二価残基で
ある化合物を挙げることができる。

この様にして得られるマレイミド化抗体は、透析、ゲル
クロマトグラフィーによって精製することができる。

カタラーゼ標識抗体は、この様にして得られたチオール
化カタラーゼとマレイミド化抗体とを、窒素、アルゴン
等の不活性ガス雰囲気下、又は、エチレンジアミン四酢
酸又はその塩の存在下に、中性の緩衝液、例えば、０．
０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）中で０℃〜４０°Ｃ
で１〜２０時間反応させることによって製造することが
できる。

チオール化カタラーゼに対するマレイミド化抗体のモル
比は、１：１〜６：１が好ましい。

エチレンジアミン四酢酸又はその塩の添加量は１０−’
　Ｍ〜１０−２Ｍが好ましい。エチレンジアミン四酢酸
の塩としてはその２ナトリウム塩が好ましい。

反応終了後、未反応のマレイミド基、チオール基をブロ
ックすることが、カタラーゼ標識抗体の安定性を向上さ
せる上で好ましい。マレイミド基をブロックするには、
システィン、メルカプトエタノール等のチオール化合物
を、又、チオール基をブロックするにはＮ−エチルマレ
−イミド等のマレイミド化合物あるいは５，５′−ジチ
オビス（２−ニトロ安息香酸）　（ＤＴＮＢ）等が用い
られる。

更に、得られたカタラーゼ標識抗体はゲルクロマトグラ
フィーによって精製することができる。

本発明の多抗原同時測定用免疫センサーを繰り返し使用
するためには、測定後、一旦、固定化抗体膜をｐＨ約２
〜４の緩衝液に浸漬すればよい。

ｐＨ約２〜４の緩衝液としては、例えば夫々濃度０．０
５〜０．２　Ｍのグリシン−塩酸緩衝液又は酒石酸−水
酸化ナトリウム緩衝液が用いられ、この緩衝液に通常１
０〜４０°Ｃで３〜１０分間固定化抗体膜を浸漬するこ
とによって、結合した抗原及び標識抗体を、フィブロイ
ンフィルムに固定化した抗体から容易にその結合能を損
うことなく解離させることができる。

ｐＨが上記範囲を越えると結合が解離しにくくなり、ま
た逆に低くなると固定化抗体が変性し易くなるなど好ま
しくない。

又、上記緩衝液に塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸
ナトリウム等の中性塩を０．５〜１０重量％含有させる
と解離操作を一層容易に行うことができる。

（発明の効果） 本発明の多抗原同時測定用免疫センサーは、以下の試験
結果に示すとおり、一つの被検試料中に含まれる多抗原
を同時に測定することができ、且つ繰り返しＥＩＡに使
用することができる再現性に優れたもので、自動連続測
定装置に適用して多数の被検体の処理を簡便に行うこと
ができる。

試験例１ 実施例１で作成した免疫センサーを用いて、第２図に示
すようなフロ一式の測定装置を組み、第１表に示すよう
なヒトＡＦＰおよびｈＣＧを含む各被検試料について以
下の様にして繰り返し測定しく計１０回）、ヒトＡＦＰ
およびｈＣＧの標準曲線を作Ｆ＃１．ｔ−（ｔｔＬ３Ｖ
ｍｋｒドｍａｒ’；Ａ矢［）−第１表 測定方法： 反応セル（容量０．２ｍｌ　）に蒸留水を満たし、これ
に第１表に示す組み合わせで標準ヒトＡＦＪ各々０．２
．５．５．１０または２０ｎｇ／ｍｌ　、　ｈＣＧ各々
０、０．０２５．０．０５．０．１または０．２　ＩＵ
／ｍｌ、馬血清１０重量％、製造例１で得られたカタラ
ーゼ標識モノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体１μｇ／ｍｌ
および製造例２で得られたカタラーゼ標識モノクローナ
ル抗ｈＣＧ抗体２μｇ／ｍｌを含有する０、１重量％牛
血清アルブミンリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７，２）０
．２　ｍｌを導入し、３０分間静置後、２０ｍ１／ｍｉ
ｎの流速で１分間蒸留水を流して反応セルを洗浄した。

次いで、２６　、５ｍＭの過酸化水素を含む０．０５　
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）　０．２ｍｌを反応セル
に導入し、夫々の酸素電極の酸素濃度に比例した電流値
より発生電位を求めた。続いて、０．１Ｍグリシン−塩
酸緩衝液（ｐＨ２，５，Ｎａ１ｌ　２重量２含有）を２
０ｍ１／ｍｉｎの流速で３０秒間流した後、３．５分間
静置して結合した抗体と抗原とを解離させ、更に２０ｍ
１／ｍｉｎの流速で１分間蒸留水を流して反応セルを洗
浄した。次に、再び上記の標準ＡＦＰ溶液およびｈＣＧ
溶液を反応セルに導入して同様な操作を繰り返してヒト
ＡＦＰおよびｈＣＧの標準曲線を作成した。（なお、操
作は免疫反応は３７°Ｃ１他は室温で行った。）試験例
２ 作成）： 実施例２で作成した免疫センサーを用いて、第２図に示
すようなフロ一式の測定装置を組み、第２表に示すよう
なヒトＡＦＰ　、　ｈＣＧおよびヒトＡＬＰを含む各被
検試料について以下の様にして繰り返し測定しく計８回
）、ヒトＡＦＰ　、　ｈＣＧおよびヒトＡＩＰの標準曲
線を作成した（第５図、第６図および第７図参照）。

第２表 測定方法： 反応セル（容量０．９ｍｌ　）に蒸留水を満たし、これ
に第２表に示す組み合わせで標準ヒトＡＦＰ各々０、１
０．２０または４０ｎｇ／ｍｌ　、ｈＣＧ各々０．０．
１゜０．２または０．４ＩＵ／ｍｌ、ＡＬＰ各々０．０
．０２５，０．０５または０．１１Ｕ／ｍｌ、馬血清１
０重量％、製造例１で得られたカタラーゼ標識モノクロ
ーナル抗ヒトＡＦＰ抗体１μｇ／ｍｌ　、製造例２で得
られたカタラーゼ標識モノクローナル抗ｈＣＧ抗体２μ
ｇ／ｍｌおよび製造例３で得られたカタラーゼ標識ポリ
クローナル抗ＡＩＰ抗体２μｇ／ｍｌを含有する０、１
重量％牛血清アルブミンリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７
，２）　１．０　ｍｌを導入し、１５分間静置後、試験
例１と同様に反応セルの洗浄、酵素反応および抗原−抗
体の解離反応を順次行い、再び、上記の標準ＡＦＰ溶液
、ｈＣＧ溶液およびＡＩＰ溶液を反応セルに導入する操
作を繰り返してヒトＡＦＰ、　Ｍ：ＧおよびヒトＡＩＰ
の標準曲線を作成した。（なお、操作は免疫反応は３７
℃、他は室温で行った。） （実施例）　以下に実施例および製造例を挙げて、本発
明を更に具体的に説明する。

製造例１ カタラーゼ標識モノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体の製造
： （１）チオール化カタラーゼの製造： カタラーゼ（牛肝臓由来、シグマ社製）　１５ｍｇを０
．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）２．５ｍｌに溶解
し、窒素曝気（６０ｍｌ／ｍ１ｎ）を１０分間行い、次
に、メチル４−メルカプトブチルイミデート１ｍｇを加
え、窒素雰囲気下に４°Ｃで２時間反応させた。反応終
了後、ダイアフローメンブラン■（アミコン社製）を用
いて窒素雰囲気下に限外濾過し、０．０５Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７，０）３ｍｌを加え、再度限外濾過を行った
。この操作を３回繰り返し、未反応のメチル４−メルカ
プトブチルイミデートを除去した後、チオール化カタラ
ーゼ溶液３ｍｌを得た。

以下の方法によって求めたチオール基の導入量は、カタ
ラーゼ１分子に対して４分子であった。

チオール基の定量： チオール化カタラーゼ１ｍｌ（５ｍｇ）にＤＴＮＢ　１
ｍｇを加えて１時間反応後、限外濾過によって、未反応
のＤＴＮＢ等の低分子化合物を除去した。

２ｍｌの蒸留水を加え、ジチオスレトール又は２−メル
カプトエタノールで還元し、５−メルカプト−２−二ト
ロ安息香酸を遊離させ、５０％トリクロロ酢酸を０．０
５ｍ１加えて静置後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５
分間）により沈澱物を除去した。ＩＮ　ＮａＯＨ’？？
ｐＨ８にした後、全量を５ｍｌとして４１２ｎｍの吸光
度よりＭ離した５−メルカプト−２−二トロ安息香酸の
量を求め、カタラーゼへのチオール基導入量を算出した
。

（２）マレイミド化モノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体の
製造： モノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体（免疫動物；マウス、
但し、実施例１（２）で用いたモノクローナル抗体とは
認識部位の異なるもの。）　１０ｍｇを０．０５Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）５．０ｍｌに溶解し、Ｎ−（ｒ
−マレイミドブチロキシ）スクシンイミド（ＧＭＢＳ）
０．５ｍｇをジオキサン０．５ｍｌに溶解して加えた。

４℃で２時間反応させた後、０．０５Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ７，０）　１０１００Ｏで透析（２時間）を２回行
ってマレイミド化モノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体溶液
６ｍｌを得た。

以下の方法によって求めたマレイミド基の導入量は、抗
体１分子に対して１０分子であった。

マレイミド基の定量： マレイミド化抗体０．５ｍｇを０．０５Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）で全量を１ｍｌとした後、１３．４ｍＭ
のシスティン１０μＱ及び０．１Ｍ　ＥＤＴＡ溶液１０
μＱをを加え、窒素雰囲気下３７°Ｃで３０分間反応さ
せる。０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）　１ｍｌ
を加えた後、０．６７ｍＭ　ＤＴＮＢ溶液０．２ｍｌを
加え、未反応のシスティンを、５−メルカプト−２−二
トロ安息香酸の４１２ｎｍの吸光度を測定することによ
って定量し、消費されたシスティンの量を求め、抗体１
分子当たりの消費されたシスティンの量から導入された
マレイミド基の量を求めた。

（３）カタラーゼ標識モノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体
の製造： 上記チオール化カタラーゼ溶液２ｍｌ　（１０ｍｇ）と
マレイミド化モノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体溶液３ｍ
ｌ（５ｍｇ）とを窒素雰囲気下で混合し、４°Ｃで１６
時間反応させた。未反応のマレイミド基をブロックする
ためシスティン１ｍｇを加え、４°Ｃで３０分間反応さ
せた後、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）１００
０　ｍｌで透析（２時間）を行った。更に、未反応のチ
オール基をブロックするためＮ−エチルマレイミド１ｍ
ｇを加え、４°Ｃで３０分間反応させた後、０．０５Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）１０００　ｍｌで透析（２
時間）を行った。次いで、遠心分＄１　（１２０００ｒ
ｐｍ、５分間）により、沈″＃物を除去した後、高速液
体カラムクロマトグラフィー（カラム；　５ｅｐｈａｄ
ｅｘ　Ｇ−３０００ＳＷ（東洋ソーダ社製）、溶出液；
　０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）　）に付し、
最初の画分を集めカタラーゼ標識モノクローナル抗ヒト
ＡＦＰ抗体溶液１２ｍ１を得た。

製造例２ カタラーゼ標識モノクローナル抗ｈＣＧ抗体の製造： 製造例１のモノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体の代わりに
モノクローナル抗ｈＣＧ抗体（免疫動物；マウス）を用
いる以外は製造例１と同様にしてカタラーゼ標識モノク
ローナル抗ｈＣＧ抗体溶液１２ｍ１を得た。

製造例３ カタラーゼ標識ポリクローナル抗ＡＩＰ抗体の製造： 製造例１のモノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体の代わりに
ポリクローナル抗ＡＩＰ抗体（免疫動物；家兎）を用い
る以外は製造例１と同様にしてカタラーゼ標識ポリクロ
ーナル抗ＡＩＰ抗体溶液１２ｍ１を得た。

実施例１ ヒトＡＦＰおよびｈＣＧ同時測定用免疫センサーの作成
： （１）フィブロイン水溶液の調製： 生糸１００ｇを１．０重量％のマルセル石けん水溶液５
０００ｍｌ中に浸漬し、８０°Ｃで３時間精練した。水
洗後、更に０．５重量％のマルセル石けん水溶液５００
０ｍｌに浸漬して８０°Ｃで３時間精練し、セリシン等
を実質的に除去したフィブロイン原料７２ｇを得た。

水１００ｇとエチルアルコール８０ｇの入ったニーダ−
中に塩化カルシウム１５０ｇを溶解し、７５°Ｃに昇温
後、上記のフィブロイン原料７０ｇを投入、攪拌下に１
時間溶解した。次いで１８０ｇの温水（７５°Ｃ）を加
えて希釈混合した。フィブロインの溶解液を冷却した後
、ホローファイバー型の透析器を用いて、流水に対して
透析脱塩し、５．７重量％のフィブロイン水溶液１２０
０ｍ１を得た。塩化カルシウムの残留量は０．０８重量
％であった。

（２）モノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体固定化フィブロ
インフィルムの製造： モノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体（免疫動物：マウス）
を生理食塩液に溶解し、２５０７ｚｇ／ｍｌの抗体溶液
を調製した。次にこの溶液を四方を仕切ったガラス板上
に抗体量が１０戸ｇ／ｃｍ”となるように流延し、１５
°Ｃで３時間乾燥した。上記フィブロイン水溶液にグリ
セリンをフィブロインに対して３０重量％になるように
加えた溶液をその上から流延し、２０°Ｃで１０時間乾
燥することによって皮膜化させ、次いで直径０．８ｃｍ
の円形に裁断し、厚さ６０戸の表記モノクローナル抗ヒ
トＡＦＰ抗体固定化フィブロインフィルムを得た。

（３）ポリクローナル抗ｈＣＧ抗体固定化フィブロイン
フィルムの製造（特開昭６０−１５５１２９号公報参照
）： ポリクローナル抗ｈｃＧ抗体（免疫動物；ヤギ）を生理
食塩液に溶解し、２５０ｇｇ／ｍｌの抗体溶液を調製し
た。次にこの溶液を、四方を仕切ったガラス板上に抗体
量が１０戸ｇ／ａｍ２となるように塗布し、２０°Ｃで
３時間乾燥した。次いで実施例１（１）と同様にして得
たフィブロイン水溶液を濃縮して１５．７重量％のフィ
ブロイン水溶液とし、更にグリセリンをフィブロインに
対して３０重量％になるように加えた溶液をその上から
流延し、２０°Ｃで８時間乾燥することによって皮膜化
させ、次いで直径０．８ｃｍの円形に裁断し、厚さ６０
ｇ１ｌｌのポリクローナル抗ｈＣＧ抗体固定化フィブロ
インフィルムを得た。

（４）ヒトＡＦＰおよびｈＣＧ同時測定用免疫センサー
の作成： 上記（２）で得られた抗ヒトＡＦＰ抗体固定化フィブロ
インフィルムをガルバニ−型酸素電極（ＡＮ型、オリエ
ンタル電気株製）に装着した免疫センサー（Ａ）と上記
（３）で得られた抗ｈＣＧ抗体固定化フィブロインフィ
ルムをガルバニ−型酸素電極（ＡＮ型、オリエンタル電
気林製）に装着した免疫センサー（Ｂ）とを、一つの反
応セルに第１図に示すように配置してヒトＡＦＰおよび
ｈＣＧ同時測定用免疫センサーを作成した。

実施例２ ヒトＡＦＰ　、　ｈＣＧおよびヒトＡＩＰ同時測　用免
疫センサーの作成： （１）ポリクローナル抗ＡＩＰ抗体固定化フィブロイン
フィルムの製造： ポリクローナル抗ＡＬＰ抗体（免疫動物；家兎）を生理
食塩液に溶解し、２５０ｇｇ／ｍｌの抗体溶液を調製し
た。次にこの溶液を、四方を仕切ったガラス板上に抗体
量が１０戸ｇ／ｃｍ２となるように塗布１、９ｎＯｒ”
１２ｒｍ間ｋＪａ１．ｒ−ｙセＩ、ｚＹ’Ｍ＊にイ５ｄ
Ｒ１））同様にして得たフィブロイン水溶液を濃縮して
１５．７重量％のフィブロイン水溶液とし、更にグリセ
リンをフィブロインに対して３０重量％になるように加
えた溶液をその上から流延し、２０°Ｃで８時間乾燥す
ることによって皮膜化させ、次いで直径０．８ｃｍの円
形に裁断し、厚さ６０７ｍのポリクローナル抗ＡＩＰ抗
体固定化フィブロインフィルムを得た。

（２）ヒトＡＦＰ　、　ｈＣＧおよびヒトＡＩＰ同時測
定用免疫センサーの作成： 実施例１（２）で得られた抗ヒトＡＦＰ抗体固定化フィ
ブロインフィルムをガルバニ−型酸素電極（ＡＮ型、オ
リエンタル電気■製）に装着した免疫センサー（Ａ）と
実施例１（３）で得られた抗ｈＣＧ抗体固定化フィブロ
インフィルムをガルバニ−型酸素電極（ＡＮ型、オリエ
ンタル電気林製）に装着した免疫センサー（Ｂ）と上記
抗ＡＩＰ抗体固定化フィブロインフィルムをガルバニ−
型酸素電極（ＡＮ型、オリエンタル電気■製）に装着し
た免疫センサー（Ｃ）とを、各免疫センサー（Ａ）、（
Ｂ）、（Ｃ）がＴ字型になるように一つの反応セルに配
置してヒトＡＦＰ　、ｈＣＧおよびヒトＡＩＰ同時測定
用免疫センサーを作成した。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で作成した免疫センサーの概略図を表
わす。 第２図は試験例１および２で用いたフロ一式の測定装置
の概略図を表わす。 第３図および第４図は、夫々、試験例１のヒトＡＦＰお
よびｈＣＧの標準曲線を表わす。 第５図、第６図および第７図は、夫々、試験例２のヒト
ＡＦＰ　、　ｈＣＧおよびヒトＡＩＰの標準曲線を表わ
す。 第１図 第２図 酵素基質溶液 第３図 ヒトＡＦＰ（ｎ９／ｍｌ） 第４図 ｈＣＧ（ＩＵ／ｍｌ） 第５図 ヒトＡＦＰ（ｎｃ＋／ｍｌ） 第６図 ０　　０．１　　０，２　　０．３　　０．４ｈＣＧ（
ＩＵ／ｍｌ） 第７図 ヒトＡＬＰ（ＩＵ／ｍｌ）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 少なくとも２本以上の酸素電極に、夫々抗体を包括固定
   化したフィブロインフィルムを装着し、これらを一つの
   反応セル中に配置することを特徴とする多抗原同時測定
   用免疫センサー。