JPS63101754A - カタラ−ゼ標識抗体の製造法 - Google Patents

カタラ−ゼ標識抗体の製造法

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JPS63101754A
JPS63101754A JP61247947A JP24794786A JPS63101754A JP S63101754 A JPS63101754 A JP S63101754A JP 61247947 A JP61247947 A JP 61247947A JP 24794786 A JP24794786 A JP 24794786A JP S63101754 A JPS63101754 A JP S63101754A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) 本発明は、エンザイムイムノアッセイ用のカタラーゼ標
識抗体の製造法に関する。
(従来の技術) 抗原抗体反応の高い特異性を利用して検体中に含まれる
特定の抗原あるいは抗体を検出、定量し、疾病等の診断
あるいは治療に役立たせることは広く行われている。な
かでもエンザイムイムノアッセイ(EIA)は簡便さ、
安全性の面からラジオイムノアッセイ(RIA)に代わ
って、臨床検査における微量分析手法として、その有用
性は益々高まって来ている。
EIAに於いては、測定対象の抗原あるいは抗体を検出
するため酵素で標識した抗体(酵素標識抗体)が用いら
れる。
EIAに於ける標識酵素としては、安定で高い活性を有
するとともに、標識反応時に失活しないものが好ましく
、従来、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、
β−D−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等
が用いられている。
これらの酵素を用いた場合、その活性の検出は、基質、
又は生成物の可視、紫外の吸収スペクトルあるいは蛍光
スペクトルの変化を測定する方法が用いられている。
ところで、カタラーゼは酵素活性が高く安定な酵素であ
り標識酵素として適している。更に、カタラーゼは過酸
化水素を分解し酸素を発生させるので、酵素活性を酸素
電極で直接電気的信号として捕えることができる。そこ
でカタラーゼを標識酵素とし、酸素電極を検出器とする
、免疫センサーが種々検討されている。
〔発明が解決しようとする問題点〕
カタラーゼを標識抗体として利用するには、カタラーゼ
と特定の抗体とを予め結合させる必要がある。従来性わ
れてきたグルタルアルデヒドによる架橋法では、カタラ
ーゼと抗体との結合が進行しすぎ高分子量化して生成物
が沈澱する、酵素活性や抗体活性を低下させる、あるい
は、低収率で再現性が悪いといった欠点があり改善が望
まれていた。
(問題点を解決するための手段) 本発明者等は種々検討した結果、 カタラーゼに一般式(I) H (式中、R1はC工〜C3のアルキル基を表わし、nは
2〜4の整数を表わす。) で示されるメルカプトイミデート化合物を反応させ、 “11“。
R3(CH2)n−C−(nは前記に同じ。)をカタラ
ーゼのアミノ基に導入する第1工程と、 抗体に一般式(II) (式中、R2は脂肪族炭化水素又は芳香族炭化水素の二
価残基を表わす。) で示されるスクシニルマレイミド化合物を反応させ、 アミノ基に導入する第2工程と、 第1工程で得られるチオール化カタラーゼと第2工程で
得られるマレイミド化抗体とを反応させ、 (n、R2は前記に同じ。)でカタラーゼと抗体とを結
合させる第3工程とからなることを特徴とするカタラー
ゼ標識抗体の製造法によって前記欠点が改良出来ること
を見出して、本発明を完成した。
本発明の第1工程、第2工程及び第3工程は、夫々以下
のようにして行うことができる。
即ち、第1工程は、カタラーゼとメルカプトイミデート
化合物(I)とを、窒素9、アルゴン等の不活性ガス雰
囲気下、又はエチレンジアミン四酢酸又はその塩の存在
下に、弱アルカリ性の緩衝液、例えば、0.05Mリン
酸緩衝液(pH8,0)中で0°C〜40°Cで0.5
〜20時間反応させる。
カタラーゼに導入されるチオール基は、カタラ−ゼ標識
抗体たり2〜6分子が好ましく、そのためカタラーゼに
対するメルカプトイミデート化合物(I)のモル比は、
1:10〜1 : 500が好ましく、又、カタラーゼ
の濃度は0.01〜1 mMが好ましい。
メルカプトイミデート化合物(I)としては、例えば、
メチル4−メルカプトブチルイミデート、メチル3−メ
ルカプトプロピオイミデート等が挙げられる。
エチレンジアミン四酢酸又はその塩の添加量は10″″
4M〜10−” Mが好ましい。エチレンジアミン四酢
酸の塩としてはその2ナトリウム塩が好ましい。
カタラーゼは動植物由来のいずれでもよいが、動物、特
にその肝臓由来のものが好ましい。
このようにして得られるチオール化カタラーゼは、透析
、ゲルクロマトグラフィー、限外濾過によって精製する
ことができるが、特に、限外濾過が好ましい。
チオール化カタラーゼは不活性ガス雪囲気下、あるいは
エチレンジアミン四酢酸又はその塩を10−’ M〜1
0−2M含有する中性の緩衝液中で保存することが好ま
しい。
第2工程は、後述する抗体とスクシニルマレイミド化合
物(II)とを、中性の緩衝液、例えば0゜05Mリン
酸緩衝液(pH7,0)中で0℃〜40°Cで0.5〜
20時間反応させる。
抗体に導入されるマレイミド基は、抗体1分子当たり5
〜20分子が好ましく、そのため抗体に対するスクシニ
ルマレイミド化合物(II)のモル比は、1:5〜1:
300が好ましく、又、抗体の濃度は0.005〜0.
1 mMが好ましい。
スクシニルマレイミド化合物(II)としては、一般式
(II)に於けるR2がプロピレン、ベンチレン等の脂
肪族炭化水素の二価残基、あるいは1,3−フェニレン
、1,4−フェニレン等の芳香族炭化水素の二価残基で
ある化合物を挙げることができる。
このようにして得られるマレイミド化抗体は、透析、ゲ
ルクロマトグラフィーによって精製することができる。
本発明に用いられる抗体としては、例えば以下のような
ものが具体例として挙げられる。
■インシュリン、絨毛性ゴナドトロピン(hCG)、胎
盤性ラクトゲン、黄体形成ホルモンなどのポリペプチド
系ホルモンの抗体。
■IgG、 IgA 、 IgM 、 IgE、α−フ
ェトプロティン(AFP) 、カルシノエンプリオニッ
クアンチゲン、ハプトグロビンなどの血清蛋白の抗体。
■大腸菌毒素、コレラトキシン、肝炎ウィルス、風疹ウ
ィルス、インフルエンザウィルスなどの毒素あるいはウ
ィルスの抗体。
■エストラジオール、プロゲステロン、テストステロン
、フェニトイン、プロカインアミド、カナマイシン、ペ
ニシリン、バルビッール酸などのステロイドホルモンあ
るいは薬剤の抗体。
これらの抗体の種類は、 IgG、 IgA 、 Ig
M等のクラスいずれをも使用することができる。
又、マウス、ラット、ウサギ、ヤギあるいはヒト等から
常法によって採取した抗体を使用すること、ができるが
、特に細胞融合法によって採取したモノクローナル抗体
の使用が均質な抗体が得られ、感度、精度の点て好まし
い。
なお、通常使用する抗体はいずれも常法によって例えば
、硫安塩析またはDEAEイオン交換カラムクロマトグ
ラフィー等で精製して用いられる。
第3工程は、第1工程で得られるチオール化カタラーゼ
と、第2工程で得られるマレイミド化抗体とを、窒素、
アルゴン等の不活性ガス雪囲気下、又はエチレンジアミ
ン四酢酸又はその塩の存在下に、中性の緩衝液、例えば
、0.05Mリン酸緩衝液(pH7,0)中で0℃〜4
0℃で1〜20時間反応させる。
チオール化カタラーゼに対するマレイミド化抗体のモル
比は、1:1〜6:1が好ましい。
エチレンジアミン四酢酸又はその塩の添加量は10−’
 M〜10′″2Mが好ましい。エチレンジアミン四酢
酸の塩としてはその2ナトリウム塩が好ましい。
反応終了後、未反応のマレイミド基、チオール基をブロ
ックすることが、カタラーゼ標識抗体の安定性を向上さ
せる上で好ましい。マレイミド基をブロックするには、
システィン、メルカプトエタノール等のチオール化合物
を、又、チオール基をブロックするにはN−エチルマレ
イミド等のマレイミド化合物あるいは5.5′−ジチオ
ビス(2−ニトロ安息香酸) (DTNB)等が用いら
れる。
更に、得られたカタラーゼ標識抗体はゲルクロマトグラ
フィーによって精製することができる。
第1工程、第2工程及び第3工程を上記のようにして行
うことにより、高い酵素活性を有するカタラーゼ標識抗
体を再現性よく、しかも高収率で製造することができる
(発明の効果) 本発明によって得られるカタラーゼ標識抗体は、以下の
試験結果に示すとおり、高い酵素活性を有しており(試
験例1)、EIAに於いて、感度、精度に優れた標識抗
体として使用でき、特に免疫センサーを用いるEIAの
標識抗体として好適に使用することができる(試験例2
.3)。
試験例1 カタラーゼ標識モノクローナル抗ヒトAFP抗体の評価
: (1)検体 本発明によって製造されたカタラーゼ標識モノクローナ
ル抗ヒトAFP抗体(実施例1 (a)〜(e)及び実
施例2 (a) 、 (b)の7検体)及びグルタルア
ルデヒド法によって製造された該標識抗体(比較例1 
(a)〜(g)(製造例1)の7検体)。
(2)試験方法 モノクローナル抗ヒトAFP抗体(カタラーゼの標識に
用いた抗体とはヒトAFPに対して結合部位の異なるも
の、AFP−1) 5kg/mlを調製し、その0.5
mlを内径0.8mmのポリスチレン試験管に入れ、4
°Cで16時間静置して内壁に抗体を吸着固定化した。
次に、蒸留水で洗浄後、0.5%の牛血清アルブミンを
含有する0、OIMリン酸緩衝生理食塩液(pH7,2
) 1mlを加えて、2時間静置後、以下の試験に使用
した。
標準ヒトAFPを0又は40ng/ml、馬血清10重
量%及び該標識抗体(上記各検体)1μg/mlを含有
する0、01Mリン酸緩衝生理食塩液(pH7,2) 
0.5mlを、上記AFP−1固定化ポリスチレン試験
管に入れ、37°Cで2時間免疫反応を行った。蒸留水
1mlで3回洗浄後、0.02M過酸化水素の0.1M
リン酸緩衝液(pH7,0)0.5mlを加え、20分
間酵素反応を行った後、IN硫酸1mlを加えて反応を
停止させ、過酸化水素に基ず< 240nmの吸光度(
A24゜)を測定した。
本発明によりて製造されたカタラーゼ標識モノクローナ
ル抗ヒトAFP抗体とグルタルアルデヒド法によって製
造された該標識抗体との標識酵素活性を、過酸化水素の
減少量〔標準ヒトAFP O(ブランク)と40ng/
mlとの吸光度の差(△A240 ) )から比較した
(3)結果 結果を第1表に示した。
(以→白) 第1表 試験例2 ヒトAFPの繰 返し測 試験(ヒトAFPの標準曲線
の作成): 製造例2で作成した免疫センサーを用い、第2図に示す
ようなフロ一式の測定装置を組み、標準ヒトAFP O
,2,5,5,20ng/mlの各濃度夫々について4
回ずつ以下のようにして繰り返し測定し、ヒトAFPの
標準曲線を作成した。
反応セル(容量0.2ml )に蒸留水を満たし、これ
に標準ヒトAFP各々0.2.5.5.20ng/ml
、馬血清10重量%及び実施例1(a)で得られたカタ
ラーゼ標識モノクローナル抗ヒトAFP抗体1μg/m
lを含有する0、1重量%牛血清アルブミン生理食塩液
0.2mlを導入し、30分間静置後、20m1/mi
nの流速で1分間蒸留水を流して反応セルを洗浄した。
次いで、26.5mMの過酸化水素を含む0.1Mリン
酸緩衝液(pH7,0)0.2mlを反応セルに導入し
、酸素電極の酸素濃度に比例した電流値を求めた。続い
て0.1Mグリシン−塩酸緩衝液(pH2,5,Na1
l 2重量%含有)を20m1/minの流速で30秒
間流した後、3.5分間静置して結合した抗体と抗原と
を解離させ、更に20m1/minの流速で1分間蒸留
水を流して反応セルを洗浄した。次に、再び上記の標準
AFP溶液を反応セルに導入して同様な操作を各濃度夫
々4回ずつ繰り返してヒトAFPの標準曲線(第3図)
を作成した。(なお、操作は免疫反応は37℃、他は室
温で行った。) 試験例3 hCGの繰り返し測 試験(hCGの標準曲線の作成)
: 製造例3で作成した免疫センサーを用い、第2図に示す
ようなフロ一式の測定装置を組み、標準ヒトAFPの代
わりにhCG及び実施例3で得られたカタラーゼ標識モ
ノクローナル抗hCG抗体を用いる以外は試験例2と同
様にして、hCG 0.25゜50、100.200 
mlU/mlの各濃度夫々について4回ずつ繰り返し測
定してhCGの標準曲線(第4図)を作成した。
(実施例) 以下に実施例および製造例を挙げて、本発明を更に具体
的に説明する。
なお、カタラーゼ標識抗体の収率は、夫々反応に使用し
た抗体量(mol)と得られた標識抗体の抗体量(mo
l)との比から算出し、実施例の末尾に一括して記載し
た(第2表)。該標識抗体の抗体量(mol)は、次式
により算出した該標識抗体の抗体濃度(LA (mol
/1) )から求めた。
LA(mol/1) =(A280(標識抗体溶液)−
fL A405(標識抗体溶液)X□(カタラーゼ)〕C:抗
体のモル吸光係数 文:測定光路長 製造例1〔比較例1(a)〜(g)〕 以下の操作を7回繰り返し行って、夫々比較例1(a)
〜(g)のカタラーゼ標識モノクローナル抗ヒトAFP
抗体を得た。
カタラーゼ(牛肝臓由来、シグマ社製)3mgを0゜0
5Mリン酸緩衝液(pH7,0) 1mlに溶解し、5
%グルタルアルデヒド水溶液15μQを加え4°Cて3
0分間反応後、モノクローナル抗ヒトAFP抗体(免疫
動物;マウス) 1mgを加え4°Cで30分間反応さ
せた。水素化ホウ素ナトリウム1mgを加え4°Cて2
0分間反応させた後、0.05Mリン酸緩衝液(pH7
,0)1000mlで透析(2時間)を2回行った。次
いで、遠心分離(12000rpm、5分間)により、
沈澱物を除去した後、高速液体カラムクロマトグラフィ
ー(カラム; 5ephadex G−3000SW(
東洋ソーダ社製)、溶出液;0.05Mリン酸緩衝液(
pH7,0) )に付し、最初の画分を集めカタラーゼ
標識モノクローナル抗ヒトAFP抗体溶液2.4mlを
得た。
製造例2 ヒトAFP測 用免 センサーの作成:(1)フィブロ
イン水溶液の調製: 生糸100gを1.0重量%のマルセル石けん水溶液5
000ml中に浸漬し、80°Cで3時間精練した。水
洗後、更に0.5重量%のマルセル石けん水溶液500
0mlに浸漬して80℃で3時間精練し、セリシン等を
実質的に除去したフィブロイン原料72gを得た。
水100gとエチルアルコール80gの入ったニーダ−
中に塩化カルシウム150gを溶解し、75°Cに昇温
後、上記のフィブロイン原料70gを投入、攪拌下に1
時間溶解した。次いで180gの温水(75°C)を加
えて希釈混合した。ブイプロインの溶解液を冷却した後
、ホローファイバー型の透析器を用いて、流水に対して
透析脱塩し、5.7重量%のフィブロイン水溶液120
0m1を得た。塩化カルシウムの残留量は0.08重量
%であった。
(2)モノクローナル抗ヒトAFP抗体固定化フィブロ
インフィルムの製造: モノクローナル抗ヒトAFP抗体(免疫動物マウス)を
生理食塩液に溶解し、250gg/mlの抗体溶液を調
製した。次にこの溶液を四方を仕切ったガラス板上に抗
体量が10μg/am2となるように流延し、15°C
で3時間乾燥した。上記フィブロイン水溶液にグリセリ
ンをフィブロインに対して30重量%になるように加え
た溶液をその上から流延し、20°Cで10時間乾燥す
ることによって皮膜化させ、次いで直径0.6cmの円
形に裁断し、厚さ60戸の表記モノクローナル抗ヒトA
FP抗体固定化フィブロインフィルムを得た。
(3)ヒトAFP測定用免疫センサーの作成:   ・
第1図に示すように、反応セル(容量0.2m1)に(
2)で得られたモノクローナル抗ヒトAFP抗体固定化
フィブロインフィルム、酸素透過膜、0−リング及びガ
ルバニ−型酸素電極(AN型、オリエンタル電気林製)
を順次装着してヒトAFP測定用免疫センサーを作成し
た。
製造例3 hCG測定用免 センサーの作 : (1)ポリクローナル抗hCG抗体固定化フィブロイン
フィルムの製造(特開昭60−155129号公報参照
): ポリクローナル抗hCG抗体(免疫動物;ヤギ)を生理
食塩液に溶解し、250gg/m 1の抗体溶液を調製
した。次にこの溶液を、四方を仕切りだガラス板上に抗
体量が1kg/am”となるように塗布し、20°Cで
3時間乾燥した。次いで製造例2(1)と同様にして得
たフィブロイン水溶液を濃縮して15.7重量%のフィ
ブロイン水溶液とし、更にグリセリンをフィブロインに
対して30重量%になるように加えた溶液をその上から
流延し、20°Cで8時間乾燥することによって皮膜化
させ、次いで直径0.7cmの円形に裁断し、厚さ90
gmのポリクローナル抗hCG抗体固定化フィブロイン
フィルムを、得た。
(2) hCG測定用免疫センサーの作成:(1)で得
られたポリクローナル抗hCG抗体固定化フィブロイン
フィルムを、製造例2(3)と同様にしてガルバニ−型
酸素電極(AN型、オリエンタル電気■製)に装着して
hCG測定用免疫センサーを作成した。
実施例1(a)〜(e) カタラーゼ標識モノクローナル抗ヒトAFP抗体の製造
: 以下の操作を5回繰り返し行って、夫々実施例1(a)
〜(e)のカタラーゼ標識モノクローナル抗ヒトAFP
抗体を得た。
(1)チオール化カタラーゼの製造(第1工程)二カタ
ラーゼ(牛肝臓由来、シグマ社製) 15mgを0.0
5Mリン酸緩衝液(pH8,0)2.5mlに溶解し、
窒素曝気(60ml/m1n)を10分間行い、次に、
メチル4−メルカプトブチルイミデート1mgを加え、
窒素雰囲気下に4°Cで2時間反応させた。反応終了後
、ダイアフローメンプラン@(アミコン社製)を用いて
窒素フ囲気下に限外濾過し、0.05Mリン酸緩衝液(
pH7,0) 3mlを加え、再度限外濾過を行った。
この操作を3回繰り返し、未反応のメチル4−メルカプ
トブチルイミデートを除去した後、チオール化カタラー
ゼ溶液3mlを得た。
以下の方法によって求めたチオール基の導入量は、カタ
ラーゼ1分子に対して4分子であった。
チオール基の定量: チオール化カタラーゼ1ml(5mg)にDTNB 1
mgを加えて1時間反応後、限外濾過によって、未反応
のDTNB等の低分子化合物を除去した。
2mlの蒸留水を加え、ジチオスレトール又は2−メル
カプトエタノールで還元し、5−メルカプト−2−二ト
ロ安息香酸を遊離させ、50%トリクロロ酢酸を0.0
5m1加えて静置後、遠心分離(12000rpm、5
分間)により沈澱物を除去した。IN NaOH′r!
pH8にした後、全量を5mlとして412nmの吸光
度より遊離した5−メルカプト−2−二トロ安息香酸の
量を求め、カタラーゼへのチオール基導入量を算出した
(2)マレイミド化モノクローナル抗ヒトAFP抗体の
製造(第2工程): モノクローナル抗ヒトAFP抗体10mgを0.05M
リン酸緩衝液(pH7,0)5.0mlに溶解し、N−
(y−マレイミドブチロキシ)スクシンイミド(GMB
S)0.5mgをジオキサン0.5mlに溶解して加え
た。4℃で2時間反応させた後、0.05Mリン酸緩衝
液(pH7,0)1000mlで透析(2時間)を2回
行ってマレイミド化モノクローナル抗ヒトAFP抗体溶
液6mlを得た。
以下の方法によって求めたマレイミド基の導入量は、抗
体1分子に対して10分子であった。
マレイミド基の定量: マレイミド化抗体0.5mgを0.05Mリン酸緩衝液
(pH7,0)で全量を1mlとした後、13.4mM
のシスティン10μQ及び0.1M EDTA溶液10
μQをを加え、窒素雰囲気下37°Cで30分間反応さ
せる。0.05Mリン酸緩衝液(pH7,0) 1ml
を加えた後、0.67mM DTNB溶液0.2mlを
加え、未反応のシスティンを、5−メルカプト−2−二
トロ安息香酸の412nmの吸光度を測定することによ
って定量し;消費されたシスティンの量を求め、抗体1
分子当たりの消費されたシスティンの量から導入された
マレイミド基の量を求めた。
(3)カタラーゼ標識モノクローナル抗ヒトAFP抗体
の製造(第3工程): 第1工程で製造したチオール化カタラーゼ溶液2ml 
(10mg)と第2工程で製造したマレイミド化モノク
ローナル抗ヒトAFP抗体溶液3ml(5mg)とを窒
素雰囲気下で混合し、4°Cで16時間反応させた。
未反応のマレイミド基をブロックするためシスティン1
mgを加え、4°Cで30分間反応させた後、0.05
Mリン酸緩衝液(pH7,0)1000 mlで透析(
2時間)を行った。更に、未反応のチオール基をブロッ
クするためN−エチルマレイミド1mgを加え、4°C
で30分間反応させた後、0.05Mリン酸緩衝液(p
H7,0)1000 mlで透析(2時間)を行った。
次いで、遠心分離(12000rpm、5分間)により
、沈ぢ物を除去した後、高速液体カラムクロマトグラフ
ィー(カラム; 5ephadex G−3000SW
(東洋ソーダ社製)、溶出液; 0.05Mリン酸緩衝
液(pH7,0) )に付し、最初の画分を集めカタラ
ーゼ標識モノクローナル抗ヒトAFP抗体溶液12m1
を得た。
実施例2(a)、(b) カタラーゼ標識モノクローナル抗ヒトAFP抗体の鴎: 以下の操作を2回繰り返し行って、夫々実施例2(a)
、(b)のカタラーゼ標識モノクローナル抗ヒトAFP
抗体を得た。
実施例1に於いて、窒素雰囲気下で行う操作を、該操作
に代えて、全てエチレンジアミン四酢酸2ナトリウム塩
10”3Mを添加して行うことによりカタラーゼ標識モ
ノクローナル抗ヒトAFP抗体溶液12m1を得た。
なお、上記で得られたチオール化カタラーゼのチオール
基導入量は、実施例1(1)と同様にして求めた結果、
カタラーゼ1分子に対して4分子であった。
実施例3 カタラーゼ標識モノクローナル抗hcG抗体の製造: (1)チオール化カタラーゼの製造(第1工程):実施
例1(1)と同様にしてチオール化カタラーゼ溶液3m
lを得た。
実施例1(1)と同様にして求めたチオール基の導入量
は、カタラーゼ1分子に対して4分子であった。
(2)マレイミド化モノクローナル抗hCG抗体の製造
(第2工程): モノクローナル抗hcG抗体3mgを0.05Mリン酸
緩衝液(pH7,0)1.5mlに溶解し、GMBS 
0.125mgをジオキサン125μgに溶解して加え
た。4°Cで2時間反応させた後、0.05Mリン酸緩
衝液(pH7,0) 10100Oで透析(3時間)を
2回行ってマレイミド化モノクローナル抗hCG抗体溶
液1.5 mlを得た。
実施例1(2)と同様にして求めたマレイミド基の導入
量は抗体1分子に対して11分子であった。
(3)カタラーゼ標識モノクローナル抗hCG抗体の製
造(第3工程): 第1工程で製造したチオール化カタラーゼ溶液2.4m
l (12mg)と第2工程で製造したマレイミド化モ
ノクローナル抗hCG抗体溶液1.5ml(3mg)と
を窒素雰囲気下で混合し、4°Cで16時間反応させた
以下実施例1(3)と同様にしてカタラーゼ標識第2表
【図面の簡単な説明】
第1図は製造例2.3で作成した免疫センサーの概略図
を表わす。 第2図は試験例2.3で用いたフロ一式の測定装置の概
略図を表わす。 第3図は試験例2のヒトAFPの標準曲線を表わし、第
4図は試験例3のhCGの標準曲線を表わす。 第1図 第2図 酵素基質溶液 第3図 2.5  5.OJo、0 20.0 ヒトAFP  (ng/ml’) 第4図 hCG  (m工U/+ml)

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 カタラーゼに一般式( I ) ▲数式、化学式、表等があります▼( I ) (式中、R^1はC_1〜C_3のアルキル基を表わし
    、nは2〜4の整数を表わす。) で示されるメルカプトイミデート化合物を反応させ、 ▲数式、化学式、表等があります▼(nは前記に同じ。 )をカタラー ゼのアミノ基に導入する第1工程と、 抗体に一般式(II) ▲数式、化学式、表等があります▼(II) (式中、R^2は脂肪族炭化水素又は芳香族炭化水素の
    二価残基を表わす。) で示されるスクシニルマレイミド化合物を反応させ、 ▲数式、化学式、表等があります▼(R^2は前記に同
    じ。)を抗体の アミノ基に導入する第2工程と、 第1工程で得られるチオール化カタラーゼと第2工程で
    得られるマレイミド化抗体とを反応させ、 ▲数式、化学式、表等があります▼ (n、R^2は前記に同じ。)でカタラーゼと抗体とを
    結合させる第3工程とからなることを特徴とするカタラ
    ーゼ標識抗体の製造法。
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