JPS63101754A - カタラ−ゼ標識抗体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、エンザイムイムノアッセイ用のカタラーゼ標
識抗体の製造法に関する。

（従来の技術） 抗原抗体反応の高い特異性を利用して検体中に含まれる
特定の抗原あるいは抗体を検出、定量し、疾病等の診断
あるいは治療に役立たせることは広く行われている。な
かでもエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）は簡便さ、
安全性の面からラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）に代わ
って、臨床検査における微量分析手法として、その有用
性は益々高まって来ている。

ＥＩＡに於いては、測定対象の抗原あるいは抗体を検出
するため酵素で標識した抗体（酵素標識抗体）が用いら
れる。

ＥＩＡに於ける標識酵素としては、安定で高い活性を有
するとともに、標識反応時に失活しないものが好ましく
、従来、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等
が用いられている。

これらの酵素を用いた場合、その活性の検出は、基質、
又は生成物の可視、紫外の吸収スペクトルあるいは蛍光
スペクトルの変化を測定する方法が用いられている。

ところで、カタラーゼは酵素活性が高く安定な酵素であ
り標識酵素として適している。更に、カタラーゼは過酸
化水素を分解し酸素を発生させるので、酵素活性を酸素
電極で直接電気的信号として捕えることができる。そこ
でカタラーゼを標識酵素とし、酸素電極を検出器とする
、免疫センサーが種々検討されている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

カタラーゼを標識抗体として利用するには、カタラーゼ
と特定の抗体とを予め結合させる必要がある。従来性わ
れてきたグルタルアルデヒドによる架橋法では、カタラ
ーゼと抗体との結合が進行しすぎ高分子量化して生成物
が沈澱する、酵素活性や抗体活性を低下させる、あるい
は、低収率で再現性が悪いといった欠点があり改善が望
まれていた。

（問題点を解決するための手段） 本発明者等は種々検討した結果、 カタラーゼに一般式（Ｉ） Ｈ （式中、Ｒ１はＣ工〜Ｃ３のアルキル基を表わし、ｎは
２〜４の整数を表わす。） で示されるメルカプトイミデート化合物を反応させ、 “１１“。

Ｒ３（ＣＨ２）ｎ−Ｃ−（ｎは前記に同じ。）をカタラ
ーゼのアミノ基に導入する第１工程と、 抗体に一般式（ＩＩ） （式中、Ｒ２は脂肪族炭化水素又は芳香族炭化水素の二
価残基を表わす。） で示されるスクシニルマレイミド化合物を反応させ、 アミノ基に導入する第２工程と、 第１工程で得られるチオール化カタラーゼと第２工程で
得られるマレイミド化抗体とを反応させ、 （ｎ、Ｒ２は前記に同じ。）でカタラーゼと抗体とを結
合させる第３工程とからなることを特徴とするカタラー
ゼ標識抗体の製造法によって前記欠点が改良出来ること
を見出して、本発明を完成した。

本発明の第１工程、第２工程及び第３工程は、夫々以下
のようにして行うことができる。

即ち、第１工程は、カタラーゼとメルカプトイミデート
化合物（Ｉ）とを、窒素９、アルゴン等の不活性ガス雰
囲気下、又はエチレンジアミン四酢酸又はその塩の存在
下に、弱アルカリ性の緩衝液、例えば、０．０５Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ８，０）中で０°Ｃ〜４０°Ｃで０．５
〜２０時間反応させる。

カタラーゼに導入されるチオール基は、カタラ−ゼ標識
抗体たり２〜６分子が好ましく、そのためカタラーゼに
対するメルカプトイミデート化合物（Ｉ）のモル比は、
１：１０〜１　：　５００が好ましく、又、カタラーゼ
の濃度は０．０１〜１　ｍＭが好ましい。

メルカプトイミデート化合物（Ｉ）としては、例えば、
メチル４−メルカプトブチルイミデート、メチル３−メ
ルカプトプロピオイミデート等が挙げられる。

エチレンジアミン四酢酸又はその塩の添加量は１０″″
４Ｍ〜１０−”　Ｍが好ましい。エチレンジアミン四酢
酸の塩としてはその２ナトリウム塩が好ましい。

カタラーゼは動植物由来のいずれでもよいが、動物、特
にその肝臓由来のものが好ましい。

このようにして得られるチオール化カタラーゼは、透析
、ゲルクロマトグラフィー、限外濾過によって精製する
ことができるが、特に、限外濾過が好ましい。

チオール化カタラーゼは不活性ガス雪囲気下、あるいは
エチレンジアミン四酢酸又はその塩を１０−’　Ｍ〜１
０−２Ｍ含有する中性の緩衝液中で保存することが好ま
しい。

第２工程は、後述する抗体とスクシニルマレイミド化合
物（ＩＩ）とを、中性の緩衝液、例えば０゜０５Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）中で０℃〜４０°Ｃで０．５〜
２０時間反応させる。

抗体に導入されるマレイミド基は、抗体１分子当たり５
〜２０分子が好ましく、そのため抗体に対するスクシニ
ルマレイミド化合物（ＩＩ）のモル比は、１：５〜１：
３００が好ましく、又、抗体の濃度は０．００５〜０．
１　ｍＭが好ましい。

スクシニルマレイミド化合物（ＩＩ）としては、一般式
（ＩＩ）に於けるＲ２がプロピレン、ベンチレン等の脂
肪族炭化水素の二価残基、あるいは１，３−フェニレン
、１，４−フェニレン等の芳香族炭化水素の二価残基で
ある化合物を挙げることができる。

このようにして得られるマレイミド化抗体は、透析、ゲ
ルクロマトグラフィーによって精製することができる。

本発明に用いられる抗体としては、例えば以下のような
ものが具体例として挙げられる。

■インシュリン、絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、胎
盤性ラクトゲン、黄体形成ホルモンなどのポリペプチド
系ホルモンの抗体。

■ＩｇＧ、　ＩｇＡ　、　ＩｇＭ　、　ＩｇＥ、α−フ
ェトプロティン（ＡＦＰ）　、カルシノエンプリオニッ
クアンチゲン、ハプトグロビンなどの血清蛋白の抗体。

■大腸菌毒素、コレラトキシン、肝炎ウィルス、風疹ウ
ィルス、インフルエンザウィルスなどの毒素あるいはウ
ィルスの抗体。

■エストラジオール、プロゲステロン、テストステロン
、フェニトイン、プロカインアミド、カナマイシン、ペ
ニシリン、バルビッール酸などのステロイドホルモンあ
るいは薬剤の抗体。

これらの抗体の種類は、　ＩｇＧ、　ＩｇＡ　、　Ｉｇ
Ｍ等のクラスいずれをも使用することができる。

又、マウス、ラット、ウサギ、ヤギあるいはヒト等から
常法によって採取した抗体を使用すること、ができるが
、特に細胞融合法によって採取したモノクローナル抗体
の使用が均質な抗体が得られ、感度、精度の点て好まし
い。

なお、通常使用する抗体はいずれも常法によって例えば
、硫安塩析またはＤＥＡＥイオン交換カラムクロマトグ
ラフィー等で精製して用いられる。

第３工程は、第１工程で得られるチオール化カタラーゼ
と、第２工程で得られるマレイミド化抗体とを、窒素、
アルゴン等の不活性ガス雪囲気下、又はエチレンジアミ
ン四酢酸又はその塩の存在下に、中性の緩衝液、例えば
、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）中で０℃〜４
０℃で１〜２０時間反応させる。

チオール化カタラーゼに対するマレイミド化抗体のモル
比は、１：１〜６：１が好ましい。

エチレンジアミン四酢酸又はその塩の添加量は１０−’
　Ｍ〜１０′″２Ｍが好ましい。エチレンジアミン四酢
酸の塩としてはその２ナトリウム塩が好ましい。

反応終了後、未反応のマレイミド基、チオール基をブロ
ックすることが、カタラーゼ標識抗体の安定性を向上さ
せる上で好ましい。マレイミド基をブロックするには、
システィン、メルカプトエタノール等のチオール化合物
を、又、チオール基をブロックするにはＮ−エチルマレ
イミド等のマレイミド化合物あるいは５．５′−ジチオ
ビス（２−ニトロ安息香酸）　（ＤＴＮＢ）等が用いら
れる。

更に、得られたカタラーゼ標識抗体はゲルクロマトグラ
フィーによって精製することができる。

第１工程、第２工程及び第３工程を上記のようにして行
うことにより、高い酵素活性を有するカタラーゼ標識抗
体を再現性よく、しかも高収率で製造することができる
。

（発明の効果） 本発明によって得られるカタラーゼ標識抗体は、以下の
試験結果に示すとおり、高い酵素活性を有しており（試
験例１）、ＥＩＡに於いて、感度、精度に優れた標識抗
体として使用でき、特に免疫センサーを用いるＥＩＡの
標識抗体として好適に使用することができる（試験例２
．３）。

試験例１ カタラーゼ標識モノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体の評価
： （１）検体 本発明によって製造されたカタラーゼ標識モノクローナ
ル抗ヒトＡＦＰ抗体（実施例１　（ａ）〜（ｅ）及び実
施例２　（ａ）　、　（ｂ）の７検体）及びグルタルア
ルデヒド法によって製造された該標識抗体（比較例１　
（ａ）〜（ｇ）（製造例１）の７検体）。

（２）試験方法 モノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体（カタラーゼの標識に
用いた抗体とはヒトＡＦＰに対して結合部位の異なるも
の、ＡＦＰ−１）　５ｋｇ／ｍｌを調製し、その０．５
ｍｌを内径０．８ｍｍのポリスチレン試験管に入れ、４
°Ｃで１６時間静置して内壁に抗体を吸着固定化した。

次に、蒸留水で洗浄後、０．５％の牛血清アルブミンを
含有する０、ＯＩＭリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７，２
）　１ｍｌを加えて、２時間静置後、以下の試験に使用
した。

標準ヒトＡＦＰを０又は４０ｎｇ／ｍｌ、馬血清１０重
量％及び該標識抗体（上記各検体）１μｇ／ｍｌを含有
する０、０１Ｍリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７，２）　
０．５ｍｌを、上記ＡＦＰ−１固定化ポリスチレン試験
管に入れ、３７°Ｃで２時間免疫反応を行った。蒸留水
１ｍｌで３回洗浄後、０．０２Ｍ過酸化水素の０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）０．５ｍｌを加え、２０分
間酵素反応を行った後、ＩＮ硫酸１ｍｌを加えて反応を
停止させ、過酸化水素に基ず＜　２４０ｎｍの吸光度（
Ａ２４゜）を測定した。

本発明によりて製造されたカタラーゼ標識モノクローナ
ル抗ヒトＡＦＰ抗体とグルタルアルデヒド法によって製
造された該標識抗体との標識酵素活性を、過酸化水素の
減少量〔標準ヒトＡＦＰ　Ｏ（ブランク）と４０ｎｇ／
ｍｌとの吸光度の差（△Ａ２４０　）　）から比較した
。

（３）結果 結果を第１表に示した。

（以→白） 第１表 試験例２ ヒトＡＦＰの繰　返し測　試験（ヒトＡＦＰの標準曲線
の作成）： 製造例２で作成した免疫センサーを用い、第２図に示す
ようなフロ一式の測定装置を組み、標準ヒトＡＦＰ　Ｏ
，２，５，５，２０ｎｇ／ｍｌの各濃度夫々について４
回ずつ以下のようにして繰り返し測定し、ヒトＡＦＰの
標準曲線を作成した。

反応セル（容量０．２ｍｌ　）に蒸留水を満たし、これ
に標準ヒトＡＦＰ各々０．２．５．５．２０ｎｇ／ｍｌ
、馬血清１０重量％及び実施例１（ａ）で得られたカタ
ラーゼ標識モノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体１μｇ／ｍ
ｌを含有する０、１重量％牛血清アルブミン生理食塩液
０．２ｍｌを導入し、３０分間静置後、２０ｍ１／ｍｉ
ｎの流速で１分間蒸留水を流して反応セルを洗浄した。

次いで、２６．５ｍＭの過酸化水素を含む０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）０．２ｍｌを反応セルに導入し
、酸素電極の酸素濃度に比例した電流値を求めた。続い
て０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２，５，Ｎａ１
ｌ　２重量％含有）を２０ｍ１／ｍｉｎの流速で３０秒
間流した後、３．５分間静置して結合した抗体と抗原と
を解離させ、更に２０ｍ１／ｍｉｎの流速で１分間蒸留
水を流して反応セルを洗浄した。次に、再び上記の標準
ＡＦＰ溶液を反応セルに導入して同様な操作を各濃度夫
々４回ずつ繰り返してヒトＡＦＰの標準曲線（第３図）
を作成した。（なお、操作は免疫反応は３７℃、他は室
温で行った。） 試験例３ ｈＣＧの繰り返し測　試験（ｈＣＧの標準曲線の作成）
： 製造例３で作成した免疫センサーを用い、第２図に示す
ようなフロ一式の測定装置を組み、標準ヒトＡＦＰの代
わりにｈＣＧ及び実施例３で得られたカタラーゼ標識モ
ノクローナル抗ｈＣＧ抗体を用いる以外は試験例２と同
様にして、ｈＣＧ　０．２５゜５０、１００．２００　
ｍｌＵ／ｍｌの各濃度夫々について４回ずつ繰り返し測
定してｈＣＧの標準曲線（第４図）を作成した。

（実施例） 以下に実施例および製造例を挙げて、本発明を更に具体
的に説明する。

なお、カタラーゼ標識抗体の収率は、夫々反応に使用し
た抗体量（ｍｏｌ）と得られた標識抗体の抗体量（ｍｏ
ｌ）との比から算出し、実施例の末尾に一括して記載し
た（第２表）。該標識抗体の抗体量（ｍｏｌ）は、次式
により算出した該標識抗体の抗体濃度（ＬＡ　（ｍｏｌ
／１）　）から求めた。

ＬＡ（ｍｏｌ／１）　＝（Ａ２８０（標識抗体溶液）−
ｆＬ Ａ４０５（標識抗体溶液）Ｘ□（カタラーゼ）〕Ｃ：抗
体のモル吸光係数 文：測定光路長 製造例１〔比較例１（ａ）〜（ｇ）〕 以下の操作を７回繰り返し行って、夫々比較例１（ａ）
〜（ｇ）のカタラーゼ標識モノクローナル抗ヒトＡＦＰ
抗体を得た。

カタラーゼ（牛肝臓由来、シグマ社製）３ｍｇを０゜０
５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）　１ｍｌに溶解し、５
％グルタルアルデヒド水溶液１５μＱを加え４°Ｃて３
０分間反応後、モノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体（免疫
動物；マウス）　１ｍｇを加え４°Ｃで３０分間反応さ
せた。水素化ホウ素ナトリウム１ｍｇを加え４°Ｃて２
０分間反応させた後、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）１０００ｍｌで透析（２時間）を２回行った。次
いで、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５分間）により、
沈澱物を除去した後、高速液体カラムクロマトグラフィ
ー（カラム；　５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−３０００ＳＷ（
東洋ソーダ社製）、溶出液；０．０５Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ７，０）　）に付し、最初の画分を集めカタラーゼ
標識モノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体溶液２．４ｍｌを
得た。

製造例２ ヒトＡＦＰ測　用免　センサーの作成：（１）フィブロ
イン水溶液の調製： 生糸１００ｇを１．０重量％のマルセル石けん水溶液５
０００ｍｌ中に浸漬し、８０°Ｃで３時間精練した。水
洗後、更に０．５重量％のマルセル石けん水溶液５００
０ｍｌに浸漬して８０℃で３時間精練し、セリシン等を
実質的に除去したフィブロイン原料７２ｇを得た。

水１００ｇとエチルアルコール８０ｇの入ったニーダ−
中に塩化カルシウム１５０ｇを溶解し、７５°Ｃに昇温
後、上記のフィブロイン原料７０ｇを投入、攪拌下に１
時間溶解した。次いで１８０ｇの温水（７５°Ｃ）を加
えて希釈混合した。ブイプロインの溶解液を冷却した後
、ホローファイバー型の透析器を用いて、流水に対して
透析脱塩し、５．７重量％のフィブロイン水溶液１２０
０ｍ１を得た。塩化カルシウムの残留量は０．０８重量
％であった。

（２）モノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体固定化フィブロ
インフィルムの製造： モノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体（免疫動物マウス）を
生理食塩液に溶解し、２５０ｇｇ／ｍｌの抗体溶液を調
製した。次にこの溶液を四方を仕切ったガラス板上に抗
体量が１０μｇ／ａｍ２となるように流延し、１５°Ｃ
で３時間乾燥した。上記フィブロイン水溶液にグリセリ
ンをフィブロインに対して３０重量％になるように加え
た溶液をその上から流延し、２０°Ｃで１０時間乾燥す
ることによって皮膜化させ、次いで直径０．６ｃｍの円
形に裁断し、厚さ６０戸の表記モノクローナル抗ヒトＡ
ＦＰ抗体固定化フィブロインフィルムを得た。

（３）ヒトＡＦＰ測定用免疫センサーの作成：　　　・
第１図に示すように、反応セル（容量０．２ｍ１）に（
２）で得られたモノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体固定化
フィブロインフィルム、酸素透過膜、０−リング及びガ
ルバニ−型酸素電極（ＡＮ型、オリエンタル電気林製）
を順次装着してヒトＡＦＰ測定用免疫センサーを作成し
た。

製造例３ ｈＣＧ測定用免　センサーの作　： （１）ポリクローナル抗ｈＣＧ抗体固定化フィブロイン
フィルムの製造（特開昭６０−１５５１２９号公報参照
）： ポリクローナル抗ｈＣＧ抗体（免疫動物；ヤギ）を生理
食塩液に溶解し、２５０ｇｇ／ｍ　１の抗体溶液を調製
した。次にこの溶液を、四方を仕切りだガラス板上に抗
体量が１ｋｇ／ａｍ”となるように塗布し、２０°Ｃで
３時間乾燥した。次いで製造例２（１）と同様にして得
たフィブロイン水溶液を濃縮して１５．７重量％のフィ
ブロイン水溶液とし、更にグリセリンをフィブロインに
対して３０重量％になるように加えた溶液をその上から
流延し、２０°Ｃで８時間乾燥することによって皮膜化
させ、次いで直径０．７ｃｍの円形に裁断し、厚さ９０
ｇｍのポリクローナル抗ｈＣＧ抗体固定化フィブロイン
フィルムを、得た。

（２）　ｈＣＧ測定用免疫センサーの作成：（１）で得
られたポリクローナル抗ｈＣＧ抗体固定化フィブロイン
フィルムを、製造例２（３）と同様にしてガルバニ−型
酸素電極（ＡＮ型、オリエンタル電気■製）に装着して
ｈＣＧ測定用免疫センサーを作成した。

実施例１（ａ）〜（ｅ） カタラーゼ標識モノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体の製造
： 以下の操作を５回繰り返し行って、夫々実施例１（ａ）
〜（ｅ）のカタラーゼ標識モノクローナル抗ヒトＡＦＰ
抗体を得た。

（１）チオール化カタラーゼの製造（第１工程）二カタ
ラーゼ（牛肝臓由来、シグマ社製）　１５ｍｇを０．０
５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）２．５ｍｌに溶解し、
窒素曝気（６０ｍｌ／ｍ１ｎ）を１０分間行い、次に、
メチル４−メルカプトブチルイミデート１ｍｇを加え、
窒素雰囲気下に４°Ｃで２時間反応させた。反応終了後
、ダイアフローメンプラン＠（アミコン社製）を用いて
窒素フ囲気下に限外濾過し、０．０５Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ７，０）　３ｍｌを加え、再度限外濾過を行った。

この操作を３回繰り返し、未反応のメチル４−メルカプ
トブチルイミデートを除去した後、チオール化カタラー
ゼ溶液３ｍｌを得た。

以下の方法によって求めたチオール基の導入量は、カタ
ラーゼ１分子に対して４分子であった。

チオール基の定量： チオール化カタラーゼ１ｍｌ（５ｍｇ）にＤＴＮＢ　１
ｍｇを加えて１時間反応後、限外濾過によって、未反応
のＤＴＮＢ等の低分子化合物を除去した。

２ｍｌの蒸留水を加え、ジチオスレトール又は２−メル
カプトエタノールで還元し、５−メルカプト−２−二ト
ロ安息香酸を遊離させ、５０％トリクロロ酢酸を０．０
５ｍ１加えて静置後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５
分間）により沈澱物を除去した。ＩＮ　ＮａＯＨ′ｒ！
ｐＨ８にした後、全量を５ｍｌとして４１２ｎｍの吸光
度より遊離した５−メルカプト−２−二トロ安息香酸の
量を求め、カタラーゼへのチオール基導入量を算出した
。

（２）マレイミド化モノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体の
製造（第２工程）： モノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体１０ｍｇを０．０５Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）５．０ｍｌに溶解し、Ｎ−
（ｙ−マレイミドブチロキシ）スクシンイミド（ＧＭＢ
Ｓ）０．５ｍｇをジオキサン０．５ｍｌに溶解して加え
た。４℃で２時間反応させた後、０．０５Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７，０）１０００ｍｌで透析（２時間）を２回
行ってマレイミド化モノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体溶
液６ｍｌを得た。

以下の方法によって求めたマレイミド基の導入量は、抗
体１分子に対して１０分子であった。

マレイミド基の定量： マレイミド化抗体０．５ｍｇを０．０５Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）で全量を１ｍｌとした後、１３．４ｍＭ
のシスティン１０μＱ及び０．１Ｍ　ＥＤＴＡ溶液１０
μＱをを加え、窒素雰囲気下３７°Ｃで３０分間反応さ
せる。０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）　１ｍｌ
を加えた後、０．６７ｍＭ　ＤＴＮＢ溶液０．２ｍｌを
加え、未反応のシスティンを、５−メルカプト−２−二
トロ安息香酸の４１２ｎｍの吸光度を測定することによ
って定量し；消費されたシスティンの量を求め、抗体１
分子当たりの消費されたシスティンの量から導入された
マレイミド基の量を求めた。

（３）カタラーゼ標識モノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体
の製造（第３工程）： 第１工程で製造したチオール化カタラーゼ溶液２ｍｌ　
（１０ｍｇ）と第２工程で製造したマレイミド化モノク
ローナル抗ヒトＡＦＰ抗体溶液３ｍｌ（５ｍｇ）とを窒
素雰囲気下で混合し、４°Ｃで１６時間反応させた。

未反応のマレイミド基をブロックするためシスティン１
ｍｇを加え、４°Ｃで３０分間反応させた後、０．０５
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）１０００　ｍｌで透析（
２時間）を行った。更に、未反応のチオール基をブロッ
クするためＮ−エチルマレイミド１ｍｇを加え、４°Ｃ
で３０分間反応させた後、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）１０００　ｍｌで透析（２時間）を行った。

次いで、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５分間）により
、沈ぢ物を除去した後、高速液体カラムクロマトグラフ
ィー（カラム；　５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−３０００ＳＷ
（東洋ソーダ社製）、溶出液；　０．０５Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７，０）　）に付し、最初の画分を集めカタラ
ーゼ標識モノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体溶液１２ｍ１
を得た。

実施例２（ａ）、（ｂ） カタラーゼ標識モノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体の鴎： 以下の操作を２回繰り返し行って、夫々実施例２（ａ）
、（ｂ）のカタラーゼ標識モノクローナル抗ヒトＡＦＰ
抗体を得た。

実施例１に於いて、窒素雰囲気下で行う操作を、該操作
に代えて、全てエチレンジアミン四酢酸２ナトリウム塩
１０”３Ｍを添加して行うことによりカタラーゼ標識モ
ノクローナル抗ヒトＡＦＰ抗体溶液１２ｍ１を得た。

なお、上記で得られたチオール化カタラーゼのチオール
基導入量は、実施例１（１）と同様にして求めた結果、
カタラーゼ１分子に対して４分子であった。

実施例３ カタラーゼ標識モノクローナル抗ｈｃＧ抗体の製造： （１）チオール化カタラーゼの製造（第１工程）：実施
例１（１）と同様にしてチオール化カタラーゼ溶液３ｍ
ｌを得た。

実施例１（１）と同様にして求めたチオール基の導入量
は、カタラーゼ１分子に対して４分子であった。

（２）マレイミド化モノクローナル抗ｈＣＧ抗体の製造
（第２工程）： モノクローナル抗ｈｃＧ抗体３ｍｇを０．０５Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，０）１．５ｍｌに溶解し、ＧＭＢＳ　
０．１２５ｍｇをジオキサン１２５μｇに溶解して加え
た。４°Ｃで２時間反応させた後、０．０５Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，０）　１０１００Ｏで透析（３時間）を
２回行ってマレイミド化モノクローナル抗ｈＣＧ抗体溶
液１．５　ｍｌを得た。

実施例１（２）と同様にして求めたマレイミド基の導入
量は抗体１分子に対して１１分子であった。

（３）カタラーゼ標識モノクローナル抗ｈＣＧ抗体の製
造（第３工程）： 第１工程で製造したチオール化カタラーゼ溶液２．４ｍ
ｌ　（１２ｍｇ）と第２工程で製造したマレイミド化モ
ノクローナル抗ｈＣＧ抗体溶液１．５ｍｌ（３ｍｇ）と
を窒素雰囲気下で混合し、４°Ｃで１６時間反応させた
。

以下実施例１（３）と同様にしてカタラーゼ標識第２表

【図面の簡単な説明】

第１図は製造例２．３で作成した免疫センサーの概略図
を表わす。 第２図は試験例２．３で用いたフロ一式の測定装置の概
略図を表わす。 第３図は試験例２のヒトＡＦＰの標準曲線を表わし、第
４図は試験例３のｈＣＧの標準曲線を表わす。 第１図 第２図 酵素基質溶液 第３図 ２．５　　５．ＯＪｏ、０　２０．０ ヒトＡＦＰ　　（ｎｇ／ｍｌ’） 第４図 ｈＣＧ　　（ｍ工Ｕ／＋ｍｌ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 カタラーゼに一般式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、Ｒ＾１はＣ＿１〜Ｃ＿３のアルキル基を表わし
   、ｎは２〜４の整数を表わす。） で示されるメルカプトイミデート化合物を反応させ、 ▲数式、化学式、表等があります▼（ｎは前記に同じ。 ）をカタラー ゼのアミノ基に導入する第１工程と、 抗体に一般式（II） ▲数式、化学式、表等があります▼（II） （式中、Ｒ＾２は脂肪族炭化水素又は芳香族炭化水素の
   二価残基を表わす。） で示されるスクシニルマレイミド化合物を反応させ、 ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｒ＾２は前記に同
   じ。）を抗体の アミノ基に導入する第２工程と、 第１工程で得られるチオール化カタラーゼと第２工程で
   得られるマレイミド化抗体とを反応させ、 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ｎ、Ｒ＾２は前記に同じ。）でカタラーゼと抗体とを
   結合させる第３工程とからなることを特徴とするカタラ
   ーゼ標識抗体の製造法。