JPS6230591B2

JPS6230591B2 -

Info

Publication number: JPS6230591B2
Application number: JP55148653A
Authority: JP
Inventors: Masafumi Mizogami
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1980-10-23
Filing date: 1980-10-23
Publication date: 1987-07-03
Also published as: JPS5772063A

Description

【発明の詳細な説明】本発明はＢ型肝炎ウイルスのアルブミンレセプ
ター定量測定法に関するものであり、詳しくは酵
素免疫分析法又は放射線免疫分析法のサンドイツ
チ法の原理を応用することによるＢ型肝炎ウイル
スのアルブミンレセプタを検出する方法に関する
ものである。

Ｂ型肝炎ウイルス（以下HBVと略称する）に
はHBs抗原―HBs抗体係、HBc抗原―HBc抗体
系、HBe抗原―HBe抗体系の三者が知られ、これ
らは感染性が高いため、ぜひともワクチンの製造
が必要である。そのため、安全あつ有効なワクチ
ン、即ち抗原性を保持し、しかも病原体を極力少
なくした抗原を得るには抗原としての活性を担う
に必要な最小構造を追求する必要がある。従来、
該最小構造の解明のための研究としてアルブミン
ポリマーと肝疾患患者の血清中のある物質、即ち
アルブミンレセプター、とが反応することにつ
き、Rev.roum.Biochim11.4 271〜276（1974）
Lenkei；Science182：1026（1973）松橋等にお
いて報告されている。また、
GastroenterologyVol76.No2（1979）今井には、
この活性物質はＢ型肝炎疾患（以下HBsと略称す
る）抗原粒子上に存在し、臨床的に評価されてい
るｅ抗原と関連しており、アルブミンポリマーを
羊赤血球にコートしたのち、対象を反応させ、そ
の凝集価によりｅ抗原の半定量を行ない、アルブ
ミンポリマーとｅ抗原陽性HBs抗原小型粒子（ア
ルブミンレセプター）との反応性を確立した旨記
載されている。

しかしながら、上述の方法は血球を用いて反応
を行なうため、非特異反応が出じ、また血球の
lotによる凝集価の変動が起こるため、定量的に
は充分な効果を得ることはできなかつた。また、
この反応に与える物質はヒト及びチンパンジーの
アルブミンポリマーに限定されるという欠点があ
つた。

一方、近年、酵素免疫分析法（Enzym
immunoassay：EIA）及び放射線免疫分析法
（Radioimmunoassay：RIA）のサンドイツチ測
定法による抗原の測定法が脚光を浴びている。こ
のサンドイツチ測定法とは、担体に十分量の抗体
を不溶化させておき、これに測定すべき抗原を結
合させ、担体上の抗体と結合した抗原の残された
抗体結合部位に酵素又は同位元素により標識され
た抗体を結合させたのち、抗体上の酵素活性又は
放射線量を測定することにより抗原の量を定量す
る方法である。しかし、従来の抗原抗体反応によ
るEIAや、RIAでは、アルブミンレセプターを主
体とした測定は不可能であり、HBs抗原とアルブ
ミンレセプターとの両者が同時に測定され、両者
の割合は不明であり、最小構造の解明には不十分
であつた。

本発明者は、この原理を利用して、抗原―抗体
反応とは無関係のHBVのアルブミンレセプター
を検出する方法につき鋭意検討を重ねた結果、本
発明に到達したもので、本発明の要旨は、コーンフラクシヨンＶをグルタールアルデヒド
で重合して得られたポリマーを、担体に均一に結
合させ、次に該担体に定量測定しようとする被検体を反
応させ、次に該担体にコーンフラクシヨンＶをグルター
ルアルデヒドで重合して得られたポリマーの酵素
標識体または抗HBs抗体の酵素標識体を反応さ
せ、次に該担体に結合した酵素の酵素活性を測定
し、該測定値に基づきＢ型肝炎ウイルスのアルブ
ミンレセプターを定量測定することを特徴とする
Ｂ型肝炎ウイルスのアルブミンレセプター定量測
定法、及びコーンフラクシヨンＶをグルタールアルデヒド
で重合して得られたポリマーを、担体に均一に結
合させ、次に該担体に定量測定しようとする被検体を反
応させ、次に該担体にコーンフラクシヨンＶをグルター
ルアルデヒドで重合して得られたポリマーの放射
性同位元素標識体または抗HBs抗体の放射性同位
元素標識体を反応させ、次に該担体に結合した放射性同位元素の放射線
量を測定し、該測定値に基づきＢ型肝炎ウイルス
のアルブミンレセプターを定量測定することを特
徴とするＢ型肝炎ウイルスのアルブミンレセプタ
ー定量測定法にある。

本発明を詳細に説明する。本発明は、先ず、コ
ーンフラクシヨンＶをグルタールアルデヒドで重
合したポリマーを担体に均一に結合させるのであ
るが、コーンフラクシヨンＶのポリマーはSigma
（シグマ）社製のコーンのエタノール分画法によ
り調製されたものが使用され、主成分としてアル
ブミン（albumin）、微量成分としてα_２―HS・
グリコプロテイン（α_２―HS・glycoprotein）、
プレアルブミン（prealbumin）、α_１―アシドグ
リコプロテイン（α_１―acid glycoprotein）等
を含むものである。

これはアルブミンにα―アシドグリコプロテイ
ンが含有していることが必要であり、PH７前後の
リン酸溶液の溶液として使用されるが、これらは
例えば１〜３重量％グルタールアルデヒド溶液を
蛋白溶液の1/20〜1/5好ましくは1/10前後加え、
室温で１〜３時間攪拌して蛋白のポリマーを形成
し、りん酸緩衝液で透析し、余分のグルタールア
ルデヒドを除去した後、PH７〜８、イオン強度is
＝0.1〜0.2特にis≒0.15のりん酸緩衝液で平衡化
したセフアデツクス（Sephadex以下Sephと略称
する）Ｇ―150ないしSephG―200でゲル化濾過を
行なつたものが使用される。これを直径3.0〜6.5
mmのポリスチレン、ナイロン、シリコン、セフア
ローズ、セルローズ、ガラス等のボール、小片、
マイクロトレー、ロツドに成型されたものから選
ばれた担体に結合させる。この方法は物理的吸着
法としてPH6.5〜８の0.1モルりん酸緩衝液で平衡
化させ、蛋白濃度0.05〜２mg／mlとなるようにア
ルブミンポリマーを添加して調製し、その溶液中
に上記担体を加え、４℃〜室温、好ましくは４℃
で１〜２日間浸漬し、上記の緩衝液で洗浄後、
0.1〜0.5重量％の牛血清アルブミン（以下BSAと
略称する）を含むPH6.5〜8.5のりん酸緩衝液で更
に１〜２日間浸清して上記の緩衝液で洗浄したの
ち、使用するまで0.1重量％BSAを含有するりん
酸緩衝液に保存する方法が挙げられる。また、化
学的方法としてはγ―アミノエトキシシラン処理
によつて結合させることもできる。

次に、上述のようにして調整された担体をPH
6.5〜8.5のりん酸緩衝液（0.1〜0.5重量％のBSA
を含有する）0.2〜0.5ml入つた試験管に入れ、測
定しようとするアルブミンレセプター20〜100μ
を加えて４〜45℃、好ましくは30〜45℃で１〜
４時間インキユベートすることにより反応させた
のち、上記と同一のりん酸緩衝液で洗浄する。こ
の際使用されるアルブミンレセプターとしては血
清、血漿、腹水等をそのまま使用される。

上記の方法で得られたアルブミンレセプターが
結合された担体に、次いで、酵素または放射性同
位元素により標識されたものとして、コーンフラ
クシヨンＶをグルタールアルデヒドで重合したポ
リマーの標識体又は抗HBs抗体の標識体を、反応
させる。

抗HBs抗体は、チンパンジー、ウサギ、ヤギ、
モルモツト等に免疫して得られる抗HBsの血清、
血漿、腹水等をそのまま、又は硫安塩析、DEAE
―Ｃ展開を行なつて精製したものが使用される。

上記標識には酵素の場合、Horseradish
peroxidase（西洋わさびパーオキシダーゼ）、β
―Ｄ―Galactosidase（β―Ｄ―ガラクトシダー
ゼ）、Alkaline phosphadase（アルカリフオスフ
アダーゼ）、Glucose oxidase（グルコースオキシ
ダーゼ）、Malatedehyd―rogenase、
Acetylcholinesterase等が、放射性同位元素の場
合は131I，125I等が挙げられ、コーンフラクシヨ
ンＶのポリマーを使用する場合は西洋わさびパー
オキシダーゼが好ましく、抗HBs抗体を使用する
場合はβ―Ｄ―ガラクトシダーゼで標識するのが
好ましい。前者の場合、例えば西洋わさびパーオ
キシダーゼを0.08M過ヨウ素酸ナトリウムにより
活性化した後、SephG―25で西洋わさびパーオキ
シダーゼ以外の作用物質を除去し、前記で調製さ
れたコーンフラクシヨンＶのポリマーと混合する
ことにより標識し、NaBH₄によつて還元した
後、SephG―200で展開し、0.1〜0.5重量％の
BSAを加えて標識体とし、使用するまで保存す
る。また後者の場合、例えば、抗HBs抗体IgGを
酸性条件下でペプシンで分解したのち、SephG―
150ないしＧ―200でゲル濾過を行ないpep
（Fab）′_２を得る。得られたpep（Fab）′_２をさ
らに２―メルカプトエタノールアミンでPeP
（Fab）′_２のheavy―鎖間を切断し、―SH基を露
出させ、ジマレイミドと結合したのち、ジマレイ
ミドの残つた反応基とβ―Ｄ―ガラクトシダーゼ
のSH基を結合させることによつて標識体が得ら
れる。このようにしてコーンフラクシヨンＶのポ
リマーの標識体又は抗HBs抗体の標識体を、アル
ブミンレセプターが結合された担体と反応させ
る。担体を洗浄後酵素反応を行ない炭酸ナトリウ
ム、シユウ酸等から選ばれた化合物の溶液を添加
して反応を停止し、結合した酵素の活性量を分光
光度計（peroxidase 405nm Ｂ―Ｄ―Gal
420nm）により測定して、その吸光度から反応量
の測定をする。この測定値に基づいて、比例計算
により被検体中のアルブミンレセプターの定量的
測定ができる。

以上詳述したように本発明法によれば、アルブ
ミンを主体とするポリマーが担体に結合している
ため、HBs抗原の定量とは別に、高精度、高感
度、かつ再現性の優れたアルブミンレセプターの
定量検出を行なうことができ、羊赤血球等を使用
しないので一般の検査室においても容易に実用化
される方法である。このため、抗原の最小構造解
明に貢献できる。特に直接的にはアルブミンレセ
プターの量的挙動は他の抗原の挙動とは異なるた
め、それ自身で肝機能の低下の予知に役立つ。
又、アルブミンポリマーもヒト及びチンパンジー
以外の動物のアルブミンポリマーを利用できる。

次に本発明を実施例により具体的に説明する
が、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実
施例により限定されるものではない。

実施例１内径10mmの試験管にPH７のりん酸緩衝液（0.1
重量％BSAを含有する）を0.2ml入れ、次にコー
ンフラクシヨンＶのポリマーをコートした直径
6.5mmのポリスチレン担体を入れ、アルブミンレ
セプター陽性血清を25μ加え、37℃で２時間イ
ンキユベートした後、上記と同一のりん酸緩衝液
１mlで３回洗浄した。次いで、西洋わさびパーオ
キシダーゼで標識したコーンフラクシヨンＶのポ
リマー0.3ml加えて37℃で２時間インキユベート
した後、上記と同一のりん酸緩衝液１mlで３回洗
浄した。別に、上記と同様の試験管に
ABTS14.7mMかほう酸ナトリウム1.47mM、
H₂O₂0.5mlを入れ、洗浄した担体を入れ替え、室
温で２時間放置し、酵素反応を行なつた。その後
0.1M炭酸ナトリウムで反応を停止して、分光光
度計で吸収波長405nmで吸光度を測定し、該測定
値に基づき比例計算にて被検体中のアルブミンレ
セプターの定量値を得た。

実施例２実施例１と同様の試験管にPH８のりん酸緩衝液
（0.1重量％BSAを含有する）を0.5ml入れ、次に
抗HBs抗体をコートした直径6.5mmのポリスチレ
ン担体を入れ、実施例１と同一のHBs陽性血清を
25μ加え37℃で２時間インキユベートした後、
上記と同一のりん酸緩衝液１mlで３回洗浄した。
次いでβ―Ｄ―Galactosidaseで標識した抗HBs
抗体を0.3ml加えて37℃で18時間インキユベート
した後、上記と同一のりん酸緩衝液１mlで３回洗
浄した。別に、上記と同一の試験管にONPG（オ
ルトニトロフエニール―β―Ｄ―ガラクトピラノ
シド）溶液を入れ、洗浄した担体を入れ替え、37
℃で18時間放置し酵素反応を行なつた。その後、
0.1M炭酸ナトリウム2.0mlで反応を停止して分光
光度計にて吸収波長420nmで吸光度を測定した。
該測定値に基づき比例計算にて被検体中のアルブ
ミンレセプターの定量値を得た。

Claims

【特許請求の範囲】１コーンフラクシヨンＶをグルタールアルデヒ
ドで重合して得られたポリマーを、担体に均一に
結合させ、次に該担体に定量測定しようとする被検体を反
応させ、次に該担体にコーンフラクシヨンＶをグルター
ルアルデヒドで重合して得られたポリマーの酵素
標識体または抗HBs抗体の酵素標識体を反応さ
せ、次に該担体に結合した酵素の酵素活性を測定
し、該測定値に基づきＢ型肝炎ウイルスのアルブ
ミンレセプターを定量測定することを特徴とする
Ｂ型肝炎ウイルスのアルブミンレセプター定量測
定法。２コーンフラクシヨンＶをグルタールアルデヒ
ドで重合して得られたポリマーを、担体に均一に
結合させ、次に該担体に定量測定しようとする被検体を反
応させ、次に該担体にコーンフラクシヨンＶをグルター
ルアルデヒドで重合して得られたポリマーの放射
性同位元素標識体または抗HBs抗体の放射性同位
元素標識体を反応させ、次に該担体に結合した放射性同位元素の放射線
量を測定し、該測定値に基づきＢ型肝炎ウイルス
のアルブミンレセプターを定量測定することを特
徴とするＢ型肝炎ウイルスのアルブミンレセプタ
ー定量測定法。３コーンフラクシヨンＶをグルタールアルデヒ
ドで重合して得られたポリマーが、アルブミンα
−アシドグリコプロテインを含有する特許請求の
範囲第１項記載のＢ型肝炎ウイルスのアルブミン
レセプター定量測定法。４コーンフラクシヨンＶをグルタールアルデヒ
ドで重合して得られたポリマーに標識される酵素
が、西洋わさびパーオキシダーゼである特許請求
の範囲第１項記載のＢ型肝炎ウイルスのアルブミ
ンレセプター定量測定法。５抗HBs抗体に標識される酵素が、β―Ｄ―ガ
ラクトシダーゼである特許請求の範囲第１項記載
のＢ型肝炎ウイルスのアルブミンレセプター定量
測定法。