KR101181364B1

KR101181364B1 - 블록화 효소 프로브 복합체

Info

Publication number: KR101181364B1
Application number: KR1020077015334A
Authority: KR
Inventors: 카츠미 아오야기
Original assignee: 가부시끼가이샤 센단세메이가가꾸겐큐죠
Priority date: 2004-12-28
Filing date: 2005-12-26
Publication date: 2012-09-11
Also published as: EP1837655B1; EP1837655A4; US20080153089A1; WO2006070732A1; JPWO2006070732A1; CN101088009B; EP1837655A1; KR20070090997A; DE602005023784D1; JP3961559B2; CA2592274C; CN101088009A; ATE482396T1; CA2592274A1

Abstract

생체내에 극미량으로 존재하는 항원, 단백질 등을 고감도로 검출하기 위하여 사용할 수 있는 블록화 효소 표식 복합체를 제공한다.

분자량 20,000 내지 4,000,000의 2분자 이상의 담체와 효소의 결합체가 효소 또는 링커를 통하여 결합된 블록체 중의 상기 효소 또는 담체에 프로브 분자가 결합된 블록화 효소 프로브 복합체.

항원, 단백질, 고감도, 블록화 효소 표식 복합체

Description

블록화 효소 프로브 복합체{Blocked enzyme probe complex}

본 발명은 프로브를 효소 표식하는 기술에 관한 것이고, 제작된 블록화 효소 프로브 복합체는 효소면역측정법이나 면역조직화학 등의 면역반응을 이용하는 면역측정에 널리 사용된다.

프로브를 효소에 의해 표식한 효소 표식 프로브는 면역학적 검출법 또는 측정법에서 널리, 일반적으로 사용되어 왔다. 예컨대 프로브를 서양고추냉이 퍼옥시다아제(HRP), 알칼리 포스파타아제(ALP), β-갈락토시다아제, 글루코오스 옥시다아제 등의 효소로 표식한 것은 면역조직화학이나 효소면역측정법 등의 검출 단계에서 사용가능하다.

면역조직화학법이나 효소면역측정법은 생체내의 자기 항원 또는 외래 항원을 검출하는 방법으로서, 오랫동안 범용화되어 왔다. 이들 면역반응을 이용한 검출법은 특이성과 감도가 높기 때문에 생체내에 존재하는 미량의 물질을 단리함 없이 검출할 수 있다. 그러나, 생체내에는 통상의 면역조직화학법이나 효소면역측정법으로는 검출할 수 없는 미량의 물질도 다수 존재하기 때문에, 이들을 검출하는 것을 목적으로 하여 측정방법의 감도를 상승시키는 방법이 검토되어 왔다.

예컨대 암 마커인 암태아성 항원(CEA)이나 α-피토프로테인(fetoprotein) 등 은 정상인의 혈청 중의 농도는 5~ 20 ng/ml이지만, 인간의 가스트린 방출 펩티드 전구체(ProGRP) 등은 정상인의 혈청 중의 농도가 14 pg/ml 정도이어서 ProGRP를 측정하기 위해서는 1000배 정도의 감도가 필요하다. 또한 외래 항원에서도 C형 간염 바이러스는 혈중에 존재하는 바이러스 양이 매우 적기 때문에 고감도의 항원 검출법이 요망되고 있었다. 그 항원을 검출하기 위해서는 100 내지 1000 카피(copy)의 바이러스 RNA를 검출하는 감도가 필요하고, 단백질의 농도로는 약 0.03 - 0.3 pg/ml의 감도가 필요하다.

이와 같은 생체내에 존재하는 미량의 항원 또는 물질을 검출하기 위해서는 면역측정법의 고감도화가 요망되고 있다. 이 효소면역측정법의 고감도화의 검토에 관해서는 이시가와 등이 상세하게 해설하고 있다(비특허문헌 1 참조). 효소면역측정법의 측정감도에 영향을 주는 인자로서는 측정계의 종류, 표식의 검출 감도, 표식법의 종류, 면역반응의 시간, 항원과 항체의 친화성 등이 고려되고 있다. 또한 실제로 샌드위치법으로 항원을 측정할 경우에 고감도화에 영향을 주는 조건으로서는 항체의 고상화 조건, 항원의 반응 효율, 효소 표식항체의 반응 효율, 표식항체의 고상으로의 비특이흡착의 경감, 표식항체의 첨가량, 면역반응의 시간, 면역반응의 온도, pH, 이온 강도, 완충액의 종류, 항원결정기의 입체적 위치와 수 등을 고려할 수 있다.

상기 검토에 더하여, 효소면역측정법의 고감도화의 방향으로서 검출단계에서 효소와 항체의 가교에 관한 표식방법의 개량이 행하여져 왔다. 각종의 표식항체의 제조법이 알려져 있고, 특히 이시가와 등에 의해 보고된 표식항체의 제조법은 일반 진단약에 널리 응용되고 있다. 이들의 대표되는 방법은 주로 항체(IgG이면, 분자량 약 150,000, Fab'(분자량 약 46,000))이라면 1분자에 효소를 1 내지 6 분자 결합시키는 것이고, 예컨대 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)(분자량: 40,000) 3분자와 IgG 1 분자를 결합시킨 결합체의 총 분자량은 40,000 x 3 + 150,000 = 270,000으로 된다. 또 알칼리포스파타아제(ALP)(분자량: 100,000) 3 분자와 IgG 1 분자를 결합시킨 결합체의 총 분자량은 100,000 x 3 + 150,000 = 450,000으로 된다. 그러나, 이시가와 등은 가장 고감도로 측정하기 위해서는 항체, 특히 Fc 부분을 제거한 Fab' 부분과 효소의 1 분자: 1 분자가 바람직하다고 기술하고, 항체 1 분자에 대해 단일한 효소 분자를 공유결합시키는 방법을 개발하였다(비특허문헌 2 참조). 효소와 항체의 비율이 1:1로 결합된 효소항체표식법의 경우, 예컨대 HRP 1 분자와 Fab' 1 분자를 결합시킨 결합체의 총 분자량은 40,000 + 46,000 = 86,000으로 된다. 이와 같이, 일반적으로 효소 표식체는 총 분자량 200,000 이하의 것이 이용되고 있는 것이 많다.

면역측정법의 고감도화의 방향으로서 단계 수를 증가시켜 시그날을 상승시키는 시도도 각종 행해져 왔다. 예컨대 비오틴과 애비딘의 고결합성을 이용하여 주로 제2 항체로 비오틴을 수 분자 이상 도입하여 놓고, 그 비오틴화 제2항체를 피분석물로 반응시킨 후 과잉량의 비오틴화 제2항체를 제거한다. 그후, 애비딘화 효소를 첨가하여 비오틴화 제2항체-애비딘 효소의 복합체를 형성시키고 제2항체에 결합되는 효소 수를 증가시켜 감도를 높이는 것이다. 애비딘 효소 대신 애비딘-비오틴 효소의 복합체도 사용할 수 있다. 또한 Butler 등은 퍼옥시다아제-항퍼옥시다아제 항체라는 항체 효소 복합체를 기재하고 있다(비특허문헌 3 참조). Bobrow 등은 퍼옥시다아제 표식 제2항체를 피분석물과 반응시켜 과잉량의 퍼옥시아다제 표식 제2 항체를 제거한 후 비오틴-티라미드(Tyramide)를 첨가하고 퍼옥시아다제 표식 제2 항체 주변의 블로킹 단백질에 라디칼로된 비오틴-티라미드를 결합시켜 세정후 퍼옥시아다제 표식 스트렙토애비딘을 이용하여 효소 시그널을 증폭시키고 있다(비특허문헌 4 참조). 그러나, 이들의 방법은 단계수가 증가하고, 측정시간이 장시간으로 되는 결점을 갖는다.

항체에 결합시키는 효소의 분자수를 증가시키기 위해, 어떤 담체에 효소를 결합시키고 그 위에서 그의 효소가 결합된 담체 상에 항체를 결합시키는 방법이 보고되어 있고, 이 방법에 의하면 단계수를 최소한으로 하여 고감도화를 실시할 수 있다(특허문헌 1 참조). 이 방법은 아미노 기를 가진 담체에 말레이미드 기 또는 티올(SH)기를 도입하고 효소를 결합시키고, 남겨진 담체의 적어도 1개의 아미노기에 말레이미드 기를 도입하여 항체를 담체에 결합시키는 방법이다. 이 방법은 담체를 통하여 항체와 효소를 결합시키기 때문에, 항체와 효소를 직접 결합시키는 것보다 다수의 효소가 결합하기 때문에 감도를 상승시킬 수 있는 것으로 생각되다. 그러나, 본 발명자들은 담체의 분자량을 5,000 내지 500,000, 바람직하게는 10,000 내지 300,000가 좋은 것으로 기재하고 있다. 이 경우, 예컨대 서양고추냉이 퍼옥시아다아제를 효소로 하면 분자량은 약 40,000 정도이다. 담체의 분자량이 500,000이라고 해도 물리적으로도 공간적으로도 500,000 분자에 결합될 수 있는 40,000 분자의 수는 한정되는 것은 당연하고, 담체에 결합가능한 효소의 분자수에도 한계가 있 다. 요컨대 담체에 효소와 항체를 결합시키면 담체 중의 관능기를 효소와 항체로 나누어야 하기 때문에 효소의 수가 적어지고 시그널은 낮아진다. 효소를 많이 결합시키면 항체의 결합공간이 적어지고 항원과의 반응성이 저하된다. 요컨대 가능하다면 항체와 효소를 많이 동일 담체상에 결합시키면 좋지만, 거대 분자의 제조 과정에 의해 응집덩어리, 침전 등이 생기고, 측정시에 백그라운드(background) 상승을 유발하며 효과로서 감도는 저하되는 경우가 많다.

특허문헌 1: 일본 특개 2000-88850호

비특허문헌 1: 초고감도 효소면역측정법, 이시가와 에이지, 1993년 학회출판 센터

비특허문헌 2: Imagawa 등, J. Appl. Biochem. 4권; 400, 1982

비특허문헌 3: Butler, (1981) Methods Enzymol., 73권; 482-523

비특허문헌 4: Bobrow, (1989) J. Immunol. Methods, 125, 279-285

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

본 발명자들은 상기 특허출원에 기재된 제조방법에 따라서 효소 표식 프로브를 시험적으로 제작하고, 고감도가 필요한 ProGRP의 측정이나 HCV 항원의 측정계에 응용하여 보았다. 그러나, 이들의 생체내에 존재하는 미량 물질을 측정하는 계에서는 종래의 것보다 감도가 높은 효소 표식 프로브를 사용하여도 충분한 감도를 얻을 수 없었다. 따라서 본 발명 중의 과제는 고감도의 측정계에 사용될 수 있는, 감도가 높은 효소 표식 프로브를 제공하는 것이다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명자들은 고감도의 효소 표식 프로브를 얻기 위하여 검토를 실시하였다. 그 결과, 2분자 이상의 담체를 효소를 통하여 결합시키고, 또 담체에 효소가 결합되어 있는 블록체를 형성하였다. 그렇게하여 블록체에 프로브를 결합시키는 것에 의해 목적으로 하는 고감도의 블록화 효소 프로브 복합체를 얻는데 성공하였다.

즉, 본 발명은 다음에 관한 것이다:

(1) 분자량 20,000 내지 4,000,000의 2분자 이상의 담체가 효소를 통하여 결합되고 그 담체에 효소가 결합된 복합체에 프로브 분자가 결합된 블록화 효소 프로브 복합체;

(2) 담체와 효소 분자가 담체 상의 관능기와 효소 분자내의 당쇄를 산화시켜 얻을 수 있는 알데히드 기에 의해 결합되어 있는 (1) 기재된 블록화 효소 프로브 복합체;

(3) 담체가 덱스트란, 아미노덱스트란, 피콜(ficoll), 덱스트린, 아가로오스, 풀루란(pullulan), 다양한 셀룰로오스, 키틴, 키토산, β-갈락토시다아제, 티로글로불린, 헤모시아닌, 폴리리신, 폴리펩티드 및 DNA로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 (1) 또는 (2)에 기재된 블록화 효소 프로브 복합체;

(4) 효소가 서양고추냉이 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 글루코오스 옥시다아제 및 루시페라아제로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 (1) 또는 (2)에 기재된 블록화 효소 프로브 복합체;

(5) 프로브가 항체 분자 또는 그의 기능적 단편, 프로테인 A, 프로테인 G, 프로테인 L, 렉틴, 리셉터(receptor) 및 애비딘으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 (1) 또는 (2)에 기재된 블록화 효소 프로브 복합체;

(6) 2종 이상의 프로브를 결합시킨 (1) 내지 (5)중 어느 하나에 기재된 블록화 효소 프로브 복합체;

(7) 항체 분자 또는 그의 기능적 단편이 항 HCV 코어 항원 항체, 항가스트린 방출 펩티드 전구체 항체 및 이들의 기능적 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 (5) 또는 (6)에 기재된 블록화 효소 프로브 복합체;

(8) 블록화 효소 프로브 복합체의 분자량이 440,000 이상인 (1) 내지 (7) 중의 어느 하나에 기재된 블록화 효소 프로브 복합체;

(9) (1) 내지 (8) 중의 어느 하나에 기재된 블록화 효소 프로브 복합체를 포함하는 면역측정용 키트 또는 핵산검출시약;

(10) 분자량 20,000 내지 4,000,000의 담체와 효소를 결합시킨 블록체를 형성하는 단계, 및 상기 블록체에 프로브를 결합시키는 단계로 구성되는 (1) 내지 (8)에 기재된 블록화 프로브 복합체를 제조하는 방법;

(11) 담체와 효소 분자의 중량비가 담체: 효소 = 1: 0.1 내지 1:20로 반응시켜 블록체를 형성하는 (10)에 기재된 방법.

또한 본 발명의 (1)의 분자량 20,000 내지 4,000,000의 2분자 이상의 담체의 결합은 효소를 거치지 않은 결합도 포함한다. 예컨대 관능기를 갖는 링커나 단백질이어도 가능하다. 또한 담체, 효소, 프로브의 각각의 결합은 관능기를 갖는 링커 분자를 통하여 블록화 효소 프로브 복합체를 형성한다.

요컨대 본 발명은 담체를 효소 또는 링커를 통하여 결합시키고 그 분자에 효소 및 프로브를 결합시키는 것에 의해 다수의 효소분자와 프로브 분자를 1분자 중에 갖는 블록화 효소 프로브 복합체이다.

본 발명의 블록화 효소 프로브 복합체는 담체에 효소를 결합시켜 블록체를 형성하고, 이 블록체에 프로브 분자를 결합시켜 제조할 수 있다. 또한 본 발명의 블록화 효소 프로브 복합체는 담체에 효소와 프로브를 결합시켜 결합체를 형성하고, 이 결합체를 서로 결합시켜 블록화하여도 제조할 수 있다.

본 발명에서는 효소에 의해 담체를 결합시켜 분자량을 크게 하는 것에 의해 보다 다수의 효소 또는 프로브를 그 블록체에 결합시킬 수 있다. 또한 한편 블록체의 표면에 프로브가 결합되어 있기 때문에 입체장애가 생기기 어렵고, 프로브 분자 사이즈에 상관없이 제작가능하다. 또한 블록화 효소 프로브 복합체의 최종적인 산물로서는 분자량 440,000 이상의 블록화 효소 프로브 복합체의 효과가 높고, 또한 668,000 이상의 것이 보다 고감도로 된다. 원칙적으로는 블록화 효소 프로브 복합체의 분자량이 클수록 복합체-분자에 결합되어 있는 효소의 양이 많아지고, 감도가 상승한다. 본 발명에 기재된 방법으로 분자량이 큰 블록화 효소 프로브 복합체가 제작될 수 있지만, 분자량이 큰 블록화 효소 프로브 복합체를 선택하기 위하여 겔 여과 등의 방법이 이용될 수 있다.

이 블록화 후의 분자량은 사용하는 담체, 효소, 프로브의 종류에 따라서 다소 변동이 있지만, 어떤 것이든 액체 중에서 블록화 효소 프로브 복합체가 침전 또는 침강하지 않는 분자량이면 좋고, 특히 상한은 규정되지 않아도 된다. 참고치로서는 Dextran을 담체로 사용한 경우에는 20,000,000이어도 어떤 문제없고(후술하는 실시예 1 및 6), 40,000,000 내지 100,000,000이어도 문제는 생기지 않는다.

본 발명은 당초 이뮤노에세이, 면역조직화학의 분야에서 사용될 수 있는 효소 프로브 복합체에 관하여 검토하는 과정에서 실시된 것이지만, 다른 분야에 적용하는 것에 제한은 없다.

발명의 효과

본 발명의 효소표식항체는 생체내에 미량밖에 존재하지 않는 항원, 단백질을 검출할 때에 종래의 효소표식항체로는 검출불가능하였던 것을 검출가능하게 하는 것이다. 이 효소표식항체를 사용하면 종래 측정불가능하였던 항원이나 단백질이 측정될 수 있다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명에서 말하는 담체라는 것은 분자량 20,000 내지 4,000,000인 것이라면 특별한 제한은 없다. 그러나, 감도를 향상시키기 위하여, 다수의 효소가 결합될 수 있는 것이 바람직하기 때문에 어느 정도의 분자량을 가진 것이 바람직하다. 담체의 예로서는 다당류나 고분자량 단백질 또는 펩티드 폴리머를 들 수 있고, 이들의 분자량은 20,000 내지 20,000,000, 바람직하게는 20,000 내지 4,000,000, 보다 바람직하게는 70,000 내지 2,000,000의 것이 적합하다. 다당류나 펩티드 폴리머를 사용하는 경우, 동일 분자량이어도 측쇄가 풍부한 편이 시그널이 높은 경향이 있다.

본 발명에서 다당류의 담체로서는 덱스트란, 아미노덱스트란, 피콜(ficoll), 덱스트린, 아가로오스, 풀루란(pullulan), 다양한 셀룰로오스, 키틴, 키토산, 가용성 전분 등을 예시할 수 있다. 또한 본 발명에서 고분자량 단백질의 담체로서는 β-갈락토시다아제, 티로글로불린, 헤모시아닌 등이 예시될 수 있다. 또한 본 발명에서 펩티드 폴리머의 담체로서는 폴리리신 외에 각종 펩티드폴리머가 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용할 수 있는 효소에는 특별히 제한은 없지만, 면역측정법에서 일반적으로 사용되는 서양고추냉이 퍼옥시다아제(HRP), 알칼리 포스파타아제(ALP), β-갈락토시다아제, 글루코오스 옥시다아제, 루시페라제 등이 적절히 사용될 수 있다. 효소는 2분자 이상의 담체 또는 담체와 프로브 분자에 결합되기 때문에 2개 이상의 관능기, 예컨대 당쇄와 아미노기, 또는 2개 이상의 아미노기, 아미노기와 카르복시기, 티올 기와 아미노기 등을 갖는 효소가 바람직하다.

담체와 효소의 결합에는 어떤 링커나 결합양식도 이용될 수 있지만, 담체와 효소의 결합 후, 그 블록체에 프로브를 결합시킬 필요가 있기 때문에 효소 또는 담체에 관능기를 남겨 놓을 필요성이 있다.

예컨대 분자량 20,000 내지 4,000,000의 담체에 존재하는 히드라진 기, 또는 적당한 링커 분자를 사용하여 담체에 도입한 히드라진 기를 통하여 효소 분자와 결합시키고 또는 적합한 링커 분자를 사용하여 효소 분자에 도입한 히드라진 기를 통하여 각 담체와 결합시켜 효소를 통하여 블록체를 제작한다. 이 블록체 중의 담체 또는 담체에 결합되어 있는 효소 분자내의 관능기를 블록 분자를 결합시키는 것에 의해 블록화 효소 프로브 복합체를 제작할 수 있다.

또는 적합한 링커 분자를 사용하여 분자량 20,000 내지 4,000,000의 담체에 도입한 히드라진 기와 효소 분자내의 당쇄를 산화시켜 얻을 수 있는 알데히드기를 결합시켜 담체와 효소 분자를 결합하고, 또한 효소분자를 통하여 블록화된 블록체 중의 담체 또는 담체에 결합되어 있는 효소 분자내의 관능기에 결합시킨 링커 분자를 통하여 프로브 분자를 결합시키는 것에 의해 동일하게 블록화 효소 프로브 복합체를 제작할 수 있다.

이 경우, 담체 또는 효소에 도입하는 히드라진 기를 갖는 링커 분자는 히드라진 기(-NHNH₂)를 갖는 황산 히드라진이나 염산 히드라진과 같은 히드라진 염류이어도 좋고, 히드라진기(-CO-NHNH₂)를 갖는 히드라지드류 또는 관능기와 히드라진 기를 갖는 물질이어도 좋다.

또한 담체 또는 효소 분자와 프로브 분자를 결합시키는 링커 분자는 말레이미드기, 숙시미딜 기, 카르복실기, 티올 기 등의 관능기를 가진 것이라면 사용가능하다.

또한 담체 상의 히드라진 기 등의 관능기의 수에도 의하지만, 효소를 통한 블록화 효소를 제조할 때의 담체의 중량에 대한 효소의 중량은 0.2 내지 10배가 바람직하고, 0.3 내지 5배가 더욱 바람직하다.

또한 일례로서 서양고추냉이 퍼옥시다아제(HRP)의 당쇄를 산화시켜 히드라진 기를 도입한 분자량 20,000 이상의 Dextran에 결합시키고, 효소를 통하여 블록화 효소를 제작한다. 담체 상의 잔존 히드라진 기 및 HRP의 잔존 아미노 기에 N-(6-말레이미도카프로일옥시)숙신이미드(EMCS)와 같은 링커 분자를 결합시키고 블록화 효소 표면에 말레이미드기를 도입하여 블록 분자 중 또는 프로브에 도입한 SH기를 반응시켜 블록화 효소 브로브 복합체를 제조한다. 이와 같은 블록화 효소 블록 복합체를 제조하기 위하여 효소의 당쇄를 이용하고 프로브의 결합에 잔존 히드라진 기 및 잔존 아미노 기를 이용하는 것이다.

블록체와 프로브의 결합에는 어떠한 가교제를 사용하여도 좋고, 또한 어떠한 결합양식이어도 좋다. 바람직하게는 수용액 중에서 안정성이 높은 헤테로 이관능성 가교제 또는 호모 이관능성 가교제가 바람직하다.

프로브로서는 항체(모노클로날 항체, 폴리클로날 항체) 및 그의 단편 (F(ab')₂, Fab', Fab, F(abc'), Fabc' 등), 각종 리셉터, 각종 애비딘(애비딘 D, 스트렙토애비딘 등), 프로테인 A, 프로테인 G, 프로테인 L, 각종 렉틴(콘카나발린 A, 렌틸 렉틴, 피토해마글루티닌 등), 각 피분석핵산 결합 프로브 등이 사용될 수 있다.

항체는 목적으로 하는 항원 또는 피분석물과 결합하는 것이라면 좋다. 항체는 펩신이나 파파인과 같은 프로테아제를 사용하여 F(ab')₂ 나 Fab와 같은 단편을 얻을 수 있다. 일반적으로 항체의 중쇄(H쇄)는 S-S 결합에 의해 중쇄 끼리가 결합되어 있고, 그 결합은 환원제에 의해 절단된다. 환원제로서는 시스테아민이나 머캅토에탄올 등을 들 수 있고, F(ab')₂ 도 그와 같은 환원제로 Fab'로 절단되어 티올(SH)기가 새로이 생긴다. 본 발명에는 항체의 이들 단편(F(ab')₂, Fab', Fab, F(abc'), Fabc' 등)도 사용할 수 있다.

본 발명을 보다 상세하게 또 비제한적으로 설명하기 위하여 이하에 효소 프로브 복합체의 제조방법 및 이들의 성능에 대하여 실시예를 들 수 있다.

도 1은 본 발명의 효소항 HCV 코어 항원 모노클로날 항체 복합체의 겔 여과에 의해 분자량 해석 결과를 나타낸다.

도 2는 효소 항 HCV 항원 모노클로날 항체 복합체와 종래법의 효소 항체를 사용하여 코어 항원의 검출감도 비교의 결과를 나타낸다.

도 3은 모노클로날 항체 1종류를 담체-효소 복합체와 결합시킨 경우와, 모노클로날 항체 2종을 담체-효소 복합체로 결합시킨 경우의 반응성을 나타낸다.

도 4는 효소의 아미노기를 블록하여 프로브를 결합시킨 것과 아미노기를 블록시키지 않고 프로브를 결합시킨 것의 반응성을 나타낸다.

도 5는 효소 항 ProGRP 항원 모노클로날 항체 복합체와 종래법의 효소 항체를 사용한 ProGRP의 검출 감도비교의 결과를 나타낸다.

실시예 1

담체로서 덱스트란 T2000을 사용한 효소-항HCV 항원 모노클로날 항체 복합체의 제조

덱스트란 T2000 (평균 분자량 2,000,000; 애머샴 제조) 0.3 g을 평량하고, 0.1M 인산 완충액(pH 7.0) 6 ml에 용해시켰다. 과요오드산 나트륨 용액을 3 ml 첨가 혼합하고 실온에서 2시간 정치반응시켜 겔여과(Sephadex G25, 애머샴 제조)를 실시하고, 보이드 분획을 분취하여 히드라진 염산염(와코우 준야쿠 제조)를 첨가하여 덱스트란에 히드라진을 도입하였다. 이론적으로는 분자량 2,000,000의 덱스트란에는 최대 22,000의 히드라진이 도입된다. 퍼옥시다아제(HRP, 토요보우 제조) 100 mg을 평량하고, 0.1M 탄산수소나트륨 용액 3 ml에 혼합 용해하고 과요오드산 나트륨 용액을 1.5 ml 첨가혼합하여 실온에서 2시간 정치 반응시켰다. 겔여과(Sephadex G25)에 의해 탈염시킨 후, 먼저 얻은 약 150 mg의 덱스트란 히드라지드를 첨가 혼합하여 실온에서 2시간 반응시켜 환원후 글리신을 0.1M로 되도록 첨가하고 4℃에서 4시간씩 3회 투석을 실시하여 블록화 담체 HRP 결합물을 얻었다. 이때 결합하지 않았던 HRP는 10% 이하이기 때문에 회수율도 포함하여 덱스트란 T2000 (평균분자량 2,000,000) 1분자에 약 12 내지 16개의 HRP가 결합된 것으로 생각된다. 이 결합물 5 mg에 디메틸포름아미드(DMF)에 용해시킨 N-(6-말레이미도카프로일옥시)숙신이미드 (EMCS, 도진 카가꾸) 1 mg을 첨가하여 실온에서 2시간 반응시켜 겔 여과(Sephadex G25)로 과량의 EMCS를 제거하고, 담체 HRP 결합물에 말레이미드를 도입하였다. 0.1M 인산 완충액(pH 6.0) 중 항 HCV 코어 항원 모노클로날 항체 3.5 mg (c11-10F(ab')₂ 와 c11-14F(ab')₂ 를 등량 혼합)의 F(ab')₂ 용액에 0.1 M 시스테아민 염산염을 1/10 용량 첨가하여 37℃에서 90분간 인큐베이션을 실시한 Fab'로 하 였다. 겔 여과(Sephadex G25)를 실시하여 보이드 분획을 분취 Fab'를 얻었다. 이 Fab'와 말레이미드 기를 도입한 담체 HRP 결합물을 하룻밤 4℃에서 반응시켜 겔 여과(Superdex 200 pg, 1.6 x 60 cm, 애머샴 제조)를 실시하여 유리 Fab'를 제거한다. 이때 본 발명의 HRP-Fab 복합체는 거의 보이드 분획 근방에 출현한다. 이때 유리 Fab'는 10%이하이기 때문에, 회수율도 포함하여 덱스트란 T2000 (평균 분자량 2,000,000) 1분자당 약 6 내지 10개의 Fab'가 결합된 것으로 생각된다. 이 분취된 분획에 우혈청 알부민(BSA)을 0.5%로 되게 첨가하여 4℃에서 보존하였다. 이와 같이 하여 제조된 HRP-Fab 복합체의 403 nm의 흡광도를 측정하고, HRP의 403 nm의 분자흡광계수로부터 복합체의 HRP 농도를 구하였다.

실시예 2

담체로서 덱스트란 T70을 사용한 효소-항HCV 코어 항원 모노클로날 항체 복합체의 제조

덱스트란 T70 (평균 분자량 70,000; 애머샴 제조) 0.3 g을 평량하고, 실시예 1과 동일하게 HRP-Fab 복합체를 얻고, 403 nm의 흡광도를 측정하여 HRP의 403 nm의 분자흡광계수로부터 복합체 중의 HRP 농도를 구하였다.

실시예 3

담체로서 덱스트란 T500을 사용하여 담체와 효소의 양비를 변화하여 효소-항HCV 코어 항원 모노클로날 항체 복합체의 제조

덱스트란 T500 (평균분자량 500,000; 애머샴) 0.3 g을 평량하고, 실시예 1과 동일한 담체(150 mg): 효소 (100 mg)의 중량비 (0.66), 담체 150 mg에 대하여 효소량을 2배량(300 mg)의 중량비(2.00) 및 담체 150 mg에 대한 효소량을 3.3배량 (500 mg)의 중량비(3.33)로 담체-효소 결합물을 제조하고, 그후 실시예 1과 동일하게 항HCV 코어 항원 모노클로날 항체를 결합시켰다. 403 nm의 흡광도를 측정하고, HRP의 403 nm의 분자흡광계수로부터 복합체 중의 HRP 농도를 구하였다.

실시예 4

담체로서 덱스트란 T500을 사용한 효소-항ProGRP 항체 복합체의 제조

덱스트란 T500 (평균분자량 500,000; 애머샴 제조) 0.3 g을 평량하고, 실시예 1과 동일하게 담체 HRP 결합물을 얻었다. 이 결합물 5 mg에 DMF에 용해시킨 EMCS 1 mg을 첨가하여 실온에서 2시간 반응시켰다. 겔 여과 (Sephadex G25)로 과량의 EMCS 를 제거하고, 담체 HRP 결합물에 말레이미드를 도입시켰다. 0.1m 인산완충액(pH 6.0)중 항PRoGRP 모노클로날 항체(2B10)의 F(ab')₂ 용액에 0.1M 시스테아민 염산염을 1/10 용량 첨가하고 37℃에서 90분간 배양을 실시하여 Fab'로 하였다. 겔 여과(Sephadex G25)를 실시하여 보이드 분획을 분취하여 Fab'를 얻었다. 이 Fab'와 말레이미드를 도입한 담체 HRP 결합물을 보이드 근방의 분획을 분취하고 우혈청 알부민(BSA)를 0.5%로 되도록 첨가하여 4℃에서 보존하였다. 이와 같이하여 제조한 HRP-Fab 복합체의 403 nm의 흡광도를 측정하고, HRP의 403 nm의 분자흡광계수로부터 복합체 중의 HRP 농도를 구하였다.

<비교예 1>

종래법을 사용한 효소항HCV 코어 항원 모노클로날 항체의 제조

이시가와 등에 의해 보고된 표식항체의 제조법은 일반적인 진단약에 널리 사용되고 있다. 이 방법(초고감도 효소면역측정법, 이시가와 에이지, 1993년 학회 출판 센터)를 종래법으로 사용하였다. HRP 4 mg을 평량하고, 0.1M 인산 완충액(pH 7.0) 0.6 ml에 용해시켰다. DMF에 용해시킨 EMCS를 제거하고, HRP의 아미노 기에 말레이미드를 도입하였다. 0.1M 인산완충액(pH 6.0)중 항HCV 코어 항원 모노클로날 항체(c11-10 및 c11-14)의 각각의 F(ab')₂용액에 0.1M 시스테아민 염산염을 1/10 용량 첨가하고, 37℃에서 90분간 배양하여 Fab'로 하였다. 겔 여과(Sephadex G25)ㄹ르 실시하여 보이드 분획을 분취하여 Fab'를 얻었다. 이 Fab'와 말레이미드를 도입한 HRP 결합물을 하룻밤 4℃에서 반응시켰다. 겔 여과(Superdex 200pg, 1.6 x 60 cm)를 실시하여 HRP-Fab의 분획을 분취하고, BSA를 0.5%로 되도록 첨가하여 4℃에서 보존하였다. 이와 같이 하여 제조된 HRP-Fab 결합물의 403 nm의 흡광도를 측정하고, HRP의 403 nm의 분자흡광계수로부터 결합물 중의 HRP 농도를 구하였다.

<비교예 2>

종래법을 사용한 효소항ProGRP 모노클로날 항체의 제조

비교예 1과 동일하게 HRP 의 아미노기에 말레이미드를 도입시켰다. 0.1M 인산 완충액(pH 6.0)중 항 PRoGRP 모노클로날항체(2B10)의 F(ab')₂ 용액에 0.1M 시스테인아민 염산염을 1/10 용량 첨가하고, 37℃에서 90분간 배양하여 Fab'로 하였다. 겔 여과(Sephadex G25)에 의해 보이드 분획을 분취하고, Fab'를 얻었다. 이 Fab'와 말레이미드를 도입한 HRP 결합물을 하룻밤 동안 4℃에서 반응시켜 Fab'를 얻었다. 이 Fab'와 말레이미드를 도입한 HRP 결합물을 하룻밤 4℃에서 반응시켜 겔 여과(Superdex 200pg, 1.6 x 60 cm)를 실시하여 HRP-Fab의 분획을 분취하고, BSA를 0.5%로 되도록 첨가하여 4℃에서 보존하였다. 이와 같이 하여 제조한 HRP-Fab 결합물의 403 nm의 흡광도를 측정하고, HRP의 403 nm의 분자흡광계수로부터 결합물 중의 HRP 농도를 구하였다.

실시예 5

실시예 1에서 제조한 효소 항HCV 항원 모노클로날 항체 복합체의 겔 여과에 의한 분자량 해석

실시예 1에서 제조한 효소 항HCV 코어 항원 모노클로날항체 복합체(Sepharyl S-500 Superfine (애머샴 제조)(1.6 x 60) 칼럼을 사용하여 겔 여과를 실시하였다. 이 Sepharcryl S-500 Superine 칼럼은 주로 대분자량의 분자 및 소입자를 분리하기 위하여 사용된다. 파마시아 Gel filtration theory and practice에 의하면, 이 칼럼 분획 범위는 다당류로 4 x 10⁴ 내지 2 x 10⁷ 이다. 캐리어에는 PBS를 사용하고, 1 ml/분의 유속으로 겔 여과를 실시하였다. 4 ml/2 분씩 각 분획을 분취하고 403 nm의 흡광도를 측정하여 HRP의 분자흡광계수로부터 HRP 농도(㎍/ml)를 구하고, 그후 각 분획의 반응성을 HRP 농도 환산으로 1 ㎍/ml로 희석하여 검토하였다. 측정방법은 이하와 같다.

96개 웰 마이크로플레이트에 항 HCV 코어 항원 모노클로날 항체 (c11-3 및 c11-7 등량 혼합)을 4 ㎍/ml의 농도로 200 ㎕를 가하고, 4℃에서 하룻밤 배양하였 다. 10 mM 인산 완충액(pH 7.3)으로 세정한 후 0.5% 카제인을 350 ㎕ 가하여 2시간 배양하였다. 재조합체 HCV 항원(c11)을 0fmol/L, 1200fmol/L의 농도로 조정한 것을 샘플로서 첨가하여 교반하면서 실온에서 60분간 배양하였다. 0.05% Tween 20을 포함하는 10 mM 인산완충액(pH 7.3)(세정액)으로 6회 세정을 실시한 후 2차 항체로서 각 분획을 HRP 농도환산으로 1 ㎍/ml로 희석시킨 것과 종래법으로 제조한 효소항체를 HRP 농도로 1㎍/ml로 200 ㎕를 가하고, 30분간 배양하였다. 또한 세정액으로 6회 세정하고, 기질 용액 (오르토페닐렌디아민, 과산화수소) 200 ㎕를 가하여 30분간 배양하였다. 5 N 염산 50 ㎕를 가하여 효소반응을 저지시키고, 마이크로플레이트 리더(코로나 MTP32)로 492 nm(레퍼런스 파장 630 nm)의 흡광도를 측정하였다. 각 겔 여과 분획의 HRP 농도와 상술한 검정결과(코어 항원 1200 fmol/L의 흡광도와 0fmol/L의 흡광도의 차)를 표 1 및 도 1에 나타내었다. 3종류의 분자량 마커의 분자량은 티로글로불린; 66,800, 페리틴;440,000, BSA; 68,000이다. 또 동시에 측정한 종래법으로 제조한 효소 항체 1 ㎍/ml에서 코어 항원 0fmol/L, 1200fmol/L 일 때의 흡광도는 각각 0.000, 0.050 이었다. 따라서, 종래법에 의한 코어 항원 1200 fmol/L의 흡광도와 0 fmol/L의 흡광도의 차는 0.050으로 되었다. 도 1로부터, 분자량이 크게 됨에 따라서 코어 항원 1200 fmol/L에서의 흡광도가 상승하는 경향이 있는 것이 확인되었다.

분획 19 이후에서는 종래법과 비교하여 시그널의 상승은 3배 이하이었지만, 분획 2 내지 18에서는 시그널의 상승은 3배 이상이었다. 티로글로불린(분자량 668,000)은 분획 17 근방에, 페리틴(분자량 440,000)은 분획 18에 피크를 나타내었기 때문에 분자량 약 440,000 이상이고 종래법에 의해서도 약 5.9배 이상의 우수한 효과가 확인되었고, 분자량 668,000 이상에서 종래법 보다도 약 7.7배 이상의 우수한 효과가 확인되었다.

본 실시예에서 담체 덱스트란 T2000의 평균분자량은 2,000,000이고, 이 담체에 분자량 40,000의 HRP가 14 분자 결합하고, 또한 이 블록화 담체 - 효소에 분자량 46,000의 Fab'가 8분자 결합한 효소 프로브 복합체의 분자량은 약 2,900,000으로 되었다. 이것이 본 실시예에서 효소 프로브 복합체의 기본 단위인 것으로 해석된다.

한편, 본 실시예에서의 겔 여과에 사용된 Sephacryl S-500 Superfine 칼럼의 분획 범위는 4 x 10⁴ 내지 2 x 10⁷ 이지만, 표 1로부터 분명한 바와 같이, 보이드 분획을 포함하는 최초의 분획도 높은 활성을 나타내고 있다. 이 보이드 분획을 포함하는 최초의 분획은 적어도 2 x 10⁷ 또는 그 이상의 분자량을 갖는 효소 프로브 복합체를 포함하고 있고, 본 실시예에서 효소 프로브 복합체의 기본 단위의 분자량은 2,900,000이기 때문에, 보이드 분획을 포함하는 최초의 분획에 존재하는 효소 프로브 복합체는 적어도 2개 이상의 최소 단위인 효소 프로브 복합체가 공유결합으로 결합되어 보다 분자량이 큰 효소 프로브 복합체, 즉 블록화 효소 프로브 복합체를 형성하고 있다고 이해할 수 있다.

또한 본 실시예에서 사용한 담체 덱스트란 T2000에는 그 평균 분자량 2,000,000을 하회하는 분자량의 덱스트란이나 이들의 분해물도 존재하고 있다. 이들도 본 발명의 효소 프로브 복합체 또는 블록화 효소 프로브 복합체의 형성에 관여하고 있는 것은 명확하고, 따라서 본 실시예에는 효소 프로브 복합체의 기본 단위의 평균 분자량인 2,900,000 이하의 분자량을 갖는 효소 프로브 복합체도 포함하고 있고, 이들도 또한 본 발명에 포함된다.

실시예 6

담체와 효소의 양비를 변화시킨 경우의 효소 항HCV 코어 항원 모노클로날 항체 복합체의 반응성

실시예 3에서 제조한 효소 항HCV 코어 항원 모노클로날 항체 복합체를 사용하여 이들의 반응성을 효소 농도 환산으로 2 ㎍/ml로 희석하여 검토하였다. 검정 방법은 이하와 같다.

96개 웰 마이크로플레이트에 항 HCV 코어 항원 모노클로날 항체 (c11-3 및 c11-7 등량 혼합)을 4 ㎍/ml의 농도로 200 ㎕를 가하고, 4℃에서 하룻밤 배양하였다. 10 mM 인산 완충액(pH 7.3)으로 세정한 후 0.5% 카제인을 350 ㎕ 가하여 2시간 배양하였다. 재조합체 HCV 항원(c11)을 0fmol/L, 25.9fmol/L, 77.8 fmol/L, 233.3 fmol/L, 700 fmol/L의 농도로 조정한 것을 샘플로서 첨가하여 교반하면서 실온에서 60분간 배양하였다. 0.05% Tween 20을 포함하는 10 mM 인산완충액(pH 7.3)(세정액)으로 6회 세정을 실시한 후 각 효소 항 HCV 코어 항원 모노클로날 항체 복합체를 효소 농도 환산으로 2 ㎍/ml로 희석한 것을 가하여 30분간 배양하였다. 또한 세정액으로 6회 세정하고, 기질 용액 (오르토페닐렌디아민, 과산화수소) 200 ㎕를 가하여 30분간 배양하였다. 5 N 염산 50 ㎕를 가하여 효소반응을 저지시키고, 마이크로플레이트 리더(코로나 MTP32)로 492 nm(레퍼런스 파장 630 nm)의 흡광도를 측정하였다.

담체: 효소의 중량비 0.66, 2.00 및 3.33으로 제조한 담체-효소 결합물을 사용하여 제작한 항 HCV 코어 항원 모노클로날 항체 복합체의 반응성은 담체: 효소의 중량비 0.66과 비교하여, 중량비 2.00인 편이 77.6%, 중량비 3.33인 편이 70.5% 이고, 효소양이 많을수록 반응성의 저하가 확인되었다. 담체: 효소의 중량비가 2.00, 3.33 또는 그 이상인 것도 종래의 것 보다 충분히 고감도인 복합체를 얻을 수 있다. 그러나, 효소가 담체량 보다도 과잉량 존재하면, 1개의 담체 분자에 효소가 많이 결합되기 때문에 최소 단위인 효소-담체가 많이 생기지만, 담체-효소-담체-효소-담체-효소로 되는 최소 단위 덩어리가 효소를 통하여 결합되어 있는 것이 적어진다는 것이 추측되었다. 즉, 실시예 5의 겔 여과 해석에서도 서술한 바와 같이, 본 발명의 효소 프로브 복합체는 적어도 2개 이상의 최소 단위인 효소 프로브 복합체가 공유결합으로 결합되어 보다 분자량이 크고 효소 프로브 복합체, 즉 블록화 효소 프로브 복합체를 형성하는 것에 의해 반응성이 높아진 것이라 이해할 수 있다.

실시예 7

실시예 1 및 2에서 제조한 효소 항 HCV 코어 항원 모노클로날 항체 복합체와 종래법의 효소 항체를 사용할 때의 코어 항원의 검출 감도 비교

96개 웰 마이크로플레이트에 항 HCV 코어 항원 모노클로날 항체 (c11-3 및 c11-7 등량 혼합)을 4 ㎍/ml의 농도로 200 ㎕를 가하고, 4℃에서 하룻밤 배양하였다. 10 mM 인산 완충액 pH 7.3 (PBS)으로 세정한 후 0.5% 카제인을 350 ㎕ 가하여 2시간 배양하였다. 흡인하여 0.5% 카제인을 제거한 후 재조합체 HCV 항원(c11)을 21870 fmol/L로부터 3배씩 희석계열을 제조하여 샘플로 첨가하고, 교반하면서 실온에서 60분간 배양하였다. 세정액으로 6회 세정을 실시한 후 2차 항체로서 실시예 1 및 2에서 제조한 효소-항 HCV 코어 항원 모노클로날 항체 복합체 또는 종래법으로 제조한 효소 항체를 HRP 농도로 환산하여 2.5 ㎍/ml 농도로 200 ㎕를 가하고, 30분간 배양하였다. 또한 세정액으로 6회 세정하고, 기질 용액 (10 mg 오르토페닐렌디아민, 과산화수소) 200 ㎕를 가하여 30분간 배양하였다. 5N 염산 50 ㎕를 가하여 효소반응을 저지시키고, 마이크로플레이트 리더(코로나 MTP32)로 492 nm(레퍼런스 파장 630 nm)의 흡광도를 측정하였다. 도 2에 그 결과를 도시하였다. 0fmol/L과 OD 0.030의 차를 검출 한계로 가정하면, 종래법의 효소 항체로는 약 263 fmol/L, 실시예 2의 효소 항체 복합체로는 약 75 fmol/L, 실시예 1의 효소 항체 복합체로는 약 10 fmol/L (0.2pg/ml)가 검출가능하였다. 요컨대 종래법과 비교하여 3.5 내지 26.3배 감도가 상승하였다. 감도 상승에 따라서 HCV 감염의 유무의 판단이나 바이러스 정량의 폭이 넓어져서 유용성이 높아졌다.

실시예 8

2종류의 모노클로날 항체를 동시에 결합시킨 효소 항 HCV 코어 항원 모노클로날 항체 복합체와 각각 결합시킨 효소 항 HCV 코어 항원 모노클로날 항체 복합체를 사용하여 코어 항원의 검출 감도 비교

실시예 1 또는 2에서는 2종류의 항 HCV 코어 항원 모노클로날 항체(c11-10 F(ab')₂ 와 c11-14 F(ab')₂를 동시에 블록화 담체 효소와 반응시켰다. 또한 이들 2종류의 모노클로날 항체를 각각 블록화 담체 효소와 반응시켜 효소 항 HCV 코어 항원 모노클로날 항체 복합체를 제조하였다. 2종류의 모노클로날 항체를 동시에 결합시킨 것과 c11-10 및 c11-14 모노클로날 항체 단독으로 결합시킨 것은 1 ㎍/ml의 농도로, 또한 c11-10 및 c11-14 모노클로날 항체 단독으로 결합시킨 것을 각 0.5㎍/ml 씩 혼합한 것(계 1 ㎍/ml)의 반응성을 검토하였다(도 3).

96개 웰 마이크로플레이트에 항 HCV 코어 항원 모노클로날 항체 (c11-3 및 c11-7 등량 혼합)을 4 ㎍/ml의 농도로 200 ㎕를 가하고, 4℃에서 하룻밤 배양하였다. 10 mM 인산 완충액 pH 7.3 (PBS)로 세정한 후 0.5% 카제인을 350 ㎕ 가하여 2시간 배양하였다. 흡인하여 0.5% 카제인을 제거한 후, 재조합체 HCV 항원(c11)을 21870 fmol/L로부터 3배씩 희석계열을 제조하여 샘플로 첨가하고, 교반하면서 실온에서 60분간 배양하였다. 세정액으로 6회 세정을 실시한 후 2차 항체로서 2종류의 모노클로날 항체를 동시에 결합시킨 것, c11-10 및 c11-14 모노클로날 항체 단독으로 결합시킨 것, 그리고 c11-10 및 c11-14 모노클로날 항체 단독으로 결합시킨 것을 각각 동량 혼합한 것을 HRP 농도로 환산하여 1 ㎍/ml 농도로 200 ㎕를 가하고, 20분간 배양하였다. 또한 세정액으로 6회 세정하고, 기질 용액 (10 mg 오르토페닐렌디아민, 과산화수소) 200 ㎕를 가하여 30분간 배양하였다. 5N 염산 50 ㎕를 가하여 효소반응을 저지시키고, 마이크로플레이트 리더(코로나 MTP32)로 492 nm(레퍼런스 파장 630 nm)의 흡광도를 측정하였다.

c11-10 및 c11-14 모노클로날 항체 단독으로 결합시킨 보다는 이들을 각각 0.5 ㎍/ml씩 혼합한 것의 반응성이 약간 향상(약 1.2배)하였지만, 그 혼합한 것보다도 2 종류의 항체를 동시에 결합시킨 것은 약 2 내지 2.5배 반응성이 향상되었다. 따라서 2종류 이상의 모노클로날 항체 및 그의 단편 등의 프로브를 블록화 담체 효소와 결합시키는 것도 더욱 효과적이다.

실시예 9

모노클로날 항체를 블록화 담체 효소 상의 담체에 특이적으로 결합시킨 효소 항 HCV 코어 항원 모노클로날 항체 복합체의 반응성

HRP의 아미노기는 매우 적고, 이시가와 등이 HRP 에 아미노기를 이용하여 말레이미드기를 도입하기 위하여 검토한 결과, 1개로부터 3개 이내[이사가와 에이지 저, 생물화학실험법 27, 효소표식법, 학회출판 센터]이다. 그 HRP가 작은 아미노기를 2-메틸말레산 무수물을 사용하여 블록한 후 실시예 3과 동일한 방법으로 담체로 하여 덱스트란 T500을 사용하여 담체: 효소의 중량비 0.66으로 담체 - 효소 결합물을 제조한 후, 항 HCV 코어 항원 모노클로날 항체를 결합시켰다. 403 nm의 흡광도를 측정하고, HRP의 403 nm의 분자흡광계수로부터 복합체 중의 HRP 농도를 구하였다.

96개 웰 마이크로플레이트에 항 HCV 코어 항원 모노클로날 항체 (c11-3 및 c11-7 등량 혼합)을 4 ㎍/ml의 농도로 200 ㎕를 가하고, 4℃에서 하룻밤 배양하였다. 10 mM 인산 완충액 pH 7.3 (PBS)로 세정한 후 0.5% 카제인을 350 ㎕ 가하여 2시간 배양하였다. 흡인하여 0.5% 카제인을 제거한 후, 재조합체 HCV 항원(c11)을 21870 fmol/L로부터 3배씩 희석계열을 제조하여 샘플로 첨가하고, 교반하면서 실온에서 60분간 배양하였다. 세정액으로 6회 세정을 실시하고, 표식항체를 HRP 농도로 환산하여 계 2 ㎍/ml 농도로 200 ㎕를 가하고, 20분간 배양하였다. 또한 세정액으로 6회 세정하고, 기질 용액 (10 mg 오르토페닐렌디아민, 과산화수소) 200 ㎕를 가하여 30분간 배양하였다. 5N 염산 50 ㎕를 가하여 효소반응을 저지시키고, 마이크로플레이트 리더(코로나 MTP32)로 492 nm(레퍼런스 파장 630 nm)의 흡광도를 측정하였다. 비교로서, 실시예 3과 동일하게 담체: 효소의 중량비 0.66으로 담체- 효소 결합물을 제조한 후 항 HCV 코어 항원 모노클로날 항체를 결합시킨 것을 사용하였다(도 4).

도 4로부터 아미노기를 블록화한 효소 항체 복합체의 반응성은 블록화하고 있지 않는 것과 비교하여 그의 약 88.1%의 활성을 나타내고, 담체에만 항체가 결합하고 있어도 충분한 반응성을 나타내는 것이 확인되었다. 본 발명의 블록화 효소 항체 복합체는 과잉량의 효소를 사용하고 있지 않기 때문에, 담체 상? 효소 상의 어느 것도 항체가 결합하는 것이 가능하지만, 담체 상에만 프로브인 항체가 결합하여도 충분한 반응성을 나타내는 것으로 생각된다.

실시예 10

실시예 4에서 제조한 효소 항ProGRP 모노클로날 항체 복합체와 종래법의 효소 항체를 사용한 ProGRP의 검출 감도 비교

96개 웰 마이크로플레이트에 항 ProGRP 모노클로날 항체(2B10)를 5 ㎍/ml의 농도로 200 ㎕를 가하고, 4℃에서 하룻밤 배양하였다. 10 mM 인산 완충액 pH 7.3 (PBS)로 2회 세정한 후 0.5% 카제인을 350 ㎕ 가하여 2시간 배양하였다. 흡인에 의해 0.5% 카제인을 제거한 후, 재조합체 ProGRP(31-98)을 8000pg/ml로부터 3배씩 희석계열을 제조하여 샘플로 첨가하고, 37℃에서 60분간 배양하였다. 세정액으로 5회 세정을 실시하고, 2차 항체로서 실시예 4에서 제조한 효소-항 ProGRP 모노클로날 항체 복합체 또는 종래법으로 제조한 효소 항체를 HRP 농도로 환산하여 1.5㎍/ml 농도로 200 ㎕를 가하고, 30분간 배양하였다. 또한 세정액으로 6회 세정하고, 기질 용액 (10 mg 오르토페닐렌디아민, 과산화수소) 200 ㎕를 가하여 30분간 배양하였다. 5N 염산 50 ㎕를 가하여 효소반응을 저지시키고, 마이크로플레이트 리더(코로나 MTP32)로 492 nm(레퍼런스 파장 630 nm)의 흡광도를 측정하였다. 도 5에 그 결과를 나타내었다. 횡축은 ProGRP의 농도, 종축은 492 nm의 흡광도를 나타낸다. 실시예 4에서 제조한 효소 항체 복합체가 종래법으로 제조한 효소 표식 항체와 비교하여 현저하게 시그널이 높은 것을 알 수 있었다. 0 pg/ml와 OD 0.020의 차를 검출 한계로 가정하면, 종래법의 효소항체로는 약 115 pg/ml, 실시예 4의 효소 항체 복합체로는 약 7 pg/ml가 검출가능하고, 요컨대 종래법과 비교하여 16.4배 감도가 상승하였다. 건강정상인 혈청 중의 ProGRP 농도는 약 14 pg/ml, 컷오프치는 50 pg/ml 전후(Jpn. J. Cnacer Res. 1995 86, 698-705)인 점에서, 종래법으로는 건강인 검체나 폐소세포암 환자 검체의 일부에서 ProGRP를 검출할 수 없게 된다. 본 발명에 의해 이와 같은 종래법에서는 검출할 수 없었던 환자나 건강인의 검체 중의 ProGRP도 검출가능하게 되어 그 유용성이 확인되었다.

Claims

분자량 20,000 내지 4,000,000의 2분자 이상의 담체가 효소를 통하여 결합되고 그 담체에 효소가 결합된 복합체에 프로브 분자가 결합되며, 분석물이 효소가 아닌, 분석물을 검출하기 위한 블록화 효소 프로브 복합체.
제 1항에 있어서, 담체와 효소 분자가 담체 상의 관능기와 효소 분자내의 당쇄를 산화시켜 얻을 수 있는 알데히드 기에 의해 결합되어 있는 블록화 효소 프로브 복합체.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 담체가 덱스트란, 아미노덱스트란, 피콜(ficoll), 덱스트린, 아가로오스, 풀루란(pullulan), 다양한 셀룰로오스, 키틴, 키토산, β-갈락토시다아제, 티로글로불린, 헤모시아닌, 폴리리신, 폴리펩티드 및 DNA로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 블록화 효소 프로브 복합체.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 효소가 서양고추냉이 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 글루코오스 옥시다아제 및 루시페라아제로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 블록화 효소 프로브 복합체.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 프로브가 항체 분자 또는 그의 기능적 단편, 프로테인 A, 프로테인 G, 프로테인 L, 렉틴, 리셉터(receptor) 및 애비딘으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 블록화 효소 프로브 복합체.
제 1항에 있어서, 2종 이상의 프로브를 결합시킨 블록화 효소 프로브 복합체.
제 5항에 있어서, 항체 분자 또는 그의 기능적 단편이 항 HCV 코어 항원 항체, 항가스트린 방출 펩티드 전구체 항체 및 이들의 기능적 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 블록화 효소 프로브 복합체.
제 1항에 있어서, 블록화 효소 프로브 복합체의 분자량이 440,000 이상인 블록화 효소 프로브 복합체.
제 1항에 따른 블록화 효소 프로브 복합체를 포함하는 면역측정용 키트 또는 핵산검출시약.
분자량 20,000 내지 4,000,000의 담체와 효소를 결합시킨 블록체를 형성하는 단계, 및 상기 블록체에 프로브를 결합시키는 단계로 구성되는 제 1항에 기재된 블록화 효소 프로브 복합체를 제조하는 방법.
제 10항에 있어서, 담체와 효소 분자의 중량비가 담체: 효소 = 1: 0.1 내지 1:20로 반응시켜 블록체를 형성하는 방법.