CN115746147A - 一种用于免疫层析的高性能链霉亲和素的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于免疫层析的高性能链霉亲和素的制备方法，该方法在链霉亲和素中加入交联剂，摇匀后在混匀器上室温反应第一预设时间，采用PBS溶液透析除去多余的交联剂；将巯基化试剂加入到链霉亲和素中，摇匀后在混匀器上室温反应第二预设时间，采用PBSE进行透析纯化；将疏水蛋白加入SMCC溶液，采用PBS透析纯化，得到疏水蛋白‑SMCC；将疏水蛋白‑SMCC与巯基化链霉亲和素混合，偶联比例为疏水蛋白‑SMCC：巯基化链霉亲和素＝1:1～5:1，摇匀后在混匀器上室温反应第三预设时间后，得到链霉亲和素‑疏水蛋白偶联物；本发明能使得链霉亲和素和NC膜之间形成稳固的结合，增加链霉亲和素的生物素结合容量，提升检测灵敏度。

Description

一种用于免疫层析的高性能链霉亲和素的制备方法

技术领域

本发明涉及免疫层析技术领域，尤其涉及一种用于免疫层析的高性能链霉亲和素的制备方法。

背景技术

免疫层析作为免疫诊断技术的一个重要组成部分，已在临床上得到了非常广泛的应用，目前已成熟应用的项目种类繁多，包括传染病筛查，心肌标志物，激素和药物的检测等等。但由于传统的免疫层析技术检测灵敏度较低，限制了其进一步推广应用。因此，也不断有新技术的出现，弥补这一缺陷。比如微球材料的革新，从早期的胶体金到彩色乳胶，再到荧光微球，灵敏度得到了明显提升。同时，从工艺端进行创新，发展出了链霉亲和素-生物素系统进行信号放大的方法，进一步提升了其性能，又可将其灵敏度提升多达数倍。目前甚至已有一些产品的检测限达到了皮克级别，用于超微量指标的检测。

链霉亲和素和生物素之间的有很强的结合力，是抗原抗体结合力的近百万倍，常被用作固相捕获试剂，用于快速测定方法中反应物的分离；一个链霉亲和素能结合四个生物素化抗体，具有信号放大的作用，提升检测信号和灵敏度。

在免疫层析放大法中，链霉亲和素通常包被在NC膜检测线(T线)位置，所使用的链霉亲和素为天然链霉亲和素和重组链霉亲和素。由于天然链霉亲和素和重组链霉亲和素是亲水性很强的蛋白，在同样亲水的NC膜表面不能形成稳固的结合。加样后，当待测溶液经过T线时，部分链霉亲和素溶解脱落，影响显色效果，导致免疫层析试纸条灵敏度和信号放大程度的降低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于免疫层析的高性能链霉亲和素的制备方法，以解决现有技术中天然链霉亲和素和重组链霉亲和素在NC膜表面不能形成稳固的结合，加样后，当待测溶液经过T线时，部分链霉亲和素溶解脱落，影响显色效果，导致免疫层析试纸条灵敏度和信号放大程度的降低的问题。

本发明提供一种用于免疫层析的高性能链霉亲和素的制备，包括：

步骤一，在链霉亲和素中加入交联剂，摇匀后在混匀器上室温反应第一预设时间后，采用PBS溶液透析除去多余的交联剂，完成链霉亲和素自交联；

步骤二，将巯基化试剂加入到所述链霉亲和素中，摇匀后在混匀器上室温反应第二预设时间后，采用PBSE进行透析纯化，得到巯基化链霉亲和素；

步骤三，将疏水蛋白加入SMCC溶液，采用PBS透析纯化，得到疏水蛋白- SMCC；

步骤四，将所述疏水蛋白-SMCC与所述巯基化链霉亲和素混合，偶联比例为疏水蛋白-SMCC：巯基化链霉亲和素＝1:1～5:1，摇匀后在混匀器上室温反应第三预设时间后，得到链霉亲和素-疏水蛋白偶联物。

进一步地，步骤一中，所述交联剂为EDC或戊二醛。

进一步地，所述交联剂的用量为链霉亲和素的50-100当量。

进一步地，步骤一中，所述链霉亲和素为10mg/ml，100mg；所述交联剂为 EDC，所述EDC为18mg，所述第一预设时间为20小时。

进一步地，步骤二中，所述巯基化试剂为DTT、SATP或2-亚氨基硫烷盐酸盐。

进一步地，步骤二中，所述巯基化试剂为2-亚氨基硫烷盐酸盐，所述2-亚氨基硫烷盐酸盐为15mg，所述第二预设时间为2小时。

进一步地，步骤三中，所述疏水蛋白为HFBI、Casein或兔抗。

进一步地，步骤三中，所述疏水蛋白为兔抗，所述兔抗为100mg，得到兔抗- SMCC。

进一步地，步骤三中，所述SMCC溶液为10mg，所述SMCC溶液用DMSO 溶解。

进一步地，步骤四中，偶联比例为兔抗-SMCC：巯基化链霉亲和素＝1:2，所述第三预设时间为2小时。

本发明的有益效果如下：本发明提供的一种用于免疫层析的高性能链霉亲和素的制备方法，通过在链霉亲和素中加入交联剂，摇匀后在混匀器上室温反应第一预设时间后，采用PBS溶液透析除去多余的交联剂，完成链霉亲和素自交联；将巯基化试剂加入到所述链霉亲和素中，摇匀后在混匀器上室温反应第二预设时间后，采用PBSE进行透析纯化，得到巯基化链霉亲和素；将疏水蛋白加入 SMCC溶液，采用PBS透析纯化，得到疏水蛋白-SMCC；将所述疏水蛋白-SMCC 与所述巯基化链霉亲和素混合，偶联比例为疏水蛋白-SMCC：巯基化链霉亲和素＝1:1～5:1，摇匀后在混匀器上室温反应第三预设时间后，得到链霉亲和素-疏水蛋白偶联物；本发明通过在链霉亲和素上偶联疏水蛋白的方法，使得链霉亲和素和NC膜之间形成稳固的结合；同时又对重组链霉亲和素进行自聚交联，显著增加链霉亲和素的生物素结合容量，从而达到大幅度提升检测灵敏度。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明的一种用于免疫层析的高性能链霉亲和素的制备方法流程图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明具体实施例及相应的附图对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。以下结合附图，详细说明本发明各实施例提供的技术方案。

在免疫层析试纸条的开发过程中，通常采用在NC膜的检测线(T线)位置包被链霉亲和素的方法，达到信号放大的目的，从而提高检测灵敏度。然而天然或重组的链霉亲和素属于亲水性很好的活性蛋白，划膜到T线位置后，并不能完全有效地固定，当有层析溶液经过时，相当一部分链霉亲和素溶解脱落，因此也制约了其灵敏度提高的程度。本发明通过在链霉亲和素上偶联疏水蛋白的方法，使得链霉亲和素和NC膜之间形成稳固的结合；同时又对重组链霉亲和素进行自聚交联，显著增加链霉亲和素的生物素结合容量，从而达到大幅度提升检测灵敏度的目的。

请参阅图1，本发明提供一种用于免疫层析的高性能链霉亲和素的制备，包括：

步骤一，在链霉亲和素中加入交联剂，摇匀后在混匀器上室温反应第一预设时间后，采用PBS溶液透析除去多余的交联剂，完成链霉亲和素自交联。

其中，所述交联剂为EDC或戊二醛。所述交联剂的用量为链霉亲和素的50- 100当量。链霉亲和素上同时含有多个氨基和多个羧基，在交联剂的存在条件下，如EDC、戊二醛等，用量为链霉亲和素的50-100当量，不同链霉亲和素分子间的氨基和羧基形成交联网状结构，能够有效增加链霉亲和素的结合容量。所述第一预设时间为20小时。

步骤二，将巯基化试剂加入到所述链霉亲和素中，摇匀后在混匀器上室温反应第二预设时间后，采用PBSE进行透析纯化，得到巯基化链霉亲和素。

其中，所述巯基化试剂为DTT、SATP或2-亚氨基硫烷盐酸盐。链霉亲和素用巯基化试剂，如DTT、SATP和2-亚氨基硫烷盐酸盐等得到巯基化的链霉亲和素。所述第二预设时间为2小时。

步骤三，将疏水蛋白加入SMCC溶液，采用PBS透析纯化，得到疏水蛋白- SMCC；

其中，所述疏水蛋白为HFBI、Casein或兔抗。通过化学键将自交联的链霉亲和素与疏水蛋白，如HFBI、Casein、兔抗等连接起来。

步骤四，将所述疏水蛋白-SMCC与所述巯基化链霉亲和素混合，偶联比例为疏水蛋白-SMCC：巯基化链霉亲和素＝1:1～5:1，摇匀后在混匀器上室温反应第三预设时间后，得到链霉亲和素-疏水蛋白偶联物。

其中，疏水蛋白用双官能团试剂SMCC修饰，两者以1:1～5:1的比例混合，形成几乎不受pH、温度等外部条件影响的稳定的偶联物。所述第三预设时间为2 小时。偶联疏水蛋白后，相比未修饰的链霉亲和素，能够更好地固定在NC膜表面，使得最大可能发挥链霉亲和素的放大效应，显著提高层析的信号强度和灵敏度。

下面结合一具体实施例对本发明的方案进行说明：

步骤1链霉亲和素自交联：

取100mg的链霉亲和素(10mg/ml)，加入18mg的EDC，摇匀后混匀器上室温反应20小时，PBS溶液透析除去多余的EDC。

步骤2制备巯基化链霉亲和素：

取15mg的2-亚氨基硫烷盐酸盐，加入到上述链霉亲和素中，摇匀后混匀器上室温反应2小时，PBSE透析纯化。

步骤3：制备兔抗-SMCC

取100mg的兔抗，加入SMCC溶液(10mg SMCC用适量DMSO溶解)， PBS透析纯化。

步骤4：链霉亲和素偶联物

兔抗-SMCC溶液与巯基化链霉亲和素混合，偶联比例为兔抗-SMCC：巯基化链霉亲和素＝1：2，摇匀后混匀器上室温反应2小时，得到链霉亲和素-兔抗偶联物。

由以上实施例可知，本发明通过在链霉亲和素上偶联疏水蛋白的方法，使得链霉亲和素和NC膜之间形成稳固的结合；同时又对重组链霉亲和素进行自聚交联，显著增加链霉亲和素的生物素结合容量，从而达到大幅度提升检测灵敏度的目的。

以上所述的本发明实施方式并不构成对本发明保护范围的限定。

Claims (10)

1.一种用于免疫层析的高性能链霉亲和素的制备，其特征在于，包括：

步骤一，在链霉亲和素中加入交联剂，摇匀后在混匀器上室温反应第一预设时间后，采用PBS溶液透析除去多余的交联剂，完成链霉亲和素自交联；

步骤二，将巯基化试剂加入到所述链霉亲和素中，摇匀后在混匀器上室温反应第二预设时间后，采用PBSE进行透析纯化，得到巯基化链霉亲和素；

步骤三，将疏水蛋白加入SMCC溶液，采用PBS透析纯化，得到疏水蛋白-SMCC；

步骤四，将所述疏水蛋白-SMCC与所述巯基化链霉亲和素混合，偶联比例为疏水蛋白-SMCC：巯基化链霉亲和素＝1:1～5:1，摇匀后在混匀器上室温反应第三预设时间后，得到链霉亲和素-疏水蛋白偶联物。

2.根据权利要求1所述的一种用于免疫层析的高性能链霉亲和素的制备，其特征在于，步骤一中，所述交联剂为EDC或戊二醛。

3.根据权利要求2所述的一种用于免疫层析的高性能链霉亲和素的制备，其特征在于，所述交联剂的用量为链霉亲和素的50-100当量。

4.根据权利要求3所述的一种用于免疫层析的高性能链霉亲和素的制备，其特征在于，步骤一中，所述链霉亲和素为10mg/ml，100mg；所述交联剂为EDC，所述EDC为18mg，所述第一预设时间为20小时。

5.根据权利要求1所述的一种用于免疫层析的高性能链霉亲和素的制备，其特征在于，步骤二中，所述巯基化试剂为DTT、SATP或2-亚氨基硫烷盐酸盐。

6.根据权利要求5所述的一种用于免疫层析的高性能链霉亲和素的制备，其特征在于，步骤二中，所述巯基化试剂为2-亚氨基硫烷盐酸盐，所述2-亚氨基硫烷盐酸盐为15mg，所述第二预设时间为2小时。

7.根据权利要求1所述的一种用于免疫层析的高性能链霉亲和素的制备，其特征在于，步骤三中，所述疏水蛋白为HFBI、Casein或兔抗。

8.根据权利要求7所述的一种用于免疫层析的高性能链霉亲和素的制备，其特征在于，步骤三中，所述疏水蛋白为兔抗，所述兔抗为100mg，得到兔抗-SMCC。

9.根据权利要求8所述的一种用于免疫层析的高性能链霉亲和素的制备，其特征在于，步骤三中，所述SMCC溶液为10mg，所述SMCC溶液用DMSO溶解。

10.根据权利要求9所述的一种用于免疫层析的高性能链霉亲和素的制备，其特征在于，步骤四中，偶联比例为兔抗-SMCC：巯基化链霉亲和素＝1：2，所述第三预设时间为2小时。

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