JP5248264B2 - イムノクロマトグラフ法による高感度測定キット - Google Patents
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Description
このような免疫測定法の1つに、イムノクロマトグラフ法がある。免疫測定法では、一般に、被検出物質を、標識物質により標識化した抗体等と反応させた後、被検出物質と複合体を形成した標識物質を、被検出物質と結合していない標識物質から分離する工程が必要となる。イムノクロマトグラフ法は、この工程を、クロマトグラフィーの原理を応用して、固定相とそれに接して連続的に流れる移動相からなる系で行う点に特徴がある。
(1)被検出物質である抗原に特異的に結合する抗体を第一試薬とし、この第一試薬をクロマトグラフ媒体の所定の部位に所定の形で塗布すること等により、クロマトグラフ媒体に判定部位を形成する。
(2)一方、被検出物質と特異的に結合する抗体を第二試薬とし、この第二試薬を酵素等の標識物質により標識、又は、当該第二試薬を不溶性担体等の標識物質に感作することにより、標識試薬を調製する。
(3)移動相を構成する展開液を、被検出物質を含む試料及び標識試薬と共に、固定相であるクロマトグラフ媒体上で展開させる。
以上の操作により、試料中に被検出物質が存在する場合には、クロマトグラフ媒体に形成した判定部位において、被検出物質である抗原が、判定部位に固定した第一試薬である抗体と結合することにより捕捉されると共に、この抗原と、標識試薬を構成する抗体とによって抗原−抗体反応が生ずる結果、当該判定部位においては第一試薬(固定化された抗体)−被検出物質(抗原)−標識試薬(標識化された抗体)の三者のサンドイッチ型複合体が生成する。その結果、判定部位に間接的に標識物質が結合することによって所定のシグナルが現れ、これによって被検出物質の検出を行うことができる。
即ち、イムノクロマトグラフ法では、標識物質と複合体を形成した被検出物質と、判定部位に固定された第一試薬との反応は、展開液とともに被検出物質が判定部位を移動する極めて短い時間に行われ、反応時間を長くすることは難しいからである。展開液の粘性を高める等の手段により反応時間を延長することも可能ではあるが、移動時間が長くなり短時間で測定可能というイムノクロマトグラフ法の利点が損なわれることとなるだけでなく、標識物質等がクロマトグラフ媒体に非特異的に吸着することにより、バックグラウンドのシグナルが上昇し、良好なシグナルノイズ比(S/N)を得ることが困難となる。
また、イムノクロマトグラフ法では、被検出物質と複合体を形成した標識物質を、被検出物質と結合していない標識物質から分離する方法として、膜状のクロマトグラフ媒体に固定した第一試薬と結合させる手段を採用している。そのために、第一試薬はクロマトグラフ媒体に固定されて分子としての運動が制限されており、抗原分子及び抗体分子の衝突確率を高めることができず、被検出物質との反応の促進が図れない。他の免疫測定法では、第一試薬を固定する固相として流動性のある粒子が多く採用され、被検出物質を含む試料溶液中で撹拌されることにより、第一試薬と被検出物質との結合反応の効率が高められていることに比較して、対照的である。
(1)ビオチンを認識するポリクローナル抗体を固定化したクロマトグラフ媒体、ビオチンが結合した、被検出物質に特異的に結合し得る第一試薬、及び、被検出物質に特異的に結合し得る第二試薬が標識物質に結合した標識試薬、を含有してなるイムノクロマトグラフ法のための測定キット。
(2)ビオチンと第一試薬とが、リンカーを介して結合したものである(1)に記載の測定キット。
(3)ポリクローナル抗体が、免疫用担体にリンカーを介して結合したビオチンを認識するポリクローナル抗体である(1)又は(2)に記載の測定キット。
(4)リンカー基が、5〜50個の炭素を含む直鎖状のリンカー基である(2)又は(3)に記載の測定キット。
(5)リンカー基が、次の一般式(I)
−[−Z−(CH2)n−R−]m− (I)
(式中、Zは、NH又はOであり、RはCH2又はCOであり、nは3〜8の整数であり、mは1〜5の整数である。)で表される基である(2)〜(4)のいずれかに記載の測定キット。
(6)mが2〜4であり、nが4〜6である(5)に記載の測定キット。
(7)ZがNHで、RがCOである(5)又は(6)に記載の測定キット。
(8)第一試薬とビオチンとの結合におけるリンカー基と、免疫用担体とビオチンの結合におけるリンカー基が同じである(2)〜(7)のいずれかに記載の測定キット。
(9)ビオチンを認識するポリクローナル抗体が固定化され判定部位を形成したクロマトグラフ媒体に、ビオチンが結合した、被検出物質に特異的に結合し得る第一試薬、及び、被検出物質に特異的に結合し得る第二試薬が標識物質に結合した標識試薬を、前記判定部位から離隔した位置で前記クロマトグラフ媒体にてクロマト展開可能なように配置してなる、イムノクロマトグラフ法のためのクロマトグラフ媒体。
(10)ビオチンと第一試薬とが、リンカーを介して結合したものである(9)に記載のクロマトグラフ媒体。
(11)ポリクローナル抗体が、免疫用担体にリンカーを介して結合したビオチンを認識するポリクローナル抗体である(9)又は(10)に記載のクロマトグラフ媒体。
(12)リンカー基が、5〜50個の炭素を含む直鎖状のリンカー基である(10)又は(11)に記載のクロマトグラフ媒体。
(13)リンカー基が、次の一般式(I)
−[−Z−(CH2)n−R−]m− (I)
(式中、Zは、NH又はOであり、RはCH2又はCOであり、nは3〜8の整数であり、mは1〜5の整数である。)で表される基である(10)〜(12)のいずれかに記載のクロマトグラフ媒体。
(14)mが2〜4であり、nが4〜6である(13)に記載のクロマトグラフ媒体。
(15)ZがNHで、RがCOである(13)又は(14)に記載のクロマトグラフ媒体。
(16)第一試薬とビオチンとの結合におけるリンカー基と、免疫用担体とビオチンの結合におけるリンカー基が同じである(10)〜(15)のいずれかに記載のクロマトグラフ媒体。
(17)ビオチンを認識するポリクローナル抗体が固定化され判定部位を形成したクロマトグラフ媒体で、被検出物質を含む試料、ビオチンが結合した、被検出物質に特異的に結合し得る第一試薬、及び、被検出物質に特異的に結合し得る第二試薬が標識物質に結合した標識試薬を、クロマト展開することを特徴とする、イムノクロマトグラフ法による測定方法。
(18)ビオチンと第一試薬とが、リンカーを介して結合したものである(17)に記載の測定方法。
(19)ポリクローナル抗体が、免疫用担体にリンカーを介して結合したビオチンを認識するポリクローナル抗体である(17)又は(18)に記載の測定方法。
(20)リンカー基が、5〜50個の炭素を含む直鎖状のリンカー基である(18)又は(19)に記載の測定方法。
(21)リンカー基が、次の一般式(I)
−[−Z−(CH2)n−R−]m− (I)
(式中、Zは、NH又はOであり、RはCH2又はCOであり、nは3〜8の整数であり、mは1〜5の整数である。)で表される基である(18)〜(20)のいずれかに記載の測定方法。
(22)mが2〜4であり、nが4〜6である(21)に記載の測定方法。
(23)ZがNHで、RがCOである(21)又は(22)に記載の測定方法。
(24)第一試薬とビオチンとの結合におけるリンカー基と、免疫用担体とビオチンの結合におけるリンカー基が同じである(18)〜(23)のいずれかに記載の測定方法。
第一試薬のヤケヒョウヒダニ抽出物とビオチンとを結合することにより、第一試薬のビオチン化を行った。一方、ニトロセルロースからなるイムノクロマト媒体の所定の位置に、マウス由来の抗ビオチンモノクローナル抗体又はヤギ由来の抗ビオチンポリクローナル抗体を塗布し判定部位を作成した。使用した抗ビオチンポリクローナル抗体は、市販されているものの他、ビオチン(以下、短鎖ビオチンともいう)又は6−[6−(ビオチニルアミノ)ヘキサノイルアミノ]ヘキサン酸(以下、長鎖ビオチンともいう)を免疫用担体に結合させたものを免疫原として作製したものであった。
被検出物質であるヤケヒョウヒダニ特異的ヒトIgEを、ビオチン化第一試薬及び標識試薬と反応させ、イムノクロマト媒体に展開し、判定部位のシグナルをイムノクロマトリーダーによって数値化した。結果を表1、2及び図1に示す。
被検出物質であるヤケヒョウヒダニ特異的ヒトIgEを、ビオチン化第一試薬及び標識試薬と反応させ、イムノクロマト媒体に展開し、判定部位のシグナルをイムノクロマトリーダーによって数値化した。結果を表3、4及び図2に示す。
−[−Z−(CH2)n−R−]m− (I)
(式中、Zは、NH又はOであり、RはCH2又はCOであり、nは3〜8の整数であり、mは1〜5の整数である。)で表される直鎖状のリンカー基が挙げられる。ビオチンがリンカーを介して第一試薬に結合する場合には、リンカーが長いほど、標識試薬−被検出物質−第一試薬からなる複合体を効率よく判定部位に捕捉することができる。直鎖状のリンカーはその基本骨格に、CO基、NH、又はOを含んでいても良く、それらはアミド結合、エステル結合、又はエーテル結合を形成していてもよい。本発明で用いられるリンカーの好ましい態様としては、ω−アミノアルカン酸を単位とする繰り返し構造を有し、より好ましくは炭素数3〜8、さらに好ましくは4〜6のω−アミノアルカン酸、さらに好ましくは6−アミノヘキサン酸を単位とする繰り返し構造を有する。リンカーが繰り返し構造を有する場合には、その繰り返し数が多いほど、それをビオチン化第一試薬に使用したイムノクロマトグラフ法において良好なS/N比を得ることができる。好ましい繰り返し数としては1〜5、好ましくは1〜4、より好ましくは2〜4である。リンカー基は、式(I)のZがビオチンのカルボキシル基とアミド結合又はエステル結合することにより結合する。ビオチンと結合したリンカーは、第一試薬のアミノ基、SH基又は還元糖末端などに公知の方法により共有結合することができる。例えば、市販のビオチンラベル化剤、6−[6−(ビオチニルアミノ)ヘキサノイルアミノ]ヘキサン酸N−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル又は6−(ビオチニルアミノ)ヘキサン酸N−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル等を使用して、第一試薬をビオチン化することができる。
ビオチンと結合したリンカーは、第一試薬のビオチン化と同様に、免疫用担体のアミノ基、SH基又は還元糖末端などに公知の方法で結合することができる。作製した免疫原は、公知の方法に従って、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、又はウシ等に投与される。投与された動物の血清中で抗体価の上昇が確認されると、動物から血液が採取され、γグロブリン画分が回収される。アフィニティー精製等の公知の方法で、免疫原に使用した免疫用担体に対して生じた抗体を除去することにより、ビオチンのみ又はビオチン及びリンカーを認識するポリクローナル抗体を調製することができる。本発明でいう抗体は、FabフラグメントやF(ab’)2フラグメント等の抗原結合性を有する抗体断片も包含する。
抗ビオチンポリクローナル抗体を固定化した後、非特異的な吸着により分析の精度が低下することを防止するため、必要に応じて、クロマトグラフ媒体に、公知の方法でブロッキング処理を行うこともできる。一般にブロッキング処理はウシ血清アルブミン、スキムミルク、カゼイン、ゼラチン等の蛋白質が好適に用いられる。
クロマトグラフ媒体の形態及び大きさは特に制限されるものではなく、実際の操作の点及び結果の観察の点において適切であればよい。操作をより簡便にするためには、判定部位が表面に形成されているクロマトグラフ媒体の裏面に、プラスチックなどよりなる支持体を設けることもできる。この支持体の性状は特に制限されるものではないが、目視判定によって測定結果の観察を行う場合には、支持体は、標識物質によりもたらされる色彩と類似しない色彩を有するものであることが好ましく、通常、無色又は白色であることが好ましい。
本発明により検出することのできる被検出物質としては、それに特異的に結合する物質が存在するものであれば特に限定されず、蛋白質、ペプチド、糖(特に糖タンパク質の糖部分、糖脂質の糖部分等)、複合糖質などを例示することができる。本明細書において「特異的に結合する」とは、生体分子が持つ親和力に基づいて結合することを意味する。このような親和力に基づく結合としては、抗原と抗体との結合が代表的なものであり、免疫測定法で広く利用されるが、このような結合のみならず、本発明では、糖とレクチンとの結合、ホルモンと受容体との結合、酵素と阻害剤との結合、核酸と核酸結合蛋白質との結合なども利用できる。具体的な被検出物質としては、例えば、癌胎児性抗原(CEA)、HER2タンパク、前立腺特異抗原(PSA)、CA19−9、α−フェトプロテイン(AFP)、免疫抑制酸性タンパク(IPA)、CA15−3、CA125、エストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、便潜血、トロポニンI、トロポニンT、CK−MB、CRP、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(HCG)、黄体形成ホルモン(LH)、卵胞刺激ホルモン(FSH)、梅毒抗体、インフルエンザウイルス、クラミジア抗原、A群β溶連菌抗原、HBs抗体、HBs抗原、ロタウイルス、アデノウイルス、アルブミン、糖化アルブミン、及び、花粉、ダニ、室内塵、食品などのアレルゲン、アレルゲン特異的IgE等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
上記被検出物質を含む試料としては、例えば、生体試料、即ち、全血、血清、血漿、尿、唾液、喀痰、鼻腔又は咽頭拭い液、髄液、羊水、乳頭分泌液、涙、汗、皮膚からの浸出液、組織や細胞及び便からの抽出液等の他、牛乳、卵、小麦、豆などやそれらを含む食品等の抽出液等が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明で使用する第二試薬を標識物質で標識化する方法としては、物理吸着や化学結合などの公知の方法が使用できる。例えば、第二試薬としての抗体をコロイド状金粒子に感作した標識試薬は、金粒子がコロイド状に分散した溶液に抗体を加えて物理吸着させた後、牛血清アルブミン溶液を添加して抗体が未結合である粒子表面をブロッキングすることにより調製する。
本発明において使用できる展開液としては、通常、水を溶媒とし、リン酸塩、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、グッドの緩衝剤等の緩衝剤を含有することが好ましい。さらに、必要に応じて、ウシ血清アルブミン(BSA)等のタンパク質成分(含有量は通常0.01重量%〜10重量%)、非イオン性界面活性剤等の添加剤を含んでいてもよい。
本発明のクロマトグラフ媒体には、任意で、被検出物質を含む試料を添加するための試料添加部位(サンプルパッド等)、試料中の血球等の固形成分を除去する部位(血球分離部位等)、展開液を添加するための展開液添加部位、判定部位に捕捉されなかった標識試薬や展開液を吸い取る吸収部位(吸収パッド等)、測定が正常に行われたことを示す対照部位等を組み入れてもよい。これらの部位の部材は、毛管現象により試料液や展開液が移動できれば特に限定されず、一般的には、ニトロセルロース膜、濾紙、ガラス繊維濾紙等の複数の多孔性物質からその目的に応じたものを選択して用い、抗ビオチン化ポリクローナル抗体が固定化されたクロマトグラフ媒体と毛管で繋がるように配置することができる。
また、従来のイムノクロマトグラフ法では、目的とする被検出物質ごとに、それに特異的に結合する第一試薬を予め判定部位に固定化したクロマトグラフ媒体を調製しなければならないという煩雑さがあった。さらに、第一試薬の種類のよっては、固定化される効率が悪い、固定化の際に反応部位が変性する等の問題があった。しかし、本発明のクロマトグラフ媒体とビオチン化第一試薬は汎用性が高く、被検出物質の種類によらず調製が可能であるという利点も有している。
23.3mg/mLのKLH(CALBIOCHEM社製) 100μLに28mg/mLのBiotin-(AC5)2-OSu(同仁化学社製)(以下、長鎖ビオチンと表記する。)を40μL添加し25℃で2時間インキュベートした。インキュベート後、PD−10カラム(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)を用い未標識のビオチンを除去し、長鎖ビオチン標識KLHを得た。
得られた長鎖ビオチン標識KLHを2.0mg/mLの濃度でヤギに1週間ごとに計4回免疫を行った。最終免疫実施日の1週間後に全採血を行い、抗血清を得た。
得られた抗血清はProtein Gカラム及びKLH結合アフィニテイーカラムを用いて精製を行い、精製抗長鎖ビオチンポリクローナル抗体を得た。
ニトロセルロースから成る、幅が16mmの膜担体(ミリポア社製:HF120)に、塗布機(BioDot社製)を用いて、実施例1(1)で作製した精製抗長鎖ビオチンポリクローナル抗体をリン酸緩衝液(pH6.0)で3mg/mLの濃度になるように希釈後塗布し、50℃で1時間乾燥させた。その後、一晩室温で乾燥させた。
0.15MのNaClを含むリン酸緩衝液(pH7.4)(以下、PBSと略すこともある)に溶解した1.0mg/mLのヤケヒョウヒダニ抽出物(LSL社製) 1mLに対して、PBSに溶解した28mg/mLのBiotin-OSu (同仁化学社製)(以下、短鎖ビオチンと表記する)を20μL添加し25℃で2時間インキュベートした。インキュベート後、PD−10カラム(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)を用い未標識のビオチンを除去し、短鎖ビオチン標識ヤケヒョウヒダニ抽出物を得た。
金コロイド懸濁液(田中貴金属工業社製: 平均粒子径40 nm)0.5mLに、リン酸緩衝液(pH7.4)で0.1mg/mLの濃度になるように希釈したマウス由来の抗ヒトIgEモノクローナル抗体を0.1mL加え、室温で10分間静置した。次いで、10重量%の牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液(pH7.4)を0.1mL加え、十分撹拌した後、8000×gで15分間遠心分離を行った。上清を除去した後、1重量%の牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液(pH7.4)0.1mLを加え、標識物質溶液とした。
上記作製した短鎖ビオチン標識タンパク質及び標識物質溶液の各々を幅が16mmのグラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、短鎖ビオチン標識タンパク質保持部材及び標識保持部材とした。次いで、バッキングシートから成る基材に、上記調製したクロマトグラフィー媒体、短鎖ビオチン標識タンパク質保持部材、標識物質保持部材、試料を添加する部分に用いるサンプルパッド、及び展開した試料、不溶性担体を吸収するための吸収パッドを貼り合わせた。最後に、裁断機で幅が5mmとなるように裁断し、イムノクロマトグラフィー用試験片を作製した。
上記作製したイムノクロマトグラフィー用試験片を用いて、以下の方法で陰性検体及び陽性検体中のヤケヒョウヒダニに対する特異IgE抗体を測定した。
0.3%のTritonX-100、150mM塩化ナトリウムを含むトリス緩衝溶液(pH8.0)から成る展開溶媒を作製した。陰性検体(0.15IU/mL)、陽性検体(2.24IU/mL)を試料とし、各試料20μLをイムノクロマトグラフィー用試験片のサンプルパッド上に載せ、次いで展開溶媒を80μL載せて展開させ、15分後にイムノクロマトリーダー(浜松ホトニクス社製)を用いて判定部位の発色強度を数値化した。陰性検体及び陽性検体の発色値よりS/N比を求めた。
図1に結果を示す。
実施例1(1)で作製した精製抗長鎖ビオチンポリクローナル抗体の代わりに市販品の抗ビオチンモノクローナル抗体(ミリポア社製)を用いて以下、実施例1と同様に測定した結果を図1に示す。
実施例1(1)で作製した精製抗長鎖ビオチンポリクローナル抗体の代わりに市販品の抗ビオチンモノクローナル抗体(生化学工業社製)を用いて以下、実施例1と同様に測定した結果を図1に示す。
実施例1(1)で作製した精製抗長鎖ビオチンポリクローナル抗体の代わりに市販品の抗ビオチンポリクローナル抗体(ICL社製)を用いて以下、実施例1と同様に測定した結果を図1に示す。
23.3mg/mLのKLH(CALBOICHEM社製) 100μLに28mg/mLの短鎖ビオチンを40μL添加し25℃で2時間インキュベートした。インキュベート後、PD−10カラム(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)を用い未標識のビオチンを除去し、短鎖ビオチン標識KLHを得た。
得られた短鎖ビオチン標識KLHを2.0mg/mLの濃度でヤギに1週間ごとに計4回免疫を行った。最終免疫実施日の1週間後に全採血を行い、抗血清を得た。
得られた抗血清はProtein Gカラム及びKLH結合アフィニテイーカラムを用いて精製を行い精製抗短鎖ビオチンポリクローナル抗体を得た。
得られて精製抗短鎖ビオチンポリクローナル抗体を用いて実施例1と同様に測定した結果を図1に示す。
実施例1(1)と同じものを使用した。
(2)精製抗長鎖ビオチンポリクローナル抗体固定化クロマトグラフィー媒体の作製
実施例1(2)と同じものを使用した。
(3)長鎖ビオチン標識タンパク質の作製
PBSに溶解した1.0mg/mLのヤケヒョウヒダニ抽出物(LSL社製) 1mLに対して、PBSに溶解した28mg/mLの長鎖ビオチンを20μL添加し25℃で2時間インキュベートした。インキュベート後、PD−10カラム(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)を用い未標識のビオチンを除去し、長鎖ビオチン標識ヤケヒョウヒダニ抽出物を得た。
(4)標識物質溶液の作製
実施例1(4)と同様に作製した。
(5)イムノクロマトグラフィー用試験片の作製
上記作製した長鎖ビオチン標識タンパク質及び標識物質溶液の各々を幅が16mmのグラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、長鎖ビオチン標識タンパク質保持部材及び標識保持部材とした。次いで、バッキングシートから成る基材に、上記調製したクロマトグラフィー媒体、長鎖ビオチン標識タンパク質保持部材、標識物質保持部材、試料を添加する部分に用いるサンプルパッド、及び展開した試料、不溶性担体を吸収するための吸収パッドを貼り合わせた。最後に、裁断機で幅が5mmとなるように裁断し、イムノクロマトグラフィー用試験片を作製した。
(6)測定
実施例1(6)と同様に測定した。図2に結果を示す。
(1)精製抗短鎖ビオチンポリクローナル抗体の作製
比較例4(1)と同じものを使用した。
(2)精製抗短鎖ビオチンポリクローナル抗体固定化クロマトグラフィー媒体の作製
比較例4(2)と同じものを使用した。
(3)Biotin-AC5-OSu標識タンパク質の作製
PBSに溶解した1.0mg/mLのヤケヒョウヒダニ抽出物(LSL社製) 1mLに対して、PBSに溶解した28mg/mLのBiotin-AC5-OSu (同仁化学社製)(以下、中鎖ビオチンと表記する)を20μL添加し25℃で2時間インキュベートした。インキュベート後、PD−10カラム(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)を用い未標識のビオチンを除去し、中鎖ビオチン標識ヤケヒョウヒダニ抽出物を得た。
(4)標識物質溶液の作製
実施例1(4)と同様に作製した。
(5)イムノクロマトグラフィー用試験片の作製
上記作製した中鎖ビオチン標識タンパク質及び標識物質溶液の各々を幅が16mmのグラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、中鎖ビオチン標識タンパク質保持部材及び標識保持部材とした。次いで、バッキングシートから成る基材に、上記調製したクロマトグラフィー媒体、中鎖ビオチン標識タンパク質保持部材、標識物質保持部材、試料を添加する部分に用いるサンプルパッド、及び展開した試料、不溶性担体を吸収するための吸収パッドを貼り合わせた。最後に、裁断機で幅が5mmとなるように裁断し、イムノクロマトグラフィー用試験片を作製した。
(6)測定
実施例1(6)と同様に測定した。図2に結果を示す。
(1)精製抗長鎖ビオチンポリクローナル抗体の作製
実施例1(1)と同じものを使用した。
(2)精製抗長鎖ビオチンポリクローナル抗体固定化クロマトグラフィー媒体の作製
実施例1(2)と同じものを使用した。
(3)中鎖ビオチン標識タンパク質の作製
比較例5(3)と同じものを使用した。
(4)標識物質溶液の作製
実施例1(4)と同様に作製した。
(5)イムノクロマトグラフィー用試験片の作製
比較例5(5)と同様に行った。
(6)測定
実施例1(6)と同様に測定した。図2に結果を示す。
(1)精製抗短鎖ビオチンポリクローナル抗体の作製
比較例4(1)と同じものを使用した。
(2)精製抗短鎖ビオチンポリクローナル抗体固定化クロマトグラフィー媒体の作製
比較例4(2)と同様に作製した。
(3)長鎖ビオチン標識タンパク質の作製
実施例2(3)と同じものを使用した。
(4)標識物質溶液の作製
実施例1(4)と同様に作製した。
(5)イムノクロマトグラフィー用試験片の作製
実施例2(5)と同様に作製した。
(6)測定
実施例1(6)と同様に測定した。図2に結果を示す。
実施例1(1)と同じものを使用した。
(2)精製抗長鎖ビオチンポリクローナル抗体固定化クロマトグラフィー媒体の作製
実施例1(2)と同じものを使用した。
(3)長鎖ビオチン標識タンパク質の作製
PBSに溶解した0.5mg/mLのマウス由来の抗PSA(前立腺癌特異抗原)モノクローナル抗体500μLに対してPBSに溶解した28mg/mLの長鎖ビオチンを20μL添加し25℃で2時間インキュベートした。インキュベート後、PD−10カラム(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)を用い未標識のビオチンを除去し、長鎖ビオチン標識抗PSAモノクローナル抗体を得た。
(4)標識物質溶液の作製
金コロイド懸濁液(田中貴金属工業社製: 平均粒子径40 nm)0.5mLに、リン酸緩衝液(pH7.4)で0.1mg/mLの濃度になるように希釈したマウス由来の抗PSAモノクローナル抗体を0.1mL加え、室温で10分間静置した。次いで、10重量%の牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液(pH7.4)を0.1mL加え、十分撹拌した後、8000×gで15分間遠心分離を行った。上清を除去した後、1重量%の牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液(pH7.4)0.1mLを加え、標識物質溶液とした。
(5)イムノクロマトグラフィー用試験片の作製
実施例2(5)と同様に作製した。
(6)測定
上記作製したイムノクロマトグラフィー用試験片を用いて、以下の方法で試料中のPSAを測定した。0.3%のTritonX-100、150mMの塩化ナトリウムを含むトリス緩衝溶液(pH8.0)から成る展開溶媒を作製した。PSA濃度を0ng/mL及び0.5ng/mLになるように調整したものを試料とし、各濃度の試料40μLをイムノクロマトグラフィー用試験片のサンプルパッド上に載せ、次いで展開溶媒を80μL載せて展開させ、15分後にイムノクロマトリーダー(浜松ホトニクス社製)を用いて判定部位の発色強度を数値化した。PSA濃度0ng/mL及び0.5ng/mLの発色値よりS/N比を求めた。結果は、18.3であった。
実施例3(1)で使用した精製抗長鎖ビオチンポリクローナル抗体の代わりに精製抗短鎖ビオチンポリクローナル抗体を使用した。また、実施例3(3)の長鎖ビオチンの変わりに短鎖ビオチンを使用し、短鎖ビオチン標識抗PSAモノクローナル抗体を作製した。以下、実施例3と同様に測定した。結果は、9.6であった。
Claims (15)
- (1)免疫用担体に5〜50個の炭素を含む直鎖状のリンカー基を介して結合したビオチンを認識するポリクローナル抗体を固定化したクロマトグラフ媒体、
(2)ビオチンが5〜50個の炭素を含む直鎖状のリンカー基を介して結合した、被検出物質に特異的に結合し得る第一試薬、及び、
(3)被検出物質に特異的に結合し得る第二試薬が標識物質に結合した標識試薬、
を含有してなるイムノクロマトグラフ法のための測定キット。 - リンカー基が、次の一般式(I)
−[−Z−(CH2)n−R−]m− (I)
(式中、Zは、NH又はOであり、RはCH2又はCOであり、nは3〜8の整数であり、mは1〜5の整数である。)
で表される基である請求項1に記載の測定キット。 - mが2〜4であり、nが4〜6である請求項2に記載の測定キット。
- ZがNHで、RがCOである請求項2又は3に記載の測定キット。
- 第一試薬とビオチンとの結合におけるリンカー基と、免疫用担体とビオチンの結合におけるリンカー基が同じである請求項1〜4のいずれかに記載の測定キット。
- 免疫用担体に5〜50個の炭素を含む直鎖状のリンカー基を介して結合したビオチンを認識するポリクローナル抗体が固定化され判定部位を形成したクロマトグラフ媒体に、
(1)ビオチンが5〜50個の炭素を含む直鎖状のリンカー基を介して結合した、被検出物質に特異的に結合し得る第一試薬、及び、
(2)被検出物質に特異的に結合し得る第二試薬が標識物質に結合した標識試薬
を、前記判定部位から離隔した位置で前記クロマトグラフ媒体にてクロマト展開可能なように配置してなる、イムノクロマトグラフ法のためのクロマトグラフ媒体。 - リンカー基が、次の一般式(I)
−[−Z−(CH2)n−R−]m− (I)
(式中、Zは、NH又はOであり、RはCH2又はCOであり、nは3〜8の整数であり、mは1〜5の整数である。)
で表される基である請求項6に記載のクロマトグラフ媒体。 - mが2〜4であり、nが4〜6である請求項7に記載のクロマトグラフ媒体。
- ZがNHで、RがCOである請求項7又は8に記載のクロマトグラフ媒体。
- 第一試薬とビオチンとの結合におけるリンカー基と、免疫用担体とビオチンの結合におけるリンカー基が同じである請求項6〜9のいずれかに記載のクロマトグラフ媒体。
- 免疫用担体に5〜50個の炭素を含む直鎖状のリンカー基を介して結合したビオチンを認識するポリクローナル抗体が固定化され判定部位を形成したクロマトグラフ媒体で、
(1)被検出物質を含む試料、
(2)ビオチンが5〜50個の炭素を含む直鎖状のリンカー基を介して結合した、被検出物質に特異的に結合し得る第一試薬、及び、
(3)被検出物質に特異的に結合し得る第二試薬が標識物質に結合した標識試薬
を、クロマト展開することを特徴とする、イムノクロマトグラフ法による測定方法。 - リンカー基が、次の一般式(I)
−[−Z−(CH2)n−R−]m− (I)
(式中、Zは、NH又はOであり、RはCH2又はCOであり、nは3〜8の整数であり、mは1〜5の整数である。)
で表される基である請求項11に記載の測定方法。 - mが2〜4であり、nが4〜6である請求項12に記載の測定方法。
- ZがNHで、RがCOである請求項12又は13に記載の測定方法。
- 第一試薬とビオチンとの結合におけるリンカー基と、免疫用担体とビオチンの結合におけるリンカー基が同じである請求項11〜14のいずれかに記載の測定方法。
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