CN107643399A - 一种提高免疫检测系统灵敏性的方法及使用该方法的装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型的免疫学检测方法：通过形成树枝状的“信号标记的检测抗体‑目标抗原‑小分子标记的捕获抗体‑目标抗原‑信号标记的检测抗体‑目标抗原‑小分子标记的捕获抗体……”复合物，固相上的抗小分子抗体将该复合物固定于检测区域，从而给出了良好的信号放大效果，大大提高了灵敏度。较现有信号放大技术相比，优势在于仅在目标抗原存在的情况下，检测信号才会得到增强。这样，在保证特异性的同时，保证了检测的高灵敏性。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种提高免疫检测系统灵敏性的方法及使用该方法的装置。
背景技术
1959年，Yalow和Berson将放射性同位素示踪与免疫反应相结合建立了放射免疫分析法，开创了免疫分析这一崭新的领域，被公认为痕量分析化学方面的重大突破。此后，一系列免疫分析方法纷纷涌现并不断发展，如酶联免疫吸附法、荧光免疫测定法、免疫层析测定法、免疫传感器测定法等。免疫检测技术正朝着定量、多组分分析、高灵敏、高特异性、方便快速以及更加经济适用的方向发展。
简单、灵敏、有效的检测技术在疾病诊断、新药开发、生化防御等领域意义重大。目前，已有众多提高检测灵敏性的文献报道。中国专利CN 01822390.7公开了一种检测分析物的测试条测试法，该方法是首先对检测抗体(靶向试剂)进行生物素(配体)化修饰，示踪颗粒标记了抗生物素抗体(标记物)，这样在检测过程中会形成“树枝状”结构，使检测信号得以放大。基于这一原理制备的乙肝表面抗原检测试纸条较Abbott公司的乙肝表面抗原检测试纸条更为灵敏。中国专利CN200880132189公开了一种免疫层析测试中信号放大的方法以及使用该方法的免疫层析试剂盒，该方法采用两种不同粒径的偶联物超灵敏检测靶物质的信号方法，也是采用了树枝状信号放大技术。
虽然，有诸多提高灵敏性的文献报道。理论上，这些方法能够检测到1个目标抗原的存在，也就是说，只要有一个目标抗原存在，检测信号就能放大到很容易被侦测到的程度(放大到最大)，因而，这些方法都有极高的灵敏度。但是，在实际应用中，不可能避免非特异反应(如：背景信号)的发生，因而，这些方法在实际应用中无法区分阴阳性，最终的结果是所有的样品都为阳性，因而，这些方法没有实际应用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是在保证特异性不降低的前提下，提供一种提高免疫检测系统灵敏性的方法，用于目标物质的高灵敏检测。
本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：
一种提高免疫检测系统灵敏性的方法，其特征在于，该免疫检测系统包括位于固相上的抗小分子抗体、小分子标记的捕获抗体和信号标记的检测抗体，检测时形成树枝状的“信号标记的检测抗体-目标抗原-小分子标记的捕获抗体-目标抗原-信号标记的检测抗体-目标抗原-小分子标记的捕获抗体……”复合物，所述抗小分子抗体将该复合物固定于检测区域。
进一步地，所述小分子是任意一种能对抗体进行标记的化学分子。
进一步地，所述小分子是异硫氰酸荧光素、生物素、或地高辛中的一种。
进一步地，所述信号标记是颗粒标记或酶标记。
进一步地，所述抗小分子抗体为抗生物素抗体。
进一步地，所述捕获抗体与小分子之间的偶联比为1∶5～1∶40。
进一步地，所述目标抗原为蛋白质、多糖、微生物或核酸等任意一种可被抗体分子特异性结合的物质。
本发明还提供一种免疫层析试纸条，其特征在于，试纸条包括依次搭接粘贴于底板上的样品垫、结合垫、层析膜、吸水纸；其中，层析膜上检测线处包被有抗小分子抗体，结合垫上含有小分子标记的捕获抗体和颗粒标记的检测抗体。
一种免疫层析试纸条，其特征在于，试纸条包括依次搭接粘贴于底板上的样品垫、结合垫1、结合垫2、层析膜、吸水纸；结合垫1和结合垫2上分别含有小分子标记的捕获抗体和颗粒标记的检测抗体。
一种免疫层析试纸条，其特征在于，试纸条包括依次搭接粘贴于底板上的样品垫、层析膜、吸水纸；检测样品时，将小分子标记的捕获抗体和颗粒标记的检测抗体与样品混合，添加到样品垫上进行检测。
一种免疫渗滤卡，其特征在于，渗滤卡检测点上包被有抗小分子抗体；检测样品时，将小分子标记的捕获抗体和颗粒标记的检测抗体与样品混合，添加到免疫渗滤卡加样孔中进行检测。
本发明具有如下有益效果：
本发明在检测时形成树枝状的“信号标记的检测抗体-目标抗原-小分子标记的捕获抗体-目标抗原-信号标记的检测抗体-目标抗原-小分子标记的捕获抗体……”复合物，固相上的抗小分子抗体将该复合物固定于检测区域，从而给出了良好的信号放大效果，大大提高了灵敏度。较现有信号放大技术相比，优势在于仅在目标抗原存在的情况下，检测信号才会得到增强。这样，在保证特异性的同时，保证了检测的高灵敏性。同样，该方法的使用使得可以制造出高灵敏度的免疫层析试试纸条和免疫渗滤卡。
说明书附图
图1为本发明信号放大原理图。
图中：1、抗小分子抗体，2、小分子标记的捕获抗体，3、信号标记的检测抗体，4、目标抗原。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的说明，实施例仅是本发明的优选实施方式，不是对本发明的限定。
实施例1一种提高检测HCV core蛋白的免疫层析试纸条灵敏性的方法，包括：
1.纳米金标记检测抗体的制备：取10mL粒径40nm的纳米金颗粒，加入10μg HCVcore蛋白检测抗体；室温反应15min；加入BSA至终浓度1％(W/V)，继续室温反应15min；离心，用1mL复溶液(10mM Tris-HCl(pH8.0)、0.5％BSA)重悬颗粒，备用。
2.生物素标记捕获抗体的制备：按照捕获抗体与Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin偶联比为1∶1～1∶40制备生物素标记的HCV core蛋白捕获抗体；用PBS(pH7.2)透析3次，去掉杂质，备用。
3.层析膜的制备：往硝酸纤维素膜上按照0.8μL/cm的量依次喷涂浓度为1.5mg/mL的抗生物素单克隆抗体(检测线)、0.2mg/mL羊抗鼠IgG(质控线)，置于37℃干燥2h，备用。所述硝酸纤维素膜购自默克密理博中国有限公司。
4.样品垫的制备：用80mM Tris-HCl(pH8.0)、0.5％BSA、0.5％Tween 20浸泡无纺布10min；置于37℃干燥，备用。
5.试纸条的组装：试纸条包括PVC底板，以及依次搭接粘贴在PVC底板上的样品垫、层析膜、吸水垫；试纸条的层析膜上由样品垫到吸水垫方向依次设有检测线、质控线。
6.检测样品：取50μL血清/血浆样品于50μL裂解液(0.1M盐酸、4M尿素、4％SDS、1％胎牛血清)中，于37℃放置10min；加入200μL 0.5M Tris，混匀；取200μL于微孔中，再往微孔中加入5μL纳米金标记检测抗体、25pg生物素标记捕获抗体，于40℃孵育3min。将试纸条样品垫一端插入微孔，10min后观察结果。
7.使用同一对抗体制备的常规免疫层析纸条：包括PVC底板，以及依次搭接粘贴在PVC底板上的样品垫(参见本实施例步骤4)、层析膜【往硝酸纤维素膜上按照0.8μL/cm的量依次喷涂浓度为1.5mg/mL的捕获抗体(检测线)、0.2mg/mL羊抗鼠IgG(质控线)，置于37℃干燥2h，备用。所述硝酸纤维素膜购自默克密理博中国有限公司】、吸水垫；试纸条的层析膜上由样品垫到吸水垫方向依次设有检测线、质控线。使用方法：取50μL血清/血浆样品于50μL裂解液(0.1M盐酸、4M尿素、4％SDS、1％胎牛血清)中，于37℃放置10min；加入200μL 0.5MTris，混匀；取200μL于微孔中，再往微孔中加入5μL纳米金标记检测抗体，于40℃孵育3min。将试纸条样品垫一端插入微孔，10min后观察结果。
8.结果：表1显示了捕获抗体、生物素偶联比不同对灵敏性的影响，结果显示该方法的检测灵敏性达到2pg/mL。使用同一对抗体制备的常规免疫层析纸条的灵敏性为150pg/ml。我们还发现，若以亲和素代替本实施例中的抗生物素单克隆抗体，则会出现严重的假阳性反应。其他几个实施例中，同样存在类似的问题。这可能是由于生物素-亲和素之间过强的亲和力所致。所以本发明中所有涉及生物素的实施例中均采用了抗生素抗体作为检测线包被抗体。
实施例2一种提高检测HIV p24蛋白的免疫层析试纸条灵敏性的方法，包括：
1.纳米金标记检测抗体的制备：取10mL粒径40nm的纳米金颗粒，加入10μg HIVP24蛋白检测抗体；室温反应15min；加入BSA至终浓度1％(W/V)，继续室温反应15min；离心，用1mL复溶液(10mM Tris-HCl(pH8.0)、0.5％BSA)重悬颗粒，备用。
2.生物素标记捕获抗体的制备：按照捕获抗体与Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin偶联比为1∶16制备生物素标记的HIV P24蛋白捕获抗体；用PBS(pH7.2)透析3次，去掉杂质，用PBS将生物素标记的HIV P24蛋白捕获抗体稀释到0.25mg/mL，备用。
3.层析膜的制备：往硝酸纤维素膜上按照0.8μL/cm的量依次喷涂浓度为1.5mg/mL的抗生物素单克隆抗体(检测线)、0.3mg/mL羊抗鼠IgG(质控线)，置于37℃干燥2h，备用。所述硝酸纤维素膜购自默克密理博中国有限公司。
4.样品垫的制备：用80mM Tris-HCl(pH8.0)、0.5％BSA、0.5％Tween 20浸泡无纺布10min；置于37℃干燥，备用。
5.结合垫的制备：将生物素标记捕获抗体稀释，与纳米金标记检测抗体等体积混匀，按照5μL/cm喷涂奥斯龙8964玻璃纤维，置于37℃干燥，备用。
6.试纸条的组装：试纸条包括底板，以及依次搭接粘贴在底板上的样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫；试纸条的层析膜上由样品垫到吸水垫方向依次设有检测线、质控线。
7.检测样品：取50μL血清/血浆样品于50μL裂解液(0.1M盐酸、4M尿素、4％SDS、1％胎牛血清)中，于37℃放置15min；加入200μL 0.5M Tris，混匀；取100μL于试纸条样品垫上，15min后观察结果。
8.使用同一对抗体制备的常规免疫层析纸条：包括底板，以及依次搭接粘贴在底板上的样品垫(参见本实施例步骤4)、结合垫【纳米金标记检测抗体等体积混匀，按照2.5μL/cm喷涂奥斯龙8964玻璃纤维，置于37℃干燥，备用】、层析膜【往硝酸纤维素膜上按照0.8μL/cm的量依次喷涂浓度为1.5mg/mL的捕获抗体(检测线)、0.2mg/mL羊抗鼠IgG(质控线)，置于37℃干燥2h，备用。所述硝酸纤维素膜购自默克密理博中国有限公司】、吸水垫；试纸条的层析膜上由样品垫到吸水垫方向依次设有检测线、质控线。检测样品：参见本实施例步骤7。
9.结果：该方法的检测灵敏性达到7pg/mL。较使用同一对抗体制备的常规免疫层析纸条的灵敏性为200pg/mL。
实施例3一种提高检测HIV p24蛋白的免疫渗滤卡灵敏性的方法，包括：
1.纳米金标标记检测抗体的制备：取10mL粒径40nm的纳米金颗粒，加入10μg HIVp24蛋白检测抗体；室温反应15min；加入BSA至终浓度1％(W/V)，继续室温反应15min；离心，用1mL复溶液(10mM Tris-HCl(pH8.0)、0.5％BSA)重悬颗粒，备用。
2.FITC(异硫氰酸荧光素)标记捕获抗体的制备：按照捕获抗体与NHS-FITC偶联比为1∶15制备FITC标记的HIV p24蛋白捕获抗体；用PBS(pH7.2)透析3次，去掉杂质，备用。
3.渗滤膜的制备：在硝酸纤维素膜上按照1μL/点的量依次喷涂浓度为1mg/mL的抗FITC单克隆抗体(检测点)、0.2mg/mL羊抗鼠IgG(质控点)，置于37℃干燥2h，备用。
4.免疫渗滤卡的组装：免疫渗滤卡包括硝酸纤维素膜、吸收垫，以及固定硝酸纤维素膜和吸收垫的外壳。
5.检测样品：取50μL血清/血浆样品于50μL裂解液(0.1M盐酸、4M尿素、4％SDS、1％胎牛血清)中，于37℃放置10min；加入200μL 0.5M Tris，混匀；加入5μL纳米金标记检测抗体、25pg FITC标记捕获抗体，置于40℃孵育3min。取100μL于免疫渗滤卡的硝酸纤维素膜上，液体滤完后，加入100μL洗涤液(PBS)，滤完后观察结果。
6.同一对抗体制备的常规免疫渗滤卡：包括硝酸纤维素膜【按照1μL/点的量依次喷涂浓度为1mg/mL的捕获抗体(检测点)、0.2mg/mL羊抗鼠IgG(质控点)，置于37℃干燥2h，备用】、吸收垫，以及固定硝酸纤维素膜和吸收垫的外壳。检测样品：取50μL血清/血浆样品于50μL裂解液(0.1M盐酸、4M尿素、4％SDS、1％胎牛血清)中，于37℃放置10min；加入200μL0.5M Tris，混匀；加入5μL纳米金标记检测抗体，置于40℃孵育3min。取100μL于免疫渗滤卡的硝酸纤维素膜上，液体滤完后，加入100μL洗涤液(PBST)，滤完后观察结果。
7.结果：该方法的检测灵敏性为15pg/mL，且检测150份血清样本(50份HIV阳性，100份HIV阴性)，准确率达到100％。使用同一对抗体制备的常规免疫渗滤卡的灵敏性为180pg/ml。
实施例4一种提高检测HIV p24蛋白的免疫层析试纸条灵敏性的方法，包括：
1.荧光纳米颗粒标记检测抗体的制备：取100μL浓度为10mg/mL的稀土荧光纳米颗粒(粒径：300nm)于900μL MES(50mM，PH6.1)中，涡旋混匀；加入20mg NHS、20mg EDC，涡旋混匀；室温反应30min；10000rpm离心10min，弃上清；涡旋重悬颗粒；加入HIV P24单克隆抗体20μg，室温反应2-4h；加入酪蛋白，使其终浓度为0.1％，继续反应2-4h；10000rpm离心10min，弃上清；用PBST洗涤颗粒三次；加入20mL颗粒重悬液(10mM Tris-HCl，1％BSA，5％海藻糖)，重悬颗粒，备用。
2.生物素标记捕获抗体的制备：按照捕获抗体与Sulfo-NHS-Biotin偶联比为1∶17制备生物素标记的HIV P24蛋白捕获抗体；用PBS(pH7.2)透析3次，去掉杂质，备用。
3.层析膜的制备：往AE99硝酸纤维素膜上按照0.8μL/cm的量依次喷涂浓度为1.8mg/mL的抗生物素单克隆抗体(检测线)、0.2mg/mL羊抗鼠IgG(质控线)，置于37℃干燥2h，备用。
4.样品垫的制备：用80mM Tris-HCl(pH8.0)、0.5％BSA、0.5％Tween 20浸泡无纺布10min；置于37℃干燥，备用。
5.结合垫1的制备：将荧光纳米颗粒标记的检测抗体按照1μL/cm喷涂到奥斯龙8964玻璃纤维上，置于37℃干燥，备用。
6.结合垫2的制备：将生物素标记的捕获抗体稀释成0.2mg/mL，按照2μL/cm喷涂到奥斯龙8964玻璃纤维上，置于37℃干燥，备用。
7.试纸条的组装：试纸条包括底板，以及依次搭接粘贴在底板上的样品垫、结合垫1、结合垫2、层析膜、吸水垫；试纸条的层析膜上由样品垫到吸水垫方向依次设有检测线、质控线。
8.检测样品：取50μL血清/血浆样品于50μL裂解液(0.1M盐酸、4M尿素、4％SDS、1％胎牛血清)中，于37℃放置10min；加入200μL 0.5M Tris，混匀；取100μL于试纸条样品垫上，15min后观察结果。
9.使用同一对抗体制备的常规免疫层析试纸条：包括底板，以及依次搭接粘贴在底板上的样品垫(参见本实施例步骤4)、结合垫(将荧光纳米颗粒标记的检测抗体按照1μL/cm喷涂到奥斯龙8964玻璃纤维上，置于37℃干燥，备用)、层析膜【往AE99硝酸纤维素膜上按照0.8μL/cm的量依次喷涂浓度为1.8mg/mL的捕获抗体(检测线)、0.2mg/mL羊抗鼠IgG(质控线)，置于37℃干燥2h，备用】)、吸水垫；试纸条的层析膜上由样品垫到吸水垫方向依次设有检测线、质控线。检测样品：参见本实施例步骤8。
10.结果：本试纸条检测HIV P24蛋白的灵敏性为75pg/mL，使用同一对抗体制备的常规免疫层析试纸条的灵敏性为300pg/mL。
实施例5一种提高检测HIV p24蛋白、HCV core蛋白的免疫层析试纸条灵敏性的方法，包括：
1.纳米金标记检测抗体的制备：1)纳米金标记HIV P24蛋白检测抗体：取10mL粒径40nm的纳米金颗粒，加入10μgHIV P24蛋白检测抗体；室温反应15min；加入BSA至终浓度1％(W/V)，继续室温反应15min；离心，用1mL复溶液(10mM Tris-HCl(pH8.0)、0.5％BSA)重悬颗粒，备用。2)纳米金标记HCV core蛋白检测抗体：取10mL粒径40nm的纳米金颗粒，加入15μgHCV core蛋白检测抗体；室温反应15min；加入BSA至终浓度1％(W/V)，继续室温反应15min；离心，用1mL复溶液(10mM Tris-HCl(pH8.0)、0.5％BSA)重悬颗粒，备用。
2.小分子标记捕获抗体的制备：1)生物素标记HIV P24蛋白捕获抗体的制备：按照捕获抗体与NHS-Biotin偶联比为1∶20制备生物素标记的HIV P24蛋白捕获抗体；用PBS(pH7.2)透析3次，去掉杂质，备用。2)FITC(异硫氰酸荧光素)标记HCV core蛋白捕获抗体：按照捕获抗体与NHS-FITC偶联比为1∶20制备FITC标记的HCV core蛋白捕获抗体；用PBS(pH7.2)透析3次，去掉杂质，备用。
3.层析膜的制备：往硝酸纤维素膜上按照0.8μL/cm的量依次喷涂浓度为1.5mg/mL的抗生物素单克隆抗体(HIV P24蛋白检测线)、1.0mg/mL的抗FITC单克隆抗体(HCV core蛋白检测线)、0.2mg/mL羊抗鼠IgG(质控线)，置于37℃干燥2h，备用。所述硝酸纤维素膜购自默克密理博中国有限公司。
4.样品垫的制备：用80mM Tris-HCl(pH8.0)、0.5％BSA、0.5％Tween 20浸泡无纺布10min；置于37℃干燥，备用。
5.结合垫1的制备：将纳米金标记HIV P24蛋白检测抗体、纳米金标记HCV core蛋白检测抗体等体积混匀，按照2μL/cm喷涂到奥斯龙8964玻璃纤维上，置于37℃干燥，备用。
6.结合垫2的制备：将FITC标记的HCV core蛋白捕获抗体和生物素标记的HIV p24蛋白捕获抗体分别稀释到1mg/mL，等体积混匀，按照2μL/cm喷涂到奥斯龙8964玻璃纤维上，置于37℃干燥，备用。
7.试纸条的组装：试纸条包括底板，以及依次搭接粘贴在底板上的样品垫、结合垫1、结合垫2、层析膜、吸水垫；试纸条的层析膜上由样品垫到吸水垫方向依次设有HIV P24蛋白检测线、HCV core蛋白检测线、质控线。
8.检测样品：取100μL血清/血浆样品于50μL裂解液(0.1M盐酸、4M尿素、4％SDS、1％胎牛血清)中，于56℃放置30min；加入200μL 0.5M Tris，混匀；取100μL于试纸条样品垫上，20min后观察结果。
9.用相同检测抗体和捕获抗体制备的HIV p24蛋白、HCV core蛋白的常规免疫层析联检试纸条：包括底板，以及依次搭接粘贴在底板上的样品垫(参见本实施例步骤4)、结合垫(参见本实施例步骤5)、层析膜【往硝酸纤维素膜上按照0.8μL/cm的量依次喷涂浓度为1.5mg/mL的HIV P24蛋白捕获抗体、1.0mg/mL的HCV core捕获抗体、0.2mg/mL羊抗鼠IgG(质控线)，置于37℃干燥2h，备用。所述硝酸纤维素膜购自默克密理博中国有限公司】、吸水垫；试纸条的层析膜上由样品垫到吸水垫方向依次设有HIV P24蛋白检测线、HCV core蛋白检测线、质控线。检测样品：参见本实施例步骤8。
10.结果：本试纸条检测HIV P24蛋白的灵敏性为25pg/mL，检测HCV core蛋白的灵敏性为325pg/mL。用相同检测抗体和捕获抗体制备的HIV p24蛋白、HCV core蛋白的常规免疫层析联检试纸条检测HIV P24蛋白的灵敏性为2.5ng/mL，检测HCV core蛋白的灵敏性为17ng/mL。
实施例6一种提高检测HIV p24蛋白的免疫渗滤卡灵敏性的方法，包括：
1.纳米金标记检测抗体的制备：取10mL粒径40nm的纳米金颗粒，加入10μg HIVp24蛋白检测抗体；室温反应15min；加入BSA至终浓度1％(W/V)，继续室温反应15min；离心，用1mL复溶液(10mM Tris-HCl(pH8.0)、0.5％BSA)重悬颗粒，备用。
2.生物素标记捕获抗体的制备：按照捕获抗体与Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin偶联比为1∶16制备生物素标记的HIV p24蛋白捕获抗体；用PBS(pH7.2)透析3次，去掉杂质，备用。
3.渗滤膜的制备：往硝酸纤维素膜上按照0.8μL/点的量依次喷涂浓度为1.5mg/mL的抗生物素单克隆抗体(检测点)、0.2mg/mL羊抗鼠IgG(质控点)，置于37℃干燥2h，备用。
4.渗滤卡的组装：渗滤卡包括渗滤膜、吸收纸以及固定渗滤膜和吸收纸的卡壳。
5.检测样品：取50μL血清/血浆样品于50μL裂解液(0.1M盐酸、4M尿素、4％SDS、1％胎牛血清)中，于37℃放置10min；加入200μL 0.5M Tris，混匀；再加入5μL纳米金标记检测抗体、25pg生物素标记捕获抗体，于40℃孵育3min。取150μL于渗滤卡加样孔中，待液体完全滤过之后，加入150μL洗涤液(PBS)，观察结果。
6.使用同一对抗体制备的常规免疫渗滤卡：包括渗滤膜(往硝酸纤维素膜上按照0.8μL/点的量依次喷涂浓度为1.5mg/mL的p24蛋白捕获抗体(检测点)、0.2mg/mL羊抗鼠IgG(质控点)，置于37℃干燥2h，备用。)、吸收纸以及固定渗滤膜和吸收纸的卡壳。检测样品：取50μL血清/血浆样品于50μL裂解液(0.1M盐酸、4M尿素、4％SDS、1％胎牛血清)中，于37℃放置10min；加入200μL 0.5M Tris，混匀；再加入5μL纳米金标记检测抗体，于40℃孵育3min。取150μL于渗滤卡加样孔中，待液体完全滤过之后，加入150μL洗涤液(PBS)，观察结果。
7.结果：本渗滤卡能够检出浓度为25pg/mL的HIV p24蛋白样品，较使用同一对抗体制备的常规免疫渗滤卡的灵敏性提高了25倍，且检测300份血清样本(100份HIV阳性，200份HIV阴性)，100份HIV阳性样本中97份检测结果为阳性，200份HIV阴性样本中没有出现假阳性。
实施例7一种提高检测甲胎蛋白、癌胚抗原的免疫层析渗滤卡灵敏性的方法，包括：
1.纳米金标记检测抗体的制备：1)取10mL粒径40nm的纳米金颗粒，加入10μg甲胎蛋白蛋白检测抗体；室温反应15min；加入BSA至终浓度1％(W/V)，继续室温反应15min；离心，用1mL复溶液(10mM Tris-HCl(pH8.0)、0.5％BSA)重悬颗粒，备用。2)取10mL粒径40nm的纳米金颗粒，加入10μg癌胚抗原检测抗体；室温反应15min；加入BSA至终浓度1％(W/V)，继续室温反应15min；离心，用1mL复溶液(10mM Tris-HCl(pH8.0)、0.5％BSA)重悬颗粒，备用。
2.小分子标记捕获抗体的制备：1)生物素标记甲胎蛋白捕获抗体的制备：按照捕获抗体与NHS-Biotin偶联比为1∶13制备生物素标记的甲胎蛋白捕获抗体；用PBS(pH7.2)透析3次，去掉杂质，备用。2)FITC(异硫氰酸荧光素)标记癌胚抗原捕获抗体：按照捕获抗体与NHS-FITC比例为1∶17制备FITC标记的癌胚抗原捕获抗体；用PBS(pH7.2)透析3次，去掉杂质，备用。
3.渗滤膜的制备：往硝酸纤维素膜上按照0.8μL/点的量依次喷涂浓度为1.5mg/mL的抗生物素单克隆抗体(甲胎蛋白检测点)、1.8mg/mL的抗FITC单克隆抗体(癌胚抗原检测点)、0.2mg/mL羊抗鼠IgG(质控点)，置于37℃干燥2h，备用。
4.渗滤卡的组装：渗滤卡包括渗滤膜、吸收纸以及固定渗滤膜和吸收纸的卡壳。
5.检测样品：取200μL血清/血浆样品，再加入5μL纳米金标记检测抗体、25pg生物素标记捕获抗体、70pg FITC标记捕获抗体，于40℃孵育3min。取150μL于渗滤卡加样孔中，待液体完全滤过之后，加入100μL洗涤液(PBS)，观察结果。
6.使用同一对抗体制备的常规免疫渗滤卡：包括渗滤膜(往硝酸纤维素膜上按照0.8μL/点的量依次喷涂浓度为1.5mg/mL的甲胎蛋白捕获抗体、1.8mg/mL的癌胚抗原捕获抗体、0.2mg/mL羊抗鼠IgG(质控点)，置于37℃干燥2h，备用)、吸收纸以及固定渗滤膜和吸收纸的卡壳。检测样品：取200μL血清/血浆样品，再加入5μL纳米金标记检测抗体，于40℃孵育3min。取150μL于渗滤卡加样孔中，待液体完全滤过之后，加入100μL洗涤液(PBS)，观察结果。
7.结果：本渗滤卡能够检出浓度为320pg/mL的甲胎蛋白样品，较使用同一对抗体制备的免疫渗滤卡的灵敏性提高了9倍；能够检出浓度为125pg/mL的癌胚抗原样品，较使用同一对抗体制备的常规免疫渗滤卡的灵敏性提高了15倍。
实施例8一种提高检测核酸的免疫层析试纸条灵敏性的方法，包括：
1.分别在沙门氏菌的上下游引物的5’端引入FITC和地高辛(DIG)标记，由引物合成公司负责完成该部分工作，合成好的引物如下：
F：5’-FITC-CTCACCAGGAGATTACAACATGG-3’
R：5’-DIG-AGCTCAGACCAAAAGTGACCATC-3’
2.核酸提取：取1ml样本，13000rpm离心1min，弃掉上清，加入100μL去离子水，100℃ 5min，13000rpm 1min，取上清用于PCR扩增，扩增体系：2.5μL10×PCR Buffer，0.1μL上下游引物(100nM)，2U Taq酶，加水至23μL；加入模板(DNA)2μL扩增条件：95℃ 5min；94℃5s，55℃40s，72℃40s；30个循环。
3.纳米金标记检测抗体的制备：取10mL粒径40nm的纳米金颗粒，加入10μg抗FITC抗体(检测抗体)；室温反应15min；加入BSA至终浓度1％(W/V)，继续室温反应15min；离心，用1mL复溶液(10mM Tris-HCl(pH8.0)、0.5％BSA)重悬颗粒，备用。
4.生物素标记捕获抗体的制备：按照抗地高辛单克隆抗体与Sulfo-NHS-Biotin偶联比为1∶17制备生物素标记的捕获抗体；用PBS(pH7.2)透析3次，去掉杂质，备用。
5.层析膜的制备：往AE99型硝酸纤维素膜上按照0.8μL/cm的量依次喷涂浓度为1.8mg/mL的抗生物素单克隆抗体(检测线)、0.2mg/mL羊抗鼠IgG(质控线)，置于37℃干燥2h，备用。
6.样品垫的制备：用80mM Tris-HCl(pH8.0)、0.5％BSA、0.5％Tween 20浸泡无纺布10min；置于37℃干燥，备用。
7.结合垫1的制备：将纳米金颗粒标记的检测抗体按照1μL/cm喷涂到奥斯龙8964玻璃纤维上，置于37℃干燥，备用。
8.结合垫2的制备：将生物素标记的捕获抗体稀释成0.8mg/mL，按照2μL/cm喷涂到奥斯龙8964玻璃纤维上，置于37℃干燥，备用。
9.试纸条的组装：试纸条包括底板，以及依次搭接粘贴在底板上的样品垫、结合垫1、结合垫2、层析膜、吸水垫；试纸条的层析膜上由样品垫到吸水垫方向依次设有沙门氏菌核酸检测线、质控线。
10.检测样品：取用去离子水将PCR产物稀释5倍，取100μL于试纸条样品垫上，15min后观察结果。
11.结果：本试纸条检测沙门氏菌核酸的灵敏性为可达到70CFU/mL，与实时荧光PCR的灵敏性相当。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种提高免疫检测系统灵敏性的方法，其特征在于，该免疫检测系统包括位于固相上的抗小分子抗体、小分子标记的捕获抗体和信号标记的检测抗体，检测时形成树枝状的“信号标记的检测抗体-目标抗原-小分子标记的捕获抗体-目标抗原-信号标记的检测抗体-目标抗原-小分子标记的捕获抗体……”复合物，所述抗小分子抗体将该复合物固定于检测区域。
2.如权利要求1所述的提高免疫检测系统灵敏性的方法，其特征在于，所述小分子是任意一种能对抗体进行标记的化学分子。
3.如权利要求1所述的提高免疫检测系统灵敏性的方法，其特征在于，所述小分子是异硫氰酸荧光素、生物素、或地高辛中的一种。
4.如权利要求1所述的提高免疫检测系统灵敏性的方法，其特征在于，所述信号标记是纳米颗粒标记或酶标记。
5.如权利要求1所述的提高免疫检测系统灵敏性的方法，其特征在于，捕获抗体与小分子之间的偶联比为1∶5～1∶40。
6.如权利要求1所述的提高免疫检测系统灵敏性的方法，其特征在于，所述目标抗原为蛋白质、多糖、微生物或核酸中任意一种能被抗体分子特异性结合的物质。
7.一种免疫层析试纸条，其特征在于，试纸条包括依次搭接粘贴于底板上的样品垫、结合垫、层析膜、吸水纸；其中，层析膜上检测线处包被有抗小分子抗体，结合垫上含有小分子标记的捕获抗体和纳米颗粒标记的检测抗体。
8.一种免疫层析试纸条，其特征在于，试纸条包括依次搭接粘贴于底板上的样品垫、结合垫1、结合垫2、层析膜、吸水纸；结合垫1和结合垫2上分别含有小分子标记的捕获抗体和颗粒标记的检测抗体。
9.一种免疫层析试纸条，其特征在于，试纸条包括依次搭接粘贴于底板上的样品垫、层析膜、吸水纸；检测样品时，将小分子标记的捕获抗体和颗粒标记的检测抗体与样品混合，添加到样品垫上进行检测。
10.一种免疫渗滤卡，其特征在于，渗滤卡检测点上包被有抗小分子抗体；检测样品时，将小分子标记的捕获抗体和颗粒标记的检测抗体与样品混合，添加到免疫渗滤卡加样孔中进行检测。
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