CN105486854A - 一种信号放大方法及相关装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种信号放大方法,其用于检测靶物质,包括:将具有能特异性结合不同靶物质的多种第一分子的偶联体与多种靶物质结合,偶联体还包括连接体、和与多种第一分子和连接体结合的第一颗粒;桥接体与偶联体的连接体结合,桥接体包括能特异性结合偶联体的连接体的第二分子;通过能特异性结合不同靶物质的多种第三分子分别捕获与桥接体结合后的偶联体上的多种靶物质。当桥接体的第二分子可与偶联体的第一分子结合,则偶联体上可不含有连接体。本发明还公开了使用该信号放大方法的相关装置。该同时检测多种靶物质的信号放大方法不但能够高灵敏检测靶物质,而且实现了多种靶物质的同时检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测靶物质的信号放大方法及相关装置。
背景技术
简单、灵敏、有效的检测技术在疾病诊断、新药开发、生化防御等领域意义重大。中国专利CN01822390.7公开了一种检测分析物的测试条测试法,该方法是首先对检测抗体(靶向试剂)进行生物素(配体)化修饰,示踪颗粒标记了抗生物素抗体(标记物),这样在检测过程中会形成“树枝状”结构,使检测信号得以放大。基于这一原理制备的乙肝表面抗原检测试纸条较Abbott公司的乙肝表面抗原检测试纸条更为灵敏。中国专利CN200880132189公开了一种免疫层析测试中信号放大的方法以及使用该方法的免疫层析试剂盒,该方法采用两种不同粒径的偶联物超灵敏检测靶物质的信号方法,也是采用了树枝状信号放大技术。
现有的检测靶物质(或分析物)的信号放大方法只能针对一种靶物质进行分析,但在检测领域,往往需要对样品中的多种靶物质进行超灵敏检测,方可作出准确可靠的判断,现有的检测方法往往是每个项目单独检测,然后综合各个检测结果,得出检测结论,且需要准备多种试纸条并采用多份样品进行测试。现有的联检方法都是在各个单检体系中寻找一个折衷的体系建立起来的,这个折衷的体系往往是以牺牲检测灵敏性为代价的,所以目前已有的联合同时检测方法的灵敏性往往不够理想,无法满足现实需要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测靶物质的信号放大方法及相关装置,该信号放大方法不但能够高灵敏检测靶物质,而且实现了多种靶物质的同时检测。
本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现:
一种检测靶物质的信号放大方法,包括:
将具有能特异性结合不同靶物质的多种第一分子的偶联体与多种靶物质结合,偶联体还包括连接体、和与多种第一分子和连接体结合的第一颗粒;
桥接体与偶联体的连接体结合,桥接体包括能特异性结合偶联体的连接体的第二分子;
通过能特异性结合不同靶物质的多种第三分子分别捕获与桥接体结合后的偶联体上的多种靶物质。
一种检测靶物质的信号放大方法,包括:
将具有能特异性结合不同靶物质的多种第一分子的偶联体与多种靶物质结合,偶联体还包括与多种第一分子结合的第一颗粒;
桥接体与偶联体的第一分子结合,所述桥接体包括能特异性结合偶联体的多种第一分子的第二分子;
通过能特异性结合不同靶物质的多种第三分子分别捕获与桥接体结合后的偶联体上的多种靶物质。
优选地,所述靶物质为蛋白质分子、蛋白质分子复合物、核酸、核酸复合物中的任意一种。
一种检测靶物质的免疫层析试纸,包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第一结合垫、层析膜、吸水垫;所述第一结合垫包被有偶联体和桥接体,其中该偶联体包括能特异性结合不同靶物质的多种第一分子、连接体及与多种第一分子和连接体结合的第一颗粒,桥接体包括能特异性结合偶联体的连接体的第二分子;所述层析膜上不同区域的检测线固定有能特异性结合不同靶物质的多种第三分子。
一种检测靶物质的免疫层析试纸,包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第一结合垫、层析膜、吸水垫;所述第一结合垫包被有偶联体和桥接体,其中该偶联体包括能特异性结合不同靶物质的多种第一分子、和与多种第一分子结合的第一颗粒,桥接体包括能特异性结合偶联体的连接体的第二分子;所述层析膜上不同区域的检测线固定有能特异性结合不同靶物质的多种第三分子。
一种检测靶物质的免疫层析试纸,包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第二结合垫、第三结合垫、层析膜、吸水垫;所述第三结合垫包被有偶联体,该偶联体包括能特异性结合不同靶物质的多种第一分子、连接体及与多种第一分子和连接体结合的第一颗粒,所述第二结合垫包被有具有能特异性结合偶联体的连接体的第二分子的桥接体;所述层析膜上不同区域的检测线固定有能特异性结合不同靶物质的多种第三分子。
一种检测靶物质的免疫层析试纸,包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第二结合垫、第三结合垫、层析膜、吸水垫;所述第三结合垫包被有偶联体,该偶联体包括能特异性结合不同靶物质的多种第一分子、和与多种第一分子结合的第一颗粒;所述第二结合垫包被有具有能特异性结合偶联体的多种第一分子的第二分子的桥接体;所述层析膜上不同区域的检测线固定有能特异性结合不同靶物质的多种第三分子。
优选地,所述第二结合垫与第三结合垫调换位置顺序。
一种检测靶物质的免疫层析装置,包括反应微孔和免疫层析试纸,该免疫层析试纸包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第四结合垫、层析膜、吸水垫;所述反应微孔含有偶联体,该偶联体包括能特异性结合不同靶物质的多种第一分子、连接体及与多种第一分子和连接体结合的第一颗粒;所述第四结合垫包被有具有能特异性结合偶联体的连接体的第二分子的桥接体,所述层析膜上不同区域的检测线固定有能特异性结合不同靶物质的多种第三分子。
一种检测靶物质的免疫层析装置,包括反应微孔和免疫层析试纸,该免疫层析试纸包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第四结合垫、层析膜、吸水垫;所述反应微孔含有偶联体,该偶联体包括能特异性结合不同靶物质的多种第一分子、和与多种第一分子结合的第一颗粒;所述第四结合垫包被有具有能特异性结合偶联体的多种第一分子的第二分子的桥接体,所述层析膜上不同区域的检测线固定有能特异性结合不同靶物质的多种第三分子。
一种靶物质的免疫渗滤装置,由渗滤卡、封闭液、偶联体、桥接体、洗涤液组成,其中渗滤卡由卡底、吸水垫料、渗滤膜、卡盖依次叠加组成,该免疫渗滤装置的检测方法包括以下步骤:
1)往渗滤膜上滴加一滴封闭液;
2)液体滤过之后,滴加一滴血清样本;
3)血清滤完之后,滴加一滴洗涤液;
4)滤完之后滴加一滴权利要求1或2所述的偶联体、一滴权利要求1或2所述的桥接体;
5)等液体滤完之后,滴加一滴洗涤液;
6)滤完之后,观察结果;
其中,渗滤膜上不同区域的检测点固定有能特异性结合不同靶物质的多种第三分子。
本发明具有如下有益效果:
本发明的信号放大方法将具有能特异性结合不同靶物质的多种第一分子与样品中不同靶物质结合后与桥接体结合,随后由位于固相上的能特异性结合不同靶物质的多种第三分子捕获固定,从而得到信号放大效果,不但能够高灵敏检测靶物质,而且实现了多种靶物质的同时检测。同样,也使用该信号放大方法制造出了高灵敏度且同时检测多种靶物质的免疫层析试纸条或免疫层析装置,其层析膜上不同区域上设有多个检测线,各个检测线的夹心反应不会相互影响,达到了一份液体样品同时检测多种靶物质,且在同样条件下进行,既节约了检测时间,也减小了检测误差,同时降低了检测成本。
附图说明
图1为本发明同时检测两种靶物质的信号放大的原理示意图;
图2为本发明一种使用该信号放大方法同时检测多种靶物质的免疫层析试纸的结构示意图;
图3为本发明另一种使用该信号放大方法同时检测多种靶物质的免疫层析试纸的结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明,实施例仅是本发明的优选实施方式,不是对本发明的限定。
本发明所提及的术语“连接体”表示通过特异性反应(如:抗原-抗体反应、核酸杂交反应)与第三分子特异性结合使得偶联体与桥接体结合的材料;术语“桥接体”表示通过特异性反应(如:抗原-抗体反应、核酸杂交反应)与偶联体上的连接体或第一分子进行特异性结合将偶联体桥接在一起形成树枝状结构的材料。
本发明的信号放大方法中,偶联体包括多种第一分子、连接体及与多种第一分子和连接体结合的第一颗粒,多种第一分子能分别特异性结合不同的靶物质;桥接体包括能特异性结合偶联体的连接体的第二分子;在检测时,偶联体上多种第一分子与样品中的不同靶物质结合,随后桥接体的第二分子与偶联体的连接体结合将偶联体桥接在一起形成多个树枝状结构,该树枝状结构上含有多种不同的靶物质,位于固相上的能特异性结合不同靶物质的多种第三分子捕获该树枝状结构上的多种靶物质(偶联体的第一分子与位于固相上的第三分子分别结合同一靶物质上的不同位点),进而达到放大信号的目的。当桥接体的第二分子可与偶联体的第一分子结合,则偶联体上可不含有连接体。
所述靶物质可以为蛋白质分子、蛋白质分子复合物、核酸、核酸复合物中的任意一种,还可以是其他能够发生特异性结合的分子。
多种第一分子包括至少两种能特异性结合不同靶物质的单克隆抗体或多克隆抗体,但不局限于抗体。多种第三分子包括至少两种能特异性结合不同靶物质的单克隆抗体或多克隆抗体,但不局限于抗体。所述第一分子和第三分子可以相同或不同。
连接体可以是蛋白质、核酸、多糖、肽等可以与桥接体发生特异性结合的材料。
桥接体可以是能特异性结合偶联体的连接体或第一分子的第二分子,还可以是偶联有能特异性结合偶联体的连接体或第一分子的第二分子的第二颗粒。第一颗粒或第二颗粒为金属颗粒、彩色乳胶颗粒、荧光颗粒中的一种,或者其他任何一种可以作为信号标记物的颗粒。第一颗粒或第二颗粒的形状为球形、管状、棒状,或者多面体状中的任一种。第一颗粒与第二颗粒可相同或不同。第一颗粒的粒径小于或等于第二颗粒的粒径。
图1显示了本发明同时检测两种靶物质A1、A2的信号放大的原理,其中偶联体包括连接体。参考图1,两种第一分子a1、a2和连接体11与第一颗粒12结合形成偶联体1,第二分子21和第二颗粒22结合形成桥接体2,两种第三分子a1’、a2’分别位于固相上的不同区域的检测位点或检测线上。检测时,偶联体1的两种第一分子a1、a2分别与样品中的两种靶物质A1、A2结合,随后偶联体1的连接体11与桥接体2的第二分子结合形成含有靶物质A1、A2的树枝状结构,流经测试条时,树枝状结构上的靶物质A1、A2与检测位点上的第三分子a1’、a2’结合以放大信号。
请参考图2,本发明的一种使用该信号放大方法同时检测多种靶物质的免疫层析试纸,包括依次搭接粘贴在底板3上的样品垫31、第一结合垫32、层析膜33、吸水垫34;所述第一结合垫32包被有偶联体及桥接体,其中偶联体包括能特异性结合不同靶物质的多种第一分子、连接体及与多种第一分子和连接体结合的第一颗粒,桥接体包括能特异性结合偶联体的连接体的第二分子;所述层析膜33上设置质控线C及在不同区域的检测线T(优选不重叠的多个检测线T1、T2…Tn,n≥2)分别固定有能特异性结合不同靶物质的多种第三分子。若桥接体的第二分子可与偶联体的第一分子结合,则偶联体上可不含有连接体。
请参考图3,本发明的另一种使用该信号放大方法同时检测多种靶物质的免疫层析试纸,偶联体和桥接体分别位于不同的结合垫上,该免疫层析试纸包括依次搭接粘贴在底板4上的样品垫41、第二结合垫42、第三结合垫43、层析膜44、吸水垫45;所述第三结合垫43包被有偶联体,该偶联体包括能特异性结合不同靶物质的多种第一分子、连接体及与多种第一分子和连接体结合的第一颗粒;所述第二结合垫42包被有桥接体,该桥接体包括能特异性结合偶联体的连接体的第二分子;所述层析膜44上设置质控线C及在不同区域的检测线T分别固定有能特异性结合不同靶物质的多种第三分子。若桥接体的第二分子可与偶联体的第一分子结合,则偶联体上可不含有连接体。在该免疫层析试纸上,第二结合垫42与第三结合垫43的位置顺序可调换。
本发明还提供了一种使用该信号放大方法同时检测多种靶物质的免疫层析装置,包括反应微孔和免疫层析试纸,该免疫层析试纸包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第四结合垫、层析膜、吸水垫;所述反应微孔含有偶联体,该偶联体包括能特异性结合不同靶物质的多种第一分子、连接体及与多种第一分子和连接体结合的第一颗粒;所述第四结合垫包被有能特异性结合偶联体的连接体的第二分子的桥接体,所述层析膜上设置质控线及在不同区域的检测线分别固定有能特异性结合不同靶物质的多种第三分子。若桥接体的第二分子可与偶联体的第一分子结合,则偶联体上可不含有连接体。
免疫层析用的垫可以是任何天然多孔材料或任何合成多孔材料,如硝酸纤维素或聚酯纤维素形成的垫。
样品垫用于吸收含有多种靶物质的液体样品,并经毛细作用将靶物质转移至结合垫上;吸水垫可以是任何能充分吸收反应后残液的垫。
第一结合垫上含有已干燥的偶联体和桥接体,偶联体与桥接体不相互接触。
层析膜上不同区域上设有多个检测线或检测位点,且检测线或检测位点在垂直方向上不重叠。每个检测位点或检测线固定有能特异性结合一种靶物质的第三分子。质控线位于检测线与吸水垫之间的层析膜上。
以下结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
免疫层析试纸条同时检测艾滋病毒P24蛋白和丙型肝炎病毒core蛋白
1、偶联体的制备:按照Frens法(1973)制备40nm胶体金颗粒;按照每毫升胶体金颗粒加入3μL0.2M碳酸钾的量调节PH;按照每毫升胶体金颗粒加入8μg艾滋病毒P24蛋白单克隆抗体Ⅰ、6μg丙型肝炎病毒core蛋白单克隆抗体Ⅰ,室温反应15min;加入牛血清白蛋白(BSA),使其终浓度为1%,室温静置15min;10000rpm离心10min;弃掉上清,加入1/10胶体金体积的重悬液(10mMTris(PH8.0),0.5%Tween20、0.4%酪蛋白、2%蔗糖)重悬颗粒。
2.桥接体的制备:按照Frens法(1973)制备20nm胶体金颗粒;按照每毫升胶体金颗粒加入4μL0.2M碳酸钾的量调节PH;按照每毫升胶体金颗粒加入10μgBSA的单克隆抗体室温反应15min;加入酪蛋白,使其终浓度为0.2%,室温静置15min;10000rpm离心10min;弃掉上清,加入与胶体金体积相同的虫悬液(10mMTris(PH8.0)、0.5%Tween20、0.4%酪蛋白、8%蔗糖)重悬颗粒。
3.第三结合垫的制备:按照5μL/cm喷偶联体于奥斯龙8964玻璃纤维素膜上,置于37℃烘干,裁成0.4cm宽,备用。
4.第二结合垫的制备:按照5μL/cm喷桥接体于奥斯龙8964玻璃纤维素膜上,置于37℃烘干,裁成0.4cm宽,备用。
5.层析膜的制备:按照1μL/cm喷涂浓度为1mg/mL的艾滋病毒P24蛋白单克隆抗体Ⅱ作为检测线T1,按照1μL/cm喷涂浓度为2mg/mL的丙型肝炎病毒core蛋白多克隆抗体Ⅱ作为检测线T2,按照1μL/cm喷涂浓度为0.2mg/mL的羊抗鼠IgG作为质控线,置于室温晾干,备用。
6.样品垫的制备:用[100mMTris(PH8.0),0.5%Tween20]浸泡聚酯纤维素膜,置于37℃烘干,裁成1.2cm宽,备用。
7.试纸条的组装:将样品垫、第二结合垫、第三结合垫、层析膜、吸水垫依次搭接粘贴到PVC底板上,裁成3.5mm宽的试纸条,干燥保存,备用。
8.试纸条的使用:1)样品处理:取血清样品,加入等体积的的样品处理液(0.3M甘氨酸,1%TritonX100),置于56℃30min;2)取80μL处理后的产物于样品垫上,10min后观察结果(质控线不显色判定检测无效,否则只要检测线有红色出现即判定为阳性)。
9.检测5648份血浆样本,本方法与美国Ortho公司的丙型肝炎Core抗原检测试剂盒(ELISA)的符合率达到95.4%,与ZeptoMetrix公司的P24酶联免疫试剂盒的符合率达到98.5%。
实施例2
免疫层析试纸条同时检测布鲁氏菌脂多糖和大肠杆菌O157脂多糖
1.偶联体的制备:取100μL浓度为10mg/mL的稀土荧光纳米颗粒(粒径:300nm)于900μLMES(50mM,PH6.1)中,涡旋混匀;加入20mgNHS、20mgEDC,涡旋混匀;室温反应30min;10000rpm离心10min,弃上清;涡旋重悬颗粒;加入布鲁氏菌脂多糖抗体Ⅰ20μg、大肠杆菌O157脂多糖单克隆抗体Ⅰ55μg,室温反应2-4h;加入酪蛋白,使其终浓度为0.1%,继续反应2-4h;10000rpm离心10min,弃上清;用PBST洗涤颗粒三次;加入20mL颗粒重悬液(10mMTris-HCl,1%BSA,5%海藻糖),重悬颗粒,备用。
2.第三结合垫的制备:按照5μL/cm喷偶联体与聚酯玻璃纤维素膜上,置于37℃烘干,裁成0.4cm宽,备用。
3.第二结合垫的制备:按照5μL/cm喷桥接体(酪蛋白单克隆抗体,浓度为10ng/mL)与聚酯纤维素膜上,置于37℃烘干,裁成0.4cm宽,备用。
4.层析膜的制备:按照1μL/cm喷涂浓度为1.5mg/mL的大肠杆菌O157单克隆抗体Ⅱ作为检测线T1,按照1μL/cm喷涂浓度为1.2mg/mL的布鲁氏菌单克隆抗体Ⅱ作为检测线T2,按照1μL/cm喷涂浓度为0.2mg/mL的羊抗鼠IgG作为质控线,置于室温晾干,备用。
5.样品垫的制备:用[100mMTris(PH8.0),0.5%Tween20]浸泡聚酯纤维素膜,置于37℃烘干,裁成1.2cm宽,备用。
6.试纸条的组装:将样品垫、第二结合垫、第三结合垫、层析膜、吸水垫依次搭接粘贴到PVC底板上,裁成3.5mm宽的试纸条,干燥保存,备用。
7.试纸条的使用:1)样品处理:取牛奶样品20μL,用0.45μM滤膜过滤,用生理盐水洗下滤膜上的菌体,置于100℃沸水浴10min;2)取80μL处理后的产物于样品垫上,15min后观察结果(质控线不显色判定检测无效,否则只要检测线有红色出现即判定为阳性)。
8.本方法与检测梯度稀释的羊布鲁氏菌和大肠杆菌O157,其检测下限分别达到102CFU/ML和101CFU/ML,显著优于目前的方法。
实施例3
免疫层析试纸条检测禽流感流感病毒
1.偶联体的制备:取100μL浓度为10mg/mL的彩色乳胶颗粒,涡旋混匀;加入H5型禽流感病毒单克隆抗体Ⅰ15μg、H5型禽流感病毒单克隆抗体Ⅰ25μg、H9型禽流感病毒单克隆抗体Ⅰ12μg,4℃过夜;加入BSA,使其终浓度为1%,37℃孵育2h;10000rpm离心10min,弃上清;用PBST洗涤颗粒三次;加入20mL颗粒重悬液(10mMTris-HCl,1%酪蛋白,3%海藻糖),重悬颗粒,备用。
2.第一结合垫的制备:按照8μL/cm喷偶联体与聚酯玻璃纤维素膜上,置于37℃烘干;裁成0.4cm宽;按照5μL/cm喷桥接体(BSA单克隆抗体,浓度10ng/mL),置于37℃烘干;备用。
3.层析膜的制备:按照1μL/cm喷涂浓度为1.5mg/mL的H5禽流感单克隆抗体Ⅱ作为检测线T1,按照1μL/cm喷涂浓度为1.2mg/mL的H7禽流感单克隆抗体Ⅱ作为检测线T2,按照1μL/cm喷涂浓度为2mg/mL的H7禽流感多克隆抗体作为检测线T3,按照1μL/cm喷涂浓度为0.2mg/mL的羊抗鼠IgG作为质控线,置于室温晾干,备用。
4.样品垫的制备:用[100mMTris(PH8.0)、0.5%Tween20]浸泡聚酯纤维素膜,置于37℃烘干,裁成1.2cm宽,备用。
5.试纸条的组装:将样品垫、第一结合垫、层析膜、吸水垫依次搭接粘贴到PVC底板上,裁成3.5mm宽的试纸条,干燥保存,备用。
6.试纸条的使用:1)样品处理:取咽拭子,于2mL生理盐水中洗下上面的病毒;2)取80μL病毒样品于样品垫上,15min后观察结果(质控线不显色判定检测无效,否则只要检测线有红色出现即判定为阳性)。
7.用本试纸条检测97份禽流感咽拭子样本,从中检测出12份阳性,其中H72份,H93份,H57份。上述阳性样本经病毒培养检测均为阳性。采用IDEXX禽流感抗体检测试剂盒检测,从中检测出53份禽流感阳性样本,经病毒培养检测,7份为阳性。
实施例4
免疫层析装置同时检测布鲁氏菌BP26蛋白和OMP31蛋白
1.偶联体的制备:取100μL浓度为10mg/mL的金纳米棒,涡旋混匀;加入BP26单克隆抗体Ⅰ5μg、OMP31单克隆抗体Ⅰ5μg,4℃过夜;加入BSA,使其终浓度为1%,室温孵育2h;10000rpm离心10min,弃上清;用PBST洗涤颗粒三次;加入20mL颗粒重悬液(10mMTris-HCl,1%酪蛋白,3%海藻糖),重悬颗粒,备用。
2.反应微孔的制备:取25μL偶联体,加入微孔中,冻干,密封,备用。
3.第四结合垫的制备:按照5μL/cm喷桥接体(BSA单克隆抗体,浓度10ng/mL),裁成0.4cm宽;置于37℃烘干;备用。
4.层析膜的制备:按照1μL/cm喷涂浓度为1.5mg/mL的BP26单克隆抗体Ⅱ作为检测线T1,按照1μL/cm喷涂浓度为1.8mg/mL的OMP31单克隆抗体Ⅱ作为检测线T2,按照1μL/cm喷涂浓度为0.2mg/mL的羊抗鼠IgG作为质控线,置于室温晾干,备用。
5.样品垫的制备:用[100mMTris(PH8.0)、0.5%Tween20]浸泡聚酯纤维素膜,置于37℃烘干,裁成1.2cm宽,备用。
6.试纸条的组装:将样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫依次搭接粘贴到PVC底板上,裁成3.5mm宽的试纸条,干燥保存,备用。
7.试纸条的使用:1)样品处理:取牛奶样品20mL,用0.45μM滤膜过滤,用生理盐水洗下滤膜上的菌体,置于100℃沸水浴10min;2)取200μL处理后的产物于反应微孔中,混匀,40℃孵育3min,将试纸条的样品垫端插入反应微孔,15min后观察结果(质控线不显色判定检测无效,否则只要检测线有红色出现即判定为阳性)。
8.本方法检测150份牛奶样品(其中23份经分离培养法检测为阳性),与布鲁氏菌分离培养法的吻合率达到100%。
实施例5
免疫层析试纸同时检测HIV抗体和HCV抗体
1.偶联体的制备:按照Frens法(1973)制备30nm胶体金颗粒;按照每毫升胶体金颗粒加入3μL0.2M碳酸钾的量调节PH;按照每毫升胶体金颗粒加入8μgHIV检测抗原(深圳菲鹏生物)、11μgHCV检测抗原(深圳菲鹏生物),室温反应15min;加入牛血清白蛋白(BSA),使其终浓度为1%,室温静置15min;10000rpm离心10min;弃掉上清,加入1/10胶体金体积的重悬液[10mMTris(PH8.0),0.5%Tween20,0.4%酪蛋白、2%蔗糖]重悬颗粒。
2.桥接体的制备:按照Frens法(1973)制备20nm胶体金颗粒;按照每毫升胶体金颗粒加入4μL0.2M碳酸钾的量调节PH;按照每毫升胶体金颗粒加入10μgBSA的单克隆抗体室温反应15min;加入酪蛋白,使其终浓度为0.2%,室温静置15min;10000rpm离心10min;弃掉上清,加入与胶体金体积相同的重悬液[10mMTris(PH8.0),0.5%Tween20,0.4%酪蛋白、2%蔗糖]重悬颗粒。
3.第三结合垫的制备:按照5μL/cm喷偶联体于奥斯龙8964玻璃纤维素膜上,置于37℃烘干,裁成0.4cm宽,备用。
4.第二结合垫的制备:按照5μL/cm喷桥接体于奥斯龙8964玻璃纤维素膜上,置于37℃烘干,裁成0.4cm宽,备用。
5.层析膜的制备:按照1μL/cm喷涂浓度为1mg/mL的HIV包被抗体作为检测线T1,按照1μL/cm喷涂浓度为2mg/mL的HCV包被抗体作为检测线T2,按照1μL/cm喷涂浓度为0.2mg/mL的羊抗鼠IgG作为质控线,置于室温晾干,备用。
6.样品垫的制备:用[100mMTris(PH8.0)、0.5%Tween20]浸泡聚酯纤维素膜,置于37℃烘干,裁成0.8cm宽,备用。
7.试纸条的组装:将样品垫、第二结合垫、第三结合垫、层析膜、吸水垫依次搭接粘贴到PVC底板上,裁成3.5mm宽的试纸条,干燥保存,备用。
8.试纸条的使用:取2μL血清或血浆于样品垫上,加80μL生理盐水于样品垫上,10min后观察结果(质控线不显色判定检测无效,否则只要检测线有红色出现即判定为阳性)。
9.检测2546份血浆样本,本方法与Abbott公司的丙型肝炎HCV抗体检测微粒发光试剂盒吻合率达到99.6%以上,与上海科华HIV抗体酶联免疫试剂盒吻合率达到99.3%。
实施例6
同时检测沙门氏菌、大肠杆菌O157、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌
1.引物序列如下表所示:上下游引物的5’端分别有不同的半抗原分子标记(如生物素)。
2.PCR扩增体系:2.5μL10×PCRBuffer,0.1μL上下游引物(100nM),2UTaq酶,加水至23μL;加入模板(DNA)2μL;扩增条件:95℃5min;94℃5s,55℃40s,72℃40s;30个循环。
3.偶联体的制备:按照Frens法(1973)制备30nm胶体金颗粒;按照每毫升胶体金颗粒加入3μL0.2M碳酸钾的量调节PH;按照每毫升胶体金颗粒加入4μg地高辛单克隆抗体、3μg罗丹明B单克隆抗体、3μgHEX单克隆抗体、4μgCy3抗体,室温反应15min;加入牛血清白蛋白(BSA),使其终浓度为1%,室温静置15min;10000rpm离心10min;弃掉上清,加入1/10胶体金体积的重悬液[10mMTris(PH8.0),0.5%Tween20,0.4%酪蛋白、2%蔗糖]重悬颗粒。
4.桥接体的制备:按照Frens法(1973)制备20nm胶体金颗粒;按照每毫升胶体金颗粒加入4μL0.2M碳酸钾的量调节PH;按照每毫升胶体金颗粒加入10μgBSA的单克隆抗体室温反应15min;加入酪蛋白,使其终浓度为0.2%,室温静置15min;10000rpm离心10min;弃掉上清,加入与胶体金体积相同的重悬液[10mMTris(PH8.0)、0.5%Tween20、0.4%酪蛋白、2%蔗糖]重悬颗粒。
5.第三结合垫的制备:按照3μL/cm喷偶联体于奥斯龙8964玻璃纤维素膜上,置于37℃烘干,裁成0.4cm宽,备用。
6.第二结合垫的制备:按照5μL/cm喷桥接体于奥斯龙8964玻璃纤维素膜上,置于37℃烘干,裁成0.4cm宽,备用。
7.层析膜的制备:按照1μL/cm喷涂浓度为1mg/mL的抗生物素单克隆抗体作为检测线T1,按照1μL/cm喷涂浓度为2mg/mL的抗FITC单克隆抗体作为检测线T2,按照1μL/cm喷涂浓度为1mg/mL的抗Cy5单克隆抗体作为检测线T3,按照1μL/cm喷涂浓度为2mg/mL的抗FAM单克隆抗体作为检测线T4,按照1μL/cm喷涂浓度为0.2mg/mL的羊抗鼠IgG作为质控线,置于室温晾干,备用。
8.样品垫的制备:用[100mMTris(PH8.0)、0.5%Tween20]浸泡聚酯纤维素膜,置于37℃烘干,裁成0.8cm宽,备用。
9.试纸条的组装:将样品垫、第二结合垫、第三结合垫、层析膜、吸水垫依次搭接粘贴到PVC底板上,裁成3.5mm宽的试纸条,干燥保存,备用。
10.试纸条的使用:将PCR产物用生理盐水稀释5倍,取80μL于样品垫上,5min后观察结果(质控线不显色判定检测无效,否则只要检测线有红色出现即判定为阳性)。
11.本方法与检测用生理盐水梯度稀释的菌体的灵敏性分别达到100cfu/mL(金黄色葡萄球菌)、101CFU/mL(E.coliO157:H7)、102CFU/mL(L.monocytogenes)、100CFU/mL(沙门氏菌)。
实施例6
免疫渗滤法检测流感病毒
1.偶联体的制备:按照Frens法(1973)制备40nm胶体金颗粒;按照每毫升胶体金颗粒加入5μL0.2M碳酸钾的量调节PH;按照每毫升胶体金颗粒加入8μg流感A病毒单克隆抗体Ⅰ、12μg流感B病毒单克隆抗体Ⅰ,室温反应15min;加入牛血清白蛋白(BSA),使其终浓度为1%,室温静置15min;10000rpm离心10min;弃掉上清,加入等胶体金体积的重悬液[10mMPB(PH7.4)、0.4%酪蛋白、5%蔗糖]重悬颗粒。
2.桥接体的制备:按照Frens法(1973)制备20nm胶体金颗粒;按照每毫升胶体金颗粒加入4μL0.2M碳酸钾的量调节PH;按照每毫升胶体金颗粒加入10μgBSA的单克隆抗体室温反应15min;加入酪蛋白,使其终浓度为0.2%,室温静置15min;10000rpm离心10min;弃掉上清,加入两倍胶体金体积的重悬液[10mMPB(PH7.4)、0.4%酪蛋白、5%蔗糖]重悬颗粒。
3.渗滤膜的制备:按照0.5μL/点喷涂浓度为1mg/mL的流感A病毒单克隆抗体Ⅱ作为检测点1,按照0.5μL/点喷涂浓度为1.5mg/mL的流感B病毒单克隆抗体Ⅱ作为检测点2,按照1μL/点喷涂浓度为0.3mg/mL的羊抗鼠IgG作为质控点,置于37℃晾干,备用。
4.渗滤卡的组装:按照卡底、吸水垫料、渗滤膜、卡盖的次序组装渗滤卡,备用。
5.检测:1)往滤膜上滴加一滴封闭液(20mMPB、0.5%酪蛋白);2)液体滤过之后,滴加一滴血清样本;3)血清滤完之后,滴加一滴洗涤液(PBST);4)滤完之后滴加一滴偶联体、一滴桥接体;5)等液体滤完之后,滴加一滴洗涤液(PBST);6)滤完之后,观察结果(质控点不显色判定检测无效,否则只要检测点有红色出现即判定为阳性)。
6.分别采用上述流感病毒检测方法和北京万泰生物药业股份有限公司的甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒检测梯度稀释的流感A和流感B病毒阳性样本。检测结果显示,本发明所公开的方法在灵敏性上具有明显优势。将流感A病毒阳性样本用生理盐水倍比稀释,稀释512倍后本发明所公开的方法检测结果仍为阳性,而万泰的检测试剂盒检测稀释到128倍的样本,检测结果为阴性。同样将将流感B病毒阳性样本用生理盐水倍比稀释,稀释256倍后本发明所公开的方法检测结果仍为阳性,而万泰的检测试剂盒检测稀释到64倍的样本,检测结果为阴性。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制,但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案,均应落在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种信号放大方法,其用于检测靶物质,包括:
将具有能特异性结合不同靶物质的多种第一分子的偶联体与多种靶物质结合,偶联体还包括连接体、和与多种第一分子和连接体结合的第一颗粒;
桥接体与偶联体的连接体结合,桥接体包括能特异性结合偶联体的连接体的第二分子;
通过能特异性结合不同靶物质的多种第三分子分别捕获与桥接体结合后的偶联体上的多种靶物质。
2.一种信号放大方法,其用于检测靶物质,包括:
将具有能特异性结合不同靶物质的多种第一分子的偶联体与多种靶物质结合,偶联体还包括与多种第一分子结合的第一颗粒;
桥接体与偶联体的第一分子结合,所述桥接体包括能特异性结合偶联体的多种第一分子的第二分子;
通过能特异性结合不同靶物质的多种第三分子分别捕获与桥接体结合后的偶联体上的多种靶物质。
3.一种检测靶物质的免疫层析试纸,包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第一结合垫、层析膜、吸水垫;所述第一结合垫包被有偶联体和桥接体,其中该偶联体包括能特异性结合不同靶物质的多种第一分子、连接体及与多种第一分子和连接体结合的第一颗粒,桥接体包括能特异性结合偶联体的连接体的第二分子;所述层析膜上不同区域的检测线固定有能特异性结合不同靶物质的多种第三分子。
4.一种检测靶物质的免疫层析试纸,包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第一结合垫、层析膜、吸水垫;所述第一结合垫包被有偶联体和桥接体,其中该偶联体包括能特异性结合不同靶物质的多种第一分子、和与多种第一分子结合的第一颗粒,桥接体包括能特异性结合偶联体的连接体的第二分子;所述层析膜上不同区域的检测线固定有能特异性结合不同靶物质的多种第三分子。
5.一种检测靶物质的免疫层析试纸,包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第二结合垫、第三结合垫、层析膜、吸水垫;所述第三结合垫包被有偶联体,该偶联体包括能特异性结合不同靶物质的多种第一分子、连接体及与多种第一分子和连接体结合的第一颗粒,所述第二结合垫包被有具有能特异性结合偶联体的连接体的第二分子的桥接体;所述层析膜上不同区域的检测线固定有能特异性结合不同靶物质的多种第三分子。
6.一种检测靶物质的免疫层析试纸,包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第二结合垫、第三结合垫、层析膜、吸水垫;所述第三结合垫包被有偶联体,该偶联体包括能特异性结合不同靶物质的多种第一分子、和与多种第一分子结合的第一颗粒;所述第二结合垫包被有具有能特异性结合偶联体的多种第一分子的第二分子的桥接体;所述层析膜上不同区域的检测线固定有能特异性结合不同靶物质的多种第三分子。
7.根据权利要求5或6所述的免疫层析试纸,其特征在于,所述第二结合垫与第三结合垫调换位置顺序。
8.一种检测靶物质的免疫层析装置,包括反应微孔和免疫层析试纸,该免疫层析试纸包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第四结合垫、层析膜、吸水垫;所述反应微孔含有偶联体,该偶联体包括能特异性结合不同靶物质的多种第一分子、连接体及与多种第一分子和连接体结合的第一颗粒;所述第四结合垫包被有具有能特异性结合偶联体的连接体的第二分子的桥接体,所述层析膜上不同区域的检测线固定有能特异性结合不同靶物质的多种第三分子。
9.一种检测靶物质的免疫层析装置,包括反应微孔和免疫层析试纸,该免疫层析试纸包括依次搭接粘贴在底板上的样品垫、第四结合垫、层析膜、吸水垫;所述反应微孔含有偶联体,该偶联体包括能特异性结合不同靶物质的多种第一分子、和与多种第一分子结合的第一颗粒;所述第四结合垫包被有具有能特异性结合偶联体的多种第一分子的第二分子的桥接体,所述层析膜上不同区域的检测线固定有能特异性结合不同靶物质的多种第三分子。
10.一种靶物质的免疫渗滤装置,由渗滤卡、封闭液、偶联体、桥接体、洗涤液组成,其中渗滤卡由卡底、吸水垫料、渗滤膜、卡盖依次叠加组成,该免疫渗滤装置的检测方法包括以下步骤:
往渗滤膜上滴加一滴封闭液;
液体滤过之后,滴加一滴血清样本;
血清滤完之后,滴加一滴洗涤液;
滤完之后滴加一滴权利要求1或2所述的偶联体、一滴权利要求1或2所述的桥接体;
等液体滤完之后,滴加一滴洗涤液;
滤完之后,观察结果;
其中,渗滤膜上不同区域的检测点固定有能特异性结合不同靶物质的多种第三分子。
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