JP4270751B2 - 全血用クロマトグラフィーデバイス内のポリカチオンの中和 - Google Patents
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Description
(発明の技術分野)
本発明は、全血サンプル中の分析物を検出するためのクロマトグラフィーアッセイデバイス及び方法、より特定的には、赤血球を凝集させる赤血球分離剤と赤血球分離剤がアッセイ系に与え得るいかなるマイナス効果も中和する中和剤とを使用するデバイス及び方法に関する。
【0002】
(発明の背景)
現代の臨床診断法では血液サンプルの検査が慣例になっている。しかしながら赤血球は多くの診断的定量を妨害するという不都合を生じる。赤血球は分析物のアッセイ中に特異的結合対を成す成分間の結合を阻害するであろう。また、赤血球は酵素活性を有しており、この活性は使用アッセイ次第では発生したシグナルを妨害するであろう。更に、クロマトグラフィーアッセイデバイス、特にクロマトグラフィーイムノアッセイデバイスを使用する高速試験フォーマットにおいて、赤血球は、デバイス上で反応を生じさせるために必要な流体流を阻害するであろう。これらの理由及びその他の理由から、多くのアッセイ方法には血漿または血清が使用されており、最初に全血サンプルから血漿または血清を分離する必要がある。
【0003】
全血サンプル中の赤血球を血漿から分離するための多くの公知技術が存在する。遠心分離は全血から血漿(血餅形成前)及び血清(血餅形成後)を分離する当業界で公知の方法である。この手順では、赤血球を試験管の底に沈降させ、デカンテーションまたは別の方法で血清を分離する。しかしながら遠心分離による全血の層分離には多くの欠点がある。遠心分離は一般に大量の血液サンプルの採取を要する。更に、処理に時間が掛かる。また、開業医には維持し難い大型実験装置が必要である。最後に、血液処理工程が増えるので、血液に含まれている病原体の被害を蒙る機会が増える。
【0004】
遠心分離の必要性を軽減または解消するために、血液の液体部分から赤血球を分離する勾配膜または捕獲膜を使用するアッセイデバイスが開発された。固定化した抗赤血球抗体も使用された。
【0005】
赤血球を血漿または血清から分離する別の公知の方法としては、(1)全血サンプルに赤血球結合剤を混合し、凝固した赤血球を除去するために特異的結合対の少なくとも一方の成分を結合させた吸水性固体エレメントで混合物を濾過する方法;(2)任意に凝固剤を組込んだガラスマイクロファイバーフィルターで全血を濾過する方法;(3)多糖材料の遮断層または排除層を使用して赤血球の通過を防止し、乾燥試験ストリップ上のシグナルの検出または可視化の妨害を防止する方法;及び、(4)赤血球を結合させるが血漿を結合させないポリカチオン性表面をもつ支持体を使用する方法、がある。
【0006】
赤血球を血漿から分離するこれらの技術の多くはコスト高で且つ複雑であり、結局は赤血球の分離が不完全であったり、溶血が生じたりする。溶血は非特異的結合または高いバックグラウンドをもたらし、アッセイ感度を低下させる。何故なら、遊離ヘモグロビンは検出ゾーンを淡紅色から暗褐色の間に着色させ、その結果として、検出ゾーンにヘモグロビンの色が存在するので発生した可視化学シグナルが全体的または部分的に隠蔽されるからである。更に、ポリカチオンのような分離剤をアッセイ系に使用すると、赤血球以外の別の試薬または結合成分の凝集がしばしば生じて系が妨害され易い。
【0007】
従って、アッセイ系に不利な影響を与えることなく血液サンプル中の分析物を検出するデバイス及び方法が要望されている。このようなデバイス及び方法は、小さいサンプルも含めて種々のサイズの血液サンプルに適していなければならない。
【0008】
(発明の概要)
本発明は、毛細流を支持し得る流体流の通路を規定しているクロマトグラフィー担体と、クロマトグラフィー担体に流体流接触させる血液サンプルの添加部位と、添加部位から離間したクロマトグラフィー担体上の検出部位と、添加部位の下流の場所に拡散的に結合された標識物質と、血液サンプルから血漿または血清を分離すべく検出部位の上流に拡散的に結合された赤血球分離剤と、分離剤と結合すべく結合分離剤の下流で検出部位の上流に拡散的に結合され分離剤の正電荷を中和し得る中和剤と、から成るクロマトグラフィーデバイスに関する。好ましくは、赤血球分離剤は、血清または血漿がクロマトグラフィー担体の下流に移動する前に赤血球が血清または血漿から分離されるように添加部位に配置される。
【0009】
本発明はまた、サンプル、好ましくは血液サンプル中の分析物の存在を検出する方法に関する。方法は、毛細流を支持し得る流体流の通路を規定しているクロマトグラフィー担体を準備し、この通路に沿って、(a)クロマトグラフィー担体に流体流接触させる血液サンプルの添加部位と、(b)添加部位から離間したクロマトグラフィー担体上の検出部位と、(c)添加部位の下流の場所に拡散的に結合された標識物質と、(d)血液サンプルから血漿または血清を分離すべく検出部位の上流に拡散的に結合された赤血球分離剤と、(e)分離剤に結合すべく結合分離剤の下流で検出部位の上流に拡散的に結合され分離剤の正電荷を中和し得る中和剤とを配備する段階と、赤血球分離剤が血液サンプルから血清または血漿を分離し且つサンプルが流路に沿って流動するときに中和剤が分離剤の正電荷を中和するように添加部位を血液サンプルに接触させる段階と、血液サンプル中の分析物の存在を検出する段階とから成る。
【0010】
(詳細な説明)
本発明は、全血サンプル中の赤血球が、赤血球の非存在下ならばアッセイ系によって容易に行われる筈の血液サンプル中の分析物の存在または量の測定を妨害するという観察に基づく。例えばイムノアッセイにおいて、添加部位に接触した全血サンプルは毛細管作用によってストリップの下流に移動することが難しいが、この原因は妨害的または障害的な赤血球の存在にある。本発明はアッセイ系の感度を損なうことなくこの問題を解決し得る。
【0011】
以下の定義は本発明の実施態様の理解に役立つであろう。
【0012】
“分析物”または“対象分析物”なる用語は、少なくとも1つのエピトープまたは結合部位を有している検出または測定すべき化合物または組成物を意味する。分析物は、天然産生の分析物特異的結合成分が存在しているかまたは該分析物に対する分析物特異的結合成分を合成し得る任意の物質を意味する。分析物の非限定例としては、毒素、有機化合物、タンパク質、ペプチド、微生物、アミノ酸、核酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬物(治療目的で投与される薬物及び違法に投与される薬物の双方を含む)、上記物質のいずれかの代謝産物または上記物質のいずれかに対する抗体がある。“分析物”なる用語はまた、任意の抗原性物質、ハプテン、抗体、高分子及びその組合せを包含する。
【0013】
“クロマトグラフィー担体”は、多孔性、吸収性、吸水性、等張性または毛管性の任意の適当な材料を意味する。これはデバイスの検出部位を含み、分析物または被験サンプルは毛細管作用すなわち灯心作用によってクロマトグラフィー担体中を搬送される。クロマトグラフィー担体は単一材料から製造されてもよく、または、多数の層が互いに流体流接触しこれによって被験サンプルが材料間を通過できるならば2種以上の材料から製造されてもよい(例えば異なるゾーン、部分、層、領域または部位を異なる材料から製造し得る)ことは当業者に容易に理解されよう。流体流接触によってサンプルの少なくとも幾つかの成分即ち分析物が多孔性材料のゾーン間を流動でき、好ましくは異なるゾーン間の接触界面に沿って均一に流動できる。天然材料、合成材料または合成的に改質した天然材料をクロマトグラフィー担体として使用できる。その非限定例としては、紙(繊維性)または紙などのセルロース材料の膜(微孔性);セルロース並びに酢酸セルロース及びニトロセルロースのようなセルロース誘導体;ファイバーガラス;天然布(例えば木綿)及び合成布(例えばナイロン);多孔質ゲルなどがある。
【0014】
“標識”は、可視手段または計器手段によって検出可能なシグナルを発生し得る任意の物質を意味する。本発明で好適に使用される種々のラベルは、化学的または物理的手段によってシグナルを発生するラベルである。これらの例としては、酵素及び基質、色原体、蛍光化合物、化学発光化合物、有色のまたは着色可能な有機ポリマーラテックス粒子、リポソームまたはその他の直接観察できる物質を含有する小胞がある。本発明では放射性標識、コロイド状金属粒子またはコロイド状非金属粒子が好ましく使用される。好ましい標識はコロイド状の金及びラテックス粒子である。
【0015】
“標識物質”または“コンジュゲート”は、特異的結合成分に結合した検出可能ラベルを含む物質を意味する。結合は共有結合でも非共有結合でもよく、核酸ハイブリダイゼーションでもよい。標識は、被験サンプル中の分析物の量に直接または間接に関係する検出可能シグナルを標識物質に発生させる。標識物質の特異的結合成分は分析物に直接または間接に結合するように選択される。
【0016】
「特異的結合成分」は特異的結合対の各成分、即ち一方の分子が化学的または物理的手段を介して第二の分子に特異的に結合するような異なる2つの分子を意味する。特異的結合成分が免疫反応体であるとき、この成分は例えば、抗体、抗原、ハプテンまたはその複合体でよく、抗体が使用されるとき、抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、組換えタンパク質または抗体、キメラ抗体、その(1つまたは複数の)混合物または(1つまたは複数の)フラグメント並びに抗体と別の特異的結合成分との混合物でよい。特異的結合成分の特定例としては、ビオチンとアビジン、抗体と対応抗原(双方がアッセイサンプルに関係を有していない)、一本鎖核酸とその相補鎖、などがある。
【0017】
「捕獲物質」は、クロマトグラフィー担体の一部分の内部または上部に結合して1つまたは複数の「捕捉部位」を形成し、分析物、標識試薬及び/または対照試薬をクロマトグラフィー担体に固定させる1つまたは複数の特異的結合成分を意味する。本発明では結合方法は厳密に限定されない。捕獲物質は分析物及び/または標識物質を未結合アッセイ試薬及び被験サンプル中の残余成分から実質的に分離することによって検出可能シグナルの観察を容易にする。捕獲物質はアッセイの開始前またはアッセイの進行中に任意の適当な結合方法によってクロマトグラフィー担体に固定される。更に、捕獲物質はクロマトグラフィー担体の上部または内部の単一の検出部位に配備されてもよくまたは複数の部位に配備されてもよい。捕獲物質はまた、種々の検出フォーマットまたは測定フォーマットを生じる多様な配置で配備され得る。例えば、捕獲物質を文字、数字、アイコンまたは記号またはその任意の組合せとして配置し得る。
【0018】
特に、本発明は、サンプル、好ましくは血液サンプル中の分析物の存在を検出するためのクロマトグラフィーアッセイデバイスを提供する。デバイスは好ましくは、毛細流を支持し得る流体流通路を規定しているクロマトグラフィー担体と血液サンプルの添加部位と血液サンプル中の分析物の存在または量を検出すべく添加部位から離間した検出部位とを有するクロマトグラフィーストリップの形態である。好ましくはデバイスが更に、クロマトグラフィー担体に拡散的に結合された標識物質(即ちコンジュゲート)を含む。好ましい実施態様では、標識物質は分析物に結合する物質または検出部位への結合に関して分析物と競合する物質であろう。デバイスは好ましくはクロマトグラフィー担体に結合した2つの追加物質、即ち、(1)検出部位の上流(以後の記載では、毛細管作用によって生じたサンプルの移動方向を「下流」と呼び、反対方向を「上流」と呼ぶ)で血液サンプルから血漿または血清を分離し得る赤血球分離剤と、(2)赤血球分離剤の下流及び検出部位の上流でクロマトグラフィー系に対する赤血球分離剤の作用特に副作用を中和する中和剤とを含む。
【0019】
本発明の文脈で所与の試薬に使用した「拡散的に結合された」という表現は、標識物質、特異的結合成分、赤血球分離剤または中和剤を非限定例とする本発明に使用される任意の試薬に関する定義であり、(1種類または複数の)試薬が結合され、結合された(1種類または複数の)試薬が流路に沿って流動可能な状態であることを表す。
【0020】
任意のアッセイ系を本発明の目的に使用し得る。イムノアッセイ系が好ましい。その非限定例は、水平流系、垂直流系、浸漬系及びディップスティックである。公知のアッセイ系を以下に概略的に記載する。
【0021】
一般に、クロマトグラフィーストリップにおいては、少なくとも1つのサンプル添加部位と検出部位とがクロマトグラフィー担体上に配置されている。対象分析物を含む疑いのあるサンプル溶液、この場合には好ましくは血液サンプル、即ち分析液は、サンプル添加部位に添加されると毛細管作用によってクロマトグラフィー担体中を移動し、予めクロマトグラフィー担体上に配置された標識手段に含まれている標識物質またはコンジュゲートは、(免疫反応のような)結合反応によって検出されたサンプル溶液中の被検定物質の存在または量に正比例または反比例して検出部位に蓄積する。その結果、サンプル溶液中の被検定物質の存在または量が、蓄積した標識物質またはコンジュゲートの存在または量の測定によって判明する。多様な種類のクロマトグラフィーストリップが公知である。後述するものを含むこれらの公知のクロマトグラフィーストリップはいずれも本発明で使用できる。本文中で使用された「クロマトグラフィーアッセイデバイス」という用語は、アッセイで使用でき且つ保存及び運搬できるように作製されたクロマトグラフィーストリップを意味する。
【0022】
クロマトグラフィーストリップの典型例を以下に記載する。サンプル添加部位は、標識物質が存在する場所と同じ場所に配置されてもよいが、好ましくは標識物質の上流の場所に配置される。被検定分析物を含む疑いのあるサンプル溶液をサンプル添加部位に接触させると、サンプル溶液が毛細管作用によって分析物と共にクロマトグラフィー担体中を下流方向に移動する。典型的には分析物は、検出部位に固定された捕獲物質に特異的に結合する化合物であるか、または、検出部位の捕獲物質に特異的に結合するコンジュゲートに特異的に結合する化合物である。例えば、捕獲物質が抗原であるかまたはコンジュゲートが抗原を含有しているときは分析物は抗体であり、捕獲物質が抗体であるかまたはコンジュゲートが抗体を含有しているときは分析物は抗原である。別の例として、分析物は、相補的なコンジュゲート及び捕獲物質に結合する核酸でもよい。
【0023】
サンプル添加部位が標識物質に対して上流の場所に配置されるとき、標識物質はサンプル添加部位に隣接して配置されてもよく、または、サンプル添加部位から不連続の場所に配置されてもよい。
【0024】
標識物質の添加は種々の手段によって行うことができ、例えばサンプル溶液添加後にクロマトグラフィーストリップ検出部位の外側のある場所に標識物質を添加してもよい。
【0025】
標識物質がサンプル溶液の毛細管作用によって移動するように配置されているるので、サンプル溶液をサンプル添加手段に添加したときに標識物質は下流方向に移動する。
【0026】
検出部位は一般に標識物質から下流の場所に標識物質からある程度の間隔で配置されている。検出部位では、分析物もしくはコンジュゲートだけに特異的に結合するかまたは被験物質の各々及び標識物質に特異的に結合する捕獲物質がクロマトグラフィー担体に固定されている。その結果として、1つの実施態様では、サンプル溶液の毛細管作用によって移動した分析物(ときには標識物質に結合している)が捕獲物質に結合するか、または、分析物がコンジュゲートに結合し、該コンジュゲートが捕獲物質に結合する。標識物質はこのように結合した被検定物質に結合し、これによって検出手段内で分析物の存在または量に応じた標識物質が蓄積する。あるいは、毛細管作用によって移動した標識物質と分析物とが競合的に捕獲物質に結合するか、または、コンジュゲートに結合し、該コンジュゲートが捕獲物質に結合する。その結果として、被検定物質の量に反比例する標識物質が蓄積する。
【0027】
ある種の標識物質は捕獲物質(または以後に捕獲物質に結合するコンジュゲート)と分析物との双方に結合するが、結合が同時に生じないという場合がある。この場合には、最初に分析物が標識物質に結合し、被検定物質に結合しなかった残りの標識物質が捕獲物質に結合する。その結果、検出手段に蓄積した標識物質を測定することによって分析物の存在または量を分析できる。
【0028】
必要な場合には、種々の物質を検出部位の上流に配置する。例えば、コンジュゲートを移動可能な状態で検出部位の上流に配置し得る。
【0029】
幾つかの場合には、1つまたは複数の追加の検出部位を第一検出部位の下流に配置し得る。また、サンプル溶液が完全に排出されるように検出部位の下流でクロマトグラフィー担体を更に延長してもよく、または、サンプル溶液吸収材料を担体に配備してもよい。
【0030】
上記のごとく、サンプル溶液中の対象分析物の存在または量は、検出部位に蓄積する標識物質の存在または量を測定することによって判明する。1つの例では、測定が目視によって行われる。
【0031】
本発明は、血清及び血漿などの任意の血液サンプルに使用できるが、好ましくは、赤血球を含有する血液サンプル、即ち全血に使用される。
【0032】
アッセイを望ましい感度で行う必要があるときは、血液サンプル中の対象分析物の検定を開始する前に赤血球を除去するのが好ましい。このためには、本発明に従って赤血球分離剤をクロマトグラフィー担体に結合させる。好ましくは、赤血球分離剤をクロマトグラフィー担体に拡散的に結合させる。赤血球分離剤は、任意の場所でクロマトグラフィー担体に結合され、赤血球を血漿または血清から分離すべく機能し得る。好ましくは、赤血球分離剤を検出部位の上流でクロマトグラフィー担体に拡散的に結合させる。最も好ましくは、赤血球分離剤をサンプル添加部位で拡散的に結合させる。この場所が好ましい理由は、赤血球がクロマトグラフィー担体に添加されたときに赤血球分離剤が直ちに赤血球を凝集させるので、毛細管作用による血清または血漿の担体に沿った流動に対する妨害はたとえあったとしても極めて少ないからである。
【0033】
本発明の赤血球分離剤は赤血球を凝集させ得る任意の物質でよい。好ましい物質は、ポリカチオンのような正電荷をもつ物質である。ポリカチオンの例は、ポリ−L−リシン臭化水素酸塩;ポリ(ジメチルジアリルアンモニウム)塩化物(Merquat(登録商標)−100、Merquat(登録商標)280、Merquat(登録商標)550);ポリ−L−アルギニン臭化水素酸塩;ポリ−L−ヒスチジン;ポリ(4−ビニルピリジン)、ポリ(4−ビニルピリジン)塩酸塩;ポリ(4−ビニルピリジン)架橋メチルクロリド第四塩;ポリ(4−ビニルピリジン−コ−スチレン);ポリ(4−ビニルピリジニウムポリ(フッ化水素));ポリ(4−ビニルピリジニウム−p−トルエンスルホン酸塩);ポリ(4−ビニルピリジニウム−三臭化物);ポリ(4−ビニルピロリドン−コ−2−ジメチルアミノエチルメタクリル酸塩);ポリビニルピロリドン,架橋;ポリビニルピロリドン,ポリ(メラミン−コ−ホルムアルデヒド);部分メチル化;ヘキサジメトリン臭化物;ポリ(Glu,Lys)1:4臭化水素酸塩;ポリ(Lys,Ala)3:1臭化水素酸塩;ポリ(Lys,Ala)2:1臭化水素酸塩;ポリ−L−リシンスクシニル化;ポリ(Lys,Ala)1:1臭化水素酸塩;及びポリ(Lys,Trp)1:4臭化水素酸塩である。最も好ましいポリカチオンはポリ(ジメチルジアリルアンモニウム)塩化物(Merquat(登録商標)−100)である。
【0034】
本発明の赤血球分離剤は、赤血球をサンプルの残余部分から分離すべく機能する適当な任意の量で使用され得る。好ましくは、赤血球分離剤は約0.04%−約1.3%(重量/容量)、より好ましくは約0.13%−約0.33%(重量/容量)、最も好ましくは約0.20%−約0.33%(重量/容量)の濃度で存在し得る。
【0035】
赤血球分離剤の正電荷はストリップ上に存在する負電荷をもついかなる物質をも凝集させる傾向を有している。例えばクロマトグラフィー担体に結合された標識物質またはコンジュゲートも赤血球分離剤によって凝集するので、分析物がコンジュゲートに結合することが妨害されたり、競合アッセイ中に標識物質と対象分析物とが検出部位の捕獲物質またはコンジュゲートに結合することが妨害されたりする。結局、イムノアッセイ系の感度及び正確度が損なわれる。
【0036】
従って、血球分離剤が正電荷をもつ物質であるときは、本発明の中和剤を使用するのが好ましい。中和剤は赤血球分離剤の正電荷を中和でき、これによって赤血球分離剤によって生じるアッセイ系の妨害を解消するかまたは少なくとも著しく軽減する。好ましくは、中和剤をクロマトグラフィー担体に拡散的に結合させる。中和剤は、中和剤が赤血球分離剤を中和すべく機能するクロマトグラフィー担体上の任意の場所に拡散的に結合され得るが、好ましくは赤血球分離剤の下流で検出部位の上流に配置され、より好ましくは拡散的に結合された標識物質と同じクロマトグラフィー上の場所に配置される。
【0037】
中和剤は、赤血球分離剤の正電荷を中和し得る任意のポリアニオンでよい。好ましいポリアニオンとしては、ポリ(アクリル酸)、ポリ(アクリル酸Na塩)、ポリ(メチルメタクリル酸)、ポリ((Na−4−スチレンスルホン酸塩)、ポリ(ビニルスルホン酸)、ポリ−L−アスパラギン酸及びカルボキシメチルセルロースがあり、硫酸デキストランが最も好ましい。
【0038】
中和剤は赤血球分離剤の正電荷を中和すべく機能する任意の量で存在し得る。一般に、中和剤の濃度は赤血球分離剤の使用濃度に依存する。中和剤は約0.33%−約20%(重量/容量)、より好ましくは約0.34%−約10%(重量/容量)、最も好ましくは0.34%−10%(重量/容量)の濃度で存在するのが好ましい。
【0039】
図1は本発明のイムノクロマトグラフィーアッセイデバイスの実施態様を示す。デバイス10は、クロマトグラフィー担体20を含む。クロマトグラフィー担体20の上に血液サンプル添加部位30が配置されている。この好ましい実施態様では赤血球分離剤即ちMerquat(登録商標)100が添加部位30に配置されている。添加部位30に隣接してコンジュゲート即ちセレン標識結合物質と中和剤即ち硫酸デキストランとを含むコンジュゲートパッド40が配置されている。更に下流に検出部位50が存在し、検出部位50は、アッセイ処理が終了したことをコントロールバー60で示し、被検定物質が存在することをテストバー70で示す。
【0040】
本発明の別の実施態様では、好ましくはサンプルを添加部位に接触させた後でバッファを添加部位に接触させてもよい。バッファは、クロマトグラフィー担体上の流路に沿って流体が適正な流速を維持する助けとなる。バッファは、流体の流路に沿って毛細管作用で流動し得る任意の物質でよい。バッファの非限定例は、リン酸塩バッファ、リン酸塩緩衝生理食塩水、トリス−HClバッファ、炭酸塩バッファ、クエン酸塩バッファ、HEPES(2−ヒドロキシピペラジン−N′−2−エタンスルホン酸)バッファ、MOPS(3−(N−モルホリノ)プロパンスルホン酸)バッファ、MES(2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸)バッファなどである。濃度及びpHは所望のアッセイデバイスで使用し得る任意の濃度及びpHでよいが、好ましくは、モル濃度が約10mM−約100mMの範囲、pHが約5−9、より好ましくは約6−8の範囲である。最も好ましくは、50mMのリン酸塩バッファ,pH7.4を使用する。
【0041】
本発明に使用される流体容量はデバイスのサイズに依存する。流体がデバイス内部を検出部位まで流れるような十分な量の流体を使用するのが望ましい。好ましくは、流体容量は約25μl−約100μlの範囲、より好ましくは約40μl−約60μlの範囲である。これに応じて、必要であれば約10μl−約40μl、より好ましくは約20μl−約30μlの容量範囲のバッファを添加するとよい。
【0042】
本発明はまた、血液サンプル中の分析物の存在を検出する方法を目的とする。好ましくは、方法が本発明のクロマトグラフィーイムノアッセイデバイスを使用する。より詳細には方法は、(1)毛細流を支持し得る流体流の通路を規定しているクロマトグラフィー担体を準備し、この通路に沿って、クロマトグラフィー担体に流体接触させる血液サンプルの添加部位と、添加部位から離間したクロマトグラフィー担体上の検出部位と、検出部位に結合すべく分析物に結合するかまたは分析物と競合する拡散的に標識された物質(またコンジュゲート)と、血液サンプルから血漿または血清を分離すべく検出部位の上流に拡散的に結合された赤血球分離剤と、クロマトグラフィー担体に結合されたコンジュゲートとを配備する段階と;(2)赤血球分離剤が血液サンプルの血清または血漿から赤血球を分離し中和剤が分離剤の正電荷を中和するように添加部位を血液サンプルに接触させる段階と;(3)血液サンプル中の分析物の存在を検出する段階とから成る。
【0043】
好ましくは、血球分離剤が正電荷をもつ物質であり、流体流の通路が拡散的に結合された中和剤を含む。中和剤は好ましくは赤血球分離剤と結合できる物質であり、赤血球分離剤の下流で検出部位の上流に配置され、分離剤の正電荷を中和する。
【0044】
従って、図1の好ましい実施態様では、血液サンプルが添加部位30に添加され、赤血球分離剤は赤血球を凝集させることによって赤血球を分離し血漿または血清を毛細管作用によってクロマトグラフィー担体20に沿って下流に移動させる。コンジュゲートパッド40の中和剤はデバイス10上の赤血球分離剤及びコンジュゲートの作用を中和し、分析物はコンジュゲートパッド40に存在するコンジュゲートに結合する。コンジュゲートに結合した分析物は引き続き下流に移動して検出部位50に到達する。対象分析物が存在するときはテストバー70が出現する。試験が適正に行われたことを示すために、対象分析物の有無に関わりなくコントロールバー60が出現する。
【0045】
本発明は好ましくは、デバイスの周囲に非反応性カバーまたは閉鎖容器を含む。好ましくは、カバーは捕獲部位との接触及び捕獲部位の汚染を防止するために少なくともクロマトグラフィー担体を包囲する。また、カバーはある程度の量のサンプルを容易に受容及び/または含有するように添加部位の近傍に隆起領域を含み得る。更に、カバーは文字、数字、アイコンまたは記号またはその任意の組合せの形態の1つまたは複数の切抜き領域を含み得る。この実施態様では、ストリップが完全に閉鎖されたときに1つまたは複数の切抜き領域が(1つまたは複数の)特定の検出部位を形成するように設計されている。ストリップの十分な部分が包装され、添加されたサンプルがストリップの一部分を先ず通過しなければ検出部位に接触できないのが好ましい。
【0046】
本発明のデバイス及び方法は、対象分析物が血液サンプルに含まれている任意のアッセイ系で使用され得る。好ましい系の非限定例は、C型肝炎ウイルス(HCV)、A型肝炎ウイルス(HAV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、B型肝炎表面抗体(HBsAb)、B型肝炎表面抗原(HBsAg)、B型肝炎コア抗体(HBcAb)、B型肝炎コア抗原(HBcAg)、癌胎児性抗原(CEA)、アルファ−フェトプロテイン(AFP)、膵臓癌マーカー(CA19−9)、梅毒、結核、マラリア、リーシュマニア及びデング熱である。
【0047】
以下の実施例は本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されると考えてはならない。
【0048】
実施例
実施例1
ポリカチオンによる赤血球凝集とSe−コンジュゲート凝集との比較
本発明の目的には、全血中の赤血球(rbc)は凝集するがセレンコンジュゲートは凝集しないのが望ましい。種々のポリカチオンを試験し、どのポリカチオンが赤血球を十分に凝集させセレンコンジュゲートをできるだけ凝集させないかについて判定した。
【0049】
HIV−1組換えタンパク質のセレンコンジュゲートを以下の手順で調製した。先ず、32mMの酸化セレンを91mMのL−アスコルビン酸と共に水溶液中で42℃で72時間反応させることによってセレンコロイドを調製した。このセレンコロイドを550nmの波長の光学密度30まで希釈し、次いで30mMのトリスバッファ,pH7.4中の40μg/mlの組換えHIV−1エンベロープタンパク質と共に室温で20分間反応させた。このセレンコロイド標識HIV−1タンパク質コンジュゲートを次に、0.1%のカゼイン含有の10mMのトリスバッファ,pH7.4で550nmの波長の光学密度30まで希釈し、室温で20分間インキュベートした。次いでコンジュゲート溶液を1970×gで4℃で20分間遠心し、上清を取出して、ペレットを廃棄した。次に2%カゼイン含有の30mMのトリスバッファ,pH7.4を上清の1/10量に均等な量で上清に添加した。最後にこのコンジュゲート溶液を、1%カゼイン、2%ショ糖及び2%乳糖を含有する50mMのトリスバッファ,pH7.4に550nmの波長の光学密度10まで希釈した。
【0050】
以下のポリカチオンの0.25%(重量/容量)水溶液を調製した:ポリ−L−リシン臭化水素酸塩,分子量(mw)37000;ポリ−L−アルギニン塩酸塩,mw12100、42400及び92000;ポリ−L−ヒスチジン,mw18400;ヘキサジメトリン臭化物、ポリ(リシン、アラニン)3:1臭化水素酸塩,mw35000;ポリ(リシン、アラニン)2:1臭化水素酸塩,mw49300;ポリ(リシン、アラニン)1:1臭化水素酸塩,mw41600;ポリ(リシン、トリプトファン)1:4臭化水素酸塩,mw38000(上記のポリカチオンはいずれもSigma,St.Louis,MOから購入した);ポリ(ジアリルジメチルアンモニウム塩化物),mw105−106(Merquat(登録商標)−100、Calgon,Pittsburgh,PA)。
【0051】
全血中の赤血球またはセレンコンジュゲートを凝集させるこれらのポリカチオンの能力を、種々のポリカチオンの0.25%溶液350μlを等量の全血またはセレンコンジュゲートに添加することによって別々の反応で観察した。溶液を混合し室温で10分間静置し、凝集を目視で判定した。結果を表1にまとめる。1個のプラス(+)は低度の凝集、2+は中程度の凝集、3+及び4+は高度の凝集を表す。
【0052】
【表1】
【0053】
赤血球を凝集させるが(2+以上)セレンコンジュゲートをできるだけ凝集させない(2+以下)ポリカチオンを選択するのが好ましい。双方が2+を示すポリカチオンはこの基準を満たす。ポリ−L−リシンHBr及びMerquat(登録商標)−100を以後の処理に選択した。Merquat(登録商標)−100は最も費用効果的である。
【0054】
実施例2
ポリアニオン中和によるコンジュゲート凝集の防止
A.硫酸デキストランを使用するコンジュゲートの流動及び凝集の防止
ポリカチオン系の赤血球凝集試薬としてポリ−L−リシンを使用し、ポリアニオンとして種々の濃度の硫酸デキストランを試験し、ポリカチオンの正電荷が硫酸デキストランによって中和され、ポリカチオンによるセレンコンジュゲートの凝集が防止されるか否かを観察した。ポリカチオンが赤血球を既に凝集させた後、ポリカチオンとセレンコンジュゲートとの相互作用が生じる前に硫酸デキストランを添加した。以下の実験で、セレンコンジュゲートの凝集及びその後のイムノクロマトグラフィーストリップに沿った流動能力に対するポリカチオン及び硫酸デキストランの効果を判定した。
【0055】
サンプルパッドと中和パッドとコンジュゲートパッドと検出ストリップとから成るイムノクロマトグラフィーストリップを作製した。サンプルパッドは、4mm幅、20mm長さのガラス繊維フィルター(Lypore 9524、Lydall,Rochester,NH)を、0.33%のポリ−L−リシン臭化水素酸塩,mw37000(Sigma,St.Louis,MO)の水溶液に浸漬させ、次いで真空下に乾燥することによって作製した。
【0056】
種々の濃度の硫酸デキストランを含有する中和パッドは、木材パルプとポリエステルとから成る4mm幅、13mm長さのフィルター(Sontara 8801、Du pont,Wilmington,Delaware)を、0%、1.1%、3.3%または10%の硫酸デキストラン,mw5000(Sigma,St.Louis,MO)を含有する水溶液に浸漬することによって作製した。浸漬後、パッドを真空下で乾燥した。
【0057】
コンジュゲートパッドは、4mm幅、4.3mm長さのガラス繊維フィルター(Lypore 9524、Lydall,Rochester,NH)を、実施例1の手順で調製し希釈したセレンコロイド標識HIV−1組換えタンパク質コンジュゲートに浸漬することによって作製した。浸漬後、コンジュゲートパッドを真空下で乾燥した。
【0058】
検出ストリップは、4mm幅、40mm長さのニトロセルロース膜フィルター(カタログ#9643G1、Millipore,Bedford,MA)から作製した。1%ショ糖を含有する100mMのトリスバッファ,pH7.4中の5mg/mlの濃度のHIV−1エンベロープ抗原を、膜の末端から約1cm内側の場所にストリップの幅方向の線を形成するようにニトロセルロース膜に添加した。線を形成した領域をポリエステルラミネート(コード#7733、Adhesives Research Inc.,Glen Rock,PA)で裏打ちした。これを十分に乾燥して抗原をニトロセルロースに固定させた。
【0059】
長手方向の一端から他端まで各セクションを1mmずつオーバーラップさせながら上記成分を配置することによって上記成分を使用した4mm幅のイムノクロマトグラフィーストリップを作製した。一端に20mm長さのサンプルパッド、次に13mm長さの中和パッド、次いで4.3mm長さのコンジュゲートパッド、最後に40mm長さの検出パッドを配置した。作製したストリップを次に、検出ストリップの上端からストリップの下端の10mm内側の場所までポリエステルラミネート(コード#8648、Adhesives Research Inc.,Glen Rock,PA)で被覆し、サンプルパッドの約10mmを露出状態で残した。次に、それぞれ0%、1.1%、3.3%または10%の硫酸デキストランを含む中和パッドをもつイムノクロマトグラフィーストリップのそれぞれに対して、そのサンプルパッドに80μlの血漿を添加した。赤色セレンコンジュゲートの凝集及びストリップに沿ったコンジュゲートの流動能力を目視によって観察した。
【0060】
以下の表2に示す結果は、ポリカチオン溶液の電荷を中和する硫酸デキストランの非存在下ではセレンコンジュゲートが凝集しストリップに沿って流動できなかったことを示す。コンジュゲートの凝集と流動との間には反比例の関係が存在した。3.3%以上の硫酸デキストラン濃度はコンジュゲートの凝集を阻止しコンジュゲートをストリップに沿って流動させ得る十分な濃度であった。
【0061】
【表2】
【0062】
B.硫酸デキストランの存在下の赤血球凝集
赤血球凝集に対する硫酸デキストランの影響を検討するために、10%硫酸デキストランを含む4.3mm長さ、4mm幅の中和パッドを作製し、全血サンプルを使用して上記実験を繰り返した。この中和パッドを組み込んで上記のようなイムノクロマトグラフィーストリップを作製し、80μlの全血をサンプルパッドに添加した。15分後、赤血球凝集の結果を目視によって観察し、ストリップに沿った血漿の流動能力を測定した。赤血球は凝集してサンプルパッドに保持されストリップに沿って流動しなかったが、血漿はストリップに沿って15分間で33mm流動した。これは、サンプルパッド中のポリカチオンが全血サンプル中の赤血球を凝集させる能力を維持していたこと、及び、中和パッド中に存在するポリアニオン即ち硫酸デキストランがこの赤血球凝集を妨害しなかったことを示す。
【0063】
C.ポリアニオンによるコンジュゲート凝集の防止
別のポリアニオンを実施例2.A.の手順で試験してセレンコンジュゲート凝集を防止する能力を判定した。15.5mm長さ、4mm幅のサンプルパッドを0.26%Merquat(登録商標)−100を含有する水溶液に浸漬させ、次いで55℃で乾燥した。中和パッドは使用せず、1%カゼインと2%ショ糖と2%乳糖と共にポリアニオンを含有する10mMのトリスバッファ,pH7.4でセレンコンジュゲートを希釈した。ポリアニオンとしては0%、1.1%または3.3%の硫酸デキストラン,mw5000(Sigma,St.Louis,MO)または0%、0.5%、1%または2%の以下のポリアニオンのいずれかを用いた(すべてAldrich Chemical Co.,Milwaukee,WI)から入手):ポリ(アクリル酸),mw5000;ポリ(ナトリウム−4−スチレンスルホン酸塩),mw70,000;ポリ(ビニルスルホン酸,ナトリウム塩);ポリ(メチルメタクリル酸),mw9500;ポリ(アクリル酸,ナトリウム塩),mw21000。コンジュゲートパッドを種々のセレンコンジュゲート溶液に浸漬させ、真空下に乾燥した。検出ストリップを実施例2.A.に記載の手順で作製し、イムノクロマトグラフィーストリップを作製した。次に、種々のポリアニオンを含有するコンジュゲートパッドを含む各イムノクロマトグラフィーストリップのサンプルパッドに50μlの血漿を添加した。赤色セレンコンジュゲートの凝集を目視によって観察した。表3は、試験した種々の濃度のポリアニオンで観察されたコンジュゲートの相対凝集量を示す。
【0064】
【表3】
【0065】
上記のように、(全血を検査するときに赤血球を凝集させるために必要な)サンプルパッド中のポリカチオンの正電荷を中和するためのポリアニオンが存在しないとき、セレンコンジュゲートが凝集した。コンジュゲーションパッドに使用されたすべてのポリアニオンが試験濃度の少なくとも1つでコンジュゲート凝集を防止した。この実験はまた、ポリアニオンを必ずしも独立のパッドに添加しなくても、コンジュゲーションパッドにセレンコンジュゲートと共存させればよいことを示した。
【0066】
実施例3
HIV−1抗体アッセイにおいて硫酸デキストランを中和パッド中で使用したときとコンジュゲーションパッド中で使用したときの比較
4mm幅、4.3mm長さのガラス繊維フィルター(Lypore 9524、Lydall,Rochester,NH)を中和パッドとして組み込んでまたは組み込まずに実施例2.A.に記載の手順でイムノクロマトグラフィーストリップを作製した。中和パッドを使用するときは、中和パッドを3.3%の硫酸デキストランを含有する水溶液に浸漬し次いで真空下に乾燥した。中和パッドを使用しないストリップにおいては、1%カゼインと2%ショ糖と2%乳糖と3.3%硫酸デキストランとを含有する10mMのトリスバッファ,pH7.4でセレンコンジュゲートを希釈し、コンジュゲートパッドをこの溶液に浸漬し次いで真空下に乾燥した。サンプルパッドとしては、0.2%のMerquat(登録商標)−100の水溶液に浸漬した以外は実施例2.A.と同じパッドを使用した。
【0067】
HIV−1抗体を含有するヒト血清をヘマトクリット値50%(血漿容量に基づく)のHIV陰性ヒト全血またはHIV陰性ヒト血漿で1:2048に希釈した。同じく全血または血漿を希釈剤として更に3つの1:2系列希釈液を調製した。80μlの陰性全血またはHIV−1陽性全血希釈系列から得られたサンプルを、独立の中和パッドに硫酸デキストランを含むかまたはコンジュゲートパッド上のセレンコンジュゲート溶液中に硫酸デキストランを含むイムノクロマトグラフィーストリップのサンプルパッドに加えた。80μlの陰性血漿またはHIV−1陽性血漿希釈系列から得られたサンプルの試験には、コンジュゲートパッド上に硫酸デキストランを含むイムノクロマトグラフィーストリップだけを使用した。サンプル添加の15分後に結果を読取った(表4)。陽性結果は、赤色セレンHIV−1抗原コンジュゲート−HIV−1抗体複合体がストリップの線状領域のHIV−1抗原に結合し検出ストリップのこの領域が赤色を呈したことを示す。陰性結果は検出ストリップのこの領域が無色であったことを示す。
【0068】
【表4】
【0069】
表4の結果は、赤血球を凝集させてサンプルをストリップに沿って流動させ得るポリカチオンMerquat(登録商標)−100と、ポリカチオンによるセレンコンジュゲートの凝集を防止してコンジュゲートを陽性サンプルに結合させ複合体を形成させてストリップに沿って検出領域まで流動させ得る中和剤としてポリアニオン硫酸デキストランとを使用したイムノクロマトグラフィーストリップアッセイによれば全血からHIV−1抗体を検出できることを示す。ポリアニオンは、独立の中和パッドとして使用されたときにもコンジュゲートパッド上にセレンコンジュゲートと共存したときにも有効であることが判明した。このアッセイでは、ポリアニオン(硫酸デキストラン)をコンジュゲートパッド中に使用したときのHIV−1抗体の検出感度が独立の中和パッドを使用したときの2倍に向上していた。
【0070】
更に、表4の結果は、サンプルを流動させるために赤血球を凝集させる必要があった全血中でもサンプルの流動を阻止する赤血球が存在しない血漿中でもHIV−1抗体の検出感度が等しいことを示し、これは、ポリカチオンが全血中の赤血球を効果的に凝集させることを示す。この結果はまた、ポリアニオンは独立の中和パッドに存在するかコンジュゲートパッドに存在するかに関わりなく、全血中の赤血球を効果的に凝集させるポリカチオンの能力を妨害しないことを示す。
【0071】
実施例4
HBsAgアッセイにおけるMerquat(登録商標)及び種々のポリアニオンの使用
全血サンプル中の肝炎B表面抗原(HBsAg)を検出するためのイムノクロマトグラフィーストリップを作製した。サンプルパッド中の赤血球を凝集させるポリカチオンとしてMerquat(登録商標)−100を使用し、コンジュゲートパッド中の種々のポリアニオンをポリカチオン中和試薬として使用し、セレンコンジュゲートの凝集を阻止するその能力を評価した。
【0072】
サンプルパッドとコンジュゲートパッドと検出ストリップとから成るイムノクロマトグラフィーストリップを作製した。サンプルパッドは、4mm幅、15.5mm長さのガラス繊維フィルターを0.26%のMerquat(登録商標)−100の水溶液に浸漬させ、55℃で乾燥することによって作製した。
【0073】
セレンコンジュゲートは実施例1と同じセレンコロイドと12μg/mlのHBsAgに対するマウスのモノクローナル抗体(抗HBs)とを用いて調製した。このセレンコロイド標識抗HBsコンジュゲートを次に、550nmの波長の光学密度が2.6になるまで以下のポリアニオンの1つを含むトリスバッファで希釈した:0.5%のポリ(アクリル酸),mw2000(PAA−2000);0.5%のポリ(アクリル酸),mw240,000(PAA−240,000);0.5%の硫酸デキストラン,mw5000;0.8%のポリ−L−アスパラギン酸,mw36,300;0.5%のカルボキシメチルセルロース,mw90,000(CMC)。硫酸デキストランとポリ−L−アスパラギン酸とはSigma,St.Louis,MOから入手し、その他のポリアニオンはAldrich Chemical Co.,Milwaukee,WIから入手した。
【0074】
コンジュゲートパッドは、4mm幅、4.3mm長さのガラス繊維フィルターを、上記ポリアニオンの1つを用いて調製し希釈したセレンコロイド標識抗HBsコンジュゲートに浸漬することによって作製した。浸漬後、コンジュゲートパッドを真空下に乾燥した。
【0075】
検出ストリップは、4mm幅、40mm長さのニトロセルロース膜フィルターから作製した。マウスモノクローナル抗HBsを3mg/mlの濃度で使用して実施例2に記載の手順で調製し、膜の末端から約1cm内側の場所にストリップの幅方向の線を形成するようにニトロセルロース膜に添加した。線を形成した領域をポリエステルラミネートで裏打ちした。これを十分に乾燥して抗体をニトロセルロースに固定させた。
【0076】
長手方向の一端から他端まで1mmずつオーバーラップさせながら上記成分を配置することによって上記成分を使用したイムノクロマトグラフィーストリップを作製した。一端にサンプルパッド、次にコンジュゲートパッド、最後に検出ストリップを配置した。作製したストリップを次に、サンプルパッドの約10mmを露出状態に残してポリエステルラミネートで被覆した。
【0077】
組換えHBsAgをヘマトクリット値50%のHBsAg陰性ヒト全血に12.5ng/mlの濃度まで添加した。更に3つの1:2系列希釈物を全血を用いて調製した。50μlの陰性全血またはHBsAg陽性全血希釈系列から得られたサンプルを、コンジュゲートパッドに種々のポリアニオンを含むイムノクロマトグラフィーストリップのサンプルパッドに加えた。サンプル添加の15分後に結果を読取った(表5)。陽性結果は、赤色セレン抗HBsコンジュゲート−HBsAg複合体がストリップの線状領域の抗HBsに結合し検出ストリップのこの領域が赤色を呈したことを示す。陰性結果は、検出ストリップのこの領域が無色であったことを示す。検出ストリップの入口部の赤色セレンコンジュゲートの凝集を目視によって観察した。
【0078】
【表5】
【0079】
どのポリアニオンの場合にもHBsAgの検出が可能であったが、コンジュゲート凝集を阻止したポリアニオン、PAA−2000、硫酸デキストラン及びポリ−L−アスパラギン酸は、全血サンプル中のHBsAgの検出感度を2−4倍も向上させた。
【0080】
HBsAg全血サンプル添加の1分後に25μlの50mMのリン酸塩バッファ,pH7.4を添加する以外は上記と同じ実験を、PAA−2000をポリアニオンとして含有しトリスバッファで希釈したセレンコロイド標識コンジュゲートを使用して繰り返した。サンプル添加後にバッファを添加しこの手順を使用して得られた結果はこの段階を使用しない結果に等しかった。従ってこれらのアッセイは、サンプル添加後のバッファの添加または不添加に拘わらず使用し得る。
【0081】
実施例5
結核アッセイにおけるMerquat(登録商標)及び硫酸デキストランの使用
全血サンプル中のMycobacterium tuberculosisに対する抗体(抗Mtb)を検出するためのイムノクロマトグラフィーストリップを作製した。サンプルパッド中の赤血球を凝集させるポリカチオンとしてMerquat(登録商標)−100を使用し、コンジュゲートパッド中の種々の濃度のポリアニオン硫酸デキストランをポリカチオン中和試薬として使用し、セレンコンジュゲートの凝集を防止するその能力を評価した。
【0082】
サンプルパッドとコンジュゲートパッドと検出ストリップとから成るイムノクロマトグラフィーストリップを作製した。サンプルパッドは、4mm幅、15.5mm長さのガラス繊維フィルターを0.26%のMerquat(登録商標)−100の水溶液に浸漬させ、次いで真空下に乾燥することによって作製した。
【0083】
セレンコンジュゲートは、実施例1と同じセレンコロイドと3.5μg/mlの大腸菌の組換えMtb抗原とを用いて調製した。このセレンコロイド標識Mtbコンジュゲートを次に、550nmの波長の光学密度が2.5になるまで0%、0.34%、1.1%または3.3%の硫酸デキストランを含むトリスバッファで希釈した。
【0084】
コンジュゲートパッドは、4mm幅、4.3mm長さのガラス繊維フィルターを、上記硫酸デキストラン濃度の1つを用いて調製し希釈したセレンコロイド標識Mtbコンジュゲートに浸漬することによって作製した。浸漬後、コンジュゲートパッドを真空下に乾燥した。
【0085】
検出ストリップは、4mm幅、40mm長さのニトロセルロース膜フィルターから作製した。実施例2と同様に調製した0.15mg/mlの濃度の組換えMtb抗原を、膜の末端から約1cm内側の場所にストリップの幅方向の線を形成するようにニトロセルロース膜に添加した。線を形成した領域をポリエステルラミネートで裏打ちした。これを十分に乾燥させて抗原をニトロセルロースに固定した。
【0086】
長手方向の一端から他端まで1mmずつオーバーラップさせながら上記成分を配置することによって上記成分を使用したイムノクロマトグラフィーストリップを作製した。一端にサンプルパッド、次にコンジュゲートパッド、最後に検出ストリップを配置した。作製したストリップを次に、サンプルパッドの約10mmを露出状態に残してポリエステルラミネートで被覆した。
【0087】
抗Mtb陽性血清をヘマトクリット値50%の陰性ヒト全血で1:100に希釈した。更に2つの1:2系列希釈物を全血を用いて調製した。50μlの陰性全血または抗Mtb陽性全血希釈系列から得られたサンプルを、種々の濃度の硫酸デキストランを含有するコンジュゲートパッドを含むイムノクロマトグラフィーストリップのサンプルパッドに加えた。サンプル添加の15分後に結果を読取った(表6)。陽性結果は、赤色セレンMtbコンジュゲート−抗Mtb複合体がストリップの線状領域のMtbに結合し、検出ストリップのこの領域が赤色を呈したことを示す。陰性結果は、検出ストリップのこの領域が無色であったことを示す。検出ストリップの入口部の赤色セレンコンジュゲートの凝集を目視によって観察した。
【0088】
【表6】
【0089】
表6のデータは、コンジュゲートの凝集を防止するポリアニオン、この場合には硫酸デキストランが存在しない場合にはアッセイが成功しないことを示す。コンジュゲート凝集とアッセイ感度との間には反比例の関係が存在する。硫酸デキストラン濃度が3.3%のとき、コンジュゲート凝集は完全に防止され、アッセイは最も高い抗Mtb検出感度を示す。
【0090】
実施例6
Merquat(登録商標)及び硫酸デキストランを使用する梅毒アッセイ
全血サンプルまたは血漿サンプル中の梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)に対する抗体(抗TP)を検出するためのイムノクロマトグラフィーストリップを作製した。全血中と血漿中との検出感度を比較することによって、アッセイを妨害し検出感度を低下させないようにポリカチオンが全血中の赤血球を効果的に凝集させたか否かを判定した。サンプルパッド中の赤血球を凝集させるポリカチオンとしてMerquat(登録商標)−100を使用し、セレンコンジュゲートの凝集を防止するポリカチオン中和試薬としてコンジュゲートパッド中のポリアニオン硫酸デキストランを使用した。
【0091】
サンプルパッドとコンジュゲートパッドと検出ストリップとから成るイムノクロマトグラフィーストリップを作製した。サンプルパッドは、4mm幅、15.5mm長さのガラス繊維フィルターを0.2%のMerquat(登録商標)−100の水溶液に浸漬させ、55℃で乾燥することによって作製した。
【0092】
セレンコンジュゲートは、実施例1と同じセレンコロイドと7.5μg/mlの梅毒トレポネーマ溶菌液(TP)とを用いて調製した。このセレンコロイド標識TPコンジュゲートを次に、550nmの波長の光学密度が2.8になるまで3.3%の硫酸デキストランを含むトリスバッファで希釈した。
【0093】
コンジュゲートパッドは、4mm幅、4.3mm長さのガラス繊維フィルターを、上記のように調製したセレンコロイド標識TPコンジュゲートに浸漬することによって作製した。浸漬後、コンジュゲートパッドを真空下に乾燥した。
【0094】
検出ストリップは、4mm幅、40mm長さのニトロセルロース膜フィルターから作製した。44μg/mlの濃度の梅毒トレポネーマ溶菌液を実施例2に記載の手順で調製し、膜の末端から約1cm内側の場所にストリップの幅方向の線を形成するようにニトロセルロース膜に添加した。線を形成した領域をポリエステルラミネートで裏打ちした。これを十分に乾燥してTP溶菌液をニトロセルロースに固定させた。
【0095】
長手方向の一端から他端まで1mmずつオーバーラップさせながら上記成分を配置することによって上記成分を使用したイムノクロマトグラフィーストリップを作製した。一端にサンプルパッド、次にコンジュゲートパッド、最後に検出ストリップを配置した。作製したストリップを次に、サンプルパッドの約10mmを露出状態に残してポリエステルラミネートで被覆した。
【0096】
抗TP陽性血清をヘマトクリット値50%の陰性ヒト全血または陰性ヒト血漿に1:10.8に希釈した。全血または血漿を希釈剤として更に4つの1:2系列希釈物を調製した。60μlの陰性全血もしくは血漿または抗TP陽性の全血または血漿希釈系列から得られたサンプルを、イムノクロマトグラフィーストリップのサンプルパッドに添加した。サンプル添加の15分後に結果を読取った(表7)。陽性結果は、赤色セレンTPコンジュゲート−抗TP複合体がストリップの線状領域のTP溶菌液に結合し、検出ストリップのこの領域が赤色を呈したことを示す。陰性結果は、検出ストリップのこの領域が無色であったことを示す。
【0097】
表7は、全血及び血漿の双方で抗TPの検出感度が同じであり、これは、ポリカチオンMerquat(登録商標)−100が全血中の赤血球を効果的に凝集させたことを示す。
【0098】
【表7】
【0099】
本文中に引用したすべての刊行物、特許及び特許出願は参照によって本発明に含まれる。これは、個々の文献の各々について個別的及び特定的にその記載内容全体が参照によって本発明に含まれると定義することに等しい。
【0100】
本発明を好ましい実施態様に基づいて詳細に説明したが、好ましい実施態様の変形が可能であることは当業者に明らかであろう。本文中に詳細に記載した態様以外の態様で本発明を実施することが可能である。従って、本発明は明細書及び特許請求の範囲に提示した本発明の要旨及び範囲に包含されるすべての変更を包含する。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は本発明のクロマトグラフィーアッセイデバイスの好ましい実施態様を示す。
【符号の説明】
10 デバイス
20 クロマトグラフィー担体
30 添加部位
40 コンジュゲートパッド
50 検出部位
60 コントロールバー
70 テストバー
Claims (14)
- 流体流の通路を規定し毛細流を支持するクロマトグラフィー担体と、
前記クロマトグラフィー担体に流体流接触させる血液サンプルの添加部位と、
前記添加部位から離間しており捕獲物質が非拡散的に結合している前記クロマトグラフィー担体上の検出部位と、
前記添加部位の下流の場所に拡散的に結合された標識物質と、
前記血液サンプルから血漿または血清を分離すべく前記検出部位の上流に拡散的に結合されたポリカチオンと、
ポリカチオンを中和すべく前記結合ポリカチオンの下流で前記検出部位の上流に拡散的に結合されたポリアニオンと、
から成る血液サンプル中の分析物の存在を検出するためのクロマトグラフィーアッセイデバイス。 - 前記デバイスがイムノアッセイデバイスであることを特徴とする請求項1に記載のクロマトグラフィーアッセイデバイス。
- 前記ポリカチオンが前記血液サンプルの添加部位に結合されていることを特徴とする請求項1に記載のクロマトグラフィーアッセイデバイス。
- 前記ポリカチオンが、ポリ−L−リシン臭化水素酸塩、ポリ−L−アルギニン塩酸塩、ポリ−L−ヒスチジン、ポリ(リシン、アラニン)3:1臭化水素酸塩、ポリ(リシン、アラニン)2:1臭化水素酸塩、ポリ(リシン、アラニン)1:1臭化水素酸塩、ポリ(リシン、トリプトファン)1:4臭化水素酸塩及びポリ(ジアリルジメチルアンモニウム塩化物)から成るグループから選択されることを特徴とする請求項1に記載のクロマトグラフィーアッセイデバイス。
- 前記ポリカチオンがポリ(ジアリルジメチルアンモニウム塩化物)であることを特徴とする請求項1に記載のクロマトグラフィーアッセイデバイス。
- 前記ポリアニオンが、硫酸デキストラン、ポリ(アクリル酸)、ポリ(ナトリウム−4−スチレンスルホン酸塩)、ポリ(ビニルスルホン酸)、ポリ(メチルメタクリル酸)、ポリ−L−アスパラギン酸及びカルボキシメチルセルロースから成るグループから選択されることを特徴とする請求項1に記載のクロマトグラフィーアッセイデバイス。
- 前記ポリアニオンが硫酸デキストランであることを特徴とする請求項1に記載のクロマトグラフィーアッセイデバイス。
- 前記ポリアニオンが前記標識物質と同じ場所でクロマトグラフィー担体に拡散的に結合されていることを特徴とする請求項1に記載のクロマトグラフィーアッセイデバイス。
- 前記標識物質がセレン標識物質であることを特徴とする請求項1に記載のクロマトグラフィーアッセイデバイス。
- 流体流の通路を規定し毛細流を支持するクロマトグラフィー担体を準備し、この通路に沿って、(a)前記クロマトグラフィー担体に流体流接触させる前記血液サンプルの添加部位と、(b)前記添加部位から離間しており捕獲物質が非拡散的に結合している前記クロマトグラフィー担体上の検出部位と、(c)前記添加部位の下流に配置された標識物質と、(d)前記血液サンプルから血漿または血清を分離すべく前記検出部位の上流に拡散的に結合されたポリカチオンと、(e)ポリカチオンを中和すべく前記結合ポリカチオンの下流で前記検出部位の上流の場所に拡散的に結合されたポリアニオンとを配備する段階と、
前記添加部位を前記血液サンプルに接触させる段階と、
前記血液サンプル中の分析物の存在を検出する段階と、
から成る血液サンプル中の分析物の存在を検出する方法。 - 前記標識物質がセレン標識物質であることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 前記ポリアニオンが、前記標識物質と同じ場所でクロマトグラフィー担体に拡散的に結合されていることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 前記ポリカチオンが、ポリ−L−リシン臭化水素酸塩、ポリ−L−アルギニン塩酸塩、ポリ−L−ヒスチジン、ポリ(リシン、アラニン)3:1臭化水素酸塩、ポリ(リシン、アラニン)3:1臭化水素酸塩、ポリ(リシン、アラニン)2:1臭化水素酸塩、ポリ(リシン、アラニン)1:1臭化水素酸塩、ポリ(リシン、トリプトファン)1:4臭化水素酸塩及びポリ(ジアリルジメチルアンモニウム塩化物)から成るグループから選択されることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 前記ポリアニオンが、硫酸デキストラン、ポリ(アクリル酸)、ポリ(ナトリウム−4−スチレンスルホン酸塩)、ポリ(ビニルスルホン酸)、ポリ(メチルメタクリル酸)、ポリ−L−アスパラギン酸及びカルボキシメチルセルロースから成るグループから選択されることを特徴とする請求項10に記載の方法。
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