ES2202931T3 - Dispositivo cromatografico y procedimiento de deteccion de un analito en una muestra de sangre. - Google Patents

Dispositivo cromatografico y procedimiento de deteccion de un analito en una muestra de sangre.

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ES2202931T3 ES98966118T ES98966118T ES2202931T3 ES 2202931 T3 ES2202931 T3 ES 2202931T3 ES 98966118 T ES98966118 T ES 98966118T ES 98966118 T ES98966118 T ES 98966118T ES 2202931 T3 ES2202931 T3 ES 2202931T3
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Abstract

Un dispositivo de ensayo cromatográfico para detectar la presencia de un analito en una muestra de sangre que comprende: un vehículo cromatográfico que define una vía para el flujo de fluido y soporta el flujo capilar, un sitio de aplicación de dicha muestra de sangre en contacto por el flujo del fluido con dicho vehículo cromatográfico, un sitio de detección en dicho vehículo cromatográfico separado de dicho sitio de aplicación que tiene unido al mismo una sustancia de captura unida no difusivamente, una sustancia marcada unida difusivamente situada corriente abajo de dicho sitio de aplicación, un policatión unido difusivamente para separar el plasma o el suero de dicha muestra de sangre corriente arriba de dicho sitio de detección y un polianión unido difusivamente para neutralizar el policatión corriente abajo de dicho policatión unido y corriente 20 arriba de dicho sitio de detección.

Description

Dispositivo cromatográfico y procedimiento de detección de un analito en una muestra de sangre.
Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere a dispositivos para ensayos cromatográficos y a un método para detectar un analito en una muestra de sangre completa, y más particularmente a un dispositivo y a un método que emplean un agente separador de glóbulos rojos sanguíneos para agregar los glóbulos rojos sanguíneos y un agente neutralizante para neutralizar cualquier efecto negativo que pueda tener el agente separador de glóbulos rojos sanguíneos sobre el sistema de ensayo.
Antecedentes de la invención
Los métodos de diagnóstico clínico modernos se llevan a cabo rutinariamente en muestras de sangre. Desgraciadamente, los glóbulos rojos sanguíneos interfieren con muchas determinaciones diagnósticas. En los ensayos para determinar un analito, los glóbulos rojos sanguíneos pueden inhibir la unión entre miembros de pares de unión específica. De igual modo, los glóbulos rojos sanguíneos tienen actividad enzimática que, dependiendo del ensayo empleado, puede interferir con la señal producida. Además, en un formato de ensayo rápido que utilice un dispositivo de ensayo cromatográfico, particularmente un dispositivo de inmunoensayo cromatográfico, los glóbulos rojos sanguíneos pueden inhibir el flujo de fluido que es necesario para que tengan lugar las reacciones en el dispositivo. Por estas y otras razones, muchas metodologías de ensayo se llevan a cabo en plasma o en suero que deben ser separados primeramente de una muestra de sangre completa.
Existen muchas técnicas conocidas para separar los glóbulos rojos sanguíneos del plasma en una muestra de sangre completa. La centrifugación es un método bien conocido en la técnica mediante el cual se separa el plasma (antes de la coagulación) y el suero (después de la coagulación) de la sangre completa. En este procedimiento, los glóbulos rojos sanguíneos sedimentan en el fondo del tubo de ensayo, y el suero es separado por decantación o mediante algún otro método. La estratificación de sangre completa por centrifugación tiene, sin embargo, muchas desventajas. Generalmente, la centrifugación requiere la extracción de una muestra de sangre grande. Además, el proceso requiere mucho tiempo y un equipamiento de laboratorio voluminoso que no está presente a menudo en la consulta de un médico. Finalmente, la manipulación extra de la sangre incrementa la exposición a los peligros potenciales de los patógenos llevados por la sangre.
Con el fin de reducir o eliminar la necesidad de centrifugación, se han desarrollado dispositivos de ensayo que emplean membranas de gradiente o membranas de captura para separar los glóbulos rojos sanguíneos de la porción líquida de la sangre. Se han utilizado también anticuerpos anti-glóbulos rojos sanguíneos inmovilizados.
Otras técnicas conocidas para separar los glóbulos rojos sanguíneos del plasma o del suero incluyen (1) la combinación de una muestra de sangre completa con un agente que se una a los glóbulos rojos sanguíneos, filtrando la mezcla a través de un elemento absorbente sólido al que está unido al menos un miembro de un par de unión específica para extraer los glóbulos rojos sanguíneos aglutinados; (2) el pase de sangre completa a través de un filtro de microfibra de vidrio que puede tener o no un agente aglutinante incorporado; (3) el empleo de una capa de barrera o exclusión de material polisacarídico para impedir que pasen los glóbulos rojos sanguíneos e interfieran con la detección o la visualización de una señal en una tira de análisis seco; y (4) la utilización de un soporte que tiene una superficie policatiónica a la que se unen los glóbulos rojos sanguíneos pero no el plasma.
Muchas de estas técnicas para la separación de los glóbulos rojos sanguíneos del plasma son costosas, complicadas, pueden tener como resultado una separación incompleta de los glóbulos rojos sanguíneos y pueden causar hemolisis. La hemolisis conduce a una unión no específica o a fondos elevados que producen una pérdida de la sensibilidad del ensayo. Ésta puede ser el resultado de la hemoglobina libre que puede colorear la zona de detección de tal manera que la zona puede obtener un color que varía desde rosa a marrón oscuro. Como resultado, la producción de una señal química visual puede ser totalmente o parcialmente oscurecida por la presencia del color de la hemoglobina en la zona de detección. Además, la utilización de un agente separador, tal como un policatión, en un sistema de ensayo tiende a interferir con el sistema, mediante la agregación a menudo de otros reactivos o de otros miembros de unión además de los glóbulos rojos sanguíneos.
Por consiguiente, existe la necesidad de un dispositivo y de un método para detectar un analito en una muestra de sangre sin afectar de manera adversa al sistema de ensayo. Tal dispositivo y método deben ser adecuados para muestras de sangre completa de varios tamaños, incluyendo muestras pequeñas.
EP-A-0 325 413 describe un dispositivo para determinar un analito en una muestra de sangre completa, que comprende un soporte del que al menos una porción tiene una superficie policatiónica para que se unan los glóbulos rojos sanguíneos y del que al menos una porción contiene un miembro de un par de unión específica unido de manera no difusiva a la misma, y un método para separar plasma de una muestra de sangre completa utilizando tal dispositivo.
Resumen de la invención
La presente invención se refiere a un dispositivo cromatográfico y a un método para detectar la presencia de un analito en una muestra, preferiblemente una muestra de sangre, según se define en las reivindicaciones adjuntas.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 representa una realización preferida del dispositivo para ensayos cromatográficos de la presente invención.
Descripción detallada de la invención
La presente invención está basada en la observación de que los glóbulos rojos sanguíneos en las muestras de sangre completa interfieren con las determinaciones de la presencia o cantidad de un analito en la muestra de sangre que podrían realizarse fácilmente de otro modo a través de sistemas de ensayo. Por ejemplo, en un inmunoensayo, es poco probable que una muestra de sangre completa puesta en contacto con un sitio de aplicación se mueva hacia abajo de la tira por acción capilar debido al impedimento o a la interferencia causados por la presencia de los glóbulos rojos sanguíneos. La presente invención resuelve este problema sin interferir con la sensibilidad del sistema de ensayo.
Las definiciones siguientes pueden ser útiles para comprender las realizaciones de la presente invención.
"Analito" o "analito de interés" se refiere al compuesto o a la composición que se va a detectar o medir, que tiene al menos un epítopo o un sitio de unión. El analito puede ser cualquier sustancia para la que exista un miembro de unión específica con el analito que esté presente de forma natural o para la que pueda prepararse un miembro de unión específica con el analito. Los analitos incluyen, pero no están limitados a, toxinas, compuestos orgánicos, proteínas, péptidos, microorganismos, aminoácidos, ácidos nucleicos, hormonas, esteroides, vitaminas, fármacos (incluyendo los administrados con fines terapéuticos así como las drogas administradas con fines ilícitos) y metabolitos de, o anticuerpos hacia, cualquiera de las sustancias anteriores. El término "analito" incluye también cualquier sustancia antigénica, haptenos, anticuerpos, macromoléculas y combinaciones de los mismos.
"Vehículo cromatográfico", se refiere a cualquier material poroso, absorbente, bíbulo, isotrópico o capilar adecuado, que incluye el sitio de detección del dispositivo y a través del cual el analito o la muestra de ensayo pueden ser transportados por acción capilar o acción de mecha. Se apreciará por una persona experta en la técnica que el vehículo cromatográfico puede estar constituido por un único material o por más de un material (por ejemplo, zonas, porciones, capas, áreas o sitios diferentes pueden estar constituidos por materiales diferentes) con la condición de que las múltiples capas estén en contacto unas y otras con el flujo del fluido, permitiendo de este modo el paso de la muestra de ensayo entre los materiales. El contacto con el flujo del fluido permite el paso de al menos algunos componentes de la muestra, esto es del analito, entre las zonas del material poroso y es preferiblemente uniforme a lo largo de la interfase de contacto entre las diferentes zonas. Pueden utilizarse como vehículo cromatográfico materiales naturales, sintéticos o materiales que existan de manera natural y que estén modificados sintéticamente, e incluyen, pero no se limitan a: papel (fibroso) o membranas (microporosas) de materiales de celulosa tales como papel; celulosa y derivados de celulosa tales como acetato de celulosa y nitrocelulosa; fibra de vidrio; tejidos, naturales (por ejemplo algodón) y sintéticos (por ejemplo nailon); geles porosos y similares.
"Marca" se refiere a cualquier sustancia que sea capaz de producir una señal que sea detectable por medios visuales o instrumentales. Varias marcas adecuadas para ser utilizadas en la presente invención incluyen marcas que producen señales por medios químicos o físicos. Ejemplos incluyen enzimas y sustratos, cromógenos, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes, partículas de látex con polímeros orgánicos coloreadas o coloreables y liposomas u otras vesículas conteniendo sustancias visibles directamente. Preferiblemente, en la presente invención se emplean marcas radioactivas, partículas metálicas coloidales o partículas no metálicas coloidales. Las marcas preferidas incluyen oro coloidal y partículas de látex.
"Sustancia marcada" o "conjugado" se refiere a una sustancia que contiene una marca detectable unida a un miembro de unión específica. La unión puede ser unión covalente o no covalente y puede incluir la hibridación de ácidos nucleicos. La marca permite a la sustancia marcada producir una señal detectable que está relacionada directamente o indirectamente con la cantidad de analito en una muestra de ensayo. El componente de la sustancia marcada que es un miembro de unión específica es seleccionado para que se una directamente o indirectamente al analito.
"Miembro de unión específica" se refiere a un miembro de un par de unión específica, esto es dos moléculas diferentes donde una de las moléculas se une específicamente a la segunda molécula por medios químicos o físicos. Si el miembro de unión específica es un inmunorreactivo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo, un antígeno, un hapteno o un complejo de los mismos, y si se utiliza un anticuerpo, puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal, una proteína o anticuerpo recombinante, un anticuerpo quimérico, mezcla(s) o fragmento(s) de los mismos, así como una mezcla de un anticuerpo y otros miembros de unión específica. Ejemplos específicos de miembros de unión específica incluyen biotina y avidina, un anticuerpo y su antígeno correspondiente (sin tener ninguno de los dos relación con la muestra que va a ser analizada), un ácido nucleico de hebra sencilla y su complemento, y similares.
"Sustancia de captura" se refiere a uno o más miembros de unión específica que están fijados en o sobre una porción del vehículo cromatográfico para formar uno o más "sitios de captura" en los que el analito, el reactivo marcado y/o el reactivo control resultan inmovilizados en el vehículo cromatográfico. El método de fijación no es crítico para la presente invención. La sustancia de captura facilita la observación de la señal detectable separando sustancialmente el analito y/o la sustancia marcada de los reactivos del ensayo no unidos y de los componentes restantes de la muestra de ensayo. La sustancia de captura puede ser inmovilizada en el vehículo cromatográfico antes o durante la realización del ensayo por medio de cualquier método de fijación adecuado. Además, la sustancia de captura puede ser proporcionada en un solo sitio de detección o en múltiples sitios de detección sobre o en el vehículo cromatográfico. La sustancia de captura puede ser proporciona también en una variedad de configuraciones con el fin de producir diferentes formatos de detección o medida. Por ejemplo, la sustancia de captura puede ser configurada como una letra, un número, un icono, un símbolo o cualquier combinación de los mismos.
En particular, la presente invención proporciona un dispositivo de ensayo cromatográfico para detectar la presencia de un analito en una muestra, preferiblemente una muestra de sangre. El dispositivo está preferiblemente en la forma de una tira cromatográfica que tiene un vehículo cromatográfico definiendo una vía para el flujo de fluido y que es capaz de soportar el flujo capilar, un sitio de aplicación de la muestra de sangre y un sitio de detección separado del sitio de aplicación para detectar la presencia o la cantidad de analito presente en la muestra de sangre. El dispositivo incluye también una sustancia marcada (o conjugado) unida difusivamente al vehículo cromatográfico. En una realización preferida, la sustancia marcada se unirá al analito o competirá con el analito para unirse al sitio de detección. El dispositivo contiene dos agentes adicionales unidos difusivamente al vehículo cromatográfico: (1) un agente separador de los glóbulos rojos sanguíneos corriente arriba (de aquí en adelante, la dirección del movimiento de una muestra causado por acción capilar es denominada "corriente abajo" y la dirección opuesta es denomina "corriente arriba") del sitio de detección que es capaz de separar el plasma o el suero de la muestra de sangre, y (2) un agente neutralizante corriente abajo del agente separador de los glóbulos rojos sanguíneos y corriente arriba del sitio de detección para neutralizar cualquier efecto, particularmente un efecto adverso, del agente separador de glóbulos rojos sanguíneos sobre el sistema cromatográfico.
En el contexto de la presente invención, la frase "unido difusivamente" según es aplicada a un reactivo dado que puede ser definido como cualquier reactivo utilizado en la presente invención, incluyendo pero no limitándose a, una sustancia marcada, un miembro de unión específica, un agente separador de glóbulos rojos sanguíneos o un agente neutralizante, está destinada a indicar que el(los) reactivo(s) está(n) unido(s) de una manera que permite al(los) reactivo(s) unido(s) fluir a lo largo de la vía de flujo.
Para los fines de la presente invención, puede emplearse cualquier sistema de ensayo. Se prefieren los sistemas de inmunoensayo incluyendo, pero no limitándose a, sistemas de flujo lateral, sistemas de flujo vertical, sistemas de impregnación y varillas de inmersión. A continuación se presenta una descripción general de sistemas de ensayo conocidos.
De manera general, en una tira de cromatografía, al menos un sitio de aplicación de la muestra y un sitio de detección de la muestra están dispuestos en un vehículo cromatográfico. Una solución de muestra, en este caso preferiblemente una muestra de sangre, sospechosa de tener un analito de interés, esto es un analito, se mueve a través del vehículo cromatográfico por acción capilar cuando es añadida al sitio de aplicación de la muestra, y una sustancia marcada o conjugado que está contenida en un medio de marcaje colocado previamente en un vehículo cromatográfico se acumula en el sitio de detección en proporción directa o inversa a la presencia o cantidad de la sustancia a analizar en la solución de la muestra, efectuado por una reacción de unión (tal como una reacción inmunológica), de tal manera que puede encontrarse la presencia o cantidad de la sustancia a analizar en la solución de la muestra midiendo la presencia o la cantidad de la sustancia marcada o conjugado así acumulada. Se conocen varios tipos de tiras para cromatografía y todas estas tiras para cromatografía conocidas, incluyendo las que serán descritas posteriormente, pueden ser utilizadas en la presente invención. El término "dispositivo de ensayo cromatográfico" según se utiliza en la presente, indica una tira para cromatografía que está producida de tal manera que puede ser utilizada en un ensayo y es capaz de ser almacenada y transportada.
Lo siguiente describe un ejemplo típico de una tira para cromatografía. Un sitio de aplicación de la muestra está situado en una posición corriente arriba de la sustancia marcada. Cuando una solución de muestra, sospechosa de contener un analito a analizar, es puesta en contacto con el sitio de aplicación de la muestra, la solución de la muestra se mueve a través del vehículo cromatográfico en dirección corriente abajo junto con el analito por acción capilar. Típicamente, el analito es un compuesto que se une de manera específica a una sustancia de captura fijada al sitio de detección, o es un compuesto que se une de manera específica a un conjugado que se une específicamente a la sustancia de captura en el sitio de detección. Por ejemplo, el analito es un anticuerpo cuando la sustancia de captura es un antígeno o cuando el conjugado contiene un antígeno, y el analito es un antígeno cuando la sustancia de captura es un anticuerpo o cuando el conjugado contiene un anticuerpo. A manera de ejemplo adicional, el analito puede ser un ácido nucleico que se une a un conjugado complementario y a la sustancia de captura.
Cuando el sitio de aplicación de la muestra está situado en una posición corriente arriba respecto a una sustancia marcada, la sustancia marcada puede estar dispuesta adyacente al sitio de aplicación de la muestra o en una posición desconectada del sitio de aplicación de la muestra.
La adición de la sustancia marcada puede ser realizada por varios medios, por ejemplo añadiéndola a una cierta posición fuera del sitio de detección de la tira cromatográfica después de la adición de la solución de la muestra.
Como la sustancia marcada está dispuesta de tal manera que se mueve por la acción capilar de la solución de la muestra, la sustancia marcada se mueve en dirección corriente abajo cuando la solución de muestra es añadida al medio de adición de la muestra.
El sitio de detección está situado generalmente en una posición corriente abajo de la sustancia marcada y a cierta distancia de la sustancia marcada. En el sitio de detección, una sustancia de captura que se une solamente a un analito o a un conjugado de manera específica, o que se une específicamente a cada una de las sustancias que van a ser analizadas y a la sustancia marcada, está fijada al vehículo cromatográfico. Por consiguiente, en una realización el analito (algunas veces unido a una sustancia marcada), movido por la acción capilar de la solución de la muestra, se une a la sustancia de captura o a un conjugado que a su vez se une a la sustancia de captura. La sustancia marcada se une a la sustancia a analizar así unida, produciendo de este modo la acumulación de la sustancia marcada en el medio de detección en respuesta a la presencia o cantidad del analito. Alternativamente, la sustancia marcada y el analito, movidos por acción capilar, se unen competitivamente a la sustancia de captura o a un conjugado que a su vez se une a la sustancia de captura, produciéndose de este modo la acumulación de la sustancia marcada en proporción inversa a la cantidad de la sustancia a analizar.
Existe un caso en el que una cierta sustancia marcada se une a una sustancia de captura (o a un conjugado que se une a su vez a una sustancia de captura) y a un analito, pero no simultáneamente y, en ese caso, el analito se une primeramente a la sustancia marcada y la sustancia marcada restante que no se había unido a la sustancia a analizar se une a la sustancia de captura. En consecuencia, puede analizarse la presencia o la cantidad del analito midiendo la sustancia marcada acumulada en el medio de detección.
Eventualmente, varias sustancias son colocadas corriente arriba del sitio de detección. Por ejemplo, un conjugado puede ser así colocado de manera movible.
En algunos casos, uno o más sitios de detección adicionales pueden ser dispuestos corriente abajo del primer sitio de detección. Además, corriente abajo del sitio de detección puede haber una extensión adicional del vehículo cromatográfico de tal manera que una solución de muestra pueda ser descargada completamente, o el vehículo puede estar equipado con un material para ser utilizado en la absorción de la solución de la muestra.
Por tanto, puede determinarse la presencia o la cantidad de un analito de interés en una solución de muestra midiendo la presencia o la cantidad de una sustancia marcada acumulada en el sitio de detección. En un caso, esto puede realizarse visualmente.
La presente invención está destinada a ser utilizada con cualquier muestra de sangre, incluyendo suero y plasma, pero se utiliza preferiblemente con una muestra de sangre que contenga glóbulos rojos sanguíneos, por ejemplo, sangre completa.
Antes del ensayo para determinar el analito de interés en la muestra de sangre, los glóbulos rojos sanguíneos son extraídos preferiblemente si el ensayo ha de trabajar con la sensibilidad deseada. Por tanto, de acuerdo con la presente invención, un agente separador de glóbulos rojos sanguíneos es unido al vehículo cromatográfico. El agente separador de los glóbulos rojos sanguíneos es unido difusivamente al vehículo cromatográfico. El agente separador de los glóbulos rojos sanguíneos puede ser unido al vehículo cromatográfico en cualquier posición que funcione para separar los glóbulos rojos sanguíneos del plasma o del suero. Es unido difusivamente al vehículo cromatográfico corriente arriba del sitio de detección. Muy preferiblemente, el agente separador de los glóbulos rojos sanguíneos es unido difusivamente al sitio de aplicación de la muestra. Esta localización es preferible porque produce la agregación de los glóbulos rojos sanguíneos tan pronto como son aplicados al vehículo cromatográfico, teniendo como resultado una interferencia mínima, si es que la hay, en el flujo del suero o del plasma a lo largo del vehículo por acción capilar.
Los agentes separadores de glóbulos rojos sanguíneos de la presente invención son materiales cargados positivamente tales como policationes, incluyendo por ejemplo, bromhidrato de poli-L-lisina; cloruro de poli(dimetil dialil amonio) (Merquat®-100, Merquat®-280, Merquat®-550); clorhidrato de poli-L-arginina; poli-L-histidina; poli(4-vinilpiridina), clorhidrato de poli(4-vinilpiridina); poli(4-vinilpiridina)reticulada, sal cuaternaria cloruro de metilo; poli(4-vinilpiridina-co-estireno); poli(4-vinilpiridinio poli(fluoruro de hidrógeno)); poli(4-vinilpiridinio-P-tolueno sulfonato); poli(4-vinilpiridinio-tribromuro); poli(4-vinilpirrolidona-co-2-dimetilaminoetil metacrilato); poli vinilpirrolidona, reticulada; poli vinilpirrolidona, poli(melamina-co-formaldehído); parcialmente metilado; bromuro de hexadimetrina; bromhidrato de poli(Glu, Lys) 1:4; bromhidrato de poli(Lys, Ala) 3:1; bromhidrato de poli(Lys, Ala) 2:1; poli-L-lisina succinilada; bromhidrato de poli(Lys, Ala) 1:1 y bromhidrato de poli(Lys, Trp) 1:4. El policatión más preferido es cloruro de poli(dimetil dialil amonio) (Merquat®-100).
El agente separador de glóbulos rojos sanguíneos de la presente invención puede ser utilizado en cualquier cantidad adecuada que funcione para separar los glóbulos rojos sanguíneos del resto de la muestra. Preferiblemente, el agente separador de glóbulos rojos sanguíneos puede estar presente en una concentración desde el 0,04% aproximadamente hasta el 1,3% aproximadamente (peso por volumen), siendo más preferida una concentración desde el 0,13% aproximadamente hasta el 0,33% aproximadamente (peso por volumen), y siendo una concentración desde el 0,20% aproximadamente hasta el 0,33% aproximadamente (peso por volumen) la más preferida.
Una carga positiva en el agente separador de glóbulos rojos sanguíneos tiene tendencia a agregar cualquier agente cargado negativamente presente en la tira. Por ejemplo, una sustancia o conjugado marcados unidos al vehículo cromatográfico pueden ser también agregados por el agente separador de los glóbulos rojos sanguíneos interfiriendo con la unión del analito al conjugado o, en un ensayo competitivo, con la unión de la sustancia marcada y del analito de interés a la sustancia de captura en el sitio de detección o a un conjugado. Finalmente, la sensibilidad y la precisión del sistema de inmunoensayo pueden estar comprometidas.
Por consiguiente, como el agente separador de glóbulos rojos sanguíneos es un material cargado positivamente, la presente invención emplea un agente neutralizante. El agente neutralizante es capaz de neutralizar la carga positiva del agente separador de glóbulos rojos sanguíneos, eliminando de este modo, o al menos minimizando, cualquier interferencia con el sistema de ensayo causada por el agente separador de los glóbulos rojos sanguíneos. El agente neutralizante es unido difusivamente al vehículo cromatográfico. El agente neutralizante es colocado corriente abajo del agente separador de los glóbulos rojos sanguíneos y corriente arriba del sitio de detección, y es colocado más preferiblemente en el mismo lugar sobre el vehículo cromatográfico que la sustancia marcada unida difusivamente.
El agente neutralizante es un polianión capaz de neutralizar la carga positiva del agente separador de los glóbulos rojos sanguíneos. Los polianiones preferidos incluyen poli(ácido acrílico), poli(ácido acrílico, sal de Na), poli(ácido metil metacrílico), poli(Na-4-estireno sulfonato), poli(ácido vinil sulfónico), ácido poli-L-aspártico y carboximetil celulosa, siendo el más preferido dextrán sulfato.
El agente neutralizante puede estar presente en cualquier cantidad que funcione para neutralizar la carga positiva del agente separador de los glóbulos rojos sanguíneos. Generalmente, la concentración del agente neutralizante depende de la concentración del agente separador de los glóbulos rojos sanguíneos que esté siendo utilizado. Preferiblemente, el agente neutralizante está presente en una concentración desde el 0,33% aproximadamente hasta el 20% aproximadamente (peso por volumen), siendo más preferida una concentración desde el 0,34% aproximadamente hasta el 10% aproximadamente (peso por volumen) y siendo una concentración desde el 0,34% hasta el 10% (peso por volumen) la más preferida.
La Figura 1 representa una realización de un dispositivo de ensayo inmunocromatográfico de acuerdo con la presente invención. El dispositivo 10 contiene un vehículo cromatográfico 20. Situado en el vehículo cromatográfico 20 está un sitio de aplicación 30 para la muestra de sangre. En esta realización preferida, el agente separador de los glóbulos rojos sanguíneos, esto es Merquat®-100, está situado en el sitio de aplicación 30. Adyacente al sitio de aplicación 30 hay una almohadilla de conjugado 40 que contiene el conjugado, esto es una sustancia de unión marcada con selenio, y un agente neutralizante, esto es dextrán sulfato. Más corriente abajo está el sitio de detección 50, el cual después de que se haya realizado el ensayo presentará un barra de control 60 y, si la sustancia a analizar está presente, una barra de ensayo 70.
En otra realización de la presente invención, un tampón puede ser puesto en contacto con el sitio de aplicación, preferiblemente después de que el sitio de aplicación haya sido puesto en contacto con la muestra. El tampón ayuda a mantener una velocidad de flujo del fluido aceptable a lo largo de la vía de flujo en el vehículo cromatográfico. El tampón puede ser cualquier sustancia que sea capaz de fluir por acción capilar a lo largo de la vía de flujo del fluido incluyendo, pero no limitándose a, tampón fosfato, solución salina tamponada con fosfato, tampón Tris-HCl, tampón carbonato, tampón citrato, tampón HEPES (ácido 2-hidroxipiperazina-N'-2- etanosulfónico), tampón MOPS (ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico), tampón MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico) y similares. Aunque la concentración y el pH pueden ser cualquier concentración y cualquier pH que funcionen en el dispositivo de ensayo deseado, preferiblemente la molaridad está en un rango desde 10 mM aproximadamente hasta 100 mM aproximadamente y el pH es de 5-9 aproximadamente y más preferiblemente de 6-8 aproximadamente. Muy preferiblemente, el tampón empleado es tampón fosfato 50 mM, pH 7,4.
El volumen de fluido empleado en la presente invención depende del tamaño del dispositivo. Deseablemente, se utiliza un volumen de fluido suficiente para permitir el flujo de fluido a través del dispositivo hasta el sitio de detección. Preferiblemente, el volumen de fluido está en un rango de 25 \mul aproximadamente hasta 100 \mul aproximadamente, y más preferiblemente desde 40 \mul aproximadamente hasta 60 \mul aproximadamente. Por consiguiente, el tampón, cuando es necesario, puede ser añadido en un rango de volumen desde 10 \mul aproximadamente hasta 40 \mul aproximadamente, y más preferiblemente desde 20 \mul aproximadamente hasta 30 \mul aproximadamente.
La presente invención está dirigida también a un método para detectar la presencia de un analito en una muestra de sangre según está definido en las reivindicaciones 10-14.
Así, en la realización preferida de la Figura 1, una muestra de sangre es aplicada en el sitio de aplicación 30 y el agente separador de glóbulos rojos sanguíneos separa los glóbulos rojos sanguíneos agregando los mismos y permitiendo que el plasma o el suero desciendan por acción capilar por el vehículo cromatográfico 20. El agente neutralizante de la almohadilla de conjugado 40 neutraliza los efectos del agente separador de glóbulos rojos sanguíneos en el dispositivo 10 y en el conjugado y el analito se une al conjugado presente en la almohadilla de conjugado 40. El analito unido al conjugado continúa descendiendo hacia el sitio de detección 50. Si el analito de interés está presente aparecerá la barra de ensayo 70. Para indicar que el análisis está funcionando correctamente, aparecerá la barra de control 60 esté presente o no el analito de interés.
La presente invención puede incluir preferiblemente una tapa o cubierta no reactiva alrededor del dispositivo. Preferiblemente, la cubierta incluye al menos el vehículo cromatográfico para evitar el contacto con, y la contaminación de, los sitios de captura. La cubierta puede incluir también un área levantada adyacente al sitio de aplicación para facilitar la recepción y/o la inclusión de un cierto volumen de muestra. Adicionalmente, la cubierta puede incluir un área o áreas para recortar en forma de una letra, número, icono o símbolo, o cualquier combinación de los mismos. En esta realización, el área o áreas para recortar forman el diseño de sitio(s) de detección particular(es) cuando la tira está completamente cerrada. Se prefiere que una porción suficiente de la tira esté cubierta para impedir que la muestra aplicada entre en contacto con los sitios de detección sin pasar primero a través de una porción de la tira.
El dispositivo y el método de la presente invención pueden ser utilizados en cualquier sistema de ensayo en el que una muestra de sangre contenga un analito de interés. Ejemplos de sistemas preferidos incluyen, pero no se limitan a, virus de la hepatitis C ("VHC"), virus de la hepatitis A ("VHA"), Virus de la Inmunodeficiencia Humana ("VIH"), anticuerpo de superficie de la hepatitis B ("HBsAb"), antígeno de superficie de la hepatitis B ("HBsAg"), anticuerpo del núcleo central de la hepatitis B ("HBcAb"), antígeno del núcleo central de la hepatitis B ("HBcAg"), antígeno carcinoembrionario ("CEA"), alfa-fetoproteína ("AFP"), un marcador de cáncer de páncreas ("CA19-9"), sífilis, tuberculosis, malaria, Leishmania y fiebre de Dengue.
Los ejemplos siguientes ilustran adicionalmente la presente invención.
Ejemplos Ejemplo 1 Agregación de glóbulos rojos sanguíneos frente a la agregación del Se-conjugado por policationes
Para los fines de la presente invención, se desea la agregación de los glóbulos rojos sanguíneos (rbcs) en sangre completa mientras que no se desea la agregación del conjugado de selenio. Se analizaron varios policationes para ver cual produciría una agregación suficiente de los rbcs mientras que agregara sólo mínimamente el conjugado de selenio.
El conjugado de selenio de la proteína recombinante del VIH-1 fue preparado de la manera siguiente: Primeramente se preparó selenio coloidal haciendo reaccionar óxido de selenio 32 mM con ácido L-ascórbico 91 mM en una solución acuosa durante 72 horas a 42ºC. Este coloide de selenio fue diluido hasta una densidad óptica de 30 a una longitud de onda de 550 nm y se hizo reaccionar posteriormente con 40 \mug/ml de proteína de la envoltura del VIH-1 recombinante en tampón Tris 30 mM, pH 7,4, durante 20 minutos a temperatura ambiente. Este conjugado de proteína del VIH-1 marcada con el coloide de selenio fue diluido a continuación hasta una densidad óptica de 30 a una longitud de onda de 550 nm en tampón Tris 10 mM, pH 7,4, que contenía un 0,1% de caseína e incubado durante 20 minutos a temperatura ambiente. La solución de conjugado fue luego centrifugada a 1970 x g durante 20 minutos a 4ºC, se retiró el sobrenadante y se desechó la pella. Posteriormente se añadió al sobrenadante un volumen de tampón Tris 30 mM, pH 7,4, conteniendo un 2% de caseína, equivalente a un décimo del volumen del sobrenadante. Finalmente, esta solución de conjugado fue diluida hasta una densidad óptica de 10 a una longitud de onda de 550 nm en tampón Tris 50 mM, pH 7,4, conteniendo un 1% de caseína, un 2% de sacarosa y un 2% de lactosa.
Se prepararon soluciones acuosas de los policationes siguientes a un 0,25% (p/v): bromhidrato de poli-L-lisina, peso molecular (PM) 37000; clorhidrato de poli-L-arginina, PM 12100, 42400 y 92000; poli-L-histidina, PM 18400; bromuro de hexadimetrina, bromhidrato de poli(Lisina, Alanina) 3:1, PM 35000; bromhidrato de poli(Lisina, Alanina) 2:1, PM 49300; bromhidrato de poli(Lisina, Alanina), 1:1, PM 41600; bromhidrato de poli(Lisina, Triptófano) 1:4, PM 38000 (todos los policationes anteriores fueron adquiridos a Sigma, St. Louis, MO); poli(cloruro de dialildimetilamonio), PM 10^{5} a 10^{6} (Merquat®-100, Calgon, Pittsburgh, PA).
La capacidad de estos policationes para agregar los rbcs en sangre completa o el conjugado de selenio fue observada en reacciones separadas añadiendo 350 \mul de las diferentes soluciones de policationes al 0,25% a un volumen igual de sangre completa o del conjugado de selenio. Las soluciones fueron mezcladas y almacenadas a temperatura ambiente durante 10 minutos, posteriormente la agregación fue evaluada visualmente. Los resultados están resumidos en la Tabla 1. Un signo más (+) indica agregación débil, 2+ indica agregación moderada y 3+ y 4+ indican agregación potente.
TABLA 1
Agregación
Policatión Peso molecular Glóbulos rojos sanguíneos Conjugado de Se
Poli-L-Lys HBr 37000 2+ 2+
Merquat®-100 10^{5} a 10^{6} 2+ 2+
Poli-L-Arg HCl 12100 2+ 2+
Poli-L-Arg HCl 42400 2+ 2+
Poli-L-Arg HCl 92000 2+ 2+
Poli-L-His 18400 + 4+
Hexadimetrina Br + +
Poli (Lys, Ala) 3:1 HBr 35000 2+ 2+
Poli (Lys, Ala) 2:1 HBr 49300 + 2+
Poli (Lys, Ala) 1:1 HBr 41600 + 2+
Poli (Lys, Trp) 1:4 HBr 38000 3+ 3+
Un policatión que produzca agregación de los rbcs (2+ o mayor) mientras que produce una agregación mínima del conjugado de selenio (2+ o menor) sería una buena elección. Aquellos policationes con un 2+ en ambas categorías cumplen este criterio. Se eligieron poli-L-lisina HBr y Merquat®-100 para los trabajos posteriores, siendo Merquat®-100 el más rentable.
Ejemplo 2 Prevención de la agregación del conjugado por neutralización con un polianión A. Flujo del conjugado y prevención de la agregación utilizando dextrán sulfato
Utilizando poli-L-lisina como reactivo agregante de rbc policatiónico, se analizaron varias concentraciones del polianión dextrán sulfato para ver si la carga positiva del policatión podía ser neutralizada por el dextrán sulfato, impidiendo así la agregación del conjugado de selenio causada por el policatión. El dextrán sulfato fue añadido después de que el policatión hubiera producido ya la agregación de los rbcs, pero antes de la interacción del policatión con el conjugado de selenio. El experimento siguiente evaluó el efecto del policatión y del dextrán sulfato sobre la agregación del conjugado de selenio y su capacidad posterior para fluir a la largo de la tira inmunocromatográfica.
Se montó una tira inmunocromatográfica compuesta por una Almohadilla de Muestra, una Almohadilla de Neutralización, una Almohadilla de Conjugado y una Tira de Detección. La Almohadilla de Muestra fue preparada impregnando un filtro de fibra de vidrio de 4 mm de ancho por 20 mm de largo (Lypore 9524, Lydall, Rochester, NH) en una solución acuosa de bromhidrato de poli-L-lisina al 0,33%, PM 37000 (Sigma, St. Louis, MO), y secándolo posteriormente bajo vacío.
Las Almohadillas de Neutralización, que contenían diferentes concentraciones de dextrán sulfato, fueron preparadas impregnando filtros de 4 mm de ancho por 13 mm de largo compuestos de pulpa de madera y poliéster (Sontara 8801, Du Pont, Wilmington, Delaware) en soluciones acuosas que contenían un 0%, un 1,1%, un 3,3% o un 10% de dextrán sulfato, PM 5000 (Sigma, St. Louis, MO). Después de ser impregnadas, las almohadillas fueron secadas bajo vacío.
La Almohadilla de Conjugado fue preparada impregnando un filtro de fibra de vidrio de 4 mm de ancho por 4,3 mm de largo (Lypore 9524, Lydall, Rochester, NH) en un conjugado de proteína recombinante del VIH-1 marcada con coloide de selenio preparado y diluido como en el Ejemplo 1. Después de ser impregnada, la Almohadilla de Conjugado fue secada bajo vacío.
La Tira de Detección era un filtro de membrana de nitrocelulosa de 4 mm de ancho por 40 mm de largo (# de catálogo H9643G1, Millipore, Bedford, MA). El antígeno de la envoltura del VIH-1 a una concentración de 5 mg/ml en tampón Tris 100 mM, pH 7,4, que contenía un 1% de sacarosa, fue añadido a la membrana de nitrocelulosa con el fin de formar una línea a través de la anchura de la tira en una posición a 1 cm aproximadamente del extremo de la membrana. La región con la línea fue reforzada con una Lámina de Poliéster (# de código 7733, Adhesives Research Inc., Glen Rock, PA). Ésta se dejó secar suficientemente para fijar el antígeno a la nitrocelulosa.
Las tiras inmunocromatográficas, de 4 mm de ancho, fueron montadas utilizando los componentes anteriores, colocándolos uno tras otro longitudinalmente con un solapamiento de 1 mm entre cada sección, con la Almohadilla de Muestra de 20 mm de largo en un extremo, a continuación de la cual estaba colocada una de las Almohadillas de Neutralización de 13 mm de largo, seguida por una Almohadilla de Conjugado de 4,3 mm de largo, y finalmente una Tira de Detección de 40 mm de largo. La tira montada fue cubierta posteriormente con una Lámina de Poliéster (# de código 8648, Adhesives Research Inc., Glen Rock, PA) desde el extremo superior de la Tira de Detección hasta una distancia de 10 mm del extremo inferior de la tira, dejando 10 mm aproximadamente de la Almohadilla de Muestra expuestos. Se aplicaron posteriormente 80 \mul de plasma a las Almohadillas de Muestra de cada una de las tiras inmunocromatográficas que contenían Almohadillas de Neutralización con un 0%, 1,1%, 3,3% ó 10% de dextrán sulfato. La agregación del conjugado de selenio rojo y la capacidad del conjugado para fluir a lo largo de la tira fueron observadas visualmente.
Los resultados, mostrados en la Tabla 2 siguiente, indicaban que, sin la presencia de dextrán sulfato para neutralizar la carga de la solución del policatión, el conjugado de selenio se agregaba y no era capaz de fluir a lo largo de la tira. Había una relación inversa entre la agregación del conjugado y el flujo, siendo suficientes concentraciones de dextrán sulfato del 3,3% o mayores para prevenir la agregación del conjugado y permitir que el conjugado fluyera a lo largo de la tira.
TABLA 2
Concentración de dextrán sulfato Agregación del conjugado Flujo del conjugado
0% ++ -
1,1% + +/-
3,3% - +
10% - +
B. Agregación de RBC en presencia de dextrán sulfato
Con el fin de determinar el efecto del dextrán sulfato sobre la agregación de rbc, se repitió el experimento anterior utilizando sangre completa como muestra con un 10% de dextrán sulfato en una Almohadilla de Neutralización de 4,3 mm de largo por 4 mm de ancho. Después de ensamblar la tira inmunocromatográfica igual que anteriormente, utilizando esta Almohadilla de Neutralización, se aplicaron 80 \mul de sangre completa a la Almohadilla de Muestra. Quince minutos más tarde, el resultado de la agregación de rbc fue observado visualmente y se midió la capacidad del plasma resultante para fluir a lo largo de la tira. Los rbc se agregaban, siendo retenidos en la Almohadilla de Muestra, y no fluían sobre la tira, mientras que el plasma fluyó 33 mm a lo largo de la tira en 15 minutos. Esto indicaba que el policatión de la Almohadilla de Muestra era todavía capaz de producir la agregación de los rbcs en la muestra de sangre completa, y que la presencia del polianión, dextrán sulfato, en la Almohadilla de Neutralización no interfería con esta agregación de rbc.
C. Prevención de la agregación del conjugado por polianiones
Se analizaron otros polianiones con el fin de evaluar su capacidad para prevenir la agregación del conjugado de selenio igual que en el Ejemplo 2.A. Una Almohadilla de Muestra de 15,5 mm de largo por 4 mm de ancho fue impregnada en una solución acuosa que contenía un 0,26% de Merquat®-100 y posteriormente fue secada a 55ºC. No se utilizaron Almohadillas de Neutralización y en su lugar el conjugado de selenio fue diluido en tampón Tris 10 mM, pH 7,4, que contenía caseína 1%, sacarosa 2%, lactosa 2% y un 0%, un 1,1% o un 3,3% del polianión dextrán sulfato, PM 5000 (Sigma, St. Louis, MO) o un 0%, un 0,5%, un 1% o un 2% de uno de los polianiones siguientes (todos de Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI): Poli (ácido acrílico), PM 5000; Poli (sulfonato de sodio-4-estireno), PM 70.000; Poli (ácido vinil sulfónico, sal de sodio); Poli (ácido metil metacrílico), PM 9500; Poli (ácido acrílico, sal de sodio), PM 2100. Las Almohadillas de Conjugado fueron impregnadas en las diferentes soluciones de conjugado de selenio y secadas bajo vacío. La Tira de Detección fue preparada igual que en el Ejemplo 2.A. y se ensamblaron las tiras inmunocromatográficas. Se aplicaron posteriormente 50 \mul de plasma a las Almohadillas de Muestra de cada una de las tiras inmunocromatográficas que contenían las Almohadillas de Conjugado con los diferentes polianiones. La agregación del conjugado de selenio rojo fue observada visualmente. La Tabla 3 muestra la cantidad relativa de agregación de conjugado observada con las diferentes concentraciones de polianiones analizadas.
TABLA 3
Agregación del conjugado de selenio
Concentración de polianión
Polianión 0% 0,5% 1-1,1% 2% 3,3%
Dextrán Sulfato ++ na + na -
Poli(ácido acrílico) ++ - - - na
Poli(sulfonato de Na- 4-estireno) ++ ++ ++ + na
Poli(ácido vinil sulfónico) ++ +/- - - na
Poli(ácido metil metacrílico) ++ - - - na
Poli(ácido acrílico sal de Na), ++ + +/- - na
na = no analizado
Igual que anteriormente, el conjugado de selenio se agregaba si no había un polianión presente para neutralizar la carga positiva del policatión de la Almohadilla de Muestra (que es necesario para la agregación de los rbc cuando se analiza sangre completa). Todos los polianiones utilizados en la Almohadilla de Conjugación impidieron que tuviera lugar la agregación del conjugado a al menos una de las concentraciones analizadas. Este experimento mostró también que el polianión no tenía que ser aplicado en una almohadilla separada, sino que podía ser combinado con el conjugado de selenio en la Almohadilla de Conjugación.
Ejemplo 3 Utilización de dextrán sulfato en la almohadilla de neutralización frente a la almohadilla de conjugación en un ensayo de anticuerpos hacia el VIH-1
Se prepararon tiras de inmunocromatografía igual que en el Ejemplo 2.A. con o sin una Almohadilla de Neutralización de filtro de fibra de vidrio de 4 mm de ancho por 4,3 mm de largo (Lypore 9524, Lydall, Rochester, NH). Cuando se utilizó, la Almohadilla de Neutralización fue impregnada en una solución acuosa que contenía un 3,3% de dextrán sulfato, y posteriormente fue secada bajo vacío. En las tiras sin Almohadilla de Neutralización, el conjugado de selenio fue diluido en tampón Tris 10 mM, pH 7,4 que contenía caseína 1%, sacarosa 2%, lactosa 2% y dextrán sulfato 3,3%, y la Almohadilla de Conjugado fue impregnada en esta solución y luego secada bajo vacío. La Almohadilla de Muestra utilizada fue como la del Ejemplo 2.A., excepto en que fue impregnada en una solución acuosa de Merquat®-100 al 0,2%.
Suero humano que contenía anticuerpos hacia el VIH-1 fue diluido 1:2048 en sangre completa humana negativa para VIH (sobre la base del volumen plasmático) con un valor de hematocrito del 50% o bien fue diluido en plasma humano negativo para VIH. Se realizaron tres diluciones seriadas 1:2 adicionales, utilizando de nuevo como diluyente sangre completa o plasma. Se añadieron 80 \mul de sangre completa negativa o de las muestras de la serie de diluciones con sangre completa positivas para VIH-1 a la Almohadilla de Muestra de tiras inmunocromatográficas preparadas con dextrán sulfato en una Almohadilla de Neutralización separada o con dextrán sulfato en la solución del conjugado de selenio en la Almohadilla de Conjugado. Se analizaron 80 \mul de plasma negativo o de muestras de la serie de diluciones en plasma positivas para VIH-1 solamente en tiras inmunocromatográficas con dextrán sulfato en la Almohadilla de Conjugado. Los resultados fueron leídos 15 minutos después de la aplicación de las muestras (Tabla 4). Un resultado positivo mostraba un color rojo en la Tira de Detección cuando el complejo anticuerpo hacia el VIH-1-conjugado del antígeno del VIH-1 con selenio rojo se unía al antígeno del VIH-1 en la región de la línea de la tira. Un resultado negativo no presentaba color en esta región de la Tira de Detección.
TABLA 4
Dextrán sulfato en la almohadilla Dextrán sulfato en la almohadilla
de neutralización de conjugado
Dilución de Sangre completa Sangre completa Plasma
la muestra
1:2048 + + +
1:4096 + + +
1:8192 - + +
1:16384 na - -
Control - - -
Negativo
na = no analizado
Los resultados de la Tabla 4 indican que son detectables anticuerpos hacia el VIH-1 de sangre completa en un ensayo con una tira inmunocromatográfica utilizando el policatión Merquat®-100 para agregar los rbcs y permitir que la muestra fluya a lo largo de la tira, y el polianión dextrán sulfato como agente neutralizante, impidiendo la agregación del conjugado de selenio por el policatión y permitiendo que el conjugado se una y forme un complejo con una muestra positiva y fluya a lo largo de la tira hacia el área de detección. Se demostró que el polianión era eficaz cuando se utilizaba en una Almohadilla de Neutralización separada o combinado con el conjugado de selenio en la Almohadilla de Conjugado. En este ensayo, la sensibilidad para detectar anticuerpos hacia el VIH-1 mostró una mejora de 2 veces cuando se utilizó el polianión (dextrán sulfato) en la Almohadilla de Conjugado en lugar de en una Almohadilla de Neutralización separada.
Adicionalmente, los resultados de la Tabla 4 indican que el policatión está agregando eficazmente los rbcs en la sangre completa según se muestra por la misma sensibilidad de detección de los anticuerpos hacia el VIH-1 en sangre completa, en la que los rbcs deben ser agregados para que fluya la muestra, o en plasma, en el que no hay rbcs que impidan el flujo de la muestra. Esto muestra también que la presencia del polianión, en una Almohadilla de Neutralización separada o en la Almohadilla de Conjugado, no interfiere con la capacidad de policatión para producir eficazmente la agregación de los rbcs en sangre completa.
Ejemplo 4 Utilización de Merquat® y de varios polianiones en un ensayo de HBsAg
Se prepararon tiras de inmunocromatografía para la detección del antígeno de superficie de la Hepatitis B (HBsAg) en muestras de sangre completa. Se utilizó Merquat®-100 como policatión para la agregación de los rbcs en la Almohadilla de Muestra, y se evaluaron varios polianiones en la Almohadilla de Conjugado como reactivos neutralizantes del policatión para impedir la agregación del conjugado de selenio.
Se montaron tiras de inmunocromatografía compuestas por una Almohadilla de Muestra, una Almohadilla de Conjugado y una Tira de Detección. La Almohadilla de Muestra fue preparada impregnando un filtro de fibra de vidrio de 4 mm de ancho por 15,5 mm de largo en una solución acuosa de Merquat®-100 al 0,26%, secándolo posteriormente a 55ºC.
El conjugado de selenio fue preparado utilizando un coloide de selenio, igual que en el Ejemplo 1, y 12 \mug/ml de anticuerpo monoclonal de ratón hacia HBsAg (anti-HBs). Este conjugado de anti-HBs marcado con el coloide de selenio fue diluido posteriormente hasta una densidad óptica de 2,6 a una longitud de onda de 550 nm en tampón Tris que contenía uno de los polianiones siguientes: Poli (ácido acrílico), PM 2000 (PAA-2000) 0,5%; Poli (ácido acrílico), PM 240.000 (PAA-240.000) 0,5%; dextrán sulfato, PM 5000 0,5%; ácido Poli-L-aspártico, PM 36.300 0,8%; Carboximetil celulosa, PM 90.000 (CMC) 0,5%. El dextrán sulfato y el ácido Poli-L-aspártico eran de Sigma, St. Louis, MO, y los restantes polianiones eran de Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI.
La Almohadilla de Conjugado fue preparada impregnando un filtro de fibra de vidrio de 4 mm de ancho por 4,3 mm de largo en un conjugado de anti-HBs marcado con el coloide de selenio preparado y diluido con uno de los polianiones anteriores. Después de la impregnación, la Almohadilla de Conjugado fue secada bajo vacío.
La Tira de Detección era un filtro de membrana de nitrocelulosa de 4 mm de ancho por 40 mm de largo, preparado igual que en el Ejemplo 2, utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón anti-HBs a una concentración de 3 mg/ml y añadido a la membrana de nitrocelulosa de manera que formara una línea a través de la anchura de la tira en una posición a 1 cm aproximadamente del extremo de la membrana. La región de la línea fue reforzada con Lámina de Poliéster. Ésta se dejó secar suficientemente para que se fijara el anticuerpo a la nitrocelulosa.
Las tiras inmunocromatográficas fueron montadas utilizando los componentes anteriores, colocando los mismos uno tras otro longitudinalmente con un solapamiento de 1 mm, con la Almohadilla de Muestra en un extremo, a continuación de la cual estaba colocada la Almohadilla de Conjugado y finalmente la Tira de Detección. La tira montada fue cubierta posteriormente con una Lámina de Poliéster, dejando expuestos 10 mm aproximadamente de la Almohadilla de Muestra.
Se añadió HBsAg recombinante a sangre completa humana negativa para HBsAg con un valor de hematocrito del 50% a una concentración de 12,5 ng/ml. Se realizaron tres diluciones seriadas 1:2 adicionales en sangre completa. Se añadieron 50 \mul de sangre completa negativa o de muestras de la serie de diluciones en sangre completa positivas para HBsAg a la Almohadilla de Muestra de tiras inmunocromatográficas preparadas con varios polianiones en la Almohadilla de Conjugado. Los resultados fueron leídos 15 minutos después de la aplicación de las muestras (Tabla 5). Un resultado positivo mostraba un color rojo en la Tira de Detección donde el complejo de HBsAg-conjugado de anti-HBs con selenio rojo se unía a los anti-HBs en la región de la línea de la tira. Un resultado negativo no presentaba color en esta región de la Tira de Detección. La agregación del conjugado de selenio rojo en la entrada de la Tira de Detección se observó visualmente.
TABLA 5
Concentración de HBsAg
(ng/ml)
Polianión 12,5 6,25 3,13 1,56 0 Agregación
del
conjugado
PAA-2000 + + + - - -
PAA-240.000 + + - - - +
Dextrán + + + - - -
sulfato
Poli-L-Asp + + + - - -
CMC + - - - - +
Aunque todos los polianiones permitieron que tuviera lugar la detección de HBsAg, aquellos polianiones que impidieron la agregación del conjugado, PAA-2000, dextrán sulfato y ácido Poli-L-aspártico, mostraban una detección de HBsAg en muestras de sangre completa de 2 a 4 veces más sensible.
El experimento anterior fue repetido utilizando el conjugado marcado con coloide de selenio diluido en tampón Tris que contenía PAA-2000 como polianión, excepto en que se añadieron 25 \mul de tampón fosfato 50 mM, pH 7,4, a la Almohadilla de Muestra un minuto después de la adición de las muestras de sangre completa con HBsAg. Los resultados obtenidos utilizando este procedimiento, con la adición del tampón después de la aplicación de la muestra, fueron idénticos a los resultados sin esta etapa. Por tanto, estos ensayos pueden ser realizados con o sin la adición de tampón después de la aplicación de la muestra.
Ejemplo 5 Utilización de Merquat® y dextrán sulfato en un ensayo para determinar tuberculosis
Se prepararon tiras de inmunocromatografía para la detección de anticuerpos hacia Mycobacterium tuberculosis (anti-Mtb) en muestras de sangre completa. Se utilizó Merquat®-100 como policatión para la agregación de los rbcs en la Almohadilla de Muestra, y se evaluaron varias concentración del polianión dextrán sulfato en la Almohadilla de Conjugado como reactivo neutralizante del policatión para prevenir la agregación del conjugado de selenio.
Se montaron las tiras inmunocromatográficas compuestas por una Almohadilla de Muestra, una Almohadilla de Conjugado y una Tira de Detección. La Almohadilla de Muestra fue preparada impregnando un filtro de fibra de vidrio de 4 mm de ancho por 15,5 mm de largo en una solución acuosa de Merquat®-100 al 0,26%, secándolo posteriormente bajo vacío.
El conjugado de selenio fue preparado utilizando coloide de selenio, igual que en el Ejemplo 1, y 3,5 \mug/ml de antígeno Mtb recombinante procedente de E. coli. Este conjugado de Mtb marcado con el coloide de selenio fue diluido posteriormente hasta una densidad óptica de 2,5 a una longitud de onda de 550 nm en tampón Tris que contenía un 0%, un 0,34%, un 1,1% o un 3,3% de dextrán sulfato.
La Almohadilla de Conjugado fue preparada impregnando un filtro de fibra de vidrio de 4 mm de ancho por 4,3 mm de largo en el conjugado de Mtb marcado con el coloide de selenio, preparado y diluido con una de las concentraciones anteriores de dextrán sulfato. Después de la impregnación, la Almohadilla de Conjugado fue secada bajo vacío.
La Tira de Detección era un filtro de membrana de nitrocelulosa de 4 mm de ancho por 40 mm de largo, preparado igual que en el Ejemplo 2, utilizando el antígeno Mtb recombinante a una concentración de 0,15 mg/ml y añadido a la membrana de nitrocelulosa de manera que formara una línea a través del ancho de la tira en una posición a 1 cm aproximadamente del extremo de la membrana. La región de la línea fue reforzada con una Lámina de Poliéster. Ésta se dejó secar suficientemente para fijar el antígeno a la nitrocelulosa.
Las tiras inmunocromatográficas fueron ensambladas utilizando los componentes anteriores, colocando los mismos uno tras otro longitudinalmente con un solapamiento de 1 mm, con la Almohadilla de Muestra en un extremo, a continuación de la cual estaba colocada la Almohadilla de Conjugado y finalmente la Tira de Detección. La tira ensamblada fue cubierta posteriormente con una Lámina de Poliéster, dejando expuestos 10 mm aproximadamente de la Almohadilla de Muestra.
Se diluyó suero positivo para anti-Mtb 1:100 en sangre humana completa negativa con un valor de hematocrito del 50%. Se realizaron dos diluciones seriadas 1:2 adicionales en sangre completa. Se añadieron 50 \mul de sangre completa negativa o de las muestras de la serie de diluciones en sangre completa positivas para anti-Mtb a la Almohadilla de Muestra de las tiras inmunocromatográficas preparadas con varias concentraciones de dextrán sulfato en la Almohadilla de Conjugado. Los resultados fueron leídos 15 minutos después de la aplicación de las muestras (Tabla 6). Un resultado positivo mostraba un color rojo en la Tira de Detección donde el complejo anti-Mtb-conjugado de Mtb con selenio rojo se unía al Mtb en la región de la línea de la tira. Un resultado negativo no presentaba color en esta región en la Tira de Detección. La agregación del conjugado de selenio rojo en la entrada de la Tira de Detección se observó visualmente.
TABLA 6
Dextrán Dilución del anti-Mtb
sulfato
(%) 1:100 1:200 1:400 Control Agregación
negativo del conjugado
0 - - - - ++
0,34 - - - - ++
1,1 + - - - +
3,3 + + - - -
Los datos de la Tabla 6 muestran que el ensayo no funciona sin la presencia de un polianión, en este caso dextrán sulfato, para prevenir la agregación del conjugado. Hay una relación inversa entre la agregación del conjugado y la sensibilidad del ensayo. A una concentración de dextrán sulfato del 3,3% no tiene lugar la agregación del conjugado y el ensayo presenta la detección más sensible de anti-Mtb.
Ejemplo 6 Ensayo para determinar sífilis utilizando Merquat® y dextrán sulfato
Se prepararon tiras de inmunocromatografía para la detección de anticuerpos hacia Treponema pallidum (anti-TP) en muestras de sangre completa o de plasma. Comparando la sensibilidad de detección en sangre completa respecto a plasma, se podría determinar si los rbcs de la sangre completa estaban siendo agregados eficazmente por el policatión para no interferir con, y disminuir de este modo, la sensibilidad de detección del ensayo. Se utilizó Merquat®-100 como policatión para la agregación de los rbcs en la Almohadilla de Muestra, y se utilizó el polianión dextrán sulfato en la Almohadilla de Conjugado como reactivo de neutralización del policatión para prevenir la agregación del conjugado de selenio.
Se montaron tiras inmunocromatográficas compuestas por una Almohadilla de Muestra, una Almohadilla de Conjugado y una Tira de Detección. La Almohadilla de Muestra fue preparada impregnando un filtro de fibra de vidrio de 4 mm de ancho por 15,5 mm de largo en una solución acuosa de Merquat®-100 al 0,2%, secándolo luego a 55ºC.
El conjugado de selenio fue preparado utilizando coloide de selenio, igual que en el Ejemplo 1, y 7,5 \mug/ml de lisado de Treponema pallidum (TP). Este conjugado de TP marcado con coloide de selenio fue diluido posteriormente hasta una densidad óptica de 2,8 a una longitud de onda de 550 nm en tampón Tris que contenía un 3,3% de dextrán sulfato.
La Almohadilla de Conjugado fue preparada impregnando un filtro de fibra de vidrio de 4 mm de ancho por 4,3 mm de largo en el conjugado de TP marcado con el coloide de selenio preparado anteriormente. Después de la impregnación, la Almohadilla de Conjugado fue secada bajo vacío.
La Tira de Detección era un filtro de membrana de nitrocelulosa de 4 mm de ancho por 40 mm de largo, preparado igual que en el Ejemplo 2 utilizando un lisado de Treponema pallidum a una concentración de 44 \mug/ml y añadido a la membrana de nitrocelulosa de manera que formara una línea a través de la anchura de la tira en una posición a 1 cm aproximadamente del extremo de la membrana. La región de la línea fue reforzada con una Lámina de Poliéster. Ésta se dejó secar suficientemente con el fin de fijar el lisado de TP a la nitrocelulosa.
Las tiras inmunocromatográficas fueron ensambladas utilizando los componentes anteriores, colocando los mismos uno tras otro longitudinalmente, con un solapamiento de 1 mm, con la Almohadilla de Muestra en un extremo, a continuación de la cual estaba colocada la Almohadilla de Conjugado y finalmente la Tira de Detección. La tira montada fue cubierta posteriormente con una Lámina de Poliéster, dejando expuestos 10 mm aproximadamente de la Almohadilla de Muestra.
Suero humano positivo para anti-TP fue diluido 1:10,8 en sangre humana completa negativa con un valor de hematocrito del 50% o en plasma humano negativo. Se realizaron cuatro diluciones seriadas 1:2 adicionales, utilizando de nuevo como diluyente sangre completa o plasma. Se añadieron a la Almohadilla de Muestra de las tiras inmunocromatográficas 60 \mul de sangre completa o de plasma negativos, o de las muestras de la serie de diluciones en sangre completa o en plasma positivas para anti-TP. Los resultados fueron leídos 15 minutos después de la aplicación de las muestras (Tabla 7). Un resultado positivo presentaba un color rojo en la Tira de Detección donde el complejo anti-TP-conjugado de TP con selenio rojo se unía al lisado de TP en la región de la línea de la tira. Un resultado negativo no presentaba color en esta región de la Tira de Detección.
La Tabla 7 muestra que la sensibilidad de detección de anti-TP era la misma en sangre completa y en plasma, indicando que el policatión Merquat®-100 agregaba eficazmente los rbcs de la sangre completa.
TABLA 7
Dilución de la muestra Sangre completa Plasma
de anti-TP
1:10,8 + +
1:21,6 + +
1:43,2 + +
1:86,4 + +
1:172,8 - -
Control negativo - -

Claims (14)

1. Un dispositivo de ensayo cromatográfico para detectar la presencia de un analito en una muestra de sangre que comprende:
un vehículo cromatográfico que define una vía para el flujo de fluido y soporta el flujo capilar,
un sitio de aplicación de dicha muestra de sangre en contacto por el flujo del fluido con dicho vehículo cromatográfico,
un sitio de detección en dicho vehículo cromatográfico separado de dicho sitio de aplicación que tiene unido al mismo una sustancia de captura unida no difusivamente,
una sustancia marcada unida difusivamente situada corriente abajo de dicho sitio de aplicación,
un policatión unido difusivamente para separar el plasma o el suero de dicha muestra de sangre corriente arriba de dicho sitio de detección y
un polianión unido difusivamente para neutralizar el policatión corriente abajo de dicho policatión unido y corriente arriba de dicho sitio de detección.
2. El dispositivo de ensayo cromatográfico de la reivindicación 1, donde dicho dispositivo es un dispositivo para inmunoensayo.
3. El dispositivo de ensayo cromatográfico de la reivindicación 1, en el que dicho policatión está unido a dicho sitio de aplicación de dicha muestra de sangre.
4. El dispositivo de ensayo cromatográfico de la reivindicación 1, en el que dicho policatión es seleccionado del grupo que consta de bromhidrato de poli-L-lisina, clorhidrato de poli-L-arginina, poli-L-histidina, bromhidrato de poli(lisina, alanina) 3:1, bromhidrato de poli(lisina, alanina) 2:1, bromhidrato de poli(lisina, alanina) 1:1, bromhidrato de poli(lisina, triptófano) 1:4 y poli(cloruro de dialildimetilamonio).
5. El dispositivo de ensayo cromatográfico de la reivindicación 1, en el que dicho policatión es poli(cloruro de dialildimetilamonio).
6. El dispositivo de ensayo cromatográfico de la reivindicación 1, en el que dicho polianión es seleccionado del grupo que consta de dextrán sulfato, poli(ácido acrílico), poli(sulfonato de sodio-4-estireno), poli(ácido vinil sulfónico), poli(ácido metil metacrílico), ácido poli-L-aspártico y carboximetil celulosa.
7. El dispositivo de ensayo cromatográfico de la reivindicación 1, en el que dicho polianión es dextrán sulfato.
8. El dispositivo de ensayo cromatográfico de la reivindicación 1, en el que dicho polianión está unido difusivamente al vehículo cromatográfico en el mismo lugar que dicha sustancia marcada.
9. El dispositivo de ensayo cromatográfico de la reivindicación 1, en el que dicha sustancia marcada es una sustancia marcada con selenio.
10. Un método para detectar la presencia de una analito en una muestra de sangre que comprende las etapas de:
la provisión de un vehículo cromatográfico que define una vía para el flujo de fluido y soporta el flujo capilar, a lo largo del cual están (a) un sitio de aplicación de dicha muestra de sangre en contacto por el flujo de fluido con dicho vehículo cromatográfico, (b) un sitio de detección en dicho vehículo cromatográfico separado de dicho sitio de aplicación que tiene unido al mismo una sustancia de captura unida no difusivamente, (c) un sustancia marcada situada corriente abajo de dicho sitio de aplicación, (d) un policatión unido difusivamente para separar el plasma o el suero de dicha muestra de sangre corriente arriba de dicho sitio de detección y (e) un polianión unido difusivamente para neutralizar el policatión situado corriente abajo de dicho policatión unido y corriente arriba de dicho sitio de detección;
la puesta en contacto de dicho sitio de aplicación con dicha muestra de sangre y
la detección de la presencia del analito en dicha muestra de sangre.
11. El método de la reivindicación 10, en el que dicha sustancia marcada es una sustancia marcada con selenio.
12. El método de la reivindicación 10, en el que dicho polianión está unido difusivamente al vehículo cromatográfico en el mismo lugar que dicha sustancia marcada.
13. El método de la reivindicación 10, en el que dicho policatión es seleccionado del grupo que consta de bromhidrato de poli-L-lisina, clorhidrato de poli-L-arginina, poli-L-histidina, bromhidrato de poli(lisina, alanina) 3:1, bromhidrato de poli(lisina, alanina) 2:1, bromhidrato de poli(lisina, alanina) 1:1, bromhidrato de poli(lisina, triptófano) 1:4 y poli(cloruro de dialildimetilamonio).
14. El método de la reivindicación 10, en el que el polianión es seleccionado del grupo que consta de dextrán sulfato, poli(ácido acrílico), poli(sulfonato de sodio-4-estireno), poli(ácido vinil sulfónico), poli(ácido metil metacrílico), ácido poli-L-aspártico y carboximetil celulosa.
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