CN1285918A - 在用于全血的层析装置中对聚阳离子的中和作用 - Google Patents

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Abstract

一种用于全血样品的层析测定装置和方法,它使用红细胞分离剂聚集红细胞,使血浆或血清能借助于毛细作用流动,并且使用中和剂中和红细胞分离剂对此装置和方法可能具有的不利影响。

Description

在用于全血的层析装置中对聚阳离子的中和作用
                      技术领域
本发明是关于检测全血样品中待分析物的层析测定装置和测定方法，更具体地说，是关于一种装置和方法，它应用红细胞分离剂聚集红细胞，并应用中和剂消除红细胞分离剂对测定系统可能存在的不利作用。
                      发明背景
现代临床诊断方法通常是对血液样品进行。不幸的是，红细胞对许多诊断测定有干扰作用。在对待分析物的检测中，红细胞可能会抑制特异性结合的配对成分之间的结合。而且，红细胞具有酶活性，取决于所采用的测定方法，这种酶活性可能干扰产生的信号。另一方面，在应用层析测定装置，特别是层析免疫测定装置的快速检测方式中，红细胞可能会阻止液体流动，液体流动对于在这种装置上发生反应是必不可少的。鉴这种原因和其它一些原因，许多检测法都用血浆或血清进行，这就首先必须从全血中分离出血浆或血清。
有许多已知的技术可用于在全血样品中使红细胞与血浆分离。离心是本领域熟知的一种方法，通过离心可从全血中分离出血浆(凝血之前)和血清(凝血之后)。在此过程中，红细胞沉淀于试管底部，可通过缓慢倾倒分离出血清。但是，通过离心使全血分层有许多缺点。通常离心需要抽取大量的血液样品。另外，此方法费时，并需要笨重的实验室设备，通常不能安装在医生的诊室内。最后，对血液额外的操作会增加暴露于血液-携带病原体的潜在危险。
为了减少或消除对离心的需要，已发展了应用梯度膜或捕集膜从血液的液体部分分离红细胞的测定装置。还使用了固相化的抗红细胞抗体。
另一些已知的用于使红细胞与血浆或血清分离的技术包括，(1)使全血样品与红细胞结合剂相结合，然后使此混合物通过一种固体的吸水性成分过滤，其特异性结合的配对组分中的至少一种与此吸水成分结合，而除去了凝集的红细胞；(2)使全血通过一种玻璃微纤维滤器，此滤器可能具有或不具有与之结合的凝集剂；(3)应用一种多糖材料的阻挡层或隔离层，以便阻止红细胞通过，从而防止它干扰对干测试条上信号的检测或目视观察；以及(4)应用一种具有聚阳离子表面的支持物，它结合红细胞而不结合血浆。
这些用于使红细胞与血浆分离的技术许多都是昂贵、复杂的，可能导致对红细胞的分离不完全，并可能引起溶血。溶血会引起非特异性结合或很高的背景干扰，导致丧失检测的灵敏度。这可以是游离血红蛋白所致，它可使检测区染色，以使此检测区可在粉红至暗褐红色的范围内显示颜色。结果，由于检测区内存在血红蛋白的颜色，可全部或部分地掩盖所产生的可视性化学信号。另外，在检测系统中应用分离剂如聚阳离子，有可能对系统产生干扰，常常是通过除了使红细胞聚集之外，还使其它一些试剂或结合成分聚集。
因此，需要有一种装置和方法，用于检测血样品中的待分析物，而对检测系统没有不利的影响。这种装置和方法应该适合于包括小量样品在内的多种体积的全血样品。
                       发明概述
本发明涉及一种层析装置，它包含一种可限定液流路径、能够支持毛细管流的层析载体，一个与层析载体保持液流接触的血液样品加样部位，一个与此加样部位分隔开的在层析载体上部的检测部位，一种位于加样部位下游的可扩散结合的被标记物，一种在检测部位上游，用于从血液样品中分离血浆或血清的可扩散结合的红细胞分离剂，以及一种在此结合分离剂下游，在检测部位上游，能够与该分离剂结合的可扩散结合的中和剂，借此可中和分离剂的正电荷。优选的情况是，此红细胞分离剂是位于加样部位，以致可在血清或血浆沿层析载体移动之前使红细胞与血清或血浆分离。
本发明还涉及一种方法，用于检测样品中，优选地是血样品中是否存在某待测物，此方法包括，提供一种能够支持毛细管流、可限定液流路径的层析载体，沿着此载体有(a)一个与层析载体保持液流接触的血液样品加样部位，(b)一个在层析载体上与加样部位分隔开的检测部位，(c)一种位于加样部位下游的可扩散结合的被标记物，(d)一种在检测部位上游，用于从血液样品中分离血浆或血清的可扩散结合的红细胞分离剂，以及(e)一种位于此结合分离剂下游和检测部位上游的，能够与该分离剂结合的可扩散结合的中和剂，借此可中和分离剂的正电荷；此方法还包括使加样部位与血液样品接触，以使红细胞分离剂可从血液样品中分离出血浆或血清，并且使中和剂在样品沿液流路径流动时可中和分离剂的正电荷；以及还包括检测血液样品中是否存在待分析物。
                       附图简述
图1显示本发明层析测定装置的优选实施方案。
                       发明详述
本发明是基于如下的观测，全血样品中的红细胞对测定血液样品中待分析物的存在或含量有干扰作用，在不存在此干扰作用时，这种检测可以通过多种测定系统方便地完成。例如在免疫测定法中，与加样部位接触的全血样品，由于存在红细胞的阻碍或干扰，不大可能借助于毛细作用沿测试条移动。本发明克服了这个问题，而不影响测定系统的灵敏度。
在对本发明实施方案的理解中可应用下面的一些定义。
“待分析物”或“待研究的分析物”指的是将被检测或测定的，具有至少一个抗原表位或结合位点的化合物或组合物。这种待分析物可以是具有天然存在的待分析物-特异性结合成分的，或者是可以制备一个待分析物-特异性结合成分的任何一种物质，待分析物包括但不局限于如下物质：毒素，有机化合物，蛋白质，肽，微生物，氨基酸，核酸，激素，类固醇，维生素，药物(包括为治疗目的给予的药物以及为不正当目的给予的药物)，以及上述任何一种物质的代谢物，或者针对它们的抗体。名词“待分析物”还包括任何一种抗原物质，半抗原，抗体，大分子和它们的组合。
“层析载体”指的是任何适合的多孔性，有吸收能力，吸水性，各向同性的材料，或者是毛细材料。它包含该装置的检测部位，通过此装置，借助于毛细作用或弱作用力，待分析物或待测样品可以被转移。本领域的技术人员应理解到，层析载体可以由单一材料构成，或者由一种以上材料构成(例如，可以由不同的材料构成不同的区带、部份、层、区域或部位)，只要这种多层次结构处于液流相互接触的状态，从而使待测样品能够在材料之间通过。液流接触允许样品中的至少某些成分，即待分析物，在多孔材料的区带之间通过，优选的情况是，沿不同区带之间的接触界面这种液流接触是均匀一致的。天然的或合成的材料，或者经合成修饰的天然存在的材料都可用作层析载体，包括但不局限于如下种类：纸(纤维状的)，或纤维素材料的膜(微孔的)例如滤纸；纤维素和纤维素衍生物如醋酸纤维素和硝酸纤维素；玻璃纤维；织物；包括天然原料(如棉花)织物和合成原料(如尼龙)织物；以及多孔凝胶等。
“标记”指的是能够产生目视或仪器可检测信号的任何一种物质。适合用于本发明的各种标记包括通过化学或物理方式产生信号的标记物。例如包括酶和底物，色原物质，荧光化合物，化学反光化合物，有色的或可着色的有机聚合物胶乳微粒，以及含有直接可视物质的脂质体或其它微泡。在本发明中优选地可使用放射标记，胶体金属微粒或胶体非金属微粒。优选的标记物包括胶体金和胶乳微粒。
“被标记物”或“缀合物”指的是含有附着于特异性结合成分的可检测标记的物质。这种附着可能是共价的或非共价的结合，还可能包括核酸杂交。这种标记可使被标记物产生可检测的信号，此信号直接或间接地与待测样品中待分析物的含量有关。可选择被标记物的特异性结合成分，使之直接或间接与待分析物结合。
“特异性结合成分”指的是特异性结合对中的一种成分，即二种不同的分子，其中一种分子通过化学或物理方式特异性地结合于第二种分子。如果这种特异性结合成分是免疫反应物，那末它可以是例如抗体，抗原，半抗原，或它们的复合物，而如果使用抗体，则可以是单克隆抗体或多克隆抗体，重组的蛋白质或抗体，嵌合抗体，它们的混合物或片段，以及抗体和其它特异性结合成分的混合物。特异性结合成分的特定实例包括，生物素和亲合素，抗体和与之相对应的抗原(二者都与待测定的样品无关)，以及单链核酸和其互补链等。
“捕集物”指的是一种或几种特异性结合成分，它们附着在一部分层析载体的内部或表面，形成一个或几个“捕集部位”，其中，待分析物，标记的试剂和/或对照试剂将被固定在此层析载体上。附着的方法对于本发明不是关键性的。捕集物通过从未结合的检测试剂和待测样品的剩余成分中基本分离出待分析物和/或被标记物，而有助于对可检测信号的观测。可以在实施检测之前或者检测过程中，通过任何适合的附着方法将捕集物固定在层析载体上。进而，可以在层析载体表面或其内部提供单一的检测部位或多个检测部位。还可以使捕集物配置成多种构型，以便产生不同的检测或测定模式。例如，可使捕集物形成字母，数字，图标或符号，或者成为它们的任何组合形式。
特别是，本发明提供了一种层析检测装置，用于检测样品中，优选地是血液样品中是否存在某种待分析物。此装置优选地是构成层析测试条的形式，它具有可限定液流路径，并能够支持毛细管流的层析载体，血液样品加样部位，以及与加样部位分隔开的检测部位，用于检测血液样品中待分析物的存在或含量。优选地，此装置还包括可扩散地结合于层析载体的被标记物(或缀合物)。在优选的实施方案中，此被标记物将与待分析物结合，或者与待分析物在检测部位竞争结合。此装置优选地还包含可扩散地结合于层析载体的另外二种试剂：(1)在检测部位上游的红细胞分离剂(此后，把通过毛细作用引起的样品运动方向称为“下游”，其相反的方向称为“上游”)，它能够从血液样品中分离出血浆或血清，以及(2)在红细胞分离剂下游，检测部位上游的中和剂，用于消除红细胞分离剂对层析系统的任何影响，特别是不利的作用。
对于本发明，被用于某一给定试剂的术语“可扩散地结合”可被规定为用于本发明的任何试剂，包括但不局限于被标记物，特异性结合成分，红细胞分离剂或中和剂，该术语表示该试剂是以允许被结合的试剂可沿液流路径流动的方式被结合。
任何一种检测系统都可能用于本发明的目的。优选的是免疫检测系统，包括但不局限于水平液流系统，垂直液流系统，浸渍系统和检测小棒。下面将概述一些已知的检测系统。
一般来说，对于层析测试条至少在层析载体上安排了一个样品加样部位和一个检测部位。当将被怀疑含有所需分析物即待分析物的样品液施加于加样部位时，借助于毛细作用它将沿层析载体移动，并且在检测部位通过结合反应(如免疫学反应)的作用，积累预先安排在层析载体上的标记装置包含的被标记物或缀合物，这种积累作用与样品液中待检测物的存在或含量成正比例或反比例，这样，通过测定如此积累的被标记或缀合物的存在或含量，就可以检测出样品液中待检测物的存在或含量。已知有多种类型的层析测试条，所有这些已知的层析测试条，包括下面将要描述的，都可用于本发明。如在此所使用的术语“层析检测装置”意指一种层析测试条，它是以可被用于检测和能够贮存和运输的这样一种方式制备的。
下面描述层析测试条的一种典型实例。可使加样部位处在与被标记物相同的位置，优选地是在被标记物的上游位置。当使被怀疑含有待检测分析物的样品液与加样部位接触时，样品液借助于毛细作用，沿层析载体连同待分析物一起向下游方向移动。通常待分析物是一种化合物，它以特异性方式结合于固定在检测部位的捕集物，或者是一种可以特异性方式结合于一种缀合物的化合物，在检测部位，此缀合物已特异性地结合于捕集物。例如，当此捕集物是一种抗原或者此缀合物含有一种抗原时，待分析物是一种抗体，当此捕集物是一种抗体，或者此缀合物含有一种抗体时，待分析物是一种抗原。作为另一种例子，待分析物还可能是可结合于互补缀合物和捕集物的核酸。
当使加样部位处于被标记物上游位置时，可安排此被标记物靠近加样部位，或者在与加样部位分开的位置。
可通过多种方式实现加入被标记物的目的，例如通过在加入样品液之后将它加到层析测定条检测部位之外的某一位置。
因为是以这样一种方式安排被标记物，以使它可借助于样品液的毛细作用移动，所以，当将样品液加入样品添加装置时，被标记物可向下游方向移动。
通常使检测部位处于被标记物的下游位置，并且与被标记物间隔一定距离。在检测部位，有一种捕集物固定于层析载体，此捕集物仅以特异性方式结合待分析物或缀合物，或者特异性地结合待检测的每种物质和被标记物。因此，在一个实施方案中，借助于样品液的毛细作用移动的待分析物(有时是连接于一种被标记物的)结合于捕集物，或者结合于一种缀合物，此缀合物本身又结合于此捕集物。被标记物结合于这种被结合的待检测物，从而导致被标记物以响应待分析物的存在或含量的方式在检测装置中积累。另一种方式是，被标记物和待分析物借助于毛细作用移动，竞争性结合于捕集物，或者结合于缀合物，此缀合物本身又结合于捕集物，从而导致被标记物与待检测物含量成反比例地积累。
有一种情况是，其中的某一被标记物既可结合捕集物(或一种缀合物，它本身又结合于捕集物)，又可结合待分析物，但不是同时结合，在这种情况下，待分析物首先结合于被标记物，未结合于待检测物的剩余被标记物结合于捕集物。因此，通过测定在检测装置中积累的被标记物，可以分析待分析物的存在和含量。
在偶尔需要时，可将不同的物质定位在检测部位的上游。例如，可以使缀合物以可移动的方式这样定位。
在某些情况下，可以在第一检测部位的下游安排一个或几个补充检测部位。在检测部位的下游，层析载体还可进一步延伸，这样使样品液可被完全释放，或者此载体可能装配有用于吸收样品液的材料。
因此，通过测定在检测部位积累的被标记物的存在或含量，可以检测样品液中所需待分析物的存在或含量。在一种情况下，这可以通过目测来完成。
本发明试图用于任何血液样品，包括血清和血浆，但是优选地是用于含有红细胞的血液样品，例如全血样品。
如果希望以理想的灵敏度进行检测，优选地是在对血液样品中所需待分析物进行检测之前将红细胞除去。因此，根据本发明将一种红细胞分离剂结合于层析载体。优选地是使红细胞分离剂可扩散地结合于层析载体。可在任何将能发挥使红细胞与血浆或血清分离功能的位置，将红细胞分离剂结合于层析载体。优选地是在检测部位的上游使它可扩散地结合于层析载体。最优选地是将红细胞分离剂可扩散地结合在样品施加部位。此位置之所以是优选的，是因为将它们用于层析载体后就立即可导致红细胞聚集，如果有的话，它仅对血清或血浆通过毛细作用沿载体的液流产生最小的干扰。
本发明的红细胞分离剂可以是能够聚集红细胞的任何一种物质。优选的试剂是带正电荷的物质如聚阳离子，包括例如，聚-氢溴酸L-赖氨酸；聚(二甲基二烯丙基铵)氯化物(Merquat_-100，Merquat_-280，Merquat_-550)；聚-盐酸L-精氨酸；聚-L-组氨酸；聚(4-乙烯吡啶)，聚(4-乙基吡啶)氢氯化物；交联的聚(4-乙烯吡啶)，氯代甲烷季盐；(4-乙烯吡啶-苯乙烯)共聚物；聚(4-乙烯吡啶聚(氟化氢))；聚(4-乙烯吡啶-对-甲苯磺酸盐)；聚(4-乙烯吡啶-三溴化物)；聚(4-乙烯吡咯烷酮-共-2-二甲氨基乙基异丁烯酸盐)；交联的聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯吡咯烷酮；聚(蜜胺-共-甲醛)；部分甲基化的；hexadimethrine溴化物；聚(谷氨酸，赖氨酸)1∶4氢溴化物；聚(赖氨酸，丙氨酸)3∶1氢溴化物；聚(赖氨酸，丙氨酸)2∶1氢溴化酸；聚琥珀酰化的L-赖氨酸，聚(赖氨酸，丙氨酸)1∶1氢溴化物；以及聚(赖氨酸，色氨酸)1∶4氢溴化物。最优选的聚阳离子是聚(二甲基二烯丙基铵)氯化物(Merquat_-100))。
可以按能从其余的样品中有效地分离红细胞的任何适合的用量使用本发明的红细胞分离剂。优选地，红细胞分离剂是以大约0.04％-1.3％(每单位体积中的重量)的浓度存在，更优选的是大约0.13％-0.33％(每单位体积中的重量)，而最优选的是大约0.20％-0.33％(每单位体积中的重量)。
红细胞分离剂上的正电荷具有使存在于测试条上任何带负电荷的试剂聚集的倾向。例如，结合于层析载体的被标记物或缀合物也可能被红细胞分离剂聚集，而干扰待分析物与缀合物的结合，或者在竞争性检测中，干扰被标记物和待分析物在检测部位与捕集物的结合或者与缀合物的结合。最终有可能损害此免疫检测系统的灵敏度和准确性。
因此，当红细胞分离剂是带正电荷的物质时，本发明优选地应用了一种中和剂。此中和剂能够中和红细胞分离剂的正电荷，从而可消除由红细胞分离剂引起的对检测系统的任何干扰，或者至少使之减到最小程度。优选地，此中和剂是可扩散地结合于层析载体。可将中和剂可扩散地结合在层析载体上能有效地中和红细胞分离剂的任何位置，但是，优选地是定位在红细胞分离剂的下游，检测部位的上游，而更优选地是定位于层析载体上与可扩散结合的被标记物相同的位置。
中和剂可以是能够中和红细胞分离剂正电荷的任何一种聚阴离子。优选的聚阴离子包括，聚(丙烯酸)，聚(丙烯酸，Na盐)，聚(甲基异丁烯酸)，聚(Na-4-苯乙烯磺酸盐)，聚(乙烯基磺酸)，聚-L-天冬氨酸，以及羧甲基纤维素，而最优选的是硫酸葡聚糖。
可以使中和剂以能有效地中和红细胞分离剂正电荷的任何含量存在。一般来说，中和剂的浓度取决于所使用红细胞分离剂的浓度。优选地，中和剂是以大约0.33％-20％(单位体积的重量)的浓度存在，更优选的是大约0.34％-10％(单位体积重量)，而0.34％-10％(单位体积重量)是最优选的。
图1描绘了本发明免疫层析检测装置的一种实施方案。装置10包括层析载体20。血液样品加样部位30位于层析载体20上。在此优选的实施方案中，红细胞分离剂即Merquat_100是定位于加样部位30。邻接加样部位30有缀合物垫片40，它含有缀合物即硒标记的结合物，以及中和剂即硫酸葡聚糖。更下游是检测部位50，在检测进行之后，它将显示出对照色带60，并且如果存在待检测物，还将显示出检测带70。
在本发明的另一个实施方案中，优选地在加样部位与样品接触之后，可用一个缓冲液与加样部位接触。缓冲液有助于在层析载体上保持沿液流路径有可接受的液流速度。此缓冲液可以是任何能够借助于毛细作用沿液流路径流动的物质，包括但不局限于磷酸缓冲液，磷酸缓冲盐水，Tris-HCl缓冲液，碳酸缓冲液，柠檬酸缓冲液，HEPES(2-羟基哌嗪-N′-2-乙磺酸)缓冲液，MOPS(3-(N-吗啉)丙磺酸)缓冲液，以及MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)缓冲液等。虽然其浓度和pH可以是能在所需检测装置中起作用的任何浓度和pH，但优选的摩尔浓度是在大约10mM-100mM之内，pH是大约5-9，更优选的是大约6-8。所使用的缓冲液最优选地是50mM磷酸缓冲液，pH7.4。
本发明所使用液体的体积取决于装置的大小。理想的情况是，使用足够的液体体积，以便使液流能通过装置到达检测部位。液体体积优选地是大约25μl-100μl，更优选地是大约40μl-60μl。因此，在需要时可按大约10μl-40μl的体积范围加入缓冲液，而更优选地是大约20μl-30μl。
本发明还涉及一种用于检测血液样品中是否存在某种待分析物的方法。此方法优选地应用本发明的层析免疫检测装置。具体地说，此方法包括(1)提供一种能够支持毛细管流，可限定液流路径的层析载体，沿着此载体有一个与层析载体保持液流接触的血液样品加样部位，一个在层析载体上与加样部位分隔开的检测部位，一种结合于待分析物或者在检测部位与待分析物竞争结合的可扩散地被标记物(或缀合物)，一种在检测部位上游用于从血液样品中分离血浆或血清的可扩散结合的红细胞分离剂，以及一种结合于层析载体的缀合物；(2)使加样部位与血液样品接触，以使红细胞分离剂能将血液样品中的红细胞与血浆或血清分离，并且使中和剂能中和此分离剂的正电荷，以及(3)检测血液样品中是否存在待分析物。
优选地，此红细胞分离剂是一种带正电荷的物质，并且液流路径上含有可扩散结合的中和剂，中和剂优选地能够与红细胞分离剂结合，并且是位于红细胞分离剂的下游和检测部位的上游，从而可中和此分离剂的正电荷。
因此，在图1的优选实施方案中，将血液样品施加于加样部位30，红细胞分离剂通过使红细胞聚集而将它们分离，并允许血浆或血清借助于毛细作用沿层析载体20移动。缀合物垫片40中的中和剂中和红细胞分离剂对装置10和缀合物的影响，待分析物与存在于缀合物垫片40中的缀合物结合。结合于此缀合物的待分析物继续向下游移动至检测部位50。如果存在所研究的待测物，将显示检测色带70。为了指示测试工作正常，将显示对照色带60，指示是否存在所研究的待分析物。
本发明可优选地包括一个非反应性覆盖层或环绕检测装置的外套。优选地此覆盖层至少封装层析载体，避免接触和污染捕集部位。此覆盖层还可能包括一个突出区，邻接加样部位，有助于接纳和/或包含一定体积的样品。此外，此覆盖层还可能包括一个或几个切开区，构成字母，数字，图标或符号，或者其任何组合物形式。在此实施方案中，当测试条被完全包装时，此切开区构成特定的检测部位图形。优选的是使测试条的足够部分被封装，以便防止施加的样品与检测部位接触，而不首先通过测试条部分。
可将本发明的装置和方法用于任何一种其中的血液样品包含所需待分析物的检测系统。优选的检测系统实例包括，但不局限于，丙肝病毒(“HCV”)，甲肝病毒(“HAV”)，人免疫缺损病毒(“HIV”)，乙肝表面抗体(“HBsAb”)，乙肝表面抗原(“HBsAg”)，乙肝核心抗体(“HBcAb”)，乙肝核心抗原(“HBcAg”)，癌胚抗原(“CEA”)，甲胎蛋白(“AFP”)，胰腺癌标志物(“CA19-9”)，梅毒，结核病，疟疾，利什曼病和登革热。
下面的实施例将进一步说明本发明，但无论如何不应认为是对本发明范围的限制。
                        实施例实施例1由聚阳离子引起的红细胞聚集作用与硒缀合物聚集作用的比较
为本发明的目的，要求全血中的红细胞(rbc′s)聚集而不希望硒缀合物聚集。试验了多种聚阳离子，观察它们能否引起rbc′s充分地聚集，而同时仅最少地聚集硒-缀合物。
按如下方法制备了HIV-1重组蛋白的硒缀合物：首先使32mM氧化硒与91ml L-抗坏血酸在水溶液中42℃反应72小时制备硒胶体。将此硒胶体稀释成在波长550nm时的光密度为30，然后在pH7.4的30mMTris缓冲液中与40μg/ml的重组HIV-1外膜蛋白室温下反应20分钟。将此硒胶体标记的HIV-1蛋白缀合物，在含有0.1％酪蛋白的pH7.410mM Tris缓冲液中，再次稀释成在波长550nm时的光密度为30，并在室温下温育20分钟。然后在4℃以1970xg将此缀合物溶液离心20分钟，取出上清液，弃去沉淀。再对此上清液加入相当于上清液十分之一体积的含有2％酪蛋白的pH7.4，30mM Tris缓冲液。最后，在含有1％酪蛋白，2％蔗糖和2％乳糖的pH7.4，50mM Tris缓冲液中，将此缀合物溶液稀释成在波长550nm时光密度为10。
配制0.25％(w/v)的如下聚阳离子水溶液：聚-L-赖氨酸氢溴化物，分子量(mw)37000；聚-L-盐酸精氨酸；mw 12100，42400和92000；聚-L-组氨酸，mw 18400；Hexadimethrine溴化物，聚(赖氨酸，丙氨酸)3∶1氢溴化物，mw 35000；聚(赖氨酸，丙氨酸)2∶1氢溴化物，mw 49300；聚(赖氨酸，丙氨酸)1∶1氢溴化物，mw 41600；聚(赖氨酸，色氨酸)1∶4氢溴化物，mw 38000(所有上述聚阳离子均购自Sigma，St.Louis，MO)；聚(二烯丙基二甲基铵氯化物)，mw 105-106(Merquat_-100，Calgon，Pittsburgh，PA)。
通过将350μl 0.25％的不同聚阳离子溶液加入等体积全血或硒缀合物中，观察这些聚阳离子在各自的反应中聚集全血中rbc′s或硒缀合物的能力。将二种溶液混合，在室温下放置10分钟，然后目视评估聚集作用。结果概括在表1中。1个加号(+)表示弱聚集作用，2+表示中度聚集作用，3+和4+表示强聚集作用。
表1
       聚集
聚阳离子     分子量 红细胞 硒缀合物
聚-L-赖氨酸HBr     37000     2+     2+
Merquat_-100     105-106     2+     2+
聚-L-精氨酸HCl     12100     2+     2+
聚-L-精氨酸HCl     42400     2+     2+
聚-L-精氨酸HCl     92000     2+     2+
聚-L-组氨酸     18400     +     4+
Hexadimethrin溴化物     +     +
聚(赖氨酸，丙氨酸)3∶1 HBr     35000     2+     2+
聚(赖氨酸，丙氨酸)2∶1 HBr     49300     +     2+
聚(赖氨酸，丙氨酸)1∶1 HBr     41600     +     2+
聚(赖氨酸，色氨酸)1∶4 HBr     38000     3+     3+
能引起rbc′s聚集(2+或更强)，而同时引起硒缀合物最小聚集(2+或更小)的聚阳离子是良好的选择。那些对二者具有2+聚集作用的聚阳离子符合此标准。对聚-L-赖氨酸HBr和Merquat_-100作进一步选择试验，Merquat_-100具有最佳成本效果。实施例2以聚阴离子的中和作用防止缀合物聚集
A．应用硫酸葡聚糖防止缀合物流动和聚集
用聚-L-赖氨酸作聚阳离子rbc聚集剂，试验不同浓度的硫酸葡聚糖聚阴离子，观察硫酸葡聚糖是否能中和聚阳离子的正电荷，从而防止由聚阳离子引起的硒缀合物的聚集。在聚阳离子已经引起rbc′s发生聚集之后，但在聚阳离子与硒缀合物相互作用之前加入硫酸葡聚糖。用如下实验评价了此聚阳离子和硫酸葡聚糖对硒缀合物的聚集作用，以及随之发生的对其沿免疫层析测试条流动能力的影响。
装配了一种免疫层析测试条，由样品垫片，中和垫片，缀合物垫片和检测片组成。样品垫片的制备：在0.33％聚-L-赖氨酸氢溴化物，mw37000(Sigma，St.Louis，MO)水溶液中，浸泡4mm宽，20mm长的玻璃纤维滤纸(Lypore 9524，Lydall，Rochester，NH)，然后真空干燥。
含有不同浓度硫酸葡聚糖的中和垫片的制备：在含有0％，1.1％，3.3％或10％硫酸葡聚糖，mw 5000(Sigma，St.Louis，MO)的水溶液中，浸泡由木浆和聚酯(Sontara 8801，Du pont，Wilmington，Delaware)制成的4mm宽，13mm长的滤纸。浸泡之后，真空干燥此垫片。
缀合物垫片的制备：在如实施例1中配制和稀释的硒胶体标记的HIV-1重组蛋白缀合物中，浸泡4mm宽，4.3mm长的玻璃纤维滤纸(Lypore9524，Lydall，Rochester，NH)。浸泡之后，将此缀合物垫片真空干燥。
检测片是4mm宽，40mm长的硝酸纤维素滤膜(产品目录号#H9643G1，Millipore，Bedford，MA)。将在含有1％蔗糖的pH7.4 100mMTris缓冲液中配制成5mg/ml浓度的HIV-1包膜抗原加到此硝酸纤维素滤膜上，使之形成一条线，在距滤膜末端约1cm的位置跨越此检测片的宽度。用聚酯薄片(代码#7733)，粘合剂研究公司，Glen Rock，PA)对此划线区衬底。使此检测片充分干燥，致使抗原固定于硝酸纤维素滤膜上。
用上述组成部分装配成4mm宽的免疫层析测试条，头尾相连地纵向排列，每部分之间重叠1mm，20mm长的样品垫片位于一端，接着放置一片13mm长的中和垫片，随之是4.3mm长的缀合物垫片，最后是40mm长的检测片。然后用聚酯薄片(代码#8648，粘合剂研究公司，Glen Rock，PA)，从检测片的顶端至距组装的测试条底部10mm覆盖此测试条，遗留下约10mm暴露的样品垫片。然后将80μl血浆施加于每种免疫层析测试条的样品垫片，这些测试条包含带有0％，1.1％，3.3％或10％硫酸葡聚糖的中和垫片。目视观测红色硒缀合物的聚集作用和此缀合物沿测试条流动的能力。
结果显示在下面表2中，表明不存在硫酸葡聚糖中和来自聚阳离子溶液的电荷时，硒缀合物聚集，不能够沿测试条流动。缀合物的聚集和流动之间存在反比关系，3.3％或更高的硫酸葡聚糖浓度足以防止缀合物聚集并允许缀合物沿测试条流动。
                         表2
硫酸葡聚糖的浓度 缀合物的聚集 缀合物的流动
0％ ++ -
1.1％ + +/-
3.3％ - +
10％ - +
B．硫酸葡聚糖存在时rbc的聚集
为了测定硫酸葡聚糖对rbc聚集的影响，用全血作样品，以10％硫酸葡聚糖在4.3mm长×4mm宽的中和垫片上重复上述实验。在用这种中和垫片如上装配免疫层析测试条之后，对样品垫片施加80μl全血。15分钟后，目视观测rbc聚集的结果，测量所形成的血浆沿测试条流动的能力。rbc′s被聚集，滞留在样品垫片上，未沿测试条向上流动，而血浆在15分钟内沿测试条流动了33mm。这表明，在样品垫片中的聚阳离子仍能够导致全血样品中rbc′s聚集，并且，在中和垫片中存在聚阴离子硫酸葡聚糖不会干扰这种rbc的聚集作用。
C．用聚阴离子防止缀合物聚集
如实施例2.A实验了其它几种聚阴离子，以便评价它们防止硒缀合物聚集的能力。将15.5mm长×4mm宽的样品垫片浸泡于含有0.26％Merquat_-100的水溶液中，然后在55℃下干燥。不使用中和垫片，而是在含有1％酪蛋白，2％蔗糖，2％乳糖，以及含有0％，1.1％或3.3％聚阴离子硫酸葡聚糖mw 5000(Sigma，St.Louis，MO)，或者0％，0.5％，1％或2％的如下一种聚阴离子(全部购自Aldrich化学公司，Milwaukee，WI)的pH7.4，10mM Tris缓冲液中稀释硒缀合物：聚(丙烯酸)，mw 5000；聚(钠-4-苯乙烯磺酸盐)，mw 70000；聚(乙烯基磺酸，钠盐)；聚(甲基异丁烯酸)，mw 9500；聚(丙烯酸，钠盐)，mw 2100。将缀合物垫片浸泡于不同的硒缀合物溶液中，并真空干燥。如实施例2.A制备检测片，并装配成免疫层析测试条。然后将50μl血浆施加于每种免疫层析测试条的样品垫片，这些免疫层析测试条具有含不同聚阴离子的缀合物垫片。目视观察红色硒缀合物的聚集。表3显示以所试验的不同浓度聚阴离子观察到的缀合物聚集的相对量。
                             表3
                          硒缀合物的聚集
              聚阴离子的浓度
    聚阴离子 0％ 0.5％ 1-1.1％ 2％   3.3％
    硫酸葡聚糖 ++ nt + nt     -
    聚(丙烯酸) ++ - - -     nt
聚(Na-4-苯乙烯磺酸盐) ++ ++ ++ +     nt
    聚(乙烯基磺酸) ++ +/- - -     nt
    聚(甲基异丁烯酸) ++ - - -     nt
    聚(丙烯酸，钠盐) ++ + +/- -     nt
nt=未试验
如上面所述，如果没有聚阴离子存在来中和来自样品垫片的聚阳离子的正电荷(在试验全血时，聚阳离子对rbc的聚集是必不可少的)，硒缀合物被聚集了。用于缀合垫片中的所有聚阴离子，至少有一种所试验的浓度可防止缀合物发生聚集。此实验还表明，不必将聚阴离子施加于单独的垫片，而可以同硒缀合物组合施加在缀合垫片上。实施例3在HIV-1抗体检测试验中将硫酸葡聚糖用于中和垫片与用于缀合垫片的比较
按实施例2.A制备免疫层析测试条，带有或不带有4mm宽×4.3mm长的玻璃纤维滤纸(Lypore 9524，Lydall，Rochester，NH)中和垫片。当使用中和垫片时，将此垫片浸泡于含有3.3％硫酸葡聚糖的水溶液中，然后真空干燥。对于没有中和垫片的测试条，将硒缀合物用含有1％酪蛋白，2％蔗糖，2％乳糖和3.3％硫酸葡聚糖的pH7.4，10mM Tris缓冲液稀释，并在此溶液中浸泡缀合物垫片，然后真空干燥。所使用的样品垫片与实施例2.A中的相同，不同的是将它浸泡在0.2％Merquat_-100水溶液中。
以50％的血细胞比容值在HIV阴性的人全血内(根据血浆体积)，或者在HIV阴性的人血浆内，按1∶2048稀释含有HIV-1抗体的人血清。再次用全血或血浆作稀释剂，进一步作3次1∶2连续稀释。将80μl阴性的全血或来自HIV-1阳性的全血系列稀释液样品加到免疫层析测试条的样品垫片上，此测试条被制备成在单独的中和垫片中含有硫酸葡聚糖，或者在缀合物垫片上，硫酸葡聚糖在硒缀合物溶液中。80μl阴性血浆或来自HIV-1阳性的血浆系列稀释液样品，只在缀合物垫片上带有硫酸葡聚糖的免疫层析测试条上测试。加样后15分钟观测结果(表4)。阳性结果在检测片上显示出红色，在此红色的硒标记HIV-1抗原缀合物-HIV-1抗体复合物，被结合于此检测片划线区上的HIV-1抗原。阴性结果在检测片上的此区域没有颜色。
                          表4
硫酸葡聚糖在中和垫片内 硫酸葡聚糖在缀合物垫片内
样品稀释度 全血 全血 血浆
1∶2048 + + +
1∶4096 + + +
1∶8192 - + +
1∶16384 nt - -
阴性对照 - - -
nt=未试验
表4中的结果说明，借助于一种免疫层析测试条，可检测全血中的HIV-1抗体，此测试条应用聚阳离子Merquat_-100聚集rbc′s，使样品能沿测试条流动，并且应用聚阴离子硫酸葡聚糖作中和剂，防止聚阳离子使硒缀合物聚集，使此缀合物能够与阳性样品结合，形成复合物并能沿测试条流动至检测区。已显示，此聚阴离子不论是分开用于中和垫片中或者与硒缀合物组合用于缀合物垫片上都是有效的。在此试验中，当将聚阴离子(硫酸葡聚糖)用于缀合物垫片，而不是在单独的中和垫片上时，显示出对检测HIV-1抗体的灵敏度提高了二倍。
此外，表4中的结果还表明聚阳离子能有效地聚集全血中的rbc′s，并且不论在全血或血浆中都显示对HIV-1抗体有同样的检测灵敏度，在全血中为了样品流动必须使rbc′s聚集，而在血浆中没有rbc′s妨碍样品流动。结果还表明，聚阴离子的存在，不论单独在中和垫片中或者在缀合物垫片中，都不会干扰聚阳离子有效地引起全血中rbc′s聚集的能力。实施例4在HBsAg检测中使用Merquat_和不同的聚阴离子
制备了用于检测全血样品中乙肝表面抗原(HBsAg)的免疫层析测试条。用Merquat_-100作为聚集样品垫片中rbc′s的聚阳离子，评价不同聚阴离子在缀合物垫片中作为聚阳离子中和剂防止硒缀合物聚集的效果。
装配由样品垫片，缀合物垫片和检测片组成的免疫层析测试条。通过在0.26％Merquat_-100水溶液中浸泡4mm宽×15.5mm长的玻璃纤维滤纸，然后在55℃干燥，而制成样品垫片。
如实施例1，用硒胶体和12μg/ml的抗HBsAg小鼠单克隆抗体(抗-HBs)制备硒缀合物，然后在含有如下聚阴离子之一的Tris缓冲液中，将此硒胶体标记的抗-HBs缀合物稀释成在波长550nm时的光密度为2.6∶0.5％聚(丙烯酸)，mw 2000(PAA-2000)；0.5％聚(丙烯酸)，mw 240000(PAA-240000)，0.5％硫酸葡聚糖，mw 5000；0.8％聚-L-天冬氨酸，mw 36，300；0.5％羧甲基纤维素，mw 90000(CMC)。硫酸葡聚糖和聚-L-天冬氨酸购自Sigma，St.Louis，MO，其余的聚阴离子购自Aldrich化学公司，Milwaukee，WI。
制备缀合物垫片：在上述制备的，并用上述聚阴离子之一稀释的硒胶体标记的抗-HBs缀合物中浸泡4mm宽×4.3mm长的玻璃纤维滤纸。浸泡之后，真空干燥此缀合物垫片。
检测片是如实施例2中制备的4mm宽×40mm长的硝酸纤维素滤膜，使用3mg/ml浓度的抗-HBs小鼠单克隆抗体，将它加到此硝酸纤维素滤膜上，使之形成一条线，在距滤膜末端约1cm的位置跨越此检测片的宽度。用聚酯薄片对此划线区衬底。使此检测片充分干燥，致使抗体固定于硝酸纤维素滤膜。
用上述组成部分装配免疫层析测试条，将它们头尾相连，1mm重叠地纵向排列，样品垫片位于一端，与它邻接的是缀合物垫片，最后是检测片。然后用聚酯薄层覆盖此组装的测试条，留下约10mm样品垫片暴露在外。
以50％血细胞比容值将重组HBsAg加到HBsAg阴性的人全血中，达到12.5ng/ml的浓度。在全血中进一步作3次1∶2系列稀释。将50μl阴性全血或来自HBsAg阳性的全血系列稀释样品加到免疫层析测试条的样品垫片上，这些测试条被制备成在其缀合物垫片中含有不同的聚阴离子。施加样品后15分钟观测结果(表5)。阳性结果在检测片上显示出红色，在此红色的硒标记抗-HBs缀合物-HBsAg复合物被结合于检测片划线区上的抗HBs。阴性结果在检测片的此区域内不显示出颜色。可在进入检测片的入口处目视观测到红色硒缀合物的聚集。
                         表5
                 HBsAg的浓度(ng/ml)
聚阴离子  12.5  6.25  3.13  1.56   0  缀合物聚集
PAA-2000    +    +    +    -   -      -
PAA-240,000    +    +    -    -   -      +
硫酸葡聚糖    +    +    +    -   -      -
聚-L-天冬氨酸    +    +    +    -   -      -
    CMC    +    -    -    -   -      +
尽管所有的聚阴离子都能用于检测HBsAg，但是那些能防止缀合物聚集的聚阴离子，PAA 2000，硫酸葡聚糖和聚-L-天冬氨酸，对全血样品中的HBsAg表现出高2-4倍的检测灵敏度。
应用在含有PAA-2000作聚阴离子的Tris缓冲液中稀释的硒胶体标记的缀合物重复了上述实验，不同的是，在加入HBsAg全血样品之后1分钟，再对样品垫片加入pH7.4，50mM磷酸缓冲液25μl。在施加样品之后再加入缓冲液，应用这种程序得到的结果与不用此步骤的结果相同。因此，对于这些检测，在施加样品之后可以加缓冲液或不加缓冲液。实施例5在检测结核病中使用Merquat_和硫酸葡聚糖
制备免疫层析测试条，用于检测全血样品中抗结核分枝杆菌抗体(抗-Mtb)。用Merquat_-100作聚阳离子，用于在样品垫片中聚集rbc′s，评价不同浓度的聚阴离子硫酸葡聚糖在缀合物垫片中作为聚阳离子中和剂防止硒缀合物聚集的效果。
装配由样品垫片，缀合物垫片和检测片组成的免疫层析测试条。样品垫片的制备：在0.26％Merquat_-100水溶液中浸泡4mm宽×15.5mm长的玻璃纤维滤纸，然后真空干燥。
同实施例1，用硒胶体和来自E.Coli的3.5μg/ml重组Mtb抗原制备硒缀合物。然后在含有0％，0.34％，1.1％或者3.3％硫酸葡聚糖的Tris缓冲液中，将此硒胶体标记的Mtb缀合物稀释成在波长550nm时的光密度为2.5。
缀合物垫片的制备：在如上述制备和用一种硫酸葡聚糖浓度稀释的硒胶体标记的Mtb缀合物中，浸泡4mm宽×4.3mm长的玻璃纤维滤纸。浸泡之后真空干燥此缀合物垫片。
检测片是4mm宽×40mm长的硝酸纤维素滤膜，如在实施例2中，用0.15mg/ml浓度的重组Mtb抗原，将它加到硝酸纤维素滤膜上，使之形成一条线，在距滤膜末端大约1cm的位置跨越此检测片的宽度。用聚酯薄片衬托在划线区的背面。使此检测片充分干燥，致使抗原能固定于硝酸纤维素。
用上述组成部分装配免疫层析测试条，将它们头尾连接，重叠1mm纵向排列，样品垫片在一端，与其邻接的是缀合物垫片，最后是检测片。然后用聚酯薄片覆盖装配的测试条，遗留大约10mm样品垫片暴露在外。
以50％的血细胞比容值在阴性的人全血内按1∶100稀释抗-Mtb阳性血清。进一步在全血内作二次1∶2系列稀释。将50μl阴性全血或来自抗-Mtb阳性全血系列稀释液的样品加到免疫层析测试条的样品垫片上，此测试条被制备成在其缀合物垫片含有不同浓度的硫酸葡聚糖。施加样品后15分钟观测结果(表6)。阳性结果在检测片上显示出红色，在此，红色的硒标记Mtb缀合物-抗-Mtb复合物结合于检测片划线区上的Mtb。阴性结果在检测片上的此区域不显示颜色。可在进入检测片的入口处目视观测红色硒缀合物的聚集。
                              表6
硫酸葡聚糖 抗-Mtb的稀释度
(％) 1∶100 1∶2000 1∶4000 阴性对照 缀合物聚集
0 - - - - ++
0.34 - - - - ++
1.1 + - - - +
3.3 + + - - -
表6中的资料显示，在不存在聚阴离子防止缀合物聚集时不能进行检测，在此聚阴离子是硫酸葡聚糖。缀合物聚集与检测灵敏度之间有反比例关系。在3.3％的硫酸葡聚糖浓度时，不发生缀合物聚集，显示出对抗-Mtb的最高灵敏度的检测。实施例6在梅毒检测中使用Merquat_和硫酸葡聚糖
制备免疫层析测试条用于检测全血或血浆样品中的抗梅毒密螺旋体抗体(抗-TP)。通过对血浆比较在全血中检测的灵敏度，可确定是否借助于聚阳离子有效地聚集全血中的rbc′s，使之不干扰检测，从而可提高此测定法的检测灵敏度。用Merquat_-100作聚阳离子，用于在样品垫片中聚集rbc′s，用聚阴离子硫酸葡聚糖在缀合物垫片中作聚阳离子中和剂，防止硒缀合物聚集。
装配由样品垫片，缀合物垫片和检测片组成的免疫层析测试条。样品垫片的制备：在0.2％Merquat_-100水溶液中浸泡4mm宽×15.5mm长的玻璃纤维滤纸，然后在55℃使它干燥。
如实施例1，使用硒胶体和7.5μg/ml的梅毒密螺旋体的溶菌产物(TP)制备硒缀合物。然后在含有3.3％硫酸葡聚糖的Tris缓冲液中，将此硒胶体标记的TP缀合物稀释成在波长550nm时的光密度为2.8。
缀合物垫片的制备：在上面制备的硒胶体标记的TP缀合物中浸泡4mm宽×4.3mm长的玻璃纤维滤纸。浸泡之后真空干燥此缀合物垫片。
检测片是4mm宽×40mm长的硝酸纤维素滤膜，如实施例2用44μg/ml浓度的梅毒密螺旋体溶菌产物制备，将它加到此硝酸纤维素滤膜上，使之形成一条线，在滤膜末端大约1cm的位置跨越检测片的宽度。用聚酯薄片衬托在划线区的背面。使此检测片充分干燥，致使TP溶菌产物固定在硝酸纤维素上。
用上面的组成部分装配免疫层析测试条，将它们头尾相连，重叠1mm纵向排列，样品垫片在一端，与其邻接的是缀合物垫片，最后是检测片。然后用聚酯薄片覆盖此装配的测试条，遗留大约10mm样品垫片暴露在外。
以50％的血细胞比容值，在阴性的人全血中或阴性的人血浆中1∶10.8稀释抗-TP阳性的人血清。再次用全血或血浆作稀释剂，进一步作4次1∶2系列稀释。将60μl阴性的全血或血浆，或者来自抗-TP阳性全血或血浆系列稀释液的样品加到此免疫层析测试条的样品垫片中。施加样品之后15分钟观测结果(表7)。阳性结果在检测片上显示出红色，在此，红色的硒标TP缀合物-抗-TP复合物结合于检测片划线区上的TP溶菌产物。阴性结果在检测片的此区域不显示出颜色。
表7显示，在全血和血浆中，对抗-TP的检测灵敏度相同，表明聚阳离子Merquat_-100有效地聚集了全血中的rbc′s。
                          表7
抗-TP样品的稀释度 全血 血浆
1∶10.8 + +
1∶21.6 + +
1∶43.2 + +
1∶86.4 + +
1∶172.8 - -
阴性对照 - -
特将在此所引证的所有出版物，专利和专利申请引入作为参考，如同每篇单独的文献各自特定地被指明引入作为参考，并且各文献全文引用。
尽管已经侧重于优选的实施方案对本发明进行了描述，但是显然，对于本领域的普通技术人员来说，这些优选的实施方案都是可改变的。有可能通过与在此特定描述的不同方式实践本发明。因此，本发明包括如在详述和所附权利要求书中所陈述的，包含在本发明精髓和范围内的所有改进形式。

Claims (18)

1．一种用于检测血液样品中是否存在某种待分析物的层析测定装置，它包括：
一种能够支持毛细管流的可限定液流路径的层析载体，
一个与层析载体保持液流接触的血液样品加样部位，
一在层析载体上与加样部位分隔开的检测部位，
一种位于加样部位下游的可扩散结合的被标记物，
一种在检测部位上游，用于从血液样品中分离血浆或血清的可扩散结合的红细胞分离剂，以及
一种在此结合分离剂下游，在检测部位上游的可扩散结合的中和剂。
2．权利要求1的层析测定装置，其中该装置是一种免疫测定装置。
3．权利要求1的层析测定装置，其中是将红细胞分离剂结合在用于施加血液样品的部位。
4．权利要求1的层析装置，其中的红细胞分离剂是一种带正电荷的物质。
5．权利要求4的层析测定装置，其中的带正电荷物质是选自如下的聚阳离子：聚-L-赖氨酸氢溴化物，聚-L-精氨酸氢氯化物，聚-L-组氨酸，聚(赖氨酸，丙氨酸)3∶1氢溴化物，聚(赖氨酸，丙氨酸)2∶1氢溴化物，聚(赖氨酸，丙氨酸)1∶1氢溴化物，聚(赖氨酸，色氨酸)1∶4氢溴化物，以及聚(二烯丙基二甲基铵氯化物)。
6．权利要求4的层析测定装置，其中的带正电荷物质是聚(二烯丙基二甲基铵氯化物)。
7．权利要求1的层析测定装置，其中的中和剂是带负电荷的物质。
8．权利要求7的层析测定装置，其中的带负电荷物质是选自如下的聚阴离子：硫酸葡聚糖，聚(丙烯酸)，聚(钠-4-苯乙烯磺酸盐)，聚(乙烯基磺酸)，聚(甲基异丁烯酸)，聚-L-天冬氨酸，以及羧甲基纤维素。
9．权利要求7的层析测定装置，其中的带负电荷物质是硫酸葡聚糖。
10．权利要求1的层析测定装置，其中是将所述的中和剂，在与被标记物相同的位置可扩散地结合于层析载体。
11．权利要求1的层析测定装置，其中的被标记物是硒标记的物质。
12．一种用于检测血液样品中是否存在待分析物的方法，包括如下步骤：
提供一种能够支持毛细管流，可限定液流路径的层析载体，沿着此载体有(a)一个与层析载体保持液流接触的血液样品加样部位，(b)一个在层析载体上与加样部位分隔开的检测部位，(c)一种位于加样部位下游的被标记物，(d)一种在检测部位上游用于从血液样品中分离血浆或血清的可扩散结合的红细胞分离剂，以及(e)一种位于此结合分离剂下游和检测部位上游的可扩散结合的中和剂；
使加样部位与血液样品接触；以及
检测此血液样品中是否存在待分析物。
13．权利要求12的方法，其中的被标记物包括硒标记的物质。
14．权利要求12的方法，其中是将中和剂在与被标记物相同的位置可扩散地结合于层析载体。
15．权利要求12的方法，其中的红细胞分离剂是带正电荷的物质。
16．权利要求15的方法，其中带正电荷的物质是选自如下的聚阳离子：聚-L-赖氨酸氢溴化物，聚-L-精氨酸氢氯化物，聚-L-组氨酸，聚(赖氨酸，丙氨酸)3∶1氢溴化物，聚(赖氨酸，丙氨酸)2∶1氢溴化物，聚(赖氨酸，丙氨酸)1∶1氢溴化物，聚(赖氨酸，色氨酸)1∶4氢溴化物，以及聚(二烯丙基二甲基铵氯化物)。
17．权利要求12的方法，其中的中和剂是带负电荷的物质。
18．权利要求17的方法，其中的带负电荷物质是选自如下的聚阴离子：硫酸葡聚糖，聚(丙烯酸)，聚(钠-4-苯乙烯磺酸盐)，聚(乙烯基磺酸)，聚(甲基异丁烯酸)，聚-L-天冬氨酸，以及羧甲基纤维素。
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