CN113125713A - 检测多种待测物的检验套组 - Google Patents
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Abstract
本公开内容提供同时检测多种待测物的检验套组，其中检验套组包括裂解溶液以及试片。裂解溶液包含盐类、界面活性剂、稳定剂、以及缓冲溶液。试片包含样品垫、结合垫、纤维膜、以及吸水垫依序搭接于支撑板上。结合垫包含结合垫溶液及多个抗体耦合微球，抗体耦合微球辨识多种待测物。抗体耦合微球的制备方法包含使1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与微球进行活化反应，活化反应时间介于16至24小时之间。本公开内容的检验套组通过调配适当成分的裂解溶液、改良试片中所含溶液的配方，取得在结合垫上有限的抗体容纳量中，可同时检测到四种以上的待测物的效果。
Description
技术领域
本公开内容是有关于检验套组及其方法，且特别是有关于可同时检测多种待测物的检验套组及其方法。
背景技术
临床上，许多疾病虽源自于不同的病原菌或病毒，然而，却具有相似的临床症状(例如由呼吸道病毒所引发的呼吸道疾病)，造成医师用药误判的高风险。虽然医疗院所已逐步导入在治疗前，使用检验套组(例如免疫层析套组)进行病原快筛的程序，以对症下药，提升治疗效果。然而，由于现行多数的检验套组在一份检体中，仅能针对单一待测物做筛检。若欲同时测多种待测物，也常因为要重复采集检体，而造成病人不适，影响病人接受检测的意愿。因此，往往多数医疗院只能进行单一待测物的快筛，却无法进一步得知是否仍有其他病原菌或病毒潜藏于体内，而影响治疗的有效性。
免疫层析套组是近年来兴起的一种快速诊断技术，具有精确、快速和操作简单等特点。其原理是将检体进行裂解溶液前处理，以提升待测物或其特异性抗原的可结合性。试片依序具有吸收区、辨识区、以及呈色区。检测的概念如下，试片中的吸收区可吸收检体中的待测物或其特异性抗原，而被吸收的待测物或其特异性抗原会随着毛细作用逐步于试片中移动。接着，待测物或其特异性抗原将于辨识区与带有特异性抗体的呈色分子(例如具呈色基团的微球)结合。而后，当待测物或其特异性抗原移动至呈色区时，另一种固定在呈色区上的特异性抗体可辨识待测物或其特异性抗原，进而于呈色区呈现颜色条带，藉此，可分辨检体中是否具有待测物。
然而，由于免疫层析套组中的试片，其最高承载液体量具有上限，因此，若欲在同一试片上同时检测多种待测物，而需配置多种特异性抗体时，必然将导致每一种特异性抗体低于测定单种待测物所使用单一抗体的浓度。当待测物越多种时，则试片中各种抗体浓度的可承载上限会越低，造成讯号更为微弱，难以判读。
因此，需要改良现行的检验套组及方法，提出可同时检测多种待测物的检验套组及其方法。
发明内容
本公开内容中的一些实施方式中，提供一种裂解溶液，裂解溶液用于快筛检验前处理，裂解溶液的重量百分比以100％计，裂解溶液包含盐类、界面活性剂、稳定剂以及缓冲溶液。盐类的重量百分比介于约0.5％至5％之间。界面活性剂的重量百分比介于约0.5％至约5％之间。稳定剂的重量百分比介于约0.5％至约5％之间。
在一些实施方式中，盐类的重量百分比介于约1％至2％之间，界面活性剂的重量百分比介于约1％至约3％之间，以及稳定剂的重量百分比介于约1％至约3％。
在一些实施方式中，裂解溶液分离呼吸道病毒的抗原。
在一些实施方式中，呼吸道病毒包括腺病毒(Adenovirus)、甲型流感病毒(Influenza A,Flu A)、乙型流感病毒(Influenza B,Flu B)、丙型流感病毒(Influenza C,Flu C)、呼吸道融合病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)、鼻病毒(Rhinovirus,RhV)、或冠状病毒(Coronavirus,CoV)。
在一些实施方式中，盐类包含氯化钠、氯化钾或前述组合。
在一些实施方式中，界面活性剂包含十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)、聚山梨醇酯(Tween)系列、曲拉通(Triton)系列、壬基酚(Nonylphenol,NP)系列或前述组合。
在一些实施方式中，稳定剂包含血清蛋白、酪蛋白、人工高分子聚合物或前述组合。
在一些实施方式中，缓冲溶液包含磷酸、碳酸、柠檬酸、乙酸、硼酸、三羟甲基氨基甲烷、三羟甲基甲胺基丙磺酸、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸、N-三-(羟甲基)甲基胺基乙酸、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸半钠盐、3-(N-吗啡啉)乙磺酸或前述组合。
在一些实施方式中，裂解溶液包含叠氮化钠(Sodium azide)。
本公开内容中的一些实施方式中，提供抗体耦合微球的制备方法，包含以下步骤：提供微球；提供冲洗液。混合微球与冲洗液，获得第一混合液；混合第一混合液与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide；EDC)，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与第一混合液中的微球进行活化反应，活化反应时间介于16至24小时之间；混合经活化反应后的微球与耦合液，获得第二混合液；以及混合第一抗体与第二混合液，使第一抗体与第二混合液中的微球于室温下进行耦合作用，获得抗体耦合微球。
在一些实施方式中，冲洗液包括2-(N-吗啉代)乙磺酸(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid；MES)。
在一些实施方式中，微球为一乳胶粒子、一金粒子、一化学发光基团、一酵素基团或生物素。
在一些实施方式中，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺在第一混合液中的浓度介于0.1M至0.5M之间。
在一些实施方式中，混合1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与第一混合液步骤，还包含混合1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、第一混合液与N-羟基丁二酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide；NHS)、或是混合1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、第一混合液与磺化N-羟基丁二酰亚胺。
在一些实施方式中，耦合液为缓冲溶液，包含磷酸、碳酸、柠檬酸、乙酸、硼酸、三羟甲基氨基甲烷、三羟甲基甲胺基丙磺酸、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸、N-三-(羟甲基)甲基胺基乙酸、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸半钠盐、3-(N-吗啡啉)乙磺酸或前述组合。
在一些实施方式中，混合第一抗体与第二混合液步骤，第一抗体与第二混合液中的微球的重量比约为1:40至1:120。
本公开内容中的一些实施方式中，提供一种免疫层析检验套组中的样品垫溶液，样品垫溶液的重量百分比以100％计，包含界面活性剂、稳定剂、分散剂以及缓冲溶液。界面活性剂，重量百分比介于约0.5％至5％之间。稳定剂，重量百分比介于约0.05％至约10％之间。分散剂，重量百分比介于约0.5％至约5％之间。
在一些实施方式中，界面活性剂的重量百分比介于约0.5％至3％之间。稳定剂的重量百分比介于约0.1％至约0.5％之间。分散剂的重量百分比介于约0.5％至约1.5％之间。
在一些实施方式中，界面活性剂包含十二烷基硫酸钠、聚山梨醇酯系列、曲拉通系列、壬基酚系列或前述组合。
在一些实施方式中，稳定剂包含血清蛋白、酪蛋白、人工高分子聚合物或前述组合。
在一些实施方式中，分散剂包含聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone；PVP)、聚乙二醇、油酸、聚丙烯酸、羟丙基纤维素或前述组合。
在一些实施方式中，缓冲溶液包含磷酸、碳酸、柠檬酸、乙酸、硼酸、三羟甲基氨基甲烷、三羟甲基甲胺基丙磺酸、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸、N-三-(羟甲基)甲基胺基乙酸、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸半钠盐、3-(N-吗啡啉)乙磺酸或前述组合。
在一些实施方式中，样品垫溶液还包含叠氮化钠。
在本公开内容的一些实施方式中，提供一种同时检测多种待测物的检验套组，包括裂解溶液以及试片。试片包含样品垫、结合垫、纤维膜、以及吸水垫依序搭接于支撑板上。结合垫包含结合垫溶液及多个抗体耦合微球，这些抗体耦合微球辨识多种待测物，这些抗体耦合微球系以前述方法所制备而成。
在一些实施方式中，样品垫包含样品垫溶液。抗体耦合微球的其中一种辨识这些待测物的其中一种，这些抗体耦合微球的任一种表面具有第一抗体，这些抗体耦合微球的任一种通过第一抗体辨识这些待测物的特定一种。当这些抗体耦合微球的其中一群的第一抗体辨识相同的待测物时，这些抗体耦合微球具有相同色彩。当不同群的这些抗体耦合微球的这些第一抗体辨识不同的待测物时，这些抗体耦合微球具有不同色彩。纤维膜包含多个条带，这些条带相互不重叠，这些条带的任一条包含第二抗体，第二抗体辨识待测物，不同条带上的第二抗体辨识不同的待测物。各条带的第二抗体与这些第一抗体中的一种分别辨识相同的待测物抗原的不同位点。
在一些实施方式中，这些待测物为呼吸道病毒，包括腺病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、呼吸道融合病毒、鼻病毒、冠状病毒、或其组合。
在一些实施方式中，裂解溶液用于检验前处理，裂解溶液的重量百分比以100％计，裂解溶液包含盐类、界面活性剂、稳定剂、以及缓冲溶液。盐类，重量百分比介于约0.5％至5％之间。界面活性剂，重量百分比介于约0.5％至约5％之间。稳定剂，重量百分比介于约0.5％至约5％之间。
在一些实施方式中，盐类包含氯化钠、氯化钾或前述组合。
在一些实施方式中，界面活性剂包含十二烷基硫酸钠、聚山梨醇酯系列、曲拉通系列、壬基酚系列或前述组合。
在一些实施方式中，稳定剂包含血清蛋白、酪蛋白、人工高分子聚合物或前述组合。
在一些实施方式中，缓冲溶液包含磷酸、碳酸、柠檬酸、乙酸、硼酸、三羟甲基氨基甲烷、三羟甲基甲胺基丙磺酸、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸、N-三-(羟甲基)甲基胺基乙酸、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸半钠盐、3-(N-吗啡啉)乙磺酸或前述组合。
在一些实施方式中，裂解溶液还包含叠氮化钠。
在一些实施方式中，样品垫溶液的重量百分比以100％计，样品垫溶液包含界面活性剂、稳定剂、分散剂、以及缓冲溶液。界面活性剂，重量百分比介于约0.5％至5％之间。稳定剂，重量百分比介于约0.05％至约10％之间。分散剂，重量百分比介于约0.5％至约5％之间。
在一些实施方式中，界面活性剂包含十二烷基硫酸钠、聚山梨醇酯系列、曲拉通系列、壬基酚系列或前述组合。
在一些实施方式中，稳定剂包含血清蛋白、酪蛋白、人工高分子聚合物或前述组合。
在一些实施方式中，分散剂包含聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、油酸、聚丙烯酸、羟丙基纤维素或前述组合。
在一些实施方式中，缓冲溶液包含磷酸、碳酸、柠檬酸、乙酸、硼酸、三羟甲基氨基甲烷、三羟甲基甲胺基丙磺酸、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸、N-三-(羟甲基)甲基胺基乙酸、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸半钠盐、3-(N-吗啡啉)乙磺酸或前述组合。
在一些实施方式中，样品垫溶液还包含叠氮化钠。
在一些实施方式中，结合垫溶液还包含稳定剂、分散剂、乳化剂以及缓冲溶液。
在一些实施方式中，结合垫溶液的重量百分比以100％计，稳定剂的重量百分比介于约0.05％至2％之间、分散剂的重量百分比介于约0.05％至10％之间、以及乳化剂的重量百分比介于约0.1％至约5％之间。
在一些实施方式中，稳定剂包含血清蛋白、酪蛋白、人工高分子聚合物或前述组合。
在一些实施方式中，分散剂包含聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、油酸、聚丙烯酸、羟丙基纤维素或前述组合。
在一些实施方式中，乳化剂包括非离子型乳化剂，包括聚氧乙烯35蓖麻油(Polyoxyl 35 Castor Oil)、聚氧乙烯40氢化蓖麻油(Polyoxyl 40 HydrogeneratedCastor Oil)、聚山梨酯20(Polysorbate 20)，或其组合。
在一些实施方式中，第一抗体的总浓度不高于600微克/毫升，以及第二抗体的总浓度不高于7.2毫克/毫升。
本公开内容的一些实施方式中，提供一种同时检测多种待测物的方法，包括以下步骤；提供一检体；提供检验套组，检验套组包含试片以及裂解溶液。试片包含样品垫、结合垫、纤维膜、以及吸水垫依序搭接于支撑板上；样品垫包含样品垫溶液。结合垫包含结合垫溶液及多个抗体耦合微球，这些抗体耦合微球辨识多种待测物，这些抗体耦合微球的任一者具有一特定颜色以及第一抗体；纤维膜包含多个条带，这些条带位置相互不重叠，这些条带的任一条包含第二抗体，第二抗体辨识待测物，不同条带上的第二抗体辨识不同的待测物；各条带的第二抗体与这些第一抗体中的一种分别辨识相同的待测物抗原的不同位点；将检体添加至裂解溶液中；将试片以样品垫朝下的方向浸入含有检体的裂解溶液中，且结合垫不会接触到裂解溶液；判读试片的这些条带是否呈色，当这些条带的一条或多条呈色，则检测出相对的一种或多种待测物。
在一些实施方式中，裂解溶液的重量百分比以100％计，裂解溶液包含盐类、界面活性剂、稳定剂、以及缓冲溶液。盐类，重量百分比介于约0.5％至5％之间。界面活性剂，重量百分比介于约0.5％至约5％之间。稳定剂，重量百分比介于约0.5％至约5％之间。
在一些实施方式中，盐类包含氯化钠、氯化钾或前述组合，界面活性剂包含壬基酚系列，稳定剂包含血清蛋白，该缓冲溶液包含磷酸缓冲溶液。
在一些实施方式中，裂解溶液还包含叠氮化钠。
在一些实施方式中，抗体耦合微球系由以下步骤制备而成：提供微球；提供冲洗液；混合微球与冲洗液，获得第一混合液；混合1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与第一混合液；1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与第一混合液中的微球进行活化反应，活化反应时间介于16至24小时之间；混合经活化反应后的微球与耦合液，获得第二混合液；混合第一抗体与第二混合液，使第一抗体与第二混合液中的微球于室温下进行耦合作用，获得抗体耦合微球。
在一些实施方式中，冲洗液包括2-(N-吗啉代)乙磺酸。
在一些实施方式中，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺在第一混合液中的浓度介于0.1M至0.5M之间。
在一些实施方式中，混合1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与第一混合液步骤，还包含混合1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、第一混合液与N-羟基丁二酰亚胺、或是混合1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、第一混合液与磺化N-羟基丁二酰亚胺。
在一些实施方式中，耦合液为磷酸缓冲溶液。
在一些实施方式中，当这些抗体耦合微球的其中一群的这些第一抗体辨识相同的待测物时，这些抗体耦合微球具有相同色彩，其中当不同群的这些抗体耦合微球的第一抗体辨识不同的待测物时，这些抗体耦合微球具有不同色彩。
在一些实施方式中，样品垫溶液的重量百分比以100％计，样品垫溶液包含界面活性剂、稳定剂、分散剂、以及缓冲溶液。界面活性剂的重量百分比介于约0.5％至5％之间。稳定剂的重量百分比介于约0.05％至约10％之间。分散剂的重量百分比介于约0.5％至约5％之间。
在一些实施方式中，界面活性剂包含壬基酚-40(NP-40)，稳定剂包含酪蛋白，分散剂包含聚乙烯吡咯烷酮，缓冲溶液包含三羟甲基氨基甲烷。
在一些实施方式中，样品垫溶液还包含叠氮化钠。
承上所述，本公开内容通过适当成分的裂解溶液的调配，达成可针对多种待测物进行裂解的良好适用性，以及改良微球的制备方法，提升微球耦合抗体的效率，进而达成在试片的结合垫中有限的抗体容纳量下，可同时检测到四种以上的待测物的效果，且各待测物的检测，均具有理想的检测极限。
附图说明
为让本发明的上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式的说明如下：
图1例示本公开内容的一些实施例中的检验套组的示意图。
图2例示本公开内容的一些实施例中的裂解试剂组的示意图。
图3例示本公开内容的一些实施例中的试片的示意图。
图4例示本公开内容的一些实施例中的检验结果的示意图。
图5例示本公开内容的一些实施例中的同时检测多种待测物的流程图。
其中，附图标记说明如下：
1…检验套组
2…裂解试剂组
210…裂解溶液
220…收集管
230…取样棒
3…试片
310…样品垫
320…结合垫
330…纤维膜
331…条带
340…吸水垫
350…支撑板
具体实施方式
为了使本发明的叙述更加详尽与完备，下文详细描述本发明的实施方式与具体实施例；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。以下所公开的各实施例，在有益的情形下可相互组合或取代，也可在一实施例中附加其他的实施例，而无须进一步的记载或说明。在以下描述中，将详细叙述许多特定细节以使读者能够充分理解以下的实施例。然而，可在无此等特定细节的情况下实践本发明的实施例。
于本文中，除非内文中对于冠词有所特别限定，否则『一』与『该』可泛指单一个或多个。将进一步理解的是，于本文中所使用的「包含」、「包括」、「具有」及相似词汇，指明其所记载的特征、区域、整数、步骤、操作、元件与/或组件，但不排除其它的特征、区域、整数、步骤、操作、元件、组件，与/或其中的群组。
虽然下文中利用一系列的操作或步骤来说明在此揭露的方法，但是这些操作或步骤所示的顺序不应被解释为本发明的限制。例如，某些操作或步骤可以按不同顺序进行及/或与其它步骤同时进行。此外，并非必须执行所有操作、步骤及/或特征才能实现本发明的实施方式。再者，在此所述的每一个操作或步骤可以包含数个子步骤或动作。
请见图1以及图2，本公开内容的一些实施方式中提供同时检测多种待测物的检验套组1，包括裂解试剂组2以及试片3。裂解试剂组2至少包含裂解溶液210，裂解溶液210用于检体的快筛检验前处理，提升试片3对于检体中的待测物的检测灵敏度以及检体的流动性。试片3则是根据免疫层析法的原理，检测经裂解溶液210处理过后的检体，是否含有待测物抗原，以判断待测物是否存在于检体中。
一般而言，若欲在同一试片上同时检测多种待测物，受限于试片上的抗体最大可容纳量，因此相较于只检测一种待测物的传统试片而言，会有呈色较弱，甚至无法检测的问题。本公开内容通过裂解溶液210以及试片3浸泡溶液的改良，提升检验套组1对于待测物抗原的检测灵敏性，进而可同时检测多种待测物(例如2种、3种、4种或更多)。检验套组1藉由试片可呈色的特征，有助于临床上的即时结果判读，而可同时检测多种待测物，更可缩短检测的时间、以及人力与物力成本。
在一实施方式中，检体来源自呼吸道，例如口腔、鼻腔、气管或支气管。在一实施例中，检体可以是口水、口腔黏膜、鼻涕、鼻黏膜、气管分泌物、或/及支气管分泌物。
在一实施方式中，待测物包含呼吸道病毒，例如腺病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、呼吸道融合病毒、鼻病毒、或冠状病毒。
在本公开内容的一些实施方式中，提供一种裂解溶液210包含盐类、界面活性剂、稳定剂以及缓冲溶液。在一实施方式中，裂解溶液210可适用于分离多种呼吸道病毒的抗原。
在一实施方式中，盐类可使裂解溶液210呈高张状态，有助于破坏检体黏液中的离子键，降低检体的黏稠度。由于检体于试片3的移动是通过毛细作用，因此，降低检体的黏稠度可提升检体于试片3移动的顺畅性，如果浓度过高，会使试片3的辨识结果呈现伪阳性。在一些实施例中，盐类包含碱金属卤化物(例如氯化钾)、碱土金属卤化物(例如氯化钠)或前述组合。在一些实施例中，裂解溶液210的重量百分比以100％计，盐类的重量百分比介于约0.5％至5％之间，例如0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％或是以上任意间距中的任意数值。在一实施例中，盐类的重量百分比介于约1％至2％之间。
在一实施方式中，界面活性剂可用于破坏待测物的表面的膜状结构(例如病毒的膜蛋白)，以增进待测物抗原的暴露程度，提升抗原的可检测性。在一些实施例中，界面活性剂包含十二烷基硫酸钠、聚山梨醇酯系列、曲拉通系列、壬基酚系列或前述组合。在一些实施例中，裂解溶液210的重量百分比以100％计，界面活性剂的重量百分比介于约0.5％至约5％之间，例如0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％或是以上任意间距中的任意数值。在一实施例中，界面活性剂的重量百分比介于约1％至3％之间。
在一实施方式中，稳定剂可用于防止蛋白质的分解以及抗体的对于待测物的非专一性辨识，如果浓度过高，会使试片3的辨识结果呈现伪阳性。在一些实施例中，稳定剂包含血清蛋白、酪蛋白、人工高分子聚合物或前述组合。在一些实施例中，裂解溶液210的重量百分比以100％计，稳定剂的重量百分比介于约0.5％至约5％之间，例如0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％或是以上任意间距中的任意数值。在一实施例中，稳定剂的重量百分比介于约1％至3％之间。
在一实施方式中，缓冲溶液包含磷酸、碳酸、柠檬酸、乙酸、硼酸、三羟甲基氨基甲烷、三羟甲基甲胺基丙磺酸、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸、N-三-(羟甲基)甲基胺基乙酸、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸半钠盐、3-(N-吗啡啉)乙磺酸或前述组合。
在一实施方式中，裂解溶液210可包含叠氮化钠。
在一实施方式中，裂解试剂组2还可选择性包含收集管220、取样棒230或同时包含前述两者。取样棒230用于搜集检体，例如鼻腔或口腔黏膜。收集管220可用于保存裂解溶液210以及作为检体前处理的反应区域。
接着，请见图3，试片3包含样品垫310、结合垫320、纤维膜330、以及吸水垫340依序搭接于支撑板350上。
在一实施方式中，样品垫310包含样品垫溶液，包含界面活性剂、稳定剂、分散剂以及缓冲溶液。
在一实施方式中，界面活性剂可用于破坏待测物的表面的膜状结构，以增进待测物抗原的暴露程度，提升抗原的可检测性。在一些实施方式中，样品垫溶液的界面活性剂包含十二烷基硫酸钠、聚山梨醇酯系列、曲拉通系列、壬基酚系列或前述组合。在一些实施方式中，样品垫溶液的重量百分比以100％计，界面活性剂的重量百分比介于约0.5％至约5％之间，例如0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％或是以上任意间距中的任意数值。在一实施例中，界面活性剂的重量百分比介于约0.5％至3％之间。
在一实施方式中，稳定剂可用于防止蛋白质的分解以及抗体的对于待测物的非专一性辨识。在一些实施例中，样品垫溶液的稳定剂包含血清蛋白(例如牛血清蛋白)、酪蛋白(例如源自于牛乳)、胺基酸(例如甘胺酸)、人工高分子聚合物或前述组合。在一些实施例中，样品垫溶液的重量百分比以100％计，稳定剂的重量百分比介于约0.05％至约10％之间，例如0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或是以上任意间距中的任意数值。值得一提的是，稳定剂的重量百分比浓度介于0.1至0.5％之间及/或稳定剂采用酪蛋白时，样品垫溶液可具有较佳的流动性。
在一实施方式中，分散剂可避免溶液产生沉降或凝集的情形，以提升储存的稳定性并维持保存浓度。在一些实施例中，样品垫溶液的分散剂包含聚乙烯吡咯烷酮(例如聚乙烯吡咯烷酮-10)、聚乙二醇、油酸、聚丙烯酸、羟丙基纤维素或前述组合。在一些实施例中，样品垫溶液的重量百分比以100％计，分散剂的重量百分比介于约0.5％至约5％之间，例如0.5％、1％、2％、3％、4％、5％或是以上任意间距中的任意数值。在一实施例中，分散剂的重量百分比介于约0.5％至1.5％之间。
在一实施方式中，缓冲溶液包含磷酸、碳酸、柠檬酸、乙酸、硼酸、三羟甲基氨基甲烷、三羟甲基甲胺基丙磺酸、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸、N-三-(羟甲基)甲基胺基乙酸、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸半钠盐、3-(N-吗啡啉)乙磺酸或前述组合。
在一实施方式中，样品垫溶液包含叠氮化钠。
在一实施方式中，结合垫320包含结合垫溶液及多个抗体耦合微球，这些抗体耦合微球辨识多种待测物。在一实施方式中，抗体耦合微球中的任一者的表面具有第一抗体，而抗体耦合微球可依其表面的第一抗体所辨识的抗原种类分为不同群。因此，特定群的抗体耦合微球可辨识多种待测物中的特定一种。在一实施方式中，第一抗体检测病毒抗原，例如呼吸道病毒，举例而言包括腺病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、呼吸道融合病毒、鼻病毒、或冠状病毒。
在一实施方式中，微球本身可直接带有颜色(例如带有颜色的乳胶粒子或金粒子)、可为呈色基团(例如化学发光基团)、或是在添加适当反应液后呈色，例如含有酵素基团(如辣根过氧化物酶)，此外，亦可选择性包含其他功能基团，例如生物素或链亲和素。
在一实施方式中，请见图3以及图4，纤维膜330的材料可使用硝酸纤维素。纤维膜330包含多个条带331，条带331位置相互不重叠，而条带331中的任一条包含一种第二抗体，第二抗体可辨识待测物。在一实施方式中，各条带331的第二抗体与特定的第一抗体分别辨识相同的待测物抗原的不同位点，因此，不同条带331上的第二抗体可辨识不同的待测物。也就是，当检体中存在多种待测物时，不同群的抗体耦合微球会分别辨识特定待测物。接着，待测物在分别与纤维膜330上的条带331结合后，通过抗体耦合微球所带有的颜色，呈色于纤维膜330。检测者可根据条带331的呈色位置，分辨特定待测物的有无。
在一实施方式中，第一抗体的总浓度不高于600微克/毫升，例如100、200、300、400、500、600微克/毫升、或是以上任意间距中的任意数值，以及第二抗体的总浓度不高于7.2毫克/毫升，例如1、2、3、4、5、6、6.5、7.2毫克/毫升、或是以上任意间距中的任意数值。
在一实施方式中，请同样见图3以及图4，当这些抗体耦合微球的其中一群上的第一抗体可辨识相同的待测物，则同时具有相同色彩。在一实施方式中，当不同群的抗体耦合微球的第一抗体辨识不同的该待测物时，不同群的抗体耦合微球之间具有不同色彩。据此，检测者根据颜色，即可分辨检体中所包含的待测物种类。在一些实施例中，当检体中存在呼吸道融合病毒(RSV)、乙型流感病毒(Flu B)、甲型流感病毒(Flu A)、腺病毒(Adeno)或以上任意病毒组合时，试片3带有可辨识此四种病毒的抗体耦合微球。例如，图4纤维膜330中由上而下依序分别为控制线、RSV、Flu B、Flu A以及Adeno的呈色条带，可依需求调整条带331顺序而不限于以上例示。据此，不同条带331可反映特定病毒的有无。此外，为简化判读，不同条带331以不同颜色呈现。
在一些实施方式中，抗体耦合微球的制备方法包含以下步骤：提供微球，提供冲洗液；混合微球与冲洗液，获得第一混合液；混合第一混合液与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与第一混合液中的微球进行活化反应；混合经活化反应后的微球与耦合液，获得第二混合液；以及混合第一抗体与第二混合液，使第一抗体与第二混合液中的微球于室温下进行耦合作用，获得抗体耦合微球。
在一实施方式中，冲洗液包括2-(N-吗啉代)乙磺酸。
在一实施方式中，混合第一混合液与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与第一混合液中的微球进行活化反应步骤，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺在第一混合液中的浓度介于0.1M至0.5M之间，例如0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、或是以上任意间距中的任意数值。
在一实施方式中，活化反应时间介于16至24小时之间，例如16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时，或是以上任意间距中的任意数值。值得注意的是，微球市售品中所指示的活化反应，时间一般介于15分钟至30分钟之间。值得一提的是，通过延长1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与微球的活化反应时间，取得微球第一抗体耦合率提升的效果，有助于提升微球检测待测物的灵敏度，进而取得可以试片3同时呈色，检测多种待测物(例如四种)是否存在于检体的效果。
在一实施方式中，混合1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与该第一混合液步骤，还包含混合1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、第一混合液与N-羟基丁二酰亚胺、或是混合1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、该第一混合液与磺化N-羟基丁二酰亚胺，亦可视需求，在此步骤中同时与其他有助于活化反应的添加物混合反应。
在一实施方式中，耦合液为缓冲溶液，包含磷酸、碳酸、柠檬酸、乙酸、硼酸、三羟甲基氨基甲烷、三羟甲基甲胺基丙磺酸、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸、N-三-(羟甲基)甲基胺基乙酸、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸半钠盐、3-(N-吗啡啉)乙磺酸或前述组合。
在一实施方式中，混合第一抗体与第二混合液步骤，第一抗体与第二混合液中的微球的重量比约为1:40至1:120，例如1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100、1:110、1:120、或是以上任意间距中的任意比例。在一实施方式中，耦合作用之后，包括添加乙醇胺(Ethanolamine)至含有第一抗体与第二混合液的溶液中，在一实施方式中，添加乙醇胺至含有第一抗体与第二混合液的溶液之后，包含以含有稳定剂(例如酪蛋白)以及缓冲溶液的清洗液，清洗并悬浮微球。
在一实施方式中，结合垫溶液包含稳定剂、分散剂、乳化剂以及缓冲溶液。
在一实施方式中，稳定剂可用于防止蛋白质的分解以及抗体的对于待测物的非专一性辨识。在一些实施例中，结合垫溶液的稳定剂包含血清蛋白(例如牛血清蛋白)、酪蛋白(例如源自于牛乳)、胺基酸(例如甘胺酸)、人工高分子聚合物或前述组合。在一些实施例中，结合垫溶液的重量百分比以100％计，稳定剂的重量百分比介于约0.05％至约2％之间，例如0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、1％、2％或是以上任意间距中的任意数值。值得一提的是，稳定剂的重量百分比浓度介于0.1至0.5％之间及/或稳定剂采用酪蛋白时，结合垫溶液可具有较佳的流动性。
在一实施方式中，分散剂可避免溶液产生沉降或凝集的情形，以提升储存的稳定性并维持保存浓度。在一些实施例中，结合垫溶液的分散剂包含聚乙烯吡咯烷酮(例如聚乙烯吡咯烷酮-10)、聚乙二醇、油酸、聚丙烯酸、羟丙基纤维素或前述组合。在一些实施例中，结合垫溶液的重量百分比以100％计，分散剂的重量百分比介于约0.05％至约10％之间，例如0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或是以上任意间距中的任意数值。
在一实施方式中，乳化剂用于稳定存在于结合垫320上的微球，乳化剂可使用非离子型乳化剂，包括聚氧乙烯35蓖麻油、聚氧乙烯40氢化蓖麻油、聚山梨酯20，或其组合。在一些实施例中，结合垫溶液的重量百分比以100％计，乳化剂的重量百分比介于约0.1％至约5％之间，例如0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％或是以上任意间距中的任意数值。
值得注意的是，裂解溶液210、样品垫溶液以及结合垫溶液之间的成分，可选择性包含相同或近似的成分，如此，有助于提升检体于试片3流动的顺畅度。
请同时参阅图2-图5，在本公开内容的一些实施方式中，还提供同时检测多种待测物的方法，包括以下步骤：提供检体；提供检验套组1，检验套组1包含试片3以及裂解溶液210，试片3包含样品垫310、结合垫320、纤维膜330、以及吸水垫340依序搭接于支撑板350上；将检体添加至裂解溶液210中；将试片3以样品垫310朝下的方向浸入含有检体的裂解溶液210中，且结合垫320不会接触到裂解溶液210，以避免影响结合垫320溶液中的微球与待测物结合的灵敏度；接着，判读试片3上的条带331是否呈色，当其中一条或多条条带331呈色，则表示检体包含呈色的条带331所对应的特定待测物。
在一实施方式中，将检体添加至裂解溶液210步骤，检体于裂解溶液210的作用时间介于约0.5分钟至5分钟之间，例如0.5分钟、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟或是以上任意间距中的任意数值。
在一实施方式中，其中将试片3以样品垫310朝下的方向浸入含有检体的裂解溶液210步骤的持续时间介于约5分钟至15分钟之间，例如5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟或是以上任意间距中的任意数值。
为进一步试验本公开内容的各种实施方式所提供的检验套组1以及同时检测多种待测物的方法，遂进行以下实施。应注意的是，下述实施例仅提供作为示范目的，而非限制本发明。
实施例一、检验套组的制备及其组成
首先，为取得可在同一检体中，同时检测多种待测物的检验套组，在本实施例中，以四种呼吸道病毒(腺病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、以及呼吸道融合病毒)作为待测物，针对检验套组中的裂解溶液以及试片中的溶液进行改良。
以往的裂解溶液，裂解不同病毒便需要使用不同的配方，因此，若需裂解四种病毒，便需要四种不论是成分或是成分含量均具有差异的裂解溶液，对于制备的人力或是时间均造成一定程度的损耗。本实施例的裂解溶液(请见表1)，利用一种配方，即可同时有效裂解病毒，使四种病毒释出病毒抗原。在本实施例中，裂解溶液的溶剂为水。此外，更兼顾样品垫溶液与结合垫溶液的相容性，增进裂解溶液于试片中的流动顺畅度。
试片中的样品垫，经样品垫溶液浸泡处理，再干燥而得，其中，样品垫可为玻璃纤维垫片，样品垫溶液所包含的组成如表2所示，溶剂为水。
试片中的结合垫可为聚酯纤维垫片，其所包含的结合垫溶液组成如表3所示，结合垫溶液的溶剂为水。结合垫制备过程如下，首先结合垫以结合垫溶液浸泡处理后风干，再喷涂乳胶液(Latex Solution)至结合垫上，待其干燥而得。乳胶液喷涂的量可为每平方公分结合垫上喷涂2至4微升(μl)的乳胶液。结合垫溶液中的分散剂可促进乳胶液中的粒子分离避免产生沉淀或凝集的情形，以提升储存稳定性并可增加试片呈色效果。
表1、裂解溶液的成分
表2、样品垫溶液的组成
表3、结合垫溶液的组成
乳胶液包含可分别辨识四种病毒的四种抗体耦合微球，每一种抗体耦合微球的制备，包含以下步骤。首先，混合带有颜色的乳胶微球(购自Thermo Fisher，商品型号DR1040HA、DR1040CA、DB1040HA、DB1040CA、以及DBK1040CA)与冲洗液(20mM MES buffer,pH6.5)，混合液经过超声波震荡，并经冲洗液清洗后，重新悬浮定量，取得含有8.5毫克/毫升的乳胶微球的第一混合液。
接着，添加磺化N-羟基丁二酰亚胺至1毫升的第一混合液中，调整磺化N-羟基丁二酰亚胺的浓度至0.4M后，震荡处理含有磺化N-羟基丁二酰亚胺的第一混合液。接着再添加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺至含有磺化N-羟基丁二酰亚胺的第一混合液中，使1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺于第一混合液中的浓度为0.2M。含有1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺以及磺化N-羟基丁二酰亚胺的第一混合液经震荡处理后，于室温下旋转，使第一混合液均匀混合，活化乳胶微球上官能基，时间持续16至24小时。
接着，混合经活化反应后的乳胶微球与耦合液(50mM PB buffer,pH 7.5、Na2HPO4·2H2O:7.223克/公升、NaH2PO4·H2O:1.29807克/公升)，并以耦合液多次清洗乳胶微球后，重新悬浮乳胶微球于耦合液中，使得乳胶微球的浓度介于7.5毫克/毫升至9毫克/毫升之间，获得第二混合液。
接着，添加第一抗体至第二混合液中，使得第一抗体于第二混合液中的浓度(w/v)分别为腺病毒：150微克/毫升，甲型流感病毒：150微克/毫升，乙型流感病毒：100微克/毫升，呼吸道融合病毒：100微克/毫升，室温下旋转作用2小时后，添加乙醇胺(作用浓度为1M)，于室温下作用30分钟，以停止抗体与乳胶微球的结合作用。
最后，以含有稳定剂的缓冲液清洗抗体耦合微球后，再以400微升的缓冲液重新悬浮微球，获得乳胶液。
实施例二、使用检验套组同时检测四种呼吸道病毒
为进一步测试实施例一的检验套组的检测效果，因此，在同一呼吸道检体中，测定检验套组对于四种呼吸道病毒的检测极限，并与四种市售套组(一种套组个别检测一种呼吸道病毒)的检测极限做比较，病毒的检测极限表示为50％的培养细胞发生病变的病毒数量(Tissue Culture Infection Dose 50；TCID50)，结果如表4所示。
表4、实施例一检验套组与市售套组检测极限的比较
结果显示，本公开内容的实施例所提供的检验套组，只须检测一次检体，即可取得以往须经四种市售套组分别检测的结果，且各病毒的检测极限均与市售套组相当。
本公开内容通过调配适当成分的裂解溶液，达成可裂解多种待测物的良好应用性；此外，并改良试片中所含溶液的配方，特别是微球的制备方法，提升微球耦合抗体的效率，取得在结合垫上有限的抗体容纳量中，可同时检测到四种以上的待测物的效果。
本公开内容的检验套组，可检测多种待测物，所达成的益处如下：
1.减少操作步骤及时间：若使用市售套组，则采集和检测步骤需要重复四次，且需要分别标记取样管以及试片，若检体数量多时，将提升取样管和检测卡对应错误的风险，增加人力以及物力的浪费。然而，若通过本公开内容的检验试剂，则检测者仅需执行一次步骤，且可节省标记与操作的时间。
2.降低失误机率：由于使用多种市售套组，需重复多次步骤，提升操作失误或检体污染的机率，但本公开内容的检验套组仅执行一组步骤即可得到结果，可减少失误，提高准确性。
虽然本发明已以实施方式揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何本领域普通技术人员在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视随附的权利要求所界定者为准。
Claims (22)
1.一种同时检测多种待测物的检验套组，其特征在于，包括一裂解溶液以及一试片，其中该试片包含一样品垫、一结合垫、一纤维膜、以及一吸水垫依序搭接于一支撑板上，
其中该结合垫包含多个抗体耦合微球，所述多个抗体耦合微球辨识多种待测物。
2.如权利要求1所述的检验套组，其特征在于，所述多个抗体耦合微球的制备方法包含以下步骤：
提供一微球；
提供一冲洗液；
混合该微球与该冲洗液，获得一第一混合液；
混合该第一混合液与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺；其中该1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺与该第一混合液中的该微球进行一活化反应，该活化反应时间介于16至24小时之间；
混合经活化反应后的该微球与一耦合液，获得一第二混合液；以及
混合一第一抗体与该第二混合液，使该第一抗体与该第二混合液中的该微球于室温下进行一耦合作用，获得该抗体耦合微球。
3.如权利要求1所述的检验套组，其特征在于，
所述多个抗体耦合微球的其中一者辨识所述多个待测物的其中一者，所述多个抗体耦合微球的任一者表面具有一第一抗体，所述多个抗体耦合微球的任一者通过该第一抗体辨识所述多个待测物的特定一者，
其中当所述多个抗体耦合微球的其中一群的所述多个第一抗体辨识相同的该待测物时，所述多个抗体耦合微球具有相同色彩，其中当不同群的所述多个抗体耦合微球的所述多个第一抗体辨识不同的该待测物时，所述多个抗体耦合微球具有不同色彩；
该纤维膜包含多个条带，所述多个条带的任一者包含一第二抗体，该第二抗体辨识该待测物，不同条带上的该第二抗体辨识不同的该待测物，其中各该条带的该第二抗体与所述多个第一抗体中的一者分别辨识相同的该待测物。
4.如权利要求1所述的检验套组，其特征在于，所述多个待测物为呼吸道病毒，包括腺病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、呼吸道融合病毒、鼻病毒、冠状病毒、或其组合。
5.如权利要求1或3所述的检验套组，其特征在于，该裂解溶液用于检验前处理，该裂解溶液的重量百分比以100％计，该裂解溶液包含：
一盐类，重量百分比介于约0.5％至5％之间；
一界面活性剂，重量百分比介于约0.5％至约5％之间；
一稳定剂，重量百分比介于约0.5％至约5％之间；以及
一缓冲溶液。
6.如权利要求5所述的检验套组，其特征在于，该盐类包含氯化钠、氯化钾或前述组合。
7.如权利要求5所述的检验套组，其特征在于，该界面活性剂包含十二烷基硫酸钠、聚山梨醇酯系列、曲拉通系列、壬基酚系列或前述组合。
8.如权利要求5所述的检验套组，其特征在于，该稳定剂包含血清蛋白、酪蛋白、人工高分子聚合物或前述组合。
9.如权利要求5所述的检验套组，其特征在于，该缓冲溶液包含磷酸、碳酸、柠檬酸、乙酸、硼酸、三羟甲基氨基甲烷、三羟甲基甲胺基丙磺酸、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸、N-三-(羟甲基)甲基胺基乙酸、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸半钠盐、3-(N-吗啡啉)乙磺酸或前述组合。
10.如权利要求5所述的检验套组，其特征在于，该裂解溶液还包含叠氮化钠。
11.如权利要求1或3所述的检验套组，其特征在于，该样品垫包含一样品垫溶液，该样品垫溶液的重量百分比以100％计，该样品垫溶液包含：
一界面活性剂，重量百分比介于约0.5％至5％之间；
一稳定剂，重量百分比介于约0.05％至约10％之间；
一分散剂，重量百分比介于约0.5％至约5％之间；以及
一缓冲溶液。
12.如权利要求11所述的检验套组，其特征在于，该界面活性剂包含十二烷基硫酸钠、聚山梨醇酯系列、曲拉通系列、壬基酚系列或前述组合。
13.如权利要求11所述的检验套组，其特征在于，该稳定剂包含血清蛋白、酪蛋白、人工高分子聚合物或前述组合。
14.如权利要求11所述的检验套组，其特征在于，该分散剂包含聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、油酸、聚丙烯酸、羟丙基纤维素或前述组合。
15.如权利要求11所述的检验套组，其特征在于，该缓冲溶液包含磷酸、碳酸、柠檬酸、乙酸、硼酸、三羟甲基氨基甲烷、三羟甲基甲胺基丙磺酸、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸、N-三-(羟甲基)甲基胺基乙酸、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸半钠盐、3-(N-吗啡啉)乙磺酸或前述组合。
16.如权利要求11所述的检验套组，其特征在于，该样品垫溶液还包含叠氮化钠。
17.如权利要求1或3所述的检验套组，其特征在于，该结合垫还包含一结合垫溶液，该结合垫溶液包含一稳定剂、一分散剂、一乳化剂以及一缓冲溶液。
18.如权利要求17所述的检验套组，其特征在于，该结合垫溶液的重量百分比以100％计，
该稳定剂的重量百分比介于约0.05％至2％之间、
该分散剂的重量百分比介于约0.05％至10％之间、以及该乳化剂的重量百分比介于约0.1％至约5％之间。
19.如权利要求17所述的检验套组，其特征在于，该稳定剂包含血清蛋白、酪蛋白、人工高分子聚合物或前述组合。
20.如权利要求17所述的检验套组，其特征在于，该分散剂包含聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、油酸、聚丙烯酸、羟丙基纤维素或前述组合。
21.如权利要求17所述的检验套组，其特征在于，该乳化剂包括非离子型乳化剂，包括聚氧乙烯35蓖麻油、聚氧乙烯40氢化蓖麻油、聚山梨酯20，或其组合。
22.如权利要求3所述的检验套组，其特征在于，该第一抗体的总浓度不高于600微克/毫升，以及该第二抗体的总浓度不高于7.2毫克/毫升。
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