CN104698185B - 检测梅毒螺旋体抗体的试剂盒及其检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测梅毒螺旋体抗体的试剂盒及其检测方法和应用，属于体外诊断检测技术领域。该试剂盒包括以下组分：1)标记物体系：包括直接连接或间接连接标记示踪物的梅毒螺旋体重组抗原1，或包括直接连接或间接连接标记示踪物的金黄葡萄球菌A蛋白；2)桥连物体系：包括直接连接或间接连接第一桥连物的梅毒螺旋体重组抗原2；3)磁性微球体系：包括直接连接或间接连接第二桥连物的磁性微球；所述第一桥连物可与第二桥连物结合。本发明的试剂盒和检测方法，能够促进抗原‑抗体结合反应充分进行，提高了检测灵敏度。

Description

检测梅毒螺旋体抗体的试剂盒及其检测方法和应用

技术领域

本发明涉及体外诊断检测技术领域，特别是涉及一种检测梅毒螺旋体抗体的试剂盒及其检测方法和应用。

背景技术

梅毒(Syphilis)是由苍白(梅毒)螺旋体(Treponema pallidum)引起的慢性、系统性性传播疾病。亦称苍白螺旋体(Treponemia pallidum,TP)，1905年由法国科学家Schaudinn与Hoffmanu发现并报告的。在分类学上属螺旋体体目(Spirochaetales)，密螺旋体科(Treponemataceae)，密螺旋体属(Genus Treponema)。菌体细长，带均匀排列的6～12个螺旋，长5～20μm,平均长6～10μm，横径0.15μm上下，运动较缓慢而有规律，实验室常用染料不易着色，可用暗视野显微镜或相差显微镜观察菌体。主要通过性途径传播，临床上可表现为一期梅毒、二期梅毒、三期梅毒、潜伏梅毒和先天梅毒(胎传梅毒)等。梅毒是人类独有的疾病，显性和隐性梅毒患者是传染源，感染梅毒的人的皮损及其分泌物、血液中含有梅毒螺旋体。感染后的头2年最具传染性，而在4年后性传播的传染性大为下降。

梅毒侵入人体后经过2-3周潜伏期，即发生皮肤损害(典型损害为硬下疳)这是一期梅毒。发生皮肤损害后机体产生抗体，从兔实验性梅毒的研究证明，梅毒初期的组织学特征是单核细胞侵润在感染的第6天，即有淋巴细胞浸润，此时梅毒螺旋体见于硬下疳中的上皮细胞间隙中，以及位于上皮细胞的内陷或吞噬体内，或成纤维细胞浆细胞、小的毛细血管内皮细胞之间及淋巴管和局部淋巴结中。由于免疫的作用使梅毒螺旋体迅速地从病灶中消除，在感染的第24天后，免疫荧光检测未发现梅毒螺旋体的存在螺旋体大部分被杀死，进入无症状的潜伏期此即一期潜伏梅毒。现在应用基因诊断能快速准确的检测出来。

梅毒患者的皮肤、粘膜中含梅毒螺旋体，未患病者在与梅毒患者的性接触中，皮肤或粘膜若有细微破损则可得病，而性接触是梅毒的主要传播途径，约占其95％以上。感染TP的早期传染性最强。如果是显性梅毒，可发生性行为接触的任何部位的硬下疳，如生殖器、肛周、直肠、乳头、舌、咽、手指等部位的硬下疳。随着病期的延长传染性越来越小，一般认为感染后2年以上性接触就不再有传染性。

一期梅毒患者，如果没有及时科普治疗、或者没有在正规医院里治疗，梅毒螺旋体就会由淋巴系统进入血液循环，并大量繁殖、播散，侵犯皮肤、粘膜、骨、内脏、心血管及神经系统，进而出现多种症状。在这个阶段，通常可能先出现流行性感冒一样的全身症状，随后会有全身淋巴结的肿大及皮肤粘膜的多种损害。皮肤损害有斑疹、斑丘疹、脓疱疹；黏膜损害有梅毒性咽炎、粘膜斑、梅毒性秃发等症状；部分患者会出现声音嘶哑，甚至完全无法发音。90％的患者都会出现梅毒疹，这是二期梅毒的基本特征。

二期梅毒的主要表现可以概括为三个特点：类感冒症状、梅毒疹和全身淋巴结肿大。患梅毒疹时由于无明显痛苦，常易被患者忽略。临床上如见到分布广泛、对称，而自觉症状轻微的皮疹时，就要详细询问病史，以免漏诊。二期梅毒疹表面梅毒螺旋体很多，因此传染性也最强。

梅毒螺旋体可侵犯中枢神经系统，可引发脊髓痨、麻痹性痴呆、视神经萎缩等；也会侵害心血管系统，可导致主动脉炎、主动脉瓣闭锁不全、主动脉瘤等；当螺旋体侵害骨骼系统，引起组织和器官破坏，功能丧失，导致残疾或死亡。梅毒螺旋体还有很强的变异性，而且变异后毒性增强，对身体器官的损伤程度加重，变异后病情发展迅速，加之传统治疗效果差，致使梅毒对身体的致残率和致死率增加。不及时治疗将导致器官的功能丧失，甚至危及生命。目前来说，“早预防、早发现、早治疗”成为预防治疗梅毒的关键，针对梅毒的快速有效的检测手段更加显得重要。

目前，梅毒的检测通常采用血清学检查，免疫血清学检查具有方便、快捷和准确等优点，已经普遍应用于医疗检测和诊断领域。较常见的免疫血清学检查方法有免疫荧光技术(ABS)、放射免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫胶金体技术(ICA)及化学发光免疫分析(CLIA)等。

其中，酶联免疫法价格便宜，但灵敏度较低，是目前国内应用最多的方法，而且酶免只可以作为定性判断，且手工操作误差较大，难以适应市场发展的需求。胶体金法的优点是及时、快速，适宜于现场检测，其特异性和灵敏度远差于酶联免疫法。化学发光法可用于定量测定，无论从方法学和自动化程度看，都要优于酶联免疫法。

常规技术中，还有采用电化学发光法检测梅毒的，电化学发光法是通过在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应。也有采用双抗原夹心法进行测定的，即一株重组抗原包被固相，另一株重组抗原标记发光物，通过测定发光信号，计算出样本中梅毒抗体(Treponema pallidum antibodies，TP)的含量。

但是，常规技术中的TP检测常存在灵敏度低、特异性差的问题。

发明内容

基于此，本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种检测梅毒螺旋体抗体的试剂盒及其检测方法和应用，采用该试剂盒及检测方法，能够提高检测灵敏度。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种检测梅毒螺旋体抗体的试剂盒，包括以下组分：

1)标记物体系：包括直接连接或间接连接标记示踪物的梅毒螺旋体重组抗原1，或包括直接连接或间接连接标记示踪物的金黄葡萄球菌A蛋白；

2)桥连物体系：包括直接连接第一桥连物的梅毒螺旋体重组抗原2；

3)磁性微球体系：包括直接连接第二桥连物的磁性微球；

所述梅毒螺旋体重组抗原1和梅毒螺旋体重组抗原2与待测梅毒螺旋体抗体结合的位点互不相同，所述第一桥连物可与第二桥连物结合。

上述“直接连接”为直接结合的连接，上述“间接连接”为通过生物素和链霉亲和素，或异硫氰酸荧光素和抗异硫氰酸荧光素抗体等能够相互结合的搭桥物以间接结合的方式连接。上述第一桥连物与第二桥连物为常规可用的搭桥物质对，如生物素和链霉亲和素，硫氰酸荧光素(FITC)和抗异硫氰酸荧光素抗体，标签蛋白和标签蛋白抗体等。其中，抗异硫氰酸荧光素抗体既可以为单克隆抗体，也可以为多克隆抗体。

本发明人通过大量研究实验考察后发现，常规技术的梅毒螺旋体抗体(TP)检测中，如使用磁性微球作为固相载体，是将梅毒螺旋体重组抗原包被于磁性微球中，加样反应时使待测抗体直接与包被于磁性微球的重组抗原结合，而由于磁性微球相对体积较大，具有较大的空间位阻，常常导致抗原-抗体结合反应并不充分，致使检测灵敏度低。

在上述研究发现的基础上，本发明对常规技术进行了改进，测定时，先不将重组抗原包被到磁性微球，而是通过一个小分子的第一桥连物标记重组抗原，让连接标记示踪物的梅毒螺旋体重组抗原1，和连接第一桥连物的梅毒螺旋体重组抗原2先与待测抗体(TP)反应，形成双抗原夹心结构的复合物，由于此时重组抗原上连接的标记示踪物和桥连物的体积均小于磁性微球，空间位阻较小，能够促进抗原-抗体结合反应充分进行，使所有待测抗体均与抗原形成双抗原夹心复合物，在不清洗的前提下，加入磁性微球，依赖磁性微球上包被的桥连物与上述形成的双抗原夹心复合物结合，磁性微球起到作为固相载体固定待测物和标记示踪物的作用，此时，外加磁场固定磁性微球，清洗掉没有通过待测抗体形成双抗原夹心复合物的连接标记示踪物的重组抗原。最后通过发光底物与标记示踪物作用发出的相对光强度，计算出待测抗体的含量。

本发明的试剂盒，由于在形成双抗原夹心复合物的过程中，与标记重组抗原的都是小分子物质，其空间位阻远远小于磁性微球的空间位阻，能够促进抗原-抗体结合反应充分进行，使所有待测抗体均与抗原形成双抗原夹心复合物，从而提高了检测灵敏度。

在上述技术方案中，标记物体系中，标记示踪物的工作浓度优选5ng/ml-500ng/ml，梅毒螺旋体重组抗原1的工作浓度优选50ng/ml-5000ng/ml；桥连物体系中，第一桥连物(如生物素等)的工作浓度优选5ng/ml-500ng/ml，梅毒螺旋体重组抗原2的工作浓度优选50ng/ml-5000ng/ml；磁性微球体系中，第二桥连物(如链霉亲和素等)的工作浓度优选0.1-2μg/ml，磁性微球的工作浓度优选0.1mg/ml-2mg/ml。将各试剂成分的浓度设定在此范围内，既能避免由于浓度过低导致光信号低，影响试剂检测的灵敏度；又能避免浓度过高所造成的成本浪费。可根据具体情况调整。

可以理解的，为了达到定量测定的目的，该试剂盒还可以包括梅毒螺旋体抗体浓度为0.05mIU/ml-10mIU/ml的校准品溶液和浓度为100mIU/ml-1000mIU/ml的校准品溶液。通过样本与校准品溶液RLU的比例关系，计算出测定结果。

同样可以理解的，该试剂盒中的各组分均含有BSA(牛血清白蛋白)和防腐剂，BSA浓度为0.01-0.5g/ml，防腐剂为山梨酸钾、苯甲酸钠、叠氮钠、亚硝酸钠、Proclin系列中的任一种或两种以上混合物。

适用于本发明的磁性微球也称为磁珠或磁球，可以是本领域中常用的磁性微球。优选的是，本发明使用的磁球，是将纳米级的Fe₂O₃或Fe₃O₄磁性粒子和有机高分子材料进行复合，形成具有超顺磁性和极大量蛋白吸附容量的微米级的固相微球，具有在外加磁场作用下可迅速被磁化，在撤走磁场后剩磁为零的属性。其中，所述有机高分子材料的种类没有特别限制，可根据需要进行选择。

本发明所使用的磁性微球应能满足直径为0.1-5μm，磁性微球还可以通过表面改性而带有多种活性功能基团，包括但不限于-OH、-COOH、-NH₂。

在其中一个实施例中，所述磁性微球为Fe₂O₃或Fe₃O₄磁性纳米粒子与有机高分子材料的复合体，并具有0.1-5μm的粒径，并且，所述磁性微球任选地通过表面改性而带有一种或多种活性功能基团。

在其中一个实施例中，所述第一桥连物和第二桥连物为生物素和链霉亲和素，或者硫氰酸荧光素和抗异硫氰酸荧光素抗体，或者标签蛋白和标签蛋白抗体中的任一组。可根据具体需要灵活选择。

在其中一个实施例中，当第一桥连物和第二桥连物为生物素和链霉亲和素时，所述间接连接标记示踪物的梅毒螺旋体重组抗原1由标记抗异硫氰酸荧光素抗体的标记示踪物，和标记异硫氰酸荧光素的梅毒螺旋体重组抗原1组成；或所述间接连接标记示踪物的梅毒螺旋体重组抗原1由标记标签蛋白抗体的标记示踪物，和标记标签蛋白的梅毒螺旋体重组抗原1组成；

当第一桥连物和第二桥连物为硫氰酸荧光素和抗异硫氰酸荧光素抗体时，所述间接连接标记示踪物的梅毒螺旋体重组抗原1由标记链霉亲和素的标记示踪物，和标记生物素的梅毒螺旋体重组抗原1组成；或所述间接连接标记示踪物的梅毒螺旋体重组抗原1由标记标签蛋白抗体的标记示踪物，和标记标签蛋白的梅毒螺旋体重组抗原1组成；

当第一桥连物和第二桥连物为标签蛋白和标签蛋白抗体时，所述间接连接标记示踪物的梅毒螺旋体重组抗原1由标记链霉亲和素的标记示踪物，和标记生物素的梅毒螺旋体重组抗原1组成；或所述间接连接标记示踪物的梅毒螺旋体重组抗原1由标记抗异硫氰酸荧光素抗体的标记示踪物，和标记异硫氰酸荧光素的梅毒螺旋体重组抗原1组成。

即在上述标记物体系中，如使用间接搭桥连接方式，以不影响桥连物体系和磁性微球体系中通过桥连物连接梅毒螺旋体重组抗原2与磁性微球为原则进行选取。除此外，上述标记物体系中采用何种连接方式(直接连接或间接搭桥连接)并不对桥连物体系和磁性微球体系造成影响或限定，既可在标记物体系中选用直接连接，也可采用间接连接。

并且，上述标记物体系中，标记示踪物的工作浓度优选5ng/ml-500ng/ml，梅毒螺旋体重组抗原1的工作浓度优选50ng/ml-5000ng/ml，异硫氰酸荧光素的工作浓度优选5ng/ml-500ng/ml，抗异硫氰酸荧光素抗体的工作浓度优选1-20μg/ml，生物素的工作浓度优选5ng/ml-500ng/ml，链霉亲和素的工作浓度优选0.1-2μg/ml，标签蛋白的工作浓度优选5ng/ml-500ng/ml，标签蛋白抗体的工作浓度优选5ng/ml-500ng/ml。

上述标记示踪物包括以下几种：1、化学发光免疫分析使用的能够直接发光的标记物，如鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺或其衍生物、吖啶酯等；2、化学发光酶免疫分析使用的配合相应的发光底物可以发光的标记物，如碱性磷酸酶或过氧化物酶等。

在其中一个实施例中，所述标记示踪物为发光标记物，选自：金刚烷，鲁米诺及其衍生物，异鲁米诺及其衍生物，吖啶酯。优选N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)，与上述发光标记物配合的氧化系统包括H₂O₂-微过氧化物酶、H₂O₂-过氧化氢酶、H₂O₂-乳过氧化物酶、H₂O₂-次氯血红素、H₂O₂-氯化血红素、次氯酸盐-CoCl₂、过硫酸盐、过氧化钾、高碘酸钠、H₂O₂-K₃Fe(CN)₆、黄嘌呤-次黄嘌呤氧化酶、叔丁醇钾中的至少一种。。

上述发光标记物是指在发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，该化合物能够经催化剂的催化和氧化剂的氧化，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，同时发射出光子(hM)。

在其中一个实施例中，所述标记示踪物为化学发光催化剂，选自：碱性磷酸酶，过氧化物酶。使用时，配合相应的化学发光底物即可发光被定量检测，所述化学发光底物包括NaOH和H₂O₂，还包括金刚烷、鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺或其衍生物中的至少一种，优选N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)。

在其中一个实施例中，所述标记物体系或桥连物体系中，所述梅毒螺旋体重组抗原由梅毒螺旋体重组抗原Tpp17、梅毒螺旋体重组抗原Tpp47和梅毒螺旋体重组抗原Tpp15分别与标记示踪物或第一桥连物反应后混合得到，所述梅毒螺旋体重组抗原Tpp17、梅毒螺旋体重组抗原Tpp47和梅毒螺旋体重组抗原Tpp15的质量比为3-6:3:1-2。优选质量比为6:3:1、3:3:2、6:3:3或3:3:1。具体为：将梅毒螺旋体重组抗原Tpp17、梅毒螺旋体重组抗原Tpp47和梅毒螺旋体重组抗原Tpp15分别投料与标记示踪物或第一桥连物反应，再根据需要对上述反应产物进行稀释得到工作溶液(混合稀释)。采用上述比例配合的梅毒螺旋体重组抗原混合溶液，可以显著提高试剂检测的灵敏度和降低一定的非特异性结合。

在其中一个实施例中，该试剂盒还包括4)特异性添加剂：包括结合剂和辅助成分，所述结合剂为新生牛血清、羊血清、鼠血清、马血清、牛血清白蛋白、羊抗人IgA、兔抗人IgA、鼠抗人IgA中的至少一种；所述辅助成分为二硫苏糖醇(DTT)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、乙二醇、丙三醇、酪蛋白、乙二胺四乙酸盐(EDTA)中的至少一种。

本发明人通过大量的实验研究发现，在常规梅毒螺旋体抗体检测中，特异性和灵敏度低的另一个原因是在样本中有大量干扰物，如：类风湿性因子(RF)、人抗小鼠抗体(HAMA)，嗜异性抗体，抗核抗体(ANA)等多种干扰免疫反应的因子。

在上述研究基础上，本发明的检测试剂盒中，还加入了特异性添加剂，与样本中的干扰物结合，从而避免干扰物对检测过程的干扰，提高了检测特异性和灵敏度。人血清中含有一些特定的抗体，这些抗体会跟免疫检验中使用的动物抗体或抗原结合，从而导致检测结果的假阳性或假阴性干扰，这些特定的抗体称为异嗜性抗体。特异性添加剂中所含有的动物源性的抗体成分含有足够的特异性结合位点，能主动结合异嗜性抗体，而添加剂中的其他物质则会提供一个稳定的异嗜性抗体发生特异性结合反应的液体环境。当异嗜性抗体与动物源性的抗体发生结合以后，便不能在桥联免疫测定系统中的标记抗原与梅毒抗体了，从而有效的消除了非特异性结合，提高了梅毒检测试剂的灵敏度。

上述特异性添加剂中，新生牛血清的体积百分浓度优选10-20％、羊血清的体积百分浓度优选0.1-10％、鼠血清(鼠源性免疫球蛋白)的体积百分浓度优选0.1-10％、马血清的体积百分浓度优选0.1-5％、牛血清白蛋白的浓度优选0.1-15g/L、羊抗人IgA的浓度优选0.1-5g/L、兔抗人IgA的浓度优选0.1-5g/L、鼠抗人IgA的浓度优选0.1-5g/L；二硫苏糖醇的浓度优选1-100mmol/L、2-(N-吗啉代)乙磺酸的浓度优选1-100mmol/L、乙二醇的体积百分浓度优选0.1-2％、丙三醇的体积百分浓度优选0.1-2％、酪蛋白的浓度优选0.1-5g/L、乙二胺四乙酸盐的浓度优选0.1-2g/L。

本发明还公开了一种梅毒螺旋体抗体的检测方法，采用上述的试剂盒，包括以下步骤：

1)一次加样：将待测样本与标记物体系和桥连物体系混合，温育，获得双抗原夹心复合物；

2)二次加样：将磁性微球体系加入上述具有双抗原夹心复合物的溶液中，混合均匀，温育，将双抗原夹心复合物固定于磁性微球上；

3)检测：将磁性微球沉淀，去除上清液，清洗后，加入发光底物，检测发出的相对光强度，计算得到梅毒螺旋体抗体的含量。

本发明的毒螺旋体抗体的检测方法，采用上述的试剂盒，在一次加样中，先不加入磁性微球，让待测抗体与连接标记示踪物的抗原和连接桥连物的抗原充分反应，形成双抗原夹心复合物，不清洗，再加入连接桥连物的磁性微球，通过桥连物之间的结合，使双抗原夹心复合物固定于磁性微球上，再通过外加磁场条件下清洗的方式实现分离，对待测抗体的含量进行测定。由于在形成双抗原夹心复合物的过程中，与标记重组抗原的都是小分子物质，其空间位阻远远小于磁性微球的空间位阻，能够促进抗原-抗体结合反应充分进行，使所有待测抗体均与抗原形成双抗原夹心复合物，从而提高了检测灵敏度。

在其中一个实施例中，所述步骤1)一次加样中，还加入上述的特异性添加剂。使特异性添加剂与样本中的干扰物结合，从而避免干扰物对检测过程的干扰，提高了检测灵敏度。

本发明还公开了上述的试剂盒在全自动化学发光分析仪上的应用。将该试剂盒应用于全自动化学发光分析仪，具有操作规范，无人为引入误差及全自动化的优点。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的一种检测梅毒螺旋体抗体的试剂盒，增加了桥连物体系，通过一个小分子的第一桥连物标记重组抗原，让连接标记示踪物的梅毒螺旋体重组抗原1，和连接第一桥连物的梅毒螺旋体重组抗原2先与待测抗体反应，形成双抗原夹心结构的复合物，由于在形成双抗原夹心复合物的过程中，与标记重组抗原的都是小分子物质，其空间位阻远远小于磁性微球的空间位阻，能够促进抗原-抗体结合反应充分进行，使所有待测抗体均与抗原形成双抗原夹心复合物，从而提高了检测灵敏度。

并且，该试剂盒还包括4)特异性添加剂，可与样本中的干扰物结合，从而避免干扰物对检测过程的干扰，提高了检测特异性和灵敏度。

本发明的一种毒螺旋体抗体的检测方法，采用上述试剂盒，检测时，先形成双抗原夹心复合物，再与磁性微球连接，利用形成双抗原夹心复合物的过程中，与标记重组抗原的都是小分子物质，其空间位阻远远小于磁性微球的空间位阻的优势，促进抗原-抗体结合反应充分进行，使所有待测抗体均与抗原形成双抗原夹心复合物，从而提高了检测灵敏度。

附图说明

图1为本发明实施例1中检测梅毒螺旋体抗体的检测方法原理示意图；

图2为对比例1中常规两步法的检测原理示意图；

图3为对比例2中常规一步法的检测原理示意图。

其中：1.待测样本中的梅毒螺旋体抗体；2.待测样本中的其他成分；3.标记ABEI的梅毒螺旋体重组抗原1；4.生物素化的梅毒螺旋体重组抗原2；5.包被链霉亲和素的磁性微球；6.包被梅毒螺旋体重组抗原2的磁性微球。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。

以下实施例中：

实施例1中的Syphilis重组抗原CMIA-TP-Ag8，来源：Fapon公司。

实施例1中的Syphilis重组抗原CMIA-TP-Ag2，来源：Fapon公司。

实施例4中的Syphilis重组抗原Tpp15，来源：Fapon公司。

实施例4中的Syphilis重组抗原Tpp17，来源：Fapon公司。

实施例4中的Syphilis重组抗原Tpp47，来源：Fapon公司。

实施例4中的金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)，来源：雅为公司。

羊抗FITC多克隆抗体，来源：购自北京百浩生物科技有限公司。

磁性微球，来源：为深圳新产业生物医学股份有限公司生产。

FITC:购自上海纪宁实业有限公司。

ABEI由深圳市新产业生物医学工程股份有限公司生产。

生物素、链霉亲和素：均购自Roche。

校准品，来源：Fapon公司。

实施例1

一种检测梅毒螺旋体抗体的试剂盒，包括以下组分：

1)标记物体系：标记ABEI的梅毒螺旋体(Syphilis)重组抗原1溶液，其中：ABEI的工作浓度：250ng/ml，Syphilis重组抗原1的工作浓度：2500ng/ml。

Syphilis重组抗原1为Fapon公司提供的CMIA-TP-Ag8抗原。

2)桥连物体系：生物素(Biotin)化的梅毒螺旋体重组抗原2溶液，其中：生物素的工作浓度：250ng/ml，Syphilis重组抗原2的工作浓度：2500ng/ml。

Syphilis重组抗原2为Fapon公司提供的CMIA-TP-Ag2抗原。

3)磁性微球体系：包被链霉亲和素(SA)的磁性微球溶液，其中：链霉亲和素的工作浓度：1.5μg/ml，磁性微球的工作浓度：0.5mg/ml。

4)特异性添加剂：

结合剂：0.1-15g/L的牛血清白蛋白(BSA)、体积百分浓度为10％-20％的新生牛血清、体积百分浓度为0.1％-10％的羊血清、体积百分浓度为0.1％-10％的鼠血清、体积百分浓度为0.1％-5％的马血清。

辅助成分：1-100mmol/L的DTT、1-100mmol/L的MES、体积百分浓度为0.1％-2％的乙二醇、体积百分浓度为0.1％-2％的丙三醇、0.1-5g/L的酪蛋白、0.1-2g/L的EDTA-2Na。

缓冲成分：1-100mmol/L的Tris-HCl缓冲液、1-100mmol/L的PBS缓冲液。

5)校准品溶液：浓度2.435mIU/ml的低浓度校准品溶液和浓度205.846mIU/ml的高浓度校准品溶液。

上述各组分均含有BSA和防腐剂，BSA质量体积百分浓度为0.1％，防腐剂主要成分为NaN₃，质量体积百分浓度为0.2％。

本实施例的检测梅毒螺旋体抗体的试剂盒制备方法中，除以下试剂外，其余均按照常规方法制备。

上述包被链霉亲和素的磁性微球通过以下方法制备：

1)配制pH为3.6的醋酸缓冲液：

称取2.55g三水合乙酸钠用4500ml纯化水溶解后再加入14ml乙酸混匀后，定容至5000ml，即得pH为3.6的醋酸缓冲液。

2)磁性微球连接(磁性微球连接CMC法)：

加入上述pH3.6醋酸缓冲液悬浮磁性微球浓度为20mg/mL，再加入1-环已基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐(CMC)(浓度为10mg/ml)，按1mg磁性微球加入15μg链霉亲和素，组成反应体系。

将上述反应体系放入恒温震荡水浴箱中37℃反应24小时。

3)磁性微球的清洗：

磁珠清洗液的配制：在0.05M PBS中溶入0.5％的BSA，即为磁珠清洗液。

清洗：将反应好的反应体系倒入烧杯中，然后置于磁铁上沉淀后，倒掉上清，加入磁珠清洗液搅拌清洗，然后放置在磁铁上，待上清液清亮后倒掉上清液。

4)磁性微球的悬浮：

磁珠悬浮液的配制:在0.05M PBS中溶入0.5％的BSA和0.4％的甲基纤维素(MC)，即为磁珠悬浮液。

清洗完毕后，加入包被体积的磁珠悬浮液，悬浮浓度为20mg/ml，即得到包被HBsAg单克隆抗体1的磁性微球溶液。

上述标记ABEI的Syphilis重组抗原1通过以下方法制备：

1)透析液的配制：在5000ml烧杯中加入Na₂CO₃14.31g，NaHCO₃26.46g，加水定容至4500ml，即得0.1mol/L的碳酸缓冲液。

2)选用截留量为14000的透析袋，量取合适的尺寸，取1mg Syphilis重组抗原1用透析液调整到1ml，放入透析液中，室温搅拌透析2小时。将透析好的溶液分装，按照1ml溶液加入100μg ABEI活化酯，37℃反应2小时。

3)以G-25凝胶柱纯化上述反应得到的标记ABEI的Syphilis重组抗原1。

4)在纯化后的标记ABEI的Syphilis重组抗原1溶液中加入等体积的含5％的BSA保护液，即得。

上述生物素化的梅毒螺旋体重组抗原2通过以下方法制备：

1)将纯化好Syphilis重组抗原2，用0.1mol/L，pH9.5的NaHCO₃缓冲液透析2h；

2)将活化的生物素溶于DMF中，按照生物素与Syphilis重组抗原2的摩尔比为20:1的比例将二者混合反应2h；

3)将反应后的液体用0.1mol/L PBS于4℃透析24小时，即制成生物素化的Syphilis重组抗原溶液。

采用本实施例的试剂盒进行梅毒螺旋体抗体检测的方法，如图1所示，包括以下步骤：

1)一次加样：将10μl待测样本、高、低浓度校准品溶液分别加入反应杯中，再加入50μl生物素化的梅毒螺旋体重组抗原2(4)溶液，50μl标记ABEI的梅毒螺旋体重组抗原1(3)溶液，并同时加入特异性添加剂，混合均匀，37℃温育15min，不清洗，使待测样本中的梅毒螺旋体抗体(1)与梅毒螺旋体重组抗原1和梅毒螺旋体重组抗原2反应，形成双抗原夹心复合物。

2)二次加样：将20μl包被链霉亲和素的磁性微球(5)溶液加入上述具有双抗原夹心复合物的溶液中，混合均匀，37℃温育10min，使上述双抗原夹心复合物通过生物素与链霉亲和素的结合，将双抗原夹心复合物固定于磁性微球上。

3)检测：外加磁场将上述固定了双抗原夹心复合物的磁性微球沉淀，去除上清液，并以缓冲液清洗去除待测样本中的其他成分(2)后，加入发光底物1(NaOH)和发光底物2(H₂O₂)，检测发出的相对光强度，通过计算得到梅毒螺旋体抗体的含量。

实施例2

一种检测梅毒螺旋体抗体的试剂盒，与实施例1的试剂盒基本相同，不同之处在于：

4)特异性添加剂中仅含有缓冲成分，无结合剂和辅助成分。

一种梅毒螺旋体抗体检测的方法，与实施例1中的检测方法基本相同，不同之处在于：采用本实施例的检测试剂盒进行检测。

实施例3

一种检测梅毒螺旋体抗体的试剂盒，与实施例1的试剂盒基本相同，不同之处在于：

1)标记物体系：

标记ABEI的梅毒螺旋体(Syphilis)重组抗原1溶液，其中：ABEI的工作浓度：250ng/ml，梅毒螺旋体(Syphilis)重组抗原1溶液的工作浓度：2500ng/ml。

2)桥连物体系：标记硫氰酸荧光素(FITC)的梅毒螺旋体(Syphilis)重组抗原2溶液，其中：FITC的工作浓度：250ng/ml，Syphilis重组抗原2的工作浓度：2500ng/ml。

3)磁性微球体系：包被羊抗硫氰酸荧光素多克隆抗体的磁性微球溶液，其中：羊抗硫氰酸荧光素多克隆抗体的工作浓度：250ng/ml，磁性微球的工作浓度：0.5mg/ml。

本实施例的检测梅毒螺旋体抗体的试剂盒制备方法参照实施例1中的方法，即按照制备生物素(Biotin)化的梅毒螺旋体重组抗原2的方法，仅是在制备生物素(Biotin)化的梅毒螺旋体重组抗原2时，将生物素(Biotin)替换为硫氰酸荧光素(FITC)即可；在制备包被磁球的链霉亲和素(SA)时，将链霉亲和素(SA)替换为羊抗硫氰酸荧光素多克隆抗体即可。

一种梅毒螺旋体抗体检测的方法，与实施例1中的检测方法基本相同，不同之处在于：1)一次加样中，加入本实施例的试剂盒中的标记物体系和桥连物体系。

实施例4

一种检测梅毒螺旋体抗体的试剂盒，包括以下组分：

1)标记物体系：标记ABEI的金黄葡萄球菌A蛋白(SPA)，其中：ABEI的工作浓度：250ng/ml，金黄葡萄球菌A蛋白(SPA)的工作浓度：2500ng/ml。

2)桥连物体系：分别生物素(Biotin)化的梅毒螺旋体重组抗原Tpp15、Tpp17、Tpp47溶液，其中：生物素的工作浓度：250ng/ml，梅毒螺旋体重组抗原Tpp15、Tpp17、Tpp47按照质量比为6:3:1的比例混合使用，即Tpp17重组抗原的工作浓度：4.5μg/ml，Tpp47重组抗原的工作浓度：2.25μg/ml，Tpp15重组抗原的工作浓度：0.75μg/ml。

3)磁性微球体系：包被链霉亲和素(SA)的磁性微球溶液，其中：链霉亲和素的工作浓度：1.5μg/ml，磁性微球的工作浓度：0.5mg/ml。

4)特异性添加剂：

结合剂：0.1-15g/L的牛血清白蛋白(BSA)、体积百分浓度为10％-20％的新生牛血清、体积百分浓度为0.1％-10％的羊血清、体积百分浓度为0.1％-10％的鼠血清、体积百分浓度为0.1％-5％的马血清。

辅助成分：1-100mmol/L的DTT、1-100mmol/L的MES、体积百分浓度为0.1％-2％的乙二醇、体积百分浓度为0.1％-2％的丙三醇、0.1-5g/L的酪蛋白、0.1-2g/L的EDTA-2Na。

缓冲成分：1-100mmol/L的Tris-HCl缓冲液、1-100mmol/L的PBS缓冲液。

5)校准品溶液：浓度2.435mIU/ml的低浓度校准品溶液和浓度205.846mIU/ml的高浓度校准品溶液。

上述各组分均含有BSA(牛血清白蛋白)和防腐剂，BSA质量体积百分浓度为0.1％，防腐剂主要成分为NaN₃，质量体积百分浓度为0.2％。

本实施例的检测梅毒螺旋体抗体的试剂盒制备方法中，分别生物素化的梅毒螺旋体重组抗原Tpp15、Tpp17、Tpp47参照实施例1的方法制备。

一种梅毒螺旋体抗体检测的方法，与实施例1中的检测方法基本相同，不同之处在于：1)一次加样中，加入本实施例的试剂盒中的标记物体系和桥连物体系。

实施例5

一种检测梅毒螺旋体抗体的试剂盒，与实施例1的试剂盒基本相同，不同之处在于：

4)特异性添加剂中不添加羊血清和鼠血清。

一种梅毒螺旋体抗体检测的方法，与实施例1中的检测方法基本相同，不同之处在于：采用本实施例的检测试剂盒进行检测。

对比例1

一种检测梅毒螺旋体抗体的试剂盒，与实施例1中的成分类似，包括以下组分：

1)标记物体系：标记ABEI的梅毒螺旋体(Syphilis)重组抗原1溶液，其中：ABEI的工作浓度：250ng/ml，Syphilis重组抗原1的工作浓度：2500ng/ml。

2)磁性微球体系：包被梅毒螺旋体重组抗原2的磁性微球溶液，其中：Syphilis重组抗原2的工作浓度：2500ng/ml，磁性微球的工作浓度：0.5mg/ml。

一种梅毒螺旋体抗体检测的方法(常规两步法)，如图2所示，包括以下步骤：

1)一次加样：将10μl待测样本、高、低浓度校准品溶液分别加入反应杯中，再加入20μl包被梅毒螺旋体重组抗原2(6)的磁性微球溶液，并同时加入100μl缓冲成分，混合均匀，37℃温育15min，使待测样本中的梅毒螺旋体抗体(1)和包被梅毒螺旋体重组抗原2的磁性微球反应，形成复合物。

2)清洗：外加磁场将上述反应产物沉淀，去除上清液，并以缓冲液清洗3次，去除待测样本中的其他成分(2)。

3)二次加样：将100μl标记ABEI的梅毒螺旋体重组抗原1(3)溶液加入上述沉淀中，混合均匀，37℃温育10min，形成双抗原夹心复合物。

4)检测：外加磁场将上述固定了双抗原夹心复合物的磁性微球沉淀，去除上清液，并以缓冲液清洗后，加入发光底物1(NaOH)和发光底物2(H₂O₂)，检测发出的相对光强度，通过计算得到梅毒螺旋体抗体的含量。

对比例2

一种检测梅毒螺旋体抗体的试剂盒，与对比例1的试剂盒相同。

一种梅毒螺旋体抗体检测的方法(常规一步法)，如图3所示，包括以下步骤：

1)加样：将10μl待测样本、高、低浓度校准品溶液分别加入反应杯中，再加入20μl包被梅毒螺旋体重组抗原2的磁性微球6溶液，100μl标记ABEI的梅毒螺旋体重组抗原1(3)溶液，并同时加入缓冲成分，混合均匀，37℃温育19min，使待测样本中的梅毒螺旋体抗体(1)与梅毒螺旋体重组抗原1和梅毒螺旋体重组抗原2反应，形成双抗原夹心复合物。

2)检测：外加磁场将上述固定了双抗原夹心复合物的磁性微球沉淀，去除上清液，并以缓冲液清洗，去除待测样本中的其他成分(2)后，加入发光底物1(NaOH)和发光底物2(H₂O₂)，检测发出的相对光强度，通过计算得到梅毒螺旋体抗体的含量。

对比例3

一种检测梅毒螺旋体抗体的试剂盒，与实施例4的试剂盒基本相同，不同之处在于：其中梅毒螺旋体重组抗原Tpp15、Tpp17、Tpp47按照质量比为1:1:1的比例混合使用，即Tpp17重组抗原，Tpp47重组抗原，Tpp15重组抗原的工作浓度均为1.5μg/ml。

一种梅毒螺旋体抗体检测的方法，与实施例4的中的检测方法基本相同，不同之处在于：采用本实施例的检测试剂盒进行检测。

实验例

采用上述实施例、对比例中的检测试剂盒和检测方法在全自动化学发光分析仪(产家：深圳市新产业生物医学工程股份有限公司，Maglumi 2000)上进行测定实验，测试样本包括：采购自中国药品生物制品检定所的Syphilis定性参考品(批号：240013-200901)和Seracare公司的Syphilis阳转盘(pss901panel)，以及从深圳某医院收集到的158例梅毒临床标本。

结果如下所示。

表1、国家定性参考品测定结果(单位：S/CO)

从上述结果中可以看出以下几点：

1、采用对比例2(常规一步法)做国家定性参考品，P2、P4、P7、P8、P10这五个阳性样本值明显偏低，很容易出现假阴性，而实施例1-4没有出现这种情况，反而实施例5与之接近，但实施例5的灵敏度要高于对比例2，对比例3明显差于对比例2，从而出现了假阴性的结果。

2、将实施例1、2、5与对比例1(常规两步法)进行对比，发现在灵敏度上，实施例1、2、5明显优于对比例1(说明书中要求L3允许做成阴性，也就是要求最好做出阳性)，实施例1、2、5均做出了阳性，虽然实施例2由于没有添加特异性添加剂从而导致L3的阳性结果没有那么明显，但也作出了区分，而对比例1没有，即实施例1、2、5明显优于对比例1。

3、将实施例1与实施例2、实施例5比较，虽然结果基本一致，但是实施例2只是把L3做成了阳性，却没有实施例1和实施例5那么明显，而且实施例5中P3明显出现了非特异性结合，P2、P5和P7明显偏低，结果显示，使用特异性添加剂的实施例1的灵敏度要高于实施例2和实施例5，而部分添加特异性添加剂(不添加羊血清和鼠血清)的实施例5的灵敏度又要高于不添加的实施例2。

4、将实施例1与实施例3比较，结果基本一致，说明采用间接连接方式对最终检测结果基本无影响，但是从结果来看，实施例3中检测得出结果中P1-P10的阳性结果明显偏低，显示出灵敏度要比实施例1低，可以根据自身需要选择最有利的连接方案进行试验。

5、将实施例1与实施例4比较，虽然结果基本一致，但是在实施例4中，P6、P7的阳性结果明显偏低，而L3比较容易导致假阴性结果的产生，所以灵敏度也要低于实施例1。但将实施例4与对比例3相比，由于其中重组抗原Tpp15、Tpp17、Tpp47的使用量不同，实施例4的检测效果优于对比例3。

表2、Seracare阳转盘测定结果(单位：S/CO)

从上述结果中可以看出，对比例3与对比例1保持了一致，但是在第44天的检出结果来看，灵敏度要低于对比例1，对比例2(常规一步法)的灵敏度非常低，而相比较对比例1(常规两步法)的结果，实施例1、3、4、5的结果与对比例1保持一致，但是已有检出值提高的优势(即上述实施例检出的数值高于对比例检出的数值)，特别是使用了特异性添加剂作为稀释液的实施例1，明显提高了灵敏度，在第31天就检测到了转阳的结果，而且阳性结果还明显高于其他3组实施例，而实施例2由于没有添加特异性添加剂，所以最后的检出结果与对比例1保持一致，并没有明显提高。

表3、158例梅毒临床标本检测数据(单位：S/CO)

从上述结果中可以看出，对比例2(常规一步法)存在的缺陷：除7、76、103、148号标本未能与其它方法阴阳性对上外，还有部分样本明显体现出测定值较低，甚至43、56、71、126、156号标本很容易做成假阴性，而对比例3中很明显可以看出所有阳性标本值都出现偏低的情况，部分弱阳性的标本甚至出现了假阴性结果，而部分阴性标本明显出现了非特异性结合，从而导致检测结果偏高，甚至出现假阳性。

实施例1、3的检测结果明显优于对比例1，而实施例2、4的测定值基本与其它方法保持了一致，但是诸如23、76号标本明显与对比例1和实施例1做的不同，实施例2由于缺少特异性添加剂所以导致76号标本出现非特异性结合，而实施例4由于采用3株抗原利用间接法联合检测灵敏度低，所以76号标本几乎没有检出阳性结果，综合检测结果来看，虽然不影响阴阳性的判断，但实施例2的灵敏度明显低于实施例1。相反的是，实施例2中，7、71、148号标本明显做的比对比例1和实施例1都高，这时出现了较为明显的非特异性结合，尤其是157号标本，虽然没有做成阳性，但是很容易出现假阳性的结果。说明加入特异性添加剂对于降低非特异性干扰是非常有效的，同样的情况出现在了实施例5中，在实施例5中部分阳性标本检测结果偏大，是出现了较为明显的非特异性结合，甚至诸如95号标本几乎做成了假阳性结果。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种检测梅毒螺旋体抗体的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：

1)标记物体系：包括直接连接或间接连接标记示踪物的梅毒螺旋体重组抗原1，或包括直接连接或间接连接标记示踪物的金黄葡萄球菌A蛋白；

2)桥连物体系：包括直接连接第一桥连物的梅毒螺旋体重组抗原2；

3)磁性微球体系：包括直接连接第二桥连物的磁性微球；

所述标记物体系或桥连物体系中，所述梅毒螺旋体重组抗原由梅毒螺旋体重组抗原Tpp17、梅毒螺旋体重组抗原Tpp47和梅毒螺旋体重组抗原Tpp15分别与标记示踪物或第一桥连物反应后混合得到，所述梅毒螺旋体重组抗原Tpp17、梅毒螺旋体重组抗原Tpp47和梅毒螺旋体重组抗原Tpp15的质量比为3-6:3:1-2；

所述梅毒螺旋体重组抗原1和梅毒螺旋体重组抗原2与待测梅毒螺旋体抗体结合的位点互不相同，所述第一桥连物可与第二桥连物结合。

2.根据权利要求1所述的检测梅毒螺旋体抗体的试剂盒，其特征在于，所述第一桥连物和第二桥连物为生物素和链霉亲和素，或者硫氰酸荧光素和抗异硫氰酸荧光素抗体，或者标签蛋白和标签蛋白抗体中的任一组。

3.根据权利要求2所述的检测梅毒螺旋体抗体的试剂盒，其特征在于，

当第一桥连物和第二桥连物为生物素和链霉亲和素时，所述间接连接标记示踪物的梅毒螺旋体重组抗原1由标记抗异硫氰酸荧光素抗体的标记示踪物，和标记异硫氰酸荧光素的梅毒螺旋体重组抗原1组成；或所述间接连接标记示踪物的梅毒螺旋体重组抗原1由标记标签蛋白抗体的标记示踪物，和标记标签蛋白的梅毒螺旋体重组抗原1组成；

当第一桥连物和第二桥连物为硫氰酸荧光素和抗异硫氰酸荧光素抗体时，所述间接连接标记示踪物的梅毒螺旋体重组抗原1由标记链霉亲和素的标记示踪物，和标记生物素的梅毒螺旋体重组抗原1组成；或所述间接连接标记示踪物的梅毒螺旋体重组抗原1由标记标签蛋白抗体的标记示踪物，和标记标签蛋白的梅毒螺旋体重组抗原1组成；

当第一桥连物和第二桥连物为标签蛋白和标签蛋白抗体时，所述间接连接标记示踪物的梅毒螺旋体重组抗原1由标记链霉亲和素的标记示踪物，和标记生物素的梅毒螺旋体重组抗原1组成；或所述间接连接标记示踪物的梅毒螺旋体重组抗原1由标记抗异硫氰酸荧光素抗体的标记示踪物，和标记异硫氰酸荧光素的梅毒螺旋体重组抗原1组成。

4.根据权利要求1所述的检测梅毒螺旋体抗体的试剂盒，其特征在于，所述标记示踪物为发光标记物，选自：金刚烷，鲁米诺及其衍生物，异鲁米诺及其衍生物，吖啶酯。

5.根据权利要求1所述的检测梅毒螺旋体抗体的试剂盒，其特征在于，所述标记示踪物为化学发光催化剂，选自：碱性磷酸酶，过氧化物酶。

6.根据权利要求1-5任一项所述的检测梅毒螺旋体抗体的试剂盒，其特征在于，还包括4)特异性添加剂：包括结合剂和辅助成分，所述结合剂为新生牛血清、羊血清、鼠血清、马血清、牛血清白蛋白、羊抗人IgA、兔抗人IgA、鼠抗人IgA中的至少一种；所述辅助成分为二硫苏糖醇、2-(N-吗啉代)乙磺酸、乙二醇、丙三醇、酪蛋白、乙二胺四乙酸盐中的至少一种。

7.一种梅毒螺旋体抗体的检测方法，其特征在于，采用权利要求1-6任一项所述的试剂盒，包括以下步骤：

1)一次加样：将待测样本与标记物体系和桥连物体系混合，温育，获得双抗原夹心复合物；

2)二次加样：将磁性微球体系加入上述具有双抗原夹心复合物的溶液中，混合均匀，温育，将双抗原夹心复合物固定于磁性微球上；

3)检测：将磁性微球沉淀，去除上清液，清洗后，加入发光底物，检测发出的相对光强度，计算得到梅毒螺旋体抗体的含量。

8.根据权利要求7所述的梅毒螺旋体抗体的检测方法，其特征在于，所述步骤1)一次加样中，还加入权利要求6所述的特异性添加剂。

9.权利要求1-6任一项所述的试剂盒在化学发光分析仪上的应用。